Optimization of Preparation Process for Hawthorn Polyphenol Microparticles Based on Response Surface Methodology
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摘要: 本研究依据聚电解质自组装原理将山楂多酚制备为山楂多酚微粒（Hawthorn polyphenol microparticles，HPM）。通过Plackett-Burman联用Box-Behnken设计，以山楂多酚的包封率和载药量为响应值对HPM的制备工艺因素进行研究。采用Plackett-Burman设计筛选对实验结果影响较为显著的因素（制备时间、硫酸浓度和包封材料比例）进行Box-Behnken响应曲面优化试验。利用SEM和TEM观测HPM的形貌，并利用模拟胃肠液研究HPM的胃肠道释放动力学。结果表明：制备时间、硫酸浓度和包封材料比例对HPM的制备具有明显影响，制备时间为3 h，硫酸浓度为0.0254%，壳聚糖与海藻酸钠比例为4:1时HPM的包封率为96.27%±1.37%。对HPM的形貌研究显示，其为不规则的圆形颗粒且分散性良好。HPM在模拟肠环境中的释放速度大于模拟胃环境。其在胃液和肠液中的释放分别属于零级和一级动力学。综上所述，本研究制备出一种包封率、载药量较高且分散性良好的HPM，并且制备的HPM可以降低胃肠道对山楂多酚的降解，为山楂多酚的食品添加提供了新的思路。Abstract: This study synthesized hawthorn polyphenol microparticles (HPM) based on the polyelectrolyte self-assembly technology. Plackett-burman combined with Box-Behnken design was used to study the factors affecting the preparation of HPM in response to the encapsulation efficiency and drug loading of hawthorn polyphenols. The Plackett-Burman design was used to screen for factors that significantly affect the outcomes, such as preparation time, sulfuric acid concentration, and the ratio of encapsulating materials, which were optimized through Box-Behnken response surface methodology. The morphology of HPM was examined using scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM), and their gastrointestinal release kinetics were assessed using simulated gastric and intestinal fluids. The results indicated that the preparation time, sulfuric acid concentration, and the ratio of encapsulating materials significantly effect the fabrication of HPM. An encapsulation efficiency of 96.27%±1.37% was achieved with a preparation time of 3 h, a sulfuric acid concentration of 0.0254%, and a 4:1 ratio of chitosan to sodium alginate. Morphological analysis of HPM revealed irregularly shaped, well-dispersed spherical particles. The release rate of HPM in simulated intestinal fluid was higher than in gastric fluid, with the release kinetics corresponding to zero-order in gastric fluid and first-order in intestinal fluid. In summary, this study successfully produced HPM with a high encapsulation efficiency, substantial drug loading, and good dispersion. The HPM formulated could reduce the degradation of hawthorn polyphenols in the gastrointestinal tract, offering a novel approach for incorporating hawthorn polyphenols into food products.
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Keywords:
- hawthorn polyphenols /
- self-assembly /
- chitosan /
- sodium alginate /
- process optimization /
