Construction of Terpinen-4-ol Encapsulation System Based on β-Cyclodextrin-based Metal-organic Framework
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摘要: 为了改善4-萜烯醇的疏水性和高挥发性，延长其作用时间，本研究通过改良蒸汽扩散法制备了β-环糊精基金属有机框架（β-cyclodextrin-based metal-organic framework，β-CD-MOF），采用溶剂孵化法制备了4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物，并以β-CD为对照探究了二者的最佳包封比例。进一步分析了4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物的形貌结构特性、光谱吸收特性和热重表征，利用体外抑菌实验测定了该包合物对三种食源性病原菌的抑制作用。结果表明，当4-萜烯醇与β-CD-MOF的质量比为1:1时，载药量和包封率最高，且优于相同制备条件下以β-CD为载体时的效果。扫描电镜观察表明，排列不规则的β-CD分子在K+的桥连作用下相互堆叠形成排列整齐的长方体β-CD-MOF。傅里叶红外光谱和X射线衍射分析表明，4-萜烯醇成功封装在β-CD-MOF中且二者之间存在氢键相互作用。热重分析表明，利用β-CD-MOF包封可以延缓4-萜烯醇的挥发速率，将4-萜烯醇应用的温度范围从30~160 ℃扩大到30~350 ℃。体外抑菌实验表明，4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌三种冷链微生物均具有长效抑菌能力。综上所述，将4-萜烯醇封装在β-CD-MOF中可以实现有效保存，本研究为绿色安全的新型冷链抑菌材料的开发提供了理论依据。Abstract: In order to improve the hydrophobicity and volatility of terpinen-4-ol and extend its duration of action, β-cyclodextrin-based metal-organic framework (β-CD-MOF) was first prepared by the modified vapor diffusion method, and then terpinen-4-ol was encapsulated with the β-CD-MOF to prepare a terpinen-4-ol/β-CD-MOF inclusion complex by the solvent incubation method. The mass ratio of the prepared β-CD-MOF or β-CD used as the control to terpinen-4-ol was optimized for encapsulation. The morphological characteristics, spectral absorption properties and thermogravimetric characterisation of the terpinen-4-ol/β-CD-MOF complex were analyzed. Through in vitro bacteriostatic assays, the inhibitory effects of the complex on three food-borne pathogens were determined. The results showed that the highest drug loading and encapsulation efficiency were achieved when the mass ratio of terpinen-4-ol to β-CD-MOF was 1:1, superior to the same preparation conditions using β-CD as a carrier. Scanning electron microscope (SEM) observations indicated that irregularly arranged β-CD molecules stacked together under the bridging action of K+, forming an orderly arranged rectangular β-CD-MOF. Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) and X-ray diffraction (XRD) analysis demonstrated terpinen-4-ol was successfully encapsulated in β-CD-MOF with hydrogen bond interactions between them. Thermogravimetric analysis (TGA) proved that the volatilization rate of terpinen-4-ol could be retarded when encapsulated by β-CD-MOF, extending its application temperature range from 30~160 ℃ to 30~350 ℃. In vitro antibacterial experiments showed that the terpinen-4-ol/β-CD-MOF complex exhibited long-lasting antibacterial abilities against three common cold-chain microorganisms, including Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. In conclusion, encapsulating terpinen-4-ol in β-CD-MOF allows for effective preservation, providing a theoretical basis for the development of novel, green and safe antimicrobial materials for cold-chain applications.
