Platycodon grandiflorum Polysaccharides with Dellifferent Extraction Processes and Their Effects on Oxaliplatin Distribution in Vivo
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摘要: 目的：探究不同提取工艺桔梗多糖（PGP）的理化性质，不同提取工艺所得的PGP对奥沙利铂（OXA）体内分布的影响。方法：本研究采用了热水提取（HW）、醋酸辅助提取（CA）、氨水辅助提取（KA）、超声辅助提取（UA）制备桔梗多糖，通过红外光谱、紫外光谱、凝胶色谱、高效液相色谱等方法测定多糖的理化性质；建立OXA电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS）体内分析方法，考察OXA单用组、OXA联用PGP-HW组、OXA联用PGP-CA组、OXA联用PGP-KA组、OXA联用PGP-UA组SD大鼠体内奥沙利铂分布的变化；使用Western Blot方法来测定肺组织中Oct-2和Pg-P蛋白的表达水平，考察PGP改变OXA体内分布的机制。结果：四种桔梗多糖在理化性质方面呈现出明显的区别。其中，PGP-KA的得率最高；四种桔梗多糖红外图谱均具备典型的多糖特征吸收峰；在分子量组成上，它们主要由7 kDa和3790 kDa两个分子量构成，但各自的分子量分布比例有所不同。此外，这四种桔梗多糖都含有甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）以及阿拉伯糖（Ara），但比例存在差异；四种多糖粒径主要集中在300 nm左右，且具有良好的溶液稳定性；与OXA单用组比，OXA联用PGP-CA组、OXA联用PGP-KA组分别增加肺组织OXA含量为36.93%和35.12%，且OXA联用PGP-KA组显著（P<0.05）增加Oct-2蛋白表达水平，而P-g-P蛋白表达水平无显著差异。结论：不同的提取工艺获得的PGP的理化性质不同，其中OXA联用PGP-CA组和OXA联用PGP-KA组能显著增加OXA在肺组织分布水平，其机制可能与增加肺组织中Oct-2的表达量有关。Abstract: Objective: To investigate the physicochemical properties of PGP extracted by different processes and the effects of these PGPs on the in vivo distribution of Oxaliplatin (OXA). Methods: In this study, hot water extraction (HW), acetic acid-assisted extraction (CA), ammonia-assisted extraction (KA), and ultrasound-assisted extraction (UA) were used to prepare PGP. The physicochemical properties of the polysaccharides were determined by methods such as infrared spectroscopy, ultraviolet spectroscopy, gel chromatography, and high-performance liquid chromatography. An inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) method was established to analyze the in vivo distribution of OXA in SD rats treated with OXA alone, OXA+PGP-HW, OXA+PGP-CA, OXA+PGP-KA, and OXA+PGP-UA. The expression levels of Oct-2 and Pg-P proteins in lung tissues were measured by Western blot to investigate the mechanism of PGP in modifying the in vivo distribution of OXA. Results: Significant differences existed in the physicochemical properties of the four types of PGPs. Among these four types, PGP-KA had the highest yield. The infrared spectra of all four PGPs exhibited typical absorption peaks characteristic of polysaccharides. The four PGPs consisted primarily of two molecular weights, 7 kDa and 3790 kDa, but the distribution percentages of these molecular weights vary. All four PGPs contained mannose (Man), rhamnose (Rha), galacturonic acid (GalA), glucose (Glu), galactose (Gal), and arabinose (Ara), although their ratios differ. The particle sizes of the four PGPs were mainly concentrated around 300 nm, and all demonstrate good solution stability. Compared with the OXA alone group, the OXA+PGP-CA and OXA+PGP-KA groups increased the lung tissue content of OXA by 36.93% and 35.12%, respectively. The OXA+PGP-KA group also significantly increased the expression level of Oct-2 protein (P<0.05), while there was no significant difference in the expression level of Pg-P protein. Conclusion: The physicochemical properties of PGP extracted by different processes are different. Among them, the combination of PGP-CA and PGP-KA can significantly increase the lung tissue distribution of OXA, which would be related to the increase in Oct-2 expression in lung tissues.