- gastrointestinal release /
- kinetics
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山楂多酚（Hawthorn polyphenols，HP）属于多酚类化合物。最近的研究发现，HP具有多种生理功能[1]，然而HP化学结构不稳定，极易被氧化而失活[2]，因此不易应用于食品加工中。而且HP在肠道中才能被机体吸收[3]，经口服进入肠道的过程中，其生物活性会降低乃至完全失活[4]。这个特点进一步限制了HP在食品领域中的应用。而近几年的研究发现，聚电解质自组装技术使天然多酚形成聚电解质复合物（Polyelectrolyte complex，PEC）可以保护天然多酚免于氧化失活，并且PEC还可以帮助天然多酚通过胃肠道消化，最终在肠道内释放[5]。利用聚电解质自组装将HP组装成PEC，不但可以解决HP化学结构不稳定难以进行食品加工的问题。还可以缓解HP经消化道后活性降低的问题。解决以上问题可以使HP作为一种益生元添加在人们日常食用的诸多食品中。
PEC的形成需要通过溶液中阴离子聚电解质与阳离子聚电解质之间发生静电相互作用[6]。壳聚糖（Chitosan，CS）和海藻酸钠（Sodium alginate，SA）可以形成多糖-多糖PEC体系。CS是一种阳离子多糖，具有独特的生物可降解性和生物相容性，具备巨大的开发潜力[7]。但CS溶解度对pH的依赖性，加之CS对离子的高敏感性可能导致由CS参与形成的PEC吸水失控[8−9]、物理结构不稳定或流变性能不足[10]。CS参与形成PEC的这些缺陷可以导致基于CS形成的PEC相互交联成团无法分散在水溶液中从而限制CS在聚电解质自组装体系中的应用。SA是一种阴离子多糖，与CS不同，可溶于中性和碱性溶液[11]。在水溶液中CS分子中带正电荷的氨基与SA分子中带负电荷的羧酸基之间的静电相互作用形成PEC。但是，二者以溶液的形式直接混合会导致形成的PEC存在分散性低[12]、溶胀能力差[13−14]、封装物释放速度过快[15]的缺点。这些缺点不利于SA和CS组成的自组装体系直接应用于HP的封装。
本研究从聚电解质自组装理论出发，以CS和SA构建包封山楂多酚的PEC体系，解析了CS-HP-SA在水溶液中通过静电相互作用形成PEC的过程中，各个因素对HP包封率和载药量的影响，筛选出主要因素并利用响应面试验对HPM的制备工艺进行了研究和优化，以期为HP在食品工业中的进一步应用奠定理论基础，也为多酚类物质在食品工业中的综合开发利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
山楂多酚 西安傲梦思胜生物科技有限公司；壳聚糖（低分子量）、海藻酸钠 德国Sigma公司；硫酸（95%~98%） 天津科密欧化学试剂有限公司；没食子酸（98%） 卡迈舒生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu试剂（98%） 天津光复精细化工研究所；Na2CO3（99.5%） 天津大茂化学试剂厂；氯化钠（分析纯） 天津市光复科技发展有限公司；胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250） 索莱宝公司；磷酸二氢钾（分析纯） 哈尔滨市新达化工厂。
Infinite M200酶标仪 瑞士Tecan公司；XL30扫描电镜 荷兰Philips公司；Tecnai G2透射电镜 捷克FEI公司；FP16072导电胶带 北京中镜科仪技术有限公司；BZ10022b透射电镜铜网 北京中镜科仪技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 山楂多酚含量的测定
用改进的Folin-Ciocalteu法测定山楂多酚含量[16]。本研究中的山楂多酚为水溶性多酚类化合物。将样品分别与1 mol/L Folin-Ciocalteu试剂以1:1的比例混合。5 min后，将Na2CO3溶液（5%，w/v）加入样品混合物中（Na2CO3溶剂/样品混合物=2:1，V/V）。样品溶液替换为蒸馏水作为空白对照，波长760 nm下，利用酶标仪测量吸光度。以没食子酸（0~70 μg/mL）标准溶液制作标准曲线，回归方程为y=0.00774x+0.00792，其中R2=0.998，n=6，y为没食子酸溶液的吸光度，x为没食子酸质量浓度（μg/mL）。通过没食子酸回归方程和样品溶液稀释倍数计算多酚质量浓度。
1.2.2 One shoot法制备HPM的单因素实验
HPM的制备参考刁岩等[17]的方法并略微改动。向2%的醋酸水溶液中加入硫酸后混匀。将CS、SA和HP分别溶解于加入硫酸的2%醋酸水溶液中，配制成均匀溶液。其后将CS溶液、溶液与SA溶液等比例混合（V:V:V=1:1:1）。三种溶液的加入顺序为HP溶液首先加入CS溶液，混匀后再加入SA溶液。利用磁力搅拌仪搅拌，使体系充分混匀。停止搅拌后4000 r/min离心15 min后取上清液测定多酚含量。按公式（1）与（2）分别计算包封率和载药量。
EE(%)=(PT−PS)/PT×100 (1) LC(%)=(PT−PS)/M×100 (2) 式中，EE为包封率（%）；LC为载药量（%）；PT为加入的HP总量（μg）；PS为上清液中HP含量（μg）；M为HP微粒的质量（μg）。
考察硫酸浓度分别为0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%时对HPM包封率和载药量的影响。其它因素固定为NaCl浓度0.01%，制备时间3 h，搅拌速度100 r/min，CS与SA的比例1:1。
考察NaCl浓度分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%时对HPM包封率和载药量的影响。其它因素固定为硫酸浓度0.03%，制备时间3 h，搅拌速度100 r/min，CS与SA的比例1:1。
