Loading [MathJax]/jax/output/SVG/fonts/TeX/Main/Regular/BasicLatin.js
  • EI
  • Scopus
  • 中国科技期刊卓越行动计划项目资助期刊
  • 北大核心期刊
  • DOAJ
  • EBSCO
  • 中国核心学术期刊RCCSE A+
  • 中国精品科技期刊
  • JST China
  • FSTA
  • 中国农林核心期刊
  • 中国科技核心期刊CSTPCD
  • CA
  • WJCI
  • 食品科学与工程领域高质量科技期刊分级目录第一方阵T1
中国精品科技期刊2020

石莼类菌孢素氨基酸的提取工艺及对副溶血弧菌的抑菌机理

胡晓琪, 徐沈晨, 王思宇, 浦孟宣, 胥珍红, 马骁, 孙颖颖

胡晓琪,徐沈晨,王思宇,等. 石莼类菌孢素氨基酸的提取工艺及对副溶血弧菌的抑菌机理[J]. 食品工业科技,2024,45(18):175−183. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023100210.
引用本文: 胡晓琪,徐沈晨,王思宇,等. 石莼类菌孢素氨基酸的提取工艺及对副溶血弧菌的抑菌机理[J]. 食品工业科技,2024,45(18):175−183. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023100210.
HU Xiaoqi, XU Shenchen, WANG Siyu, et al. Research of Extraction Process of Mycosporine-like Amino Acids of Ulva lactuca and Its Mechanism of Anti-bacterial Properties Against Vibrio parahaemolyticus[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(18): 175−183. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023100210.
Citation: HU Xiaoqi, XU Shenchen, WANG Siyu, et al. Research of Extraction Process of Mycosporine-like Amino Acids of Ulva lactuca and Its Mechanism of Anti-bacterial Properties Against Vibrio parahaemolyticus[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(18): 175−183. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2023100210.

石莼类菌孢素氨基酸的提取工艺及对副溶血弧菌的抑菌机理

基金项目: 江苏省自然科学研究面上项目(BK20211353);连云港市科技项目重点研发计划(CG2226);江苏海洋大学大学生创新训练计划项目。
详细信息
    作者简介:

    胡晓琪(1996−),女,硕士研究生,研究方向:食品加工与安全,E-mail:1136783383@qq.com

    通讯作者:

    孙颖颖(1978−),女,博士,教授,研究方向:海洋生物提取与分离工程,E-mail:syy-999@163.com

  • 中图分类号: TS201.2

Research of Extraction Process of Mycosporine-like Amino Acids of Ulva lactuca and Its Mechanism of Anti-bacterial Properties Against Vibrio parahaemolyticus

  • 摘要: 为探明石莼类菌孢素氨基酸(MAAs)的提取工艺及对副溶血弧菌的抑菌机理,本研究采用单因素实验和响应面优化试验,分析了液固比、提取温度和提取时间对石莼MAAs得率的影响,并对MAAs进行了硅胶柱层析分离以及HPLC和ESI-MS鉴定。通过扫描、荧光显微镜观察胞内核酸、蛋白质的泄露及DNA分解等分析MAAs对副溶血弧菌的抑菌机理。结果表明,石莼MAAs的最佳提取参数为液固比25:1 mL/g、提取温度40 ℃和提取时间118 min,制备到的MAAs得率为179.34±3.91 mg/g。石莼MAAs明显破坏了副溶血弧菌的细胞膜,导致了胞内核酸和蛋白质泄露,并促使菌体内DNA发生分解。MAAs经硅胶柱层析分离获得2个组分,经鉴定组分H2为shinorine,其在石莼干粉末中含量可达10.32 mg/g。本研究为石莼MAAs的制备和副溶血弧菌的生物防治提供了技术参考。
    Abstract: To explore the extraction process of mycosporine amino acids (MAAs) and the antibacterial mechanism of Vibrio parahaemolyticus, the effects of liquid-solid ratio, extraction temperature and extraction time on the yield of MAAs were analyzed by single factor and response surface optimization tests, and MAAs were isolated and identified by silica gel column chromatography, HPLC and ESI-MS. The antibacterial mechanism of MAAs against Vibrio parahaemolyticus was analyzed by scanning and fluorescence microscopy to observe the leakage of intracellular nucleic acids and proteins, and DNA decomposition. The results showed that the optimal extraction parameters of MAAs of Ulva lactuca was liquid-solid ratio of 25 mL/g, extraction temperature of 40 ℃ and extraction time of 118 min, and the yield of MAAs was 179.34±3.91 mg/g. MAAs significantly destroyed the cell membrane of Vibrio parahaemolyticus, causing the leakage of nucleic acid and proteins, and promoting the breakdown of DNA in the bacteria. MAAs were isolated by silica gel column chromatography to obtain two fractions, and the fraction H2 was identified as shinorine, and the content in Ulva lactuca dry powder could reach 10.32 mg/g. This study provides a technical reference for the preparation of MAAs of Ulva lactuca and the biological control of Vibrio parahaemolyticus.
  • 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种广泛存在于海洋环境中的嗜盐革兰氏阴性杆状或曲线形细菌[1],是全球海鲜消费引起的食源性疾病暴发的主要原因之一[2],可能会导致头晕、呕吐、腹泻和其他胃肠道疾病[3]。随着全球变暖,韩国、美国和中国南部沿海地区[4]发生了大量由副溶血弧菌引起的细菌源食物中毒事件,严重影响人类健康。作为一个全球公共卫生问题,食物中毒已经引起了广泛关注。抗生素(四环素、环丙沙星)常用于预防副溶血弧菌。然而,抗生素的耐药性对其预防构成了严重的挑战[5],需要积极寻找预防和防治副溶血弧菌感染的新策略。