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根据世界卫生组织统计，2020年癌症导致近1000万例病患死亡，其中与肺癌相关达221万例。肺癌发病率和病死率在我国居恶性肿瘤榜首[1]。奥沙利铂（Oxaliplatin，OXA）是第三代铂类化疗药，用于治疗包括肺癌在内的多种癌症，但由于其在体内分布广泛，易引起严重不良反应[2]。而联合疗法能增加药物靶向性，提高病变部位药物浓度从而降低其副作用[3]。
桔梗为桔梗科植物桔梗（Platycodon grandiflorum（jacq）.A.DC）的干燥根，具有宣肺祛痰、利咽排脓、载药上行的功效，是传统的药食两用药材，为肺经引经药[4]。有研究显示，桔梗水提液能增强清热解毒药如黄芩、栀子的抗炎解毒功效，进一步改善急性肺损伤模型大鼠症状[5]；桔梗水提液可提高罗红霉素[6]、左旋氧氟沙星[7]、顺铂[8]在肺组织的分布，说明了桔梗水提液可以提高肺靶向性。临床上，桔梗主要以汤剂形式给药，而桔梗多糖（Platycodon grandiflorum polysaccharides，PGP）是桔梗水提液中主要活性成分[9]，最新研究显示，桔梗多糖能有效促进桔梗皂苷D在肠道中的吸收[10]，并显著影响其在SD大鼠体内的药代动力学参数[11]。提示桔梗多糖可能是桔梗中影响其他药物体内分布的关键活性成分。
提取是中药制药非常重要的一步。不同提取工艺可影响多糖的结构[12]及活性[13]，然而，目前尚不清楚何种工艺提取的桔梗多糖能够显著影响OXA在体内的分布。因此，本文期望采用不同提取工艺获取桔梗多糖，比较它们的理化性质及对OXA体内组织分布的影响，从而优化桔梗多糖提取工艺，以期对桔梗多糖进一步开发奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
桔梗饮片 广州市岭南中药饮片有限公司；OXA注射液 江苏恒瑞医药有限公司；SD大鼠 40只，雄性，4~6周，体重300~400 g，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号：44002100006789，本动物实验通过广东省中医院动物伦理委员会批准，动物实验伦理号：2022128；蛋白定量分析试剂盒 美国Thermo公司、D-葡萄糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸 上海源叶生物科技有限公司；Pt标准品 美国O2Si Smart Solutions公司；Anti-P-Glycoproten 英国Abcan公司；Anti-OCT-2 英国Cohesion Biosciences公司；甲醇、乙腈 色谱级，德国Merck公司；乙醇、醋酸、氨水等化学试剂均为分析纯。
U-2910紫外可见分光光度计 日本日立公司；Spectrum Two傅立叶变换红外光谱仪 美国珀金埃尔默；Agilent1260液相色谱仪配DAD检测器、Agilent 8800 电感耦合等离子体质谱仪 美国安捷伦公司；Nanobrook 90Plus PALS粒径电位测定仪 美国布鲁克海文；CEM微波消解仪 美国杜邦公司；ChemiDoc MP高灵敏度化学发光成像仪 美国伯乐公司。
1.2 实验方法
1.2.1 不同提取工艺PGP制备
分别采用热水提取（HW）、醋酸辅助提取（CA）、氨水辅助提取（KA）、超声辅助提取（UA）四种工艺提取PGP。
桔梗饮片粉碎，过6目筛，70%乙醇加热回流脱脂，干燥得脱脂药材。称取20 g脱脂药材，加500 mL水，加热回流提取2 h，趁热过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液，得PGP-HW；取20 g脱脂药材，加500 mL pH为3醋酸溶液，加热回流提取2 h，趁热过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液，用氨水调pH为7，得PGP-CA。取20 g脱脂药材，加500 mL pH为12氨水溶液，加热回流提取2 h，趁热过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液，用醋酸溶液调pH为7，得PGP-KA。取20 g脱脂药材，加500 mL水，超声功率为200 W，温度为70 ℃，提取0.5 h，趁热过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液，得PGP-UA。减压浓缩至生药量为0.2 g/mL，85%乙醇沉淀，离心，以无水乙醇反复洗涤，超纯水复溶。转移至3000 Da透析袋透析72 h，每4 h更换纯水，冷冻干燥，称重，计算得率并测定蛋白含量。