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Keywords:
- β-CD-MOF /
- terpinen-4-ol /
- encapsulation /
- characterization /
- stability /
- antibacterial activity
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在冷链运输过程中，生鲜食品始终存在受食源性病原微生物污染的风险，常见的冷链微生物污染者主要有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌等。随着生活水平的提高，消费者更加注重食品的安全性，绿色安全的低温抗菌材料拥有广阔的发展潜能，逐渐成为研究的热点[1]。因此，本研究旨在开发一种绿色安全的新型冷链抑菌材料，有效缓解生鲜食品的腐败变质，保留食品原有风味并延长贮存期。
4-萜烯醇（terpinen-4-ol，C10H18O），又名萜品烯-4-醇、松油烯-4-醇，化学名4-甲基-1-（1-甲基乙基）-3-环己烯-1-醇，是茶树精油的主要活性成分，占比30%以上，具有强大的抗菌和抗炎特性[2−4]，对金黄色葡萄球菌[5]、蜡样芽胞杆菌[6]等细菌以及白色念珠菌[7]、红色毛藓菌[8]等真菌的生长皆有良好的抑制作用。GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定了4-萜烯醇的主要来源茶树油（又名互叶白千层油）为允许使用的食品用天然香料，然而它的疏水性和高挥发特性限制了其应用。降低4-萜烯醇的挥发速度，提高其稳定性成为其在食品工业应用中需解决的首要问题。利用多孔材料将4-萜烯醇分子封装在空腔内，可以提高4-萜烯醇的稳定性，改变气体分子的释放行为。
金属有机框架（Metal organic framework，MOF）是一种由金属离子与非食品级有机配体配位而成的多孔结晶材料，由于合成组分（金属离子和有机配体）具备一定的毒性，在食品工业应用中受到极大的限制[9]。而使用生物相容性金属离子和有机配体连接物生产的绿色无毒的环糊精基金属有机框架（Cyclodextrin-based metal-organic framework，CD-MOF）的出现突破了这一限制[10]，已成为当前食品领域的研究热点。最典型的CD-MOF材料于2010年被首次报道，随着γ-CD-MOF合成技术的不断完善[11]，基于其他碱金属离子（如Na+，Rb+，Cs+）以及α-CD，β-CD的MOF材料也相继得到了发展[12]，已经在负载各种生物活性分子及控释方面展现出巨大的潜力[13−15]。
目前，对于4-萜烯醇的研究大多集中于生物制剂和生物杀虫剂的制备方面，关于其包封的内容相对较少，且已有研究的包封效果存在复合物稳定性差、负载水平低、包封条件苛刻等局限性。β-CD-MOF结合了β-CD和MOF材料的优点，其三维网状、高孔隙率和大比表面积的结构具备强包合能力和高负载能力，且不产生有毒试剂残留，有望成为高效附载4-萜烯醇的新载体[16]。本研究将4-萜烯醇封装在 β -CD-MOF中以实现有效保存，旨在为绿色安全的新型冷链抑菌材料的开发提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，ATCC 19115） 均购自北京保藏生物科技有限公司，试管斜面4 ℃保存；牛肉膏蛋白胨（BPM）液体培养基：称取5.0 g胰蛋白胨，3.0 g牛肉浸取物，5.0 g氯化钠，1000 mL蒸馏水，滴加5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH为7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却后保存备用；牛肉膏蛋白胨（BPM）固体培养基：与上述配制过程相同，灭菌前加入15.0 g琼脂，高压蒸汽灭菌后，趁热倒平板，冷却凝固后于4 ℃条件保存备用；β-环糊精（分析纯）、4-萜烯醇（纯度98%）、十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）（分析纯） 均购自上海麦克林生化科技有限公司。
SN-HD-850超净工作台 北京玖蓝科技有限公司；ZY-75MA立式高压蒸汽灭菌锅 上海力辰科技有限公司；SU-8020扫描电子显微镜 日本日立公司；IS-10傅里叶红外光谱仪 美国尼高力公司；D8 X射线衍射分析仪 深圳科时达电子科技有限公司；STA-449-F3热重-差热分析仪 上海斯迈欧分析仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 β-CD-MOF的制备
制备过程参考刘娟[17]报道的实验方法，并做出适当的修改。
结晶过程：称取2.8352 g β-环糊精和1.1236 g氢氧化钾（物质的量比为1:8），溶于60 mL去离子水和20 mL乙醇中，混合，超声处理30 min，溶解均匀。通过0.45 μm的聚四氟乙烯膜抽滤溶液以除去尺寸较大的颗粒。将抽滤后的溶液移入含有200 mL甲醇的烧杯中，用保鲜膜包装密封，置于40 ℃恒温水浴中反应6 h。然后，向混合溶液中依次加入800 mg CTAB和100 mL甲醇溶液，室温下过夜结晶。在7000×g、20 ℃条件下离心10 min，收集沉淀。用异丙醇溶液洗涤除去沉淀中过量的CTAB晶体，经4 ℃低温干燥后得到纳米尺寸的β-CD-MOF[18]。