考察制备时间分别为1、2、3、4、5、6 h时对HPM包封率和载药量的影响。其它因素固定为硫酸浓度0.03%，NaCl浓度0.01%，搅拌速度100 r/min，CS与SA的比例1:1。
考察搅拌速度分别为0、60、80、100、120、140、160、180 r/min时对HPM包封率和载药量的影响。其它因素固定为硫酸浓度0.03%，NaCl浓度0.01%，制备时间3 h，CS与SA的比例1:1。
考察CS与SA的比例分别为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1时对HPM包封率和载药量的影响。其它因素固定为硫酸浓度0.03%，NaCl浓度0.01%，制备时间3 h，搅拌速度100 r/min。
1.2.3 Plackett-Burman试验设计
通过单因素实验测定的水平范围，应用Design-Expert 12软件，按照Plackett-Burman试验设计原理，以EE和LC作为响应值，将制备时间（A）、搅拌速度（B）、CS/SA（C）、NaCl浓度（D）和硫酸浓度（E）为验证因素，设定5因素2水平的实验设计[18]。共设计了12组实验，如表1所示。
表 1 Plackett-Burman试验设计的因素和水平Table 1. Factors and levels of Plackett-Burman experimental design因素 水平 −1 1 A 制备时间（h） 2 3 B 搅拌速度（r/min） 100 200 C CS/SA（W/W） 3:1 4:1 D NaCl浓度（%） 0.04 0.05 E 硫酸浓度（%） 0.025 0.03 1.2.4 响应面试验设计
通过Plackett-Burman试验设计对单因素显著性的筛选以及所筛选单因素实验测定的水平范围，应用Design-Expert 12软件，按照Box-Behnken试验设计原理，将包封率作为响应值，设定3因素3水平的响应面试验，对HPM的制备工艺进行优化，如表2所示。
表 2 响应面试验因素与水平Table 2. Factors and levels of Box-Behnken design因素 水平 −1 0 1 A制备时间（h） 2 3 4 C CS/SA 3:1 4:1 5:1 E 硫酸浓度（%） 0.02 0.025 0.03 1.2.5 HPM的形貌观察
山楂多酚PEC组装体系中添加与未添加SO42−时，HPM的形貌由普通相机获取。根据响应面试验优化的HPM制备参数，分别利用扫描电镜和透射电镜观察HPM的形貌[19−24]。将HPM制备完成后加入蒸馏水和无水乙醇洗涤2次。4000 r/min离心15 min后分别加入无水乙醇或者环己烷重悬。将乙醇重悬液滴在导电铜片上。待乙醇挥发后经过表面喷金处理，用扫描电子显微镜采集图像。将环己烷重悬液滴到200目碳膜覆盖的铜网上，干燥后由透射电子显微镜采集图像。
1.2.6 HPM的体外缓释实验
山楂多酚体外释放动力学研究参照Li等[25]的方法并略作改动。将HPM浸入人工胃液（Simulated gastric fluid，SGF，2 g/L NaCl、3.2 g/L胃蛋白酶，pH=1.2）或人工肠液（Simulated intestinal fluid，SIF，6 g/L磷酸二氢钾，10 g/L胰蛋白酶，pH=7.4）。置于振荡培养箱（37 ℃，80 r/min）中，SGF中的HPM每1 h将1份样品离心，取沉淀用蒸馏水和乙醇洗净后真空冷冻干燥后称重。HPM置于SGF中4 h后，4000 r/min离心15 min。将沉淀用蒸馏水冲洗三遍后加入SIF中，置入振荡培养箱（37 ℃，80 r/min）中。适当的时间间隔将1份样品4000 r/min离心15 min，取沉淀用蒸馏水和乙醇洗净后真空冷冻干燥后称重。为了描述HPM的释放动力学，使用了零阶、一阶、Higuchi、Hixcon-Crowell和Ritger-Peppas数学模型。
1.3 数据处理
本研究所有数据均采用Origin 9软件进行统计分析。结果用平均值±标准差表示。单因素方差分析用于比较各组之间的差异。P<0.05被认为具有统计学意义。本研究中的数据是通过3次独立实验获得的。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果及分析
由于SO42−对电荷密集型聚电解质组装为复合物的分散性影响较大，所以本文首先研究了SO42−浓度因素对HPM包封率和载药量的影响（图1A）。由于壳聚糖需要在pH3~6之间才能展现出良好的胶体性质[26−28]，所以，以硫酸作为SO42−基团的携带试剂，其在组装体系中的浓度范围为0.005%~0.03%。在此范围内HPM的包封率随着SO42−基团浓度的降低而升高，当SO42−基团浓度为0.005%时有最大包封率为84.14%±1.75%。其载药量随着SO42−基团浓度的降低并没有显著变化。造成此种结果的原因可能为，研究中以硫酸分子作为SO42−基团的载体，这样其在组装体系中是由pH与SO42−基团共同对PEC的形成产生影响。所以导致硫酸浓度下降，HPM包封率越高的现象。
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图 1 硫酸浓度（A）、NaCl浓度（B）、制备时间（C）、搅拌速度（D）和CS/SA（E）对HPM包封率和载药量的影响Figure 1. Effects of H2SO4 concentration (A), NaCl concentration (B), time (C), stiring speed (D), CS/SA (E) on encapsulation efficiency and loading content of HPM为了进一步增加电荷密集型PEC在水溶液中的分散性，本研究在组装体系中加入了NaCl，以NaCl代表溶液的离子强度，研究离子强度因素对HPM包封率和载药量的影响（图1B）。随着组装体系中NaCl浓度上升，HPM包封率和载药量表现出截然不同的趋势。HPM包封率随着NaCl浓度上升而升高，反之载药量随之逐渐降低。这个结果表明NaCl参与到PEC形成的组装过程中。在NaCl为0.02%时，山楂多酚的载药量最大为25.7%±1.06%；当NaCl为0.06%时，山楂多酚的包封率最大为80.90%±0.15%。