式中：w（%）表示桔梗多糖得率；m1表示桔梗多糖质量，mg；m2表示脱脂药材质量，mg。
1.2.2 紫外/红外图谱的测定
准确称取5 mg不同提取工艺PGP，加蒸馏水配成1 mg/mL的多糖溶液，以波长范围600~200 nm于紫外可见分光光度计进行扫描[14]。分别取四种不同提取工艺PGP 3 mg，利用傅立叶变换红外光谱仪在400~4000 cm−1范围内进行红外扫描[15]。
1.2.3 分子量分布的测定
采用高效液相凝胶色谱仪测定PGP分子量[16]。分别取3690、2370、1190、680、450、35和4 kDa的葡聚糖标准品3 mg，用超纯水配成1.0 mg/mL的对照品溶液，过0.45 µm水系膜，用Agilent1260高效液相仪配示差检测器测定，以标准品的重均分子量对数lg（Mw）为横坐标，保留时间为纵坐标绘制标准曲线。色谱条件：色谱柱为TSKG-5000PWXL柱，流动相为水，流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，示差折光检测器温度40 ℃，进样量为10 µL。准确称取3 mg样品，按上述同样操作进行测定，记录保留时间并代入标准方程计算各多糖分子量分布。
1.2.4 单糖组成的测定
采用完全酸水解结合PMP柱前衍生化法测定PGP中的单糖组成情况[17]。步骤如下：5 mg样品溶于三氟乙酸，110 ℃水解4 h。除三氟乙酸，纯水复溶，待测。称取各单糖标准品 30.00 mg：阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glu）、鼠李糖（Rha）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖醛酸（GluA），加入蒸馏水充分溶解，定容于1 mL容量瓶，充分摇匀。混合单糖标准液为各单糖标准液混合并依次对半稀释成浓度为3000、1500、750、375、187.5、93.75、46.86、0 µg/mL的标准曲线工作液。加入200 µL 0.3 mol/L NaOH溶液和200 µL 0.6 mol/L PMP溶液，混匀，在70 ℃反应100 min。结束后，加200 µL 0.3 mol/L HCl中和。加入氯仿萃取三次，取水层过0.22 µm水系滤膜，上机检测。
液相色谱条件：安捷伦1260配置紫外检测器，流动相磷酸盐缓冲液（pH=6.9）:乙腈=84:16；Thermo C16（250×4.66 mm，5 µm），流速：1 mL/min，柱温：30 ℃，进样体积：10 µL，检测波长：254 nm。
1.2.5 粒径和电位的测定
称取不同提取工艺PGP，用超纯水溶解配制成5 mg/mL样品溶液，过0.8 µm的水系滤膜，使用粒径电位测定仪测定其平均粒径和电位。
1.2.6 动物分组给药及取样
取SD大鼠33只，然后再随机分为如下6组：正常组、OXA单用组（OXA）及不同提取工艺获得的多糖联用组（OXA+PGP-HW、OXA+PGP-CA、OXA+PGP-KA、OXA+PGP-UA），除正常组3只外，其他每组6只。正常组正常饲养；OXA经腹腔注射给药（6 mg/kg，0.2 mL/只/0.5 d）；PGP灌胃给药（100 mg/kg，0.2 mL/只/0.5 d），OXA单用组灌胃饮用水0.2 mL/只/0.5 d。连续给药3 d，第4 d，最后一次给药后1 h，麻醉SD大鼠，腹主动脉取血，处死大鼠，分离出肝、心、脾、肺、肾组织，用冰的生理盐水洗去浮血，−80 ℃保存。
1.2.7 样品处理
将样品从冰箱取出，组织用真空干燥机冻干。取血浆200 µL，组织样品取30 mg将样品置于消解管中，加入5 mL浓硝酸浸泡1 h，盖上密封盖，放入微波消解仪中消解，消解结束后，除酸，将消解液转移至10 mL容量瓶中，用2%硝酸冲洗消化罐内壁3次以上，合并至10 mL容量瓶中，用2%硝酸定容至刻度，混匀，待分析使用[18]。
1.2.8 ICP-MS准确度、精密度、回收率及稳定性方法学考察
取SD大鼠空白血浆及组织，加入OXA标准溶液，照前述方法处理并分析，依次得到空白血浆与空白脏器色谱图、模拟生物样品色谱图、实际生物样品色谱图。以铂元素制备一系列浓度500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8 ng/mL，2%硝酸为基液。制备低（30.68 ng/mL）、中（122.71 ng/mL）、高（490.82 ng/mL）浓度质控样品，每个质量浓度平行6份，考察准确度、日内日间精密度、方法学回收率、室温12 h及冻融3次稳定性。方法学结果均符合了体内分析的要求。