活化过程：为了除去β-CD-MOF晶体孔道内残留的高沸点溶剂（主要是氢氧化钾溶液）及水分，用二氯甲烷溶液浸泡晶体，置于摇床上振荡3 d，每隔24 h更换一次溶液。在7000×g、20 ℃条件下离心10 min收集晶体，45 ℃下真空干燥12 h，干燥后的样品研磨备用。
1.2.2 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物的制备
包封过程参考KANG等[10]报道的实验方法，设置4-萜烯醇与β-CD-MOF的质量比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3，探究二者的最佳质量比。将4-萜烯醇加入无水乙醇中，完全溶解，将200 mg β-CD-MOF分散于100 mg/mL对应体积的4-萜烯醇乙醇溶液中，在50 ℃下以300 r/min速度水浴振荡3 h。在4 ℃下冷却24 h后离心，去除上清液后用无水乙醇洗涤以去除未结合的4-萜烯醇，然后过滤并在60 ℃下真空干燥4 h，得到4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物。
1.2.3 4-萜烯醇/β-CD包合物的制备
为在同等条件下比较β-CD-MOF与β-CD的载药量和包封率，4-萜烯醇/β-CD包合物的制备过程参考上述1.2.2，设置4-萜烯醇与β-CD的质量比为1:1，用100 mg/mL 4-萜烯醇乙醇溶液完全溶解200 mg β-CD，在50 ℃下以300 r/min速度水浴振荡3 h。在4 ℃下冷却24 h后离心，去除上清液后用无水乙醇洗涤以去除未结合的4-萜烯醇，然后过滤并在60 ℃下真空干燥4 h，得到4-萜烯醇/β-CD包合物。
1.2.4 4-萜烯醇包封率的测定
测定方法参考YANG等[19]的文献报道，在25 ℃下，以无水乙醇为参比，测定了不同浓度的4-萜烯醇（5、9、13、17、21、25 mmol/L）在233 nm处的吸光度，绘制了标准曲线y=0.0381x+0.0035，R2=0.9995。将100 mg干燥后的包合物加入到10 mL无水乙醇中。将混合溶液超声处理30 min，使4-萜烯醇完全从包合物中提取出来。通过离心分离进一步去除不溶物。最后，测定上清液溶液的吸光度，利用标准曲线计算相应浓度。每个样品重复3次，分别按公式（1）、公式（2）计算复合物的载药量和包封率。
(1) (2) 1.2.5 表征方法
1.2.5.1 扫描电镜分析
采用扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）对制备的β-CD-MOF和天然β-CD的晶体形貌进行测定。在样品台上用导电双面胶固定晶体样品，取一片晶体样品平铺使其形成较薄的一层，真空喷金处理后，将样品放置于扫描电镜中，在合适的放大倍数下拍摄相片。
1.2.5.2 傅里叶红外光谱分析
采用傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）对制备的4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物、4-萜烯醇/β-CD包合物以及相应的壁材β-CD-MOF、β-CD进行红外光谱分析。采用溴化钾压片法，将2 mg样品与溴化钾（约200 mg）一起研磨成细粉进行压片处理，以纯溴化钾为背景，在4000~400 cm−1扫描范围内进行红外光谱扫描，分辨率为4 cm−1，累计扫描64次。
1.2.5.3 X射线衍射分析
对制备的4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物、4-萜烯醇/β-CD包合物以及相应的壁材β-CD-MOF、β-CD进行广角X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）对比测定，实验选取的衍射条件为：铜靶，CuKα辐射，管电流40 mA，管电压40 kV，衍射角度范围2θ=5°~50°，步长为0.02°，扫描速度5°/min。
1.2.5.4 热重分析
对4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物、4-萜烯醇/β-CD包合物、β-CD-MOF、β-CD以及游离态的4-萜烯醇的热稳定性进行热重分析（Thermogravimetric analysis，TGA），分析得到的热重曲线和微商热重曲线。实验参数设置为：氮气/空气流动环境，温度上升速率为10 ℃/min，温度上升范围为30~600 ℃。
1.2.6 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物的抑菌活性