PEC形成是一种分子自组装的过程，在一定时间内，PEC会根据溶液中自组装分子的不同而进行自由生长[29]。所以本文对HPM形成的时间及对其封装山楂多酚的效率和形成PEC后的载药量进行了研究（图1C）。随着时间的延长，HPM包封率与载药量均呈现出先增高后降低的趋势。当时间为3 h时，包封率和载药量均出现最大值。此时包封率为77.31%±1.14%；载药量为21.22%±0.39%。
由于溶液中分子碰撞概率会影响PEC在溶液的组装过程[30]。而剪切力场可以改变溶液中分子碰撞的概率。所以本研究以磁力搅拌仪为组装体系提供持续的剪切力，研究HPM组装过程中，搅拌速度对其包封率和载药量的影响，结果如图1D所示。在搅拌速度为0~180 r/min之间，包封率在71.84%±2.62%至73.81%±1.58%之间波动，而载药量在19.18%±0.86%至20.12%±0.60%之间波动，结果之间无显著差异。这些结果表明不同搅拌速度所引起的持续剪切力对组装体系的包封率和载药量无显著影响。
形成PEC的过程需要阴离子聚电解质和阳离子聚电解质于溶液中发生组装[31]。这二者的浓度比例即单位时间内分子之间的互相碰撞几率成为形成PEC结构的关键因素。所以接下来研究了封装材料比例对HPM包封率和载药量的影响（图1E）。随着溶液中壳聚糖浓度比例的升高，HPM包封率和载药量均呈现出先增高后下降的趋势。当壳聚糖与海藻酸钠的比例为4:1时，包封率和载药量均出现最大值，分别为95.15%±0.35%、22.91%±0.82%。
2.2 Plackett-Burman试验设计及结果分析
在各单因素研究的基础之上，通过Plackett-Burman试验设计，以HPM包封率和载药量作为响应值，对制备时间、搅拌速度、CS/SA、NaCl浓度和硫酸浓度为验证因素，建立5因素2水平的实验设计。利用Design-Expert统计分析软件共设计了12组实验。所得结果如表3所示。
表 3 Plackett-Burman试验设计及结果Table 3. Experimental results of Plackett-Burman design实验号 A 制备
时间（h）B 搅拌速度
（r/min）C CS/SA
（W/W）D NaCl
浓度（%）E 硫酸
浓度（%）EE 包封
率（%）LC 载药
量（%）1 1.00 1.00 −1.00 −1.00 −1.00 72.91 24.62 2 −1.00 −1.00 1.00 −1.00 1.00 68.25 26.86 3 1.00 −1.00 1.00 1.00 −1.00 75.27 23.39 4 1.00 −1.00 1.00 1.00 1.00 75.58 23.99 5 1.00 1.00 1.00 −1.00 −1.00 75.16 26.47 6 −1.00 1.00 1.00 1.00 −1.00 67.07 24.57 7 −1.00 1.00 1.00 −1.00 1.00 68.74 26.20 8 −1.00 −1.00 −1.00 1.00 −1.00 65.61 20.64 9 −1.00 1.00 −1.00 1.00 1.00 65.28 20.81 10 1.00 −1.00 −1.00 −1.00 1.00 73.62 22.74 11 1.00 1.00 −1.00 1.00 1.00 73.51 20.96 12 −1.00 −1.00 −1.00 −1.00 −1.00 65.14 23.77 运用Design-Expert软件对设计方案中12组实验数据进行分析拟合，得到以包封率（EE）和载药量（LC）为响应值，以制备时间（A）、搅拌速度（B）、CS/SA（C）、NaCl浓度（D）和硫酸浓度（E）为自变量的拟合方程，方程分别如下：
EE=70.51+3.83A−0.07B+1.17C−0.13D+0.32E
LC=23.75−0.06A+0.19B+1.50C−1.36D−0.16E
对上述EE和LC拟合方程进行分析，二者的显著性结果如表4和表5所示。模型项中无论EE拟合方程还是LC拟合方程，其P值均小于0.01，F值较高（268.5与28.34）说明二者的模型项显著。无论EE拟合方程的决定系数（R2=0.9956）还是LC拟合方程决定系数（R2=0.9594）均接近1，说明由二者所建立模型的实际值与预测值拟合性较高[18]。二者的校正系数（R2Adj=0.9919与R2Adj=0.9255）较大，即表明EE拟合模型可以解释99.19% HPM包封率的变化，拟合LC模型可以解释92.55% HPM载药量的变化。这个结果也说明EE和LC拟合模型可以预测大多数变异，进一步说明了以EE和LC所建立的回归方程拟合度较好[32]；EE拟合方程变异系数（0.5383%）和LC拟合方程变异系数（2.49%）的值均较低。这个结果表明由Plackett-Burman设计生成的12组实验可靠性较高[32]。可以用此模型对实验数据进行分析和预测。