ICP-MS测定方法：ICP-MS以氩气（纯度为99.99%）作为载气，八极杆RF：160 V，氦气流速：5 mL/min，Q1偏转电压：−4 V，Q1预过滤偏转电压：−38 V，Q1后过滤偏转电压：−38 V，蠕动泵：0.5 rps，提取透镜2：−200 V，Omega偏转电压：−100 V，Omega透镜电压：9.8 V，能量歧视：5 V。
1.2.9 免疫印迹法测定肺脏组织的转运蛋白表达量
取各组动物冻干组织肺脏25 mg，加入750 µL蛋白裂解液，匀浆后裂解，离心收集上清，采用BCA法测定蛋白浓度。将30 µg蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶中电泳，转膜，采用BSA封闭，加入一抗（1:1000），孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗（1:5000）孵育，TBST洗涤，避光加入ECL发光液，高灵敏度化学发光成像仪曝光成像，Image J软件分析各条带灰度值。
1.3 数据处理
采用GraphPad Prism 8分析数据并处理结果，SIMCA 14.1软件用于PGP的理化特征（单糖组成）和OXA肺分布的相关分析。实验结果以“平均值±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析；P<0.05被认为具有统计显著性。
2. 结果与分析
2.1 不同提取工艺对PGP理化性质的影响
2.1.1 多糖得率和蛋白质含量结果
多糖提取得率是评价提取工艺优劣的最直接指标。如表1所示，多糖的得率排序为：PGP-CA<PGP-UA<PGP-HW<PGP-KA。中药中包括两种类型的多糖：可溶性多糖和不溶性多糖[19]。前者可直接提取；后者通常采用高温、延长提取时间、添加辅助剂（如酸或碱）、或者超声波辅助等方法[20]使不溶性多糖降解为可溶性多糖而增加多糖得率。然而，这些方法也可能导致可溶性多糖的降解，在醇沉过程中因溶于乙醇而被去除。这可能是导致PGP-UA和PGP-CA的得率较低的原因之一。此外，与通常使用的强碱（如NaOH）不同[21]，本研究中采用了弱碱（氨）。弱碱作用更温和，降低了对多糖结构的破坏，可能是PGP-KA得率较高的原因之一[22]。
表 1 不同提取工艺PGP得率和蛋白质含量Table 1. Yield and protein content of PGP were obtained by different extraction techniques提取工艺 重量（g） 得率（%） 蛋白含量（%） PGP-HW 5.12±0.17 25.59±0.85 2.70±0.32 PGP-CA 1.81±0.16 9.05±0.80 3.03±0.78 PGP-KA 5.50±0.19 27.52±0.94 3.44±0.20 PGP-UA 2.93±0.12 14.65±0.61 1.27±0.97 为了准确测定多糖中的蛋白质含量，本文对四种提取工艺进行了研究。结果显示，这四种工艺得到的PGP中仅含有微量的蛋白质。这可能是由于蛋白质的疏水性以及蛋白质分子间的二硫键作用，导致植物细胞中的蛋白质几乎不溶于水[23]。在四种工艺中，KA工艺的蛋白质含量最高，达到了3.44%±0.20%。这可能是因为高碱度有助于破坏氢键，从而释放出酚羟基和磺酸基中的氢，使酚基和磺酸基阴离子化。这一过程增加了蛋白质分子表面的电荷，从而提高了其水溶性[24]。
2.1.2 紫外和红外光谱分析
为了研究不同提取工艺对桔梗多糖的含量和官能团的影响，利用多糖的紫外和红外吸收特征进行分析。图1A紫外结果显示，四种提取工艺PGP均在260～280 nm处信号弱，说明蛋白质和核糖含量较少[25]。图1B红外结果所示，四种提取工艺得到的PGP都具有多糖的三个特征吸收，分别是位于3300 cm−1左右的O-H强伸缩振动峰和位于2900 cm−1左右的C-H弱伸缩峰，以及位于1400 cm−1附近的C-H变角振动峰[26]。四种多糖还均在1730 cm−1处有C=O振动峰，说明都含糖醛酸。在820 cm−1处的吸收峰说明PGP为α构型[27]。其它键的伸缩振动基本一致，提示不同工艺对PGP的特征官能团结构和骨架结构无显著影响[28]。
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图 1 不同提取工艺PGP紫外和红外图谱注：A：为不同提取工艺PGP紫外图谱；B：为不同提取工艺PGP红外图谱。Figure 1. Ultraviolet and infrared spectra of PGP in different extraction processes2.1.3 分子量分布测定