    类菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acids,MAAs)是一类具有多种活性的化合物,存在于大型海藻中[68]。例如,红毛苔(Bangiafusco-purpurea[9]、海萝(Gloiopeltis furcata[10]、江蓠(Gracilaria changii[11]、条斑紫菜(Porphyra yezoensis[12]、羊栖菜(Hizikia fusifarme[13]、海带(Laminaria saccharina[14]等大型红藻和褐藻,大型绿藻MAAs报道很少[15]。研究指出,含有MAAs的大型绿藻种类不超过50种[6],且它们的MAAs含量通常较低,但大型绿藻Prasiola crispa ssp. antarctica and Prasiola crispa含有较高含量的MAAs[16]。为了探知更多种类大型绿藻是否含有MAAs,本文选定了我国常见的一种大型绿藻石莼(Ulva lactuca[15],研究其MAAs的提取工艺。目前,大型海藻MAAs研究主要集中在海藻中的分布[17]和生物活性方面[8],提取工艺的研究并不多。本文首先采用单因素实验和响应面试验,研究了石莼MAAs的提取工艺。在此基础上,评价了MAAs对多种致病菌的抑菌活性,通过分析MAAs对副溶血弧菌胞内核酸蛋白质、细胞膜完整性、DNA结合和分解等影响,探讨其对副溶血弧菌的抑菌机理,以期为MAAs在副溶血弧菌的生物防治方面提供技术依据。

    新鲜石莼 采自山东省威海市,经清洗、真空干燥,超微粉碎机粉碎后,过40目筛备用;副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus CICC 21618)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens ATCC 49138)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus CICC 23828)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CICC 23656) 江苏海洋大学海洋食品与生物工程学院;甲醇 色谱纯,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;硅胶粉200~300目 青岛海洋化工有限公司;试验所用试剂均为国产分析纯。

    BZS-82A水浴恒温振荡器 上海博珍仪器设备制造厂;RE52CS-2旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;全波长酶标仪、高效液相色谱仪 Thermo scientific公司;TSQ Quantum Access液质联用仪 赛默飞世尔科技有限公司;倒置系统显微镜 Olympus公司。

    称取0.5 g石莼粉末,加入到一定体积25%甲醇水溶液(体积比,下同),搅拌后密封放入恒温水浴摇床中,摇床转数180 r/min,在设定温度下振荡浸提一定时间。提取结束后,冷却至室温,倒出浸提液。重新加入相同体积25%的甲醇水溶液中,按照上述条件重复浸提取2次。浸提液合并,在10000 r/min的条件下离心20 min后,弃去上清液,保留沉淀。用蒸馏水洗涤沉淀2~3次,洗涤液和先前的上清液合并,抽滤和减压蒸发以除去甲醇,随后加入80%无水乙醇,−20℃下沉淀6 h后,于45 ℃下减压浓缩,经冷冻干燥,制备到石莼MAAs,单因素水平设计见表1

    表  1  单因素实验的因素水平
    Table  1.  Factors and levels of single-factor experiments
    考察因素 水平 固定因素
    液固比(mL/g) 10:1 15:1 20:1 25:1 30:1 提取温度和时间设定为45 ℃和120 min
    提取温度(℃) 36 38 40 42 44 液固比和提取时间设定为25:1 mL/g和120 min
    提取时间(min) 60 120 180 240 300 液固比和提取温度设定为25:1 mL/g和40 ℃
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    根据单因素实验结果,按照响应面法Box-Behnken中心组合试验设计的原理,进行三因素三水平试验设计,以液固比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)为响应因子,以MAAs得率(mg/g)为响应值,优化石莼MAAs提取的适宜条件。响应面试验设计因素与水平见表2