表 4 包封率回归模型方差分析Table 4. Analysis of variance (ANOVA) of regression model in encapsulation efficiencies来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 193.75 5 38.75 268.5 <0.0001 A 制备时间 175.95 1 175.95 1221.18 <0.0001 B 搅拌速度 0.0531 1 0.0531 0.3683 0.5662 C CS/SA 16.36 1 16.36 113.53 <0.0001 D NaCl浓度 0.1888 1 0.1888 1.31 0.2960 E 硫酸浓度 1.21 1 1.21 8.39 0.0275 残差 0.8645 6 0.1441 总离差 194.62 11 R2=0.9956 R2Adj=0.9919 (C.V. %=0.5383) 表 5 载药量回归模型的方差分析结果Table 5. Analysis of variance (ANOVA) of regression model in loading content来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 49.72 5 9.94 28.34 0.0004 A 制备时间 0.0392 1 0.0392 0.1117 0.7496 B 搅拌速度 0.4268 1 0.4268 1.22 0.3124 C CS/SA 26.83 1 26.83 76.46 0.0001 D NaCl浓度 22.12 1 22.12 63.04 0.0002 E 硫酸浓度 0.3058 1 0.3058 0.8715 0.3866 残差 2.11 6 0.3509 总离差 51.83 11 R2=0.9594 R2Adj=0.9255 (C.V. %=2.49) 由表4与表5可以看出，HPM形成过程中的五个考察因素，EE的显著性大小排序依次为：制备时间=CS/SA<硫酸浓度<NaCl浓度<搅拌速度。其中制备时间、CS/SA与硫酸浓度对HPM的包封率具有显著影响。LC的显著性大小排序依次为：CS/SA<NaCl浓度<搅拌速度<硫酸浓度<制备时间。其中CS/SA与NaCl浓度对HPM的载药量具有显著影响。
2.3 响应面试验设计及结果分析
由于在Plackett-Burman设计的试验中发现对HPM包封率具有显著影响的因素为制备时间、CS/SA与硫酸浓度。所以为了优化HPM的制备工艺，利用Box-Behnken试验设计，以制备时间（A）、CS/SA（C）与硫酸浓度（E）作为自变量，以HPM包封率（EE）作为响应值，建立三因素三水平的实验设计。通过Design-Expert软件共设计了17组实验。依照实验设计所列出的序号依次进行实验，所得结果如表6所示。
表 6 响应面试验设计与结果Table 6. Experimental design and results for response surface analysis实验号 A 制备时间（h） C CS/SA（W/W） E 硫酸浓度（%） 包封率（%） 1 1 0 1 88.70 2 −1 1 0 83.48 3 −1 −1 0 84.90 4 0 0 0 93.28 5 0 1 1 91.01 6 0 1 −1 83.64 7 0 0 0 97.75 8 −1 0 −1 86.05 9 1 1 0 89.19 10 1 0 −1 90.00 11 0 0 0 95.20 12 0 −1 −1 91.16 13 1 −1 0 89.14 14 0 0 0 93.68 15 0 −1 1 81.82 16 0 0 0 97.12 17 −1 0 1 84.85 运用Design-Expert软件对Box-Behnken设计方案中17组实验数据进行多元回归拟合，得到以包封率（EE）为响应值，A、B、C为自变量的二次多项回归方程，回归方程如下：
EE=95.41+2.22A+0.04C−0.56E+0.37AC−0.03AE+4.18CE−4.12A2−4.61B2−3.89C2
此回归方程的分析及结果如表7所示。以EE为响应值建立的二次多项回归方程模型项显著，拟合方程失拟项不显著，该模型建模成功[18]。方差分析显示该模型的决定系数（R2=0.9534）接近1，拟合性较高[33]。校正系数（R2Adj=0.8936）较大，说明该模型可以解释89.36%的HPM包封率的变化[34]。变异系数较低（1.78%），表明实验数据可靠。交互因素AC和AE的P值大于0.05，不显著，而交互因素CE的P值小于0.01，显示出C因素与E因素之间具有显著的交互作用。这说明EE与各实验因子之间存在非直接线性关系[35]。交互因素AC和AE不显著，而交互因素CE显著，表明CS/SA与硫酸浓度的交互作用显著。这进一步证明了硫酸对整个HPM组装过程中pH和SO42−基团的双重影响。
表 7 回归模型方差分析Table 7. Analysis of variance (ANOVA) of regression model来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 363.07 9 40.34 15.93 0.0007 A-制备时间（h） 39.37 1 39.37 15.55 0.0056 C-CS/SA（W/W） 0.0115 1 0.0115 0.0045 0.9482 E-硫酸浓度（%） 2.5 1 2.50 0.9884 0.3533 AC 0.5363 1 0.5363 0.2118 0.6593 AE 0.0026 1 0.0026 0.001 0.9756 CE 69.87 1 69.87 27.59 0.0012 A2 71.37 1 71.37 28.18 0.0011 B2 89.47 1 89.47 35.33 0.0006 C2 63.71 1 63.71 25.16 0.0015 残差 17.73 7 2.53 失拟项 1.76 3 0.5874 0.1472 0.9263 纯误差 15.96 4 3.99 矫正总值 380.79 16 R2=0.9534 R2Adj=0.8936 (C.V. %=1.78) 以EE为响应值所建立的二次多项回归方程模型生成的响应曲面如图2所示。3D响应面可以反应该模型中三个变量（制备时间、CS/SA与硫酸浓度）的实验水平与响应值的关系以及三个因素之间的交互作用[18]。也可以直观地反映回归方程中各个因素及其交互作用对HPM包封率的影响。其中变量之间交互作用的强弱可以由3D响应面和对应的等高线的形状来反映：首先，相互作用较弱的两个因素，其等高线呈圆形，而相互作用较强的两个因素等高线呈椭圆形；其次，在3D响应面的象限中模型因素对响应值的影响可由曲线的变化表明。因素对响应值影响较小则曲线较为平滑，反之则曲线陡峭[36]。