为了测定不同提取工艺对桔梗多糖的分子量的影响，利用分子筛原理测定分子量。如图2所示。四种多糖均由2个主要的分子量组成，但分子量分布占比不同。PGP-HW和PGP-CA中以10 min左右出峰的大分子量（3690 kDa）多糖占比较高，分别为58.25%和64.30%；而PGP-KA和PGP-UA则以20 min左右出峰的小分子量（7 kDa）多糖占比较高，分别为53.91%和73.19%，提示氨水辅助和超声辅助提取使PGP降解，导致分子量变小[20]。
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图 2 不同提取工艺的PGP分子量图谱注：A：P-HW分子量图谱；B：PGP-CA分子量图谱；C：PGP-KA分子量图谱；D：PGP-UA分子量图谱。Figure 2. Molecular weight maps of PGP in different extraction processes2.1.4 桔梗多糖的单糖组成分析
为了研究不同提取工艺对桔梗多糖单糖组成的影响，通过与单糖标准品的保留时间比较分析单糖组成。如图3所示，四种提取工艺所获得的PGP均含甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）等单糖成分，不含有葡萄糖醛酸（GluA），但比例不同[29]。其中PGP-HW中，各单糖的含量比例为Man、Rha、Gala、Glu、Gal、Ara=5.33:1.14:5.38:26.76:16.77:44.62。与PGP-HW相比，PGP-CA中Gala相对含量明显降低。PGP-KA的单糖组成为Man、Rha、Gala、Glu、Gal、Ara=3.24:3.09:12.21:13.95:18.45:49.06，PGP-UA主要以Glu为主，其单糖组成为Man、Rha、Gala、Glu、Gal、Ara=3.05:1:14.91:52.53:11.28:17.23。
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图 3 不同提取工艺PGP单糖组成注：1. Man；2. Rha；3. Glua；4. Gala；5. Glu；6. Gal；7. Ara。Figure 3. Composition of PGP monosaccharides in different extraction processes2.1.5 桔梗多糖的粒径和电位
为了测定桔梗多糖溶液的颗粒大小分布及稳定性，通过分析样品颗粒的散射光强随时间的涨落规律测定粒径和电位。如图4所示。在四种不同提取得到的桔梗多糖的粒径和电位均无明显差异。其电位均为负值，可能与桔梗多糖中含有少量Gala有关[12]，与单糖组成结果相符。
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图 4 不同提取工艺PGP粒径和Zeta电位注：A：不同提取工艺PGP粒径分布图；B：不同提取工艺PGP电位图。Figure 4. PGP particle size and Zeta potential of different extraction processes2.2 不同工艺提取工艺桔梗多糖对OXA体内分布的影响
为了测定不同提取工艺桔梗多糖对奥沙利铂体内分布的影响，通过质谱的质量筛选作用检出铂元素，分析图谱进行奥沙利铂定量测定。如表2所示，OXA单用体内分布顺序为肾脏>脾脏>肝>肺>心。然而，当与桔梗多糖联用时，其分布顺序变为肾，OXA含量分别增加了36.93%和35.12%（P<0.05）。而在其他脏器组织中，并未观察到显著变化。这与以往研究中，桔梗水提液可以提高氟苯尼考[30]、替米考星[31]等其他药物在肺内的浓度结果一致。有证据表明，桔梗多糖可以显著影响桔梗皂苷D在SD大鼠体内的药代动力学参数[11]，说明桔梗多糖具有影响其他药物分布的能力，且可能是桔梗引经作用的物质基础之一。
表 2 OXA的组织分布情况Table 2. Tissue distribution of oxaliplatin分组 浓度（µg/mL） 浓度（ng/mg） 血 肝 肾 脾 心 肺 OXA 6.39±1.6 68.23±7.59 293.71±46.68 205.99±22.08 38.21±10.30 66.92±7.62 OXA+PGP-HW 7.76±2.49 68.31±11.00 274.00±56.61 217.46±42.84 38.34±14.78 76.73±8.12 OXA+PGP-CA 7.80±1.05 73.96±10.01 268.04±48.83 214.98±44.90 43.03±6.94 91.63±13.89** OXA+PGP-KA 8.14±2.89 67.36±16.27 326.93±27.97 250.77±70.83 49.90±13.86 90.42±22.04* OXA+PGP-UA 7.38±1.14 59.50±10.49 282.40±61.01 214.42±46.09 33.59±6.58 65.24±9.61 注：ICP-MS检测各组织OXA浓度（x±s，n=6），*表示与OXA组比具有显著差异，P<0.05。 2.3 PGP促进OXA肺分布的转运机制