抑菌试验参考潘晓丹[20]报道的研究方法，采用牛津杯法测量包合物的抑菌环直径，确定4-萜烯醇包合物48 h内对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的抑菌活性。将适量菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃条件下摇床200 r/min活化培育24 h，用紫外分光光度计测定菌悬液在600 nm处的吸光值（OD600），控制OD600值小于1。吸取100 μL菌液与等量无菌生理盐水，加入到100 mL牛肉膏蛋白胨固体培养基中，涂布均匀制成平板。在制好的平板表面垂直放入牛津杯（φ=8 mm），取15 mg 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物，用100 μL无菌生理盐水溶解，超声30 min分散后，分别加至牛津杯孔内，使用等量的β-CD-MOF作为对照组，等量无菌生理盐水作为空白组。放入37 ℃恒温培养箱内培育48 h，每隔12 h使用直尺测量各组样品抑菌环直径（mm）。
1.3 数据处理
本研究各项实验均重复3次。数据分析使用SPSS 26.0软件，设置显著性水平为P<0.05，最终结果以平均值±标准差的形式表示，各图谱用Origin 9.1进行绘制。
2. 结果与分析
2.1 4-萜烯醇与β-CD-MOF质量比对4-萜烯醇载药量和包封率的影响
测定不同质量比样品液的吸光度，利用标准曲线计算4-萜烯醇浓度、载药量和包封率。由图1可得，随着4-萜烯醇与β-CD-MOF质量比的变化，样品的载药量和包封率呈先升高后降低的趋势，在质量比1:1时，达到较高水平。当质量比小于1:1时，随着β-CD-MOF浓度的升高，更多的4-萜烯醇分子被活化，分子间的有效碰撞增多。当质量比大于1:1时，过量的4-萜烯醇分子使β-CD-MOF的捕获能力处于极限，无法得到充分活化，因此负载水平较低[21−23]。当4-萜烯醇与β-CD-MOF的质量比为1:1时，包合物的载药量和包封率可达21.15%和26.58%，远高于其他质量比，且比同等条件下的4-萜烯醇/β-CD的载药量（20.38%）和包封率（23.19%）分别高出0.77%和3.39%。
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图 1 4-萜烯醇与β-CD-MOF的质量比对4-萜烯醇载药量和包封率的影响注：在P<0.05水平下，a，b，c和A，B，C表示样本间有显著差异。Figure 1. Effect of mass ratio of terpinen-4-ol to β-CD-MOF on the drug capacity and encapsulation rate of terpinen-4-ol与HU等[9]采用β-CD-MOF包封薄荷醇的结果相比，本实验4-萜烯醇的载药量和包封率均偏低，由此推断，相较于薄荷醇分子，β-CD-MOF对4-萜烯醇分子的捕获能力偏弱，该作用力的大小取决于芯壁材之间空腔结构和内表面积结构的匹配程度。与YANG等[19]采用β-CD和YU等[24]采用γ-CD-MOF封装4-萜烯醇的结果相比，本实验所得载药量偏高，而包封率偏低。从载体制备和包封过程两方面分析：首先，在β-CD-MOF制备过程中，反应时间、温度、β-CD添加量、β-CD与KOH的摩尔比、溶剂种类、表面活性剂CTAB的浓度等条件的选择会影响晶体的形态与尺寸，进而影响了4-萜烯醇的载药量和包封率。其次，在4-萜烯醇包封过程中，添加的初始4-萜烯醇浓度过高，导致β-CD-MOF无法充分包封，以致于出现高载药量低包封率的现象。综上，尽管本实验的包封率有待通过优化试验条件来提高，但包合物载药量的增加表明β-CD-MOF与4-萜烯醇间的分子特性是相匹配的。
2.2 4-萜烯醇包合物的表征
2.2.1 晶体形貌分析
采用扫描电镜测定天然β-CD与β-CD-MOF的晶体形貌特征，如图2所示。
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图 2 β-CD（a，b，c）和β-CD-MOF（d，e，f）的SEM图像注：a、d（20 μm）；b、e（10 μm）；c、f（5 μm）。Figure 2. SEM images of β-CD (a,b,c) and β-CD-MOF (d,e,f)天然β-CD的颗粒形状和大小均不规则，排列松散不整齐，破碎较多。与之相比，β-CD-MOF的颗粒更小且大小均一，形貌结构也相对整齐规则，晶体排列有序，呈现出长方体形状。此现象与β-CD-MOF的合成机理有关，当β-CD分子处于碱性溶液体系时，在静电作用下，-OH基团中的质子H+丢失，暴露出-O−，此时邻C上的O与之结合形成一个-OCCO−基团，该基团能与K+配位，因此β-CD分子在K+的桥连作用下能够相互堆叠，不断延展，从而形成排列整齐规则，疏松多孔的β-CD-MOF。根据WANG等[25]和BLIGHT等[26]的研究报道，β-CD-MOF的平面晶体结构呈现整齐透明的矩形，立体结构为无色的长方体晶体，形成单斜P21空间群，β-CD单元排列形成平行的一维纳米管，CD环面的主次面再以头对头/尾对尾的排列方式组装，每个界面通过几个互补的氢键稳定，本实验的SEM图像形貌特征与报道一致。
2.2.2 傅里叶红外光谱分析