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图 2 各因素交互作用对HPM包封率的响应面注：A：制备时间与CS/SA交互作用；B：硫酸浓度和制备时间交互作用；C：CS/SA和硫酸浓度交互作用。Figure 2. Response surface showing the interactive effects of factors on encapsulation efficiency of HPM图2A、图2B分别显示了硫酸浓度和CS/SA位于中心水平时，制备时间和CS/SA交互作用以及硫酸浓度和制备时间对HPM包封率的影响。发现制备时间和CS/SA以及硫酸浓度和制备时间均对HPM包封率的交互作用较弱。响应曲面呈现缓坡面。
图2C显示了由HPM的制备时间位于中心水平时，HPM组装的CS/SA和HPM体系中硫酸浓度交互作用对HPM包封率的影响。CS/SA和硫酸浓度对山楂多酚包封率的交互作用较强，响应曲面呈现陡坡面。
2.4 最优工艺条件的预测及验证
对以EE为响应值所建立的二次多项回归方程求解可得HPM包封率达到最大值时的制备条件（表8）。制备时间为3.06 h、CS/SA为4.001:1以及硫酸浓度为0.02537273%时HPM包封率为最大值（97.75%）。
表 8 最佳工艺条件下的预测值与实际值Table 8. Predicted and actual values under optimal process conditions指标 时间（h） CS/SA（W/W） 硫酸浓度（%） 包封率（%） 预测值 3.06 4.001:1 0.02537273 97.75 实际值 3 4:1 0.0254 96.27±1.37 为了验证以EE为响应值所建立的二次多项回归方程的准确性，将最优的预测实验条件进行修正后对该模型进行实际验证。修正后的实验条件为HPM的制备时间为3 h、CS/SA为4:1及硫酸浓度为0.0254%。经过实验所得出的HPM包封率为96.27%±1.37%，与预测HPM包封率（97.75%）相对比偏差较小，证明本研究中以EE为响应值所建立的二次多项回归方程可以优化HPM的制备工艺，并且具有指导意义。
2.5 优化后HPM的形貌及其体外释放动力学
图3所示的是HPM形成的组装体系中SO42−对HPM形貌的影响。当组装体系中无SO42−时，HPM团聚严重，在水溶液中分散不良（图3A）。当体系中存在SO42−时，HPM在水溶液中分散良好。HPM在电镜下的形貌如图4所示，HPM为不规则的圆形颗粒。颗粒之间边界较为明显，并无黏连现象。无论在SGF中还是SIF中，HPM的多酚释放量均随着时间的延长逐渐升高。
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图 3 SO42−对HPM形貌的影响注：A：组装体系中无SO42−；B：组装体系中添加SO42−。Figure 3. Effects of SO42− on morphology of HPM![]()
图 4 扫描电镜和透射电镜下HPM的形貌注：A、B：扫描电镜下HPM的形貌；C：透射电镜下HPM的形貌。Figure 4. SEM and TEM picture of HPM由于天然多酚的吸收部位在肠道[37]。所以本文分别研究了在SGF与SIF中HPM的释放特性（图5）。山楂多酚在模拟胃环境中释放率较低，孵育6 h后，释放率为22.65%±2.78%。其在SIF下前6 h山楂多酚的释放与胃液中的趋势相同但是释放率明显升高，6 h后，释放率为36.72%±5.10%。随后，HPM随着时间的延长，释放率缓慢上升，直到33 h时，释放率为75.84%±2.04%。这些数据证明HPM是一种缓释型载体。
将HPM在不同溶出介质中的溶出情况进行数学模型构建，结果如表9所示。从结果中可得出，通过比较不同方程的决定系数（R2）值，HPM在SGF的溶出模型符合零级方程而SIF的溶出模型符合一级方程。
表 9 HPM释放动力学模型Table 9. Release kinetic models of hawthorn polyphenols microparticles配方 动力学模型 公式 斜率 R2 人工胃液（SGF） Zero-order Mt/Mi=0.0201t+0.1032 0.0201 0.9963 First-order ln（1−Mt/Mi）=−0.0243t–0.1061 −0.0243 0.9941 Higuchi Mt/Mi=0.069t1/2+0.0489 0.069 0.9717 Hixcon-Crowell （1−Mt/Mi）1/3=−0.0076t+0.9649 −0.0076 0.9949 Ritger-Peppas ln（Mt/Mi）=0.3257Ln t–2.1292 0.3257 0.9591 人工肠液（SIF） Zero-order Mt/Mi=0.0174t+0.2516 0.017 0.945 First-order ln（1−Mt/Mi）=−0.038t–0.2336 −0.038 0.982 Higuchi Mt/Mi=0.1224t1/2–0.0791 0.1224 0.9775 Hixcon-Crowell （1–Mt/Mi）1/3=−0.0097t+0.9175 −0.0097 0.973 Ritger-Peppas ln（Mt/Mi）=0.3869Ln t–1.6367 0.3869 0.9506 3. 结论