为了研究联用PGP-CA和PGP-KA对OXA在SD大鼠肺组织中的药物分布影响的转运机制，采用了Western Blot方法来检测肺组织中Oct-2和P-g-P转运蛋白的表达水平。结果如图5所示：与OXA单用组相比，联用PGP-KA组显著增加了肺组织中Oct-2转运蛋白的表达水平。然而，在各组中，P-g-P转运蛋白的表达水平均未显示出显著变化。Oct-2和P-g-P转运蛋白主要参与了OXA体内的摄取和外排[32]。这些结果提示，肺组织中OXA含量的增加可能与Oct-2转运蛋白的表达水平增高相关。然而，PGP-CA也显著增加了OXA的肺内分布，却不影响Oct-2蛋白表达，可能是由于药物组织内浓度受多种因素如药物转运蛋白、血浆蛋白结合率、药物代谢酶等影响[33]，其机制有待进一步探讨。
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图 5 肺组织转运蛋白的表达注：A：肺组织中P-g-P相对表达量；B：肺组织中Oct-2相对表达量；C：肺组织免疫印迹，1-Con、2-OXA、3-OXA+PGP-CA、4-OXA+PGP-KA。Figure 5. Expression of transporters in lung tissue2.4 PGP构效关系的初步分析
对其结构与活性之间关系的分析表明，PGP的特性影响奥沙利铂的体内分布。随着Rha和Ara相对含量的增加，奥沙利铂在肺脏中分布作用增加；而Glu相对含量越高，奥沙利铂在肺脏中分布作用降低。为了探究结构与活性之间的关联，进行了Pearson相关性分析。如表3所示，Rha和Ara与OXA在肺组织中的分布呈正相关，相关系数分别为0.93和0.91。相反，Glu与OXA在肺组织中的分布呈负相关，相关系数为−0.98。Gal、Man和Gala与PGP的肺分布增强作用之间的关联并不明显，相关性较低。这些结果表明，PGP理化性质与OXA在肺组织中的分布可能存在特定的结构-活性关系。
表 3 PGP单糖组成与OXA肺组织分布的相关性分析Table 3. Correlation analysis between PGP monosaccharide composition and OXA lung tissue distribution指标 Man
（mol%）Rha
（mol%）Gala
（mol%）Glu
（mol%）Gal
（mol%）Ara
（mol%）OXA肺
组织分布0.12 0.93 0.39 −0.98 0.18 0.91 3. 结论
本研究比较了四种提取工艺对桔梗多糖的理化特性及OXA体内分布的影响。结果表明，不同工艺得到的桔梗多糖得率、分子量分布、单糖组成对OXA体内分布有显著影响。其中PGP-KA得率最高。四种桔梗多糖红外图谱均显示具有典型多糖特征吸收峰，但峰强度有一定差异。四种桔梗多糖有两个主要的分子量组成，但分子量分布占比不同。四种提取工艺所获得的桔梗多糖单糖成分相同，但比例有差异，其中PGP-UA以葡萄糖为主，另外三种桔梗多糖以阿拉伯糖为主。值得注意的是，PGP-CA和PGP-KA显著提高了OXA在SD大鼠肺组织中的分布。尤其是PGP-KA，其效果可能与Oct-2的表达水平上升有关。多糖的结构与活性之间的关系一直是多糖研究的热点，本研究发现Rha和Ara与OXA在肺组织中的分布呈正相关，而Glu呈负相关。这说明了多糖中的Rha和Ara结构可能促进OXA在肺组织的分布，Glu结构可能对OXA在肺组织的分布具有抑制作用。综上，本研究为桔梗多糖抗肿瘤研究提供了一定的实验参考，也为桔梗多糖的提取工艺优选和应用提供了一定的实验依据。
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图 1 不同提取工艺PGP紫外和红外图谱
注：A：为不同提取工艺PGP紫外图谱；B：为不同提取工艺PGP红外图谱。
Figure 1. Ultraviolet and infrared spectra of PGP in different extraction processes