红外光谱常被用来鉴定复合物是否形成，通过对比复合物、主体及客体的红外光谱图的异同，分析特征吸收峰位置和强度的变化从而推测主客体间是否复合成功。对β-CD、β-CD-MOF、4-萜烯醇/β-CD包合物、4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物的红外光谱进行了分析。结果表明，β-CD和β-CD-MOF的FTIR谱均存在以下吸收带：3420 cm−1（-OH拉伸振动）；2950 cm−1（-CH2）；1670 cm−1（-OH弯曲）；1030 cm−1（C-O-C），与已有研究结果相符[27]。
由已有研究结论可知，4-萜烯醇的傅里叶变换红外光谱的特征峰为：3430 cm−1（-OH）；2960，2820 cm−1（-CH2）；1430 cm−1（-C-OH）[19]。图3中显示了两种4-萜烯醇包合物的红外光谱，与母体材料相似，在3700~3000 cm−1处均出现一个较宽的吸收峰，该特征峰是由-OH基团伸缩振动产生的[28]。相关研究报道，-OH基团波段向波数更小的方向移动越多，表明分子间的氢键相互作用力越强[29]。与β-CD-MOF和β-CD相比，4-萜烯醇包合物分子结构上-OH基团拉伸振动向波数较小的方向略有偏移，从3420 cm−1偏移至3400 cm−1，这一结果表明4-萜烯醇与母体材料之间存在氢键相互作用。同时，两种包合物在1415 cm−1处均出现相较于母体材料更明显的吸收峰，该峰临近4-萜烯醇1430 cm−1处的吸收带，这表明4-萜烯醇成功封装在包合物中，与游离的4-萜烯醇相比，包合物中1430 cm−1的特征带移到了1415 cm−1，与YANG等[30]研究结果符合，表明β-CD-MOF和β-CD与4-萜烯醇之间存在相互作用。
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图 3 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物、4-萜烯醇/β-CD包合物、β-CD-MOF和 β-CD的红外光谱图Figure 3. Infrared spectrogram of terpinen-4-ol/β-CD-MOF, terpinen-4-ol/β-CD, β-CD-MOF and β-CD综上所述，4-萜烯醇与β-CD-MOF成功复合，形成了新物质。相较于母体材料的红外光谱，两种包合物的图谱中均未出现新的特征峰，表明包封过程中无新化学键引入，主客体分子原有的化学结构并未发生改变，即包合物的形成对4-萜烯醇原有的理化功能特性没有影响，与HU等[9]封装薄荷醇的红外光谱结论一致。
2.2.3 X射线衍射图谱分析
X射线衍射分析是利用晶体形成的X射线衍射，对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法。结果如图4所示，β-CD-MOF与天然β-CD的XRD图谱存在明显差异，与β-CD相比，β-CD-MOF的许多衍射峰发生了轻微移动，有的峰消失，有的峰被其他更清晰的特征峰取代，在2θ=5°~50°扫描范围内，β-CD-MOF在6.4°、9.2°、12.5°、18.7°和19.2°出现晶体的特征衍射峰[31]。该结果表明，β-CD分子与K+相互作用形成了更有序的晶体结构，这与SEM的结果一致。
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图 4 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物、4-萜烯醇/β-CD包合物、β-CD-MOF和 β-CD的X射线衍射图谱Figure 4. X-ray diffraction patterns of terpinen-4-ol/β-CD-MOF, terpinen-4-ol/β-CD, β-CD-MOF and β-CDX射线衍射是检测粉末或微晶状态下包合物晶体结构的方法，若形成了真正的包合物，那么其衍射图谱应该与母体材料存在明显不同[31]。采用XRD对4-萜烯醇/β-CD-MOF和4-萜烯醇/β-CD两种包合物的结晶结构进行分析，结果如图4所示。与母体材料相比，包合物的特征峰出现变弱或消失的情况。相比之下，β-CD在21.0°、21.3°处的峰转移到了4-萜烯醇/β-CD包合物中对应的角度较低的19.2°、19.4°处；β-CD-MOF中9.2°处的峰在4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物中消失，且两种包合物的峰值强度相对于母体材料均有所下降，XRD结果表明，壁材分子与4-萜烯醇分子之间形成了新的复合物，与YANG等[19]制备4-萜烯醇/β-CD包合物的实验结果相符。
2.2.4 热重分析