本研究利用聚电解质自组装原理将山楂多酚制备为HPM。单因素实验的基础上，利用Plackett-Burman试验设计分析了HPM制备过程中各因素的显著性。并且利用响应面试验对HPM的制备工艺进行优化。建立制备时间、硫酸浓度以及CS/SA对HPM的二次回归方程模型，经实验验证，该数学模型可靠，可以用于HPM包封率的预测。结合单因素实验、Plackett-Burman设计分析制备显著性因素和响应面优化模型确定HPM制备工艺参数为制备时间为3 h、硫酸浓度为0.0254%以及CS/SA为4:1。在此最优条件下，HPM包封率为96.27%±1.37%。优化后的HPM直径为200 nm左右，其在SGF中释放率较低为零阶释放，其在SIF中释放较高为一阶释放。
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图 1 硫酸浓度（A）、NaCl浓度（B）、制备时间（C）、搅拌速度（D）和CS/SA（E）对HPM包封率和载药量的影响
Figure 1. Effects of H2SO4 concentration (A), NaCl concentration (B), time (C), stiring speed (D), CS/SA (E) on encapsulation efficiency and loading content of HPM
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图 2 各因素交互作用对HPM包封率的响应面
注：A：制备时间与CS/SA交互作用；B：硫酸浓度和制备时间交互作用；C：CS/SA和硫酸浓度交互作用。
Figure 2. Response surface showing the interactive effects of factors on encapsulation efficiency of HPM
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图 3 SO42−对HPM形貌的影响
注：A：组装体系中无SO42−；B：组装体系中添加SO42−。
Figure 3. Effects of SO42− on morphology of HPM
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图 4 扫描电镜和透射电镜下HPM的形貌
注：A、B：扫描电镜下HPM的形貌；C：透射电镜下HPM的形貌。
Figure 4. SEM and TEM picture of HPM
表 1 Plackett-Burman试验设计的因素和水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design
因素 水平 −1 1 A 制备时间（h） 2 3 B 搅拌速度（r/min） 100 200 C CS/SA（W/W） 3:1 4:1 D NaCl浓度（%） 0.04 0.05 E 硫酸浓度（%） 0.025 0.03 
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表 2 响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design
因素 水平 −1 0 1 A制备时间（h） 2 3 4 C CS/SA 3:1 4:1 5:1 E 硫酸浓度（%） 0.02 0.025 0.03
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表 3 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 3 Experimental results of Plackett-Burman design
实验号 A 制备
时间（h）B 搅拌速度
（r/min）C CS/SA
（W/W）D NaCl
浓度（%）E 硫酸
浓度（%）EE 包封
率（%）LC 载药
量（%）1 1.00 1.00 −1.00 −1.00 −1.00 72.91 24.62 2 −1.00 −1.00 1.00 −1.00 1.00 68.25 26.86 3 1.00 −1.00 1.00 1.00 −1.00 75.27 23.39 4 1.00 −1.00 1.00 1.00 1.00 75.58 23.99 5 1.00 1.00 1.00 −1.00 −1.00 75.16 26.47 6 −1.00 1.00 1.00 1.00 −1.00 67.07 24.57 7 −1.00 1.00 1.00 −1.00 1.00 68.74 26.20 8 −1.00 −1.00 −1.00 1.00 −1.00 65.61 20.64 9 −1.00 1.00 −1.00 1.00 1.00 65.28 20.81 10 1.00 −1.00 −1.00 −1.00 1.00 73.62 22.74 11 1.00 1.00 −1.00 1.00 1.00 73.51 20.96 12 −1.00 −1.00 −1.00 −1.00 −1.00 65.14 23.77
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表 4 包封率回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of regression model in encapsulation efficiencies
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 193.75 5 38.75 268.5 <0.0001 A 制备时间 175.95 1 175.95 1221.18 <0.0001 B 搅拌速度 0.0531 1 0.0531 0.3683 0.5662 C CS/SA 16.36 1 16.36 113.53 <0.0001 D NaCl浓度 0.1888 1 0.1888 1.31 0.2960 E 硫酸浓度 1.21 1 1.21 8.39 0.0275 残差 0.8645 6 0.1441 总离差 194.62 11 R2=0.9956 R2Adj=0.9919 (C.V. %=0.5383)