    表  2  响应面试验的因素与水平
    Table  2.  Factors and levels of response surface tests
    因素 水平
    −1 0 1
    A:液固比(mL/g) 20:1 25:1 30:1
    B:提取温度(℃) 38 40 42
    C:提取时间(min) 90 120 150
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    根据文献[17-18]报道的MAAs摩尔消光系数ε及方法,可计算处石莼MAAs中MAAs总含量,计算公式如下:

    X(mg)=A×M/ε

    式中:X为MAAs质量,mg;A为特征吸收波长334 nm下的吸光度;M为分子质量332,g/mol;ε为MAAs摩尔消光系数43700,mol−1·cm−1

    W(%)=m/M×100

    式中,W为MAAs 得率(%);m为初始提取的 MAAs质量(g);M为石莼干粉末质量(g)。

    参考实验室前期建立的薄层层析法[19]。称取0.05 g石莼MAAs,溶于10 mL蒸馏水。点样在硅胶G板上,展开剂为甲醇/乙醇/蒸馏水(8:10:0.5,体积比),显色剂为碘化秘钾试剂(7.3 g碘化铋钾,冰醋酸10 mL,蒸馏水60 mL)。静置显色10~60 min,含氮化合物会呈现橙色或黄色斑点。

    主要检测了石莼MAAs中蛋白质、总酚、糖脂、黄酮和甾醇,方法依次为Bradford法[20]、Folin-Ciocalteu比色法[21]、硫酸苯酚法[22]、硝酸铝显色法[23]和磷硫铁法[24]。上述化合物的标准曲线如下:

    蛋白质标准曲线y=0.9486x+0.0284(R2=0.9962),式中,y为样品中蛋白质浓度,mg/mL;x为样品吸光度。

    多酚标准曲线y=1.8403x+0.0527(R2=0.9979),式中,y为样品中多酚质量浓度,mg/mL;x为样品吸光度。

    糖脂标准曲线y=47.042x-0.0435(R2=0.9956),式中,y为样品中糖脂质量浓度,mg/mL;x为样品吸光度。

    黄酮标准曲线y=0.7451x+0.0221(R2=0.9957),式中,y为样品中黄酮质量浓度,mg/mL;x为样品吸光度。

    甾醇浓度计算公式为C1=A1×C2/A2,式中,C1为样品中甾醇浓度,mg/mL;C2为样品浓度;mg/mL;A1为标准品吸光度;A2为样品吸光度。

    HPLC测定:采用C18柱(5 μm,4.6 mm×150 mm),柱温为25 ℃,进样量10 μL,流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为甲醇,流速为0.8 mL/min,检测波长为330 nm,梯度洗脱条件:0~20 min,B%:10%~70%;ESI-MS测定:喷雾气压45 psi,氮气流速10.0 L/min,干燥温度350 ℃,破碎电压100 V,毛细管电压4500 V,全扫描(Scan),参比离子质荷比:121.0509、922.0098,为参比离子对测定结果进行实时矫正,分辨率m/z在922.0098处全扫描响应为11300,质荷比(m/z)范围在120~1000。

    测定方法参考Aladham等[25]并略微调整。取副溶血弧菌菌悬液100 μL至96孔细胞培养板中,再取溶于无菌去离子水的石莼MAAs(pH7.0)100 μL加至上述孔中,使其终浓度分为1、2、3、4、5、6 mg/mL。对照组加入100 μL菌悬液和100 μL去离子水。将96孔细胞培养板置于28 ℃生化培养箱24 h,酶标仪测定OD600 nm的吸光度,确定最小抑菌浓度MIC。

    参照石超等[26]的方法并稍作修改。将菌悬液稀释至OD600 nm=0.5,加入终浓度为0、1×MIC和2×MIC的石莼MAAs,置于全波长酶标仪中28 ℃培养,每隔1 h取样,在600 nm下测其吸光度。

    将PBS重悬的菌液中加入2 mL 1×MIC石莼MAAs,对照组加入等量的无菌去离子水,置于28 ℃生化培养箱中孵育2 h。8000 r/min离心15 min去除上清液,所得到的菌体用PBS重悬洗涤3次,再用2.5%戊二醛溶液于4 ℃固定样品过夜。过夜后用PBS洗涤菌体3次,用不同浓度的乙醇梯度脱水,将脱水后的样品混匀后取100 μL于干净载玻片涂匀晾干后喷金(喷金厚度10 nm),扫描电镜观察细菌形态变化。