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图 2 不同提取工艺的PGP分子量图谱
注：A：P-HW分子量图谱；B：PGP-CA分子量图谱；C：PGP-KA分子量图谱；D：PGP-UA分子量图谱。
Figure 2. Molecular weight maps of PGP in different extraction processes
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图 3 不同提取工艺PGP单糖组成
注：1. Man；2. Rha；3. Glua；4. Gala；5. Glu；6. Gal；7. Ara。
Figure 3. Composition of PGP monosaccharides in different extraction processes
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图 4 不同提取工艺PGP粒径和Zeta电位
注：A：不同提取工艺PGP粒径分布图；B：不同提取工艺PGP电位图。
Figure 4. PGP particle size and Zeta potential of different extraction processes
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图 5 肺组织转运蛋白的表达
注：A：肺组织中P-g-P相对表达量；B：肺组织中Oct-2相对表达量；C：肺组织免疫印迹，1-Con、2-OXA、3-OXA+PGP-CA、4-OXA+PGP-KA。
Figure 5. Expression of transporters in lung tissue
表 1 不同提取工艺PGP得率和蛋白质含量
Table 1 Yield and protein content of PGP were obtained by different extraction techniques
提取工艺 重量（g） 得率（%） 蛋白含量（%） PGP-HW 5.12±0.17 25.59±0.85 2.70±0.32 PGP-CA 1.81±0.16 9.05±0.80 3.03±0.78 PGP-KA 5.50±0.19 27.52±0.94 3.44±0.20 PGP-UA 2.93±0.12 14.65±0.61 1.27±0.97 
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表 2 OXA的组织分布情况
Table 2 Tissue distribution of oxaliplatin
分组 浓度（µg/mL） 浓度（ng/mg） 血 肝 肾 脾 心 肺 OXA 6.39±1.6 68.23±7.59 293.71±46.68 205.99±22.08 38.21±10.30 66.92±7.62 OXA+PGP-HW 7.76±2.49 68.31±11.00 274.00±56.61 217.46±42.84 38.34±14.78 76.73±8.12 OXA+PGP-CA 7.80±1.05 73.96±10.01 268.04±48.83 214.98±44.90 43.03±6.94 91.63±13.89** OXA+PGP-KA 8.14±2.89 67.36±16.27 326.93±27.97 250.77±70.83 49.90±13.86 90.42±22.04* OXA+PGP-UA 7.38±1.14 59.50±10.49 282.40±61.01 214.42±46.09 33.59±6.58 65.24±9.61 注：ICP-MS检测各组织OXA浓度（x±s，n=6），*表示与OXA组比具有显著差异，P<0.05。
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表 3 PGP单糖组成与OXA肺组织分布的相关性分析
Table 3 Correlation analysis between PGP monosaccharide composition and OXA lung tissue distribution
指标 Man
（mol%）Rha
（mol%）Gala
（mol%）Glu
（mol%）Gal
（mol%）Ara
（mol%）OXA肺
组织分布0.12 0.93 0.39 −0.98 0.18 0.91
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