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表 5 载药量回归模型的方差分析结果
Table 5 Analysis of variance (ANOVA) of regression model in loading content
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 49.72 5 9.94 28.34 0.0004 A 制备时间 0.0392 1 0.0392 0.1117 0.7496 B 搅拌速度 0.4268 1 0.4268 1.22 0.3124 C CS/SA 26.83 1 26.83 76.46 0.0001 D NaCl浓度 22.12 1 22.12 63.04 0.0002 E 硫酸浓度 0.3058 1 0.3058 0.8715 0.3866 残差 2.11 6 0.3509 总离差 51.83 11 R2=0.9594 R2Adj=0.9255 (C.V. %=2.49)
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表 6 响应面试验设计与结果
Table 6 Experimental design and results for response surface analysis
实验号 A 制备时间（h） C CS/SA（W/W） E 硫酸浓度（%） 包封率（%） 1 1 0 1 88.70 2 −1 1 0 83.48 3 −1 −1 0 84.90 4 0 0 0 93.28 5 0 1 1 91.01 6 0 1 −1 83.64 7 0 0 0 97.75 8 −1 0 −1 86.05 9 1 1 0 89.19 10 1 0 −1 90.00 11 0 0 0 95.20 12 0 −1 −1 91.16 13 1 −1 0 89.14 14 0 0 0 93.68 15 0 −1 1 81.82 16 0 0 0 97.12 17 −1 0 1 84.85
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表 7 回归模型方差分析
Table 7 Analysis of variance (ANOVA) of regression model
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 363.07 9 40.34 15.93 0.0007 A-制备时间（h） 39.37 1 39.37 15.55 0.0056 C-CS/SA（W/W） 0.0115 1 0.0115 0.0045 0.9482 E-硫酸浓度（%） 2.5 1 2.50 0.9884 0.3533 AC 0.5363 1 0.5363 0.2118 0.6593 AE 0.0026 1 0.0026 0.001 0.9756 CE 69.87 1 69.87 27.59 0.0012 A2 71.37 1 71.37 28.18 0.0011 B2 89.47 1 89.47 35.33 0.0006 C2 63.71 1 63.71 25.16 0.0015 残差 17.73 7 2.53 失拟项 1.76 3 0.5874 0.1472 0.9263 纯误差 15.96 4 3.99 矫正总值 380.79 16 R2=0.9534 R2Adj=0.8936 (C.V. %=1.78)
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表 8 最佳工艺条件下的预测值与实际值
Table 8 Predicted and actual values under optimal process conditions
指标 时间（h） CS/SA（W/W） 硫酸浓度（%） 包封率（%） 预测值 3.06 4.001:1 0.02537273 97.75 实际值 3 4:1 0.0254 96.27±1.37
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表 9 HPM释放动力学模型
Table 9 Release kinetic models of hawthorn polyphenols microparticles
配方 动力学模型 公式 斜率 R2 人工胃液（SGF） Zero-order Mt/Mi=0.0201t+0.1032 0.0201 0.9963 First-order ln（1−Mt/Mi）=−0.0243t–0.1061 −0.0243 0.9941 Higuchi Mt/Mi=0.069t1/2+0.0489 0.069 0.9717 Hixcon-Crowell （1−Mt/Mi）1/3=−0.0076t+0.9649 −0.0076 0.9949 Ritger-Peppas ln（Mt/Mi）=0.3257Ln t–2.1292 0.3257 0.9591 人工肠液（SIF） Zero-order Mt/Mi=0.0174t+0.2516 0.017 0.945 First-order ln（1−Mt/Mi）=−0.038t–0.2336 −0.038 0.982 Higuchi Mt/Mi=0.1224t1/2–0.0791 0.1224 0.9775 Hixcon-Crowell （1–Mt/Mi）1/3=−0.0097t+0.9175 −0.0097 0.973 Ritger-Peppas ln（Mt/Mi）=0.3869Ln t–1.6367 0.3869 0.9506
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