热稳定性是衡量β-CD-MOF材料是否具有开发价值的重要指标，热重分析是指在程序控制温度下测量样品的质量与温度变化关系的一种热分析技术，用来研究材料的热稳定性和组分，微商热重曲线（Derivative thermogravimetric curve，DTG）是对由热重法得到的TGA曲线进行微商处理得到的曲线。本研究以天然β-CD作为对照，对合成的β-CD-MOF进行了热重分析。如图5所示，β-CD仅在280~380 ℃温度范围内出现一个失重峰，而β-CD-MOF在50~100 ℃和280~380 ℃出现两个失重过程，HU等[9]报道了低温失重峰与材料吸附的水和/或甲醇分子的蒸发有关。天然β-CD内几乎无溶剂残留，因此不存在低温失重峰，而β-CD-MOF在制备过程中不可避免地存在溶剂残留；高温失重峰对应材料本身的热分解。在接近600 ℃时，β-CD和β-CD-MOF的残留质量率分别为17.15%和31.22%，且后者的失重峰更平缓，DTG峰值更小，表明β-CD-MOF具备更完整更稳定的晶体结构；然而，β-CD-MOF的热降解温度相对较低，导致其热稳定下降的原因可能是其内部作用力较弱的金属配位键和疏松多孔的晶体结构。
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图 5 β-CD、β-CD-MOF、4-萜烯醇/β-CD包合物、4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物以及游离态4-萜烯醇的TGA曲线（a）和DTG曲线（b）Figure 5. TGA curve (a) and DTG curve (b) of β-CD, β-CD-MOF, terpinen-4-ol/β-CD, terpinen-4-ol/β-CD-MOF and pure terpinen-4-ol为了确定包埋在β-CD-MOF空腔内的4-萜烯醇的热稳定性，对最佳包封比例下制备的4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物进行热重-差热分析，以包封比例相同的4-萜烯醇/β-CD包合物和游离态的4-萜烯醇作为对照。测试结果如图5所示，4-萜烯醇的失重主要集中在50~160 ℃范围内，表明其挥发性强，热稳定性差。与β-CD和β-CD-MOF相比，包合物在50~160 ℃范围内存在明显的失重峰，表明4-萜烯醇成功进入到β-CD-MOF和β-CD的空腔内；与游离态的醇相比，包合物的存在可以延缓4-萜烯醇的蒸发速率，将4-萜烯醇应用的温度范围从30~160 ℃扩大到30~350 ℃。而在两种包合物中，4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物的残留质量率更高，失重峰更平缓，热稳定性更强，该结论与YU等[24]报道一致。以上结果表明，β-CD-MOF在改善化合物的热稳定性领域具有潜在应用价值，将4-萜烯醇封装在β-CD-MOF中可以实现对4-萜烯醇的有效保存。
2.3 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物的抑菌效果
采用牛津杯法测量4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物的抑菌环直径以分析其抑菌效果，结果如表1所示。牛津杯法实验过程中，4-萜烯醇浓度已达到对应微生物的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC），查阅文献[2]可知，三者敏感性存在差异，金黄色葡萄球菌敏感性最高，单增李斯特菌次之，大肠杆菌最低。
表 1 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物的抑菌环直径（mm）Table 1. Bacteria inhibition ring diameter of terpinen-4-ol/β-CD-MOF (mm)组别 E. coli S. aureus L. monocytogenes 12 h 24 h 36 h 48 h 12 h 24 h 36 h 48 h 12 h 24 h 36 h 48 h 无菌生理盐水 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 β-CD-MOF 0.0 0.4 0.7 1.0 0.0 0.4 0.8 1.1 0.0 0.4 0.7 0.9 4-萜烯醇/β-CD-MOF 0.5 1.2 2.7 3.6 1.1 3.2 4.8 6.5 0.8 2.2 3.8 5.2 恒温培养48 h后，与空白组无菌生理盐水相比，对照组β-CD-MOF出现极小的抑菌环，可能是由于制备过程中晶体孔道内残留乙醇的挥发；实验组4-萜烯醇/β-CD-MOF对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的抑菌环直径分别为3.6、6.5、5.2 mm，表明4-萜烯醇对三种微生物均具有一定的抑菌活性，其中，对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的抑制活性优于大肠杆菌，这可能是由于革兰氏阴性菌细胞壁中存在脂多糖，且金黄色葡萄球菌中脂多糖含量更高，阻碍了生物活性物质到达细胞膜，减缓了微生物的裂解速率[31]，与潘晓丹[20]和YU等[24]报道的抗菌实验结果相符。随着时间的延长，抑菌环直径逐渐增大，表明包合物具有良好的缓释效果和长效抑菌能力。
3. 结论
本研究以β-CD为原料合成能够高效包封4-萜烯醇的金属有机框架材料β-CD-MOF，探究了最佳的包封条件，提高了4-萜烯醇的附载量，证明了包合物的抑菌效果。SEM结果证明了β-CD-MOF的合成机理即β-CD分子在K+的桥连作用下能够相互堆叠，不断延展，从而形成排列整齐规则，疏松多孔的β-CD-MOF。当4-萜烯醇与β-CD-MOF质量比为1:1时，载药量和包封率可达21.15%和26.58%，远高于其他质量比，且比相同制备条件下的4-萜烯醇/β-CD的载药量（20.38%）和包封率（23.19%）分别高出0.77%和3.39%。傅里叶红外光谱和X射线衍射测试表明，4-萜烯醇成功封装在包合物中且与壁材之间存在氢键相互作用；热重分析证明，包合物的存在可以延缓4-萜烯醇的挥发速率，将4-萜烯醇应用的温度范围从30~160 ℃扩大到30~350 ℃。4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌三种常见细菌均具有一定的抑菌活性，且包合物具有长效抑菌能力和良好的缓释效果。
本研究证明了将4-萜烯醇封装在β-CD-MOF中可以实现对醇有效稳定的保存，体现出β-CD-MOF作为挥发性化合物的载体具有巨大的潜力，在抗菌实验的基础上，未来可以将这种绿色安全的新型包合物制备成凝胶或薄膜材料应用冷链生鲜食品的抗菌保鲜中，有待进一步研究。
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图 1 4-萜烯醇与β-CD-MOF的质量比对4-萜烯醇载药量和包封率的影响
注：在P<0.05水平下，a，b，c和A，B，C表示样本间有显著差异。
Figure 1. Effect of mass ratio of terpinen-4-ol to β-CD-MOF on the drug capacity and encapsulation rate of terpinen-4-ol
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图 2 β-CD（a，b，c）和β-CD-MOF（d，e，f）的SEM图像
注：a、d（20 μm）；b、e（10 μm）；c、f（5 μm）。
Figure 2. SEM images of β-CD (a,b,c) and β-CD-MOF (d,e,f)
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图 3 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物、4-萜烯醇/β-CD包合物、β-CD-MOF和 β-CD的红外光谱图
Figure 3. Infrared spectrogram of terpinen-4-ol/β-CD-MOF, terpinen-4-ol/β-CD, β-CD-MOF and β-CD
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图 4 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物、4-萜烯醇/β-CD包合物、β-CD-MOF和 β-CD的X射线衍射图谱
Figure 4. X-ray diffraction patterns of terpinen-4-ol/β-CD-MOF, terpinen-4-ol/β-CD, β-CD-MOF and β-CD
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图 5 β-CD、β-CD-MOF、4-萜烯醇/β-CD包合物、4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物以及游离态4-萜烯醇的TGA曲线（a）和DTG曲线（b）
Figure 5. TGA curve (a) and DTG curve (b) of β-CD, β-CD-MOF, terpinen-4-ol/β-CD, terpinen-4-ol/β-CD-MOF and pure terpinen-4-ol
表 1 4-萜烯醇/β-CD-MOF包合物的抑菌环直径（mm）
Table 1 Bacteria inhibition ring diameter of terpinen-4-ol/β-CD-MOF (mm)
组别 E. coli S. aureus L. monocytogenes 12 h 24 h 36 h 48 h 12 h 24 h 36 h 48 h 12 h 24 h 36 h 48 h 无菌生理盐水 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 β-CD-MOF 0.0 0.4 0.7 1.0 0.0 0.4 0.8 1.1 0.0 0.4 0.7 0.9 4-萜烯醇/β-CD-MOF 0.5 1.2 2.7 3.6 1.1 3.2 4.8 6.5 0.8 2.2 3.8 5.2 
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