    在PBS重悬的菌液中加入0、1×MIC和2×MIC石莼MAAs在28 ℃条件下分别孵育1 h和3 h,每个实验设定3个平行样。然后,加入终浓度为2 μg/mL的碘化丙啶(PI),混合物在28 ℃黑暗条件下孵育20 min。最后,用PBS洗涤混合物2次,去除多余的PI,并悬浮细胞沉淀至1 mL。在避光条件下用移液枪吸取10 μL悬浮液至干净载玻片,均匀涂开后晾干制片,在倒置荧光显微镜下选择红色激发光波长观察PI啶摄取情况。

    参照Cui等[27]的方法并稍作修改。取4等份10 mL处于对数期的副溶血弧菌,5000 r/min离心10 min收集细菌沉淀,用无菌PBS溶液悬浮。实验组分别加入1×MIC和2×MIC石莼MAAs,设定不添加石莼MAAs的对照组。28 ℃培养,每30 min取样1 mL(0~180 min),6000 r/min离心5 min,0.22 µm滤膜过滤,用紫外分光光度计在260 nm和280 nm的吸光度。在上述过程中,每个实验设定3个平行样。

    采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒,根据操作方法对其基因组DNA进行提取,于−20 ℃保存备用。参考Hou等[28]报道的实验方法,将提取的基因组DNA分别添加到终浓度为1/2×MIC、1×MIC和2×MIC石莼MAAs和仅添加PBS的对照组,于28 ℃下孵育60 min,每个实验设定3个平行样。制备1%琼脂糖凝胶,电泳40 min后取出凝胶,用凝胶成像仪拍照。

    参照朱文轩等[29]的方法,并对分离方法进行了主要改进。取1.5 g石莼MAAs加载在硅胶柱层析(2.5 cm×45 cm,200~300目)上,洗脱剂为甲醇/乙醇/蒸馏水(8:10:0.5,体积比),洗脱速度为1.0 BV/h,洗脱3倍柱体积(BV),每管收集10 mL馏分。减压浓缩后,采用薄层层析和紫外光谱检测浓缩馏分的MAAs[19]

    本研究所有实验结果均重复进行3次,使用OriginPro2021、SPSS14.0、Design-Expert13.1.0.1软件对数据进行图标绘制和ANOVA-单因素方差分析,P<0.05表示差异显著。

    图1可知,随液固比的增加,石莼MAAs得率呈现显著的(P<0.05)先增加后下降的趋势。在液固比为25:1 mL/g时,MAAs得率达到最大值,为151.11 mg/g。液固比继续增加,MAAs得率下降,但仍然高于液固比在20 mL/g时MAAs得率。这表明,较高的液固比更有利于石莼MAAs的溶出。

    图  1  液固比(A)、温度(B)和时间(C)对石莼MAAs得率的影响
    注:不同字母表示数据之间存在显著差异,P<0.05。
    Figure  1.  Effects of liquid-solid ratio (A), temperature (B) and time (C) on MAAs yield from Ulva lactuca

    图1中,石莼MAAs得率随提取温度的升高呈现先增大后下降的趋势。在40 ℃时,石莼MAAs得率最高,为176.6 mg/g。当提取温度增加至44 ℃时,石莼MAAs得率略低于提取温度为38 ℃时的MAAs得率。结果表明,较低温度有利于石莼MAAs的提取。红毛苔、江蓠和海带等大型海藻MAAs的提取温度为40[9]、48[11]或45 ℃[9]。在60~120 min提取时间内,石莼MAAs得率随提取时间的增加而明显(P<0.05)增加,在120 min时,MAAs得率为182.35 mg/g。当提取时间继续增加,MAAs得率明显(P<0.05)下降,更长的提取时间并不利于MAAs的提取。从这些结果可以看出,不同种类大型海藻MAAs提取条件存在差异,这不仅与大型海藻含有的MAAs组成有关,可能还与MAAs在海藻中的位置有关。

    为进一步优化石莼MAAs提取工艺,以液固比、提取温度、提取时间为自变量,石莼MAAs得率为响应值,进行响应面试验设计,结果见表3。采用Design-Expert13.1.0.1软件对表4的试验结果进行回归分析,得到回归模型Y=185.40+3.88A−2.31B+1.77C−2.76AB+0.9675AC−1.84BC−13.03A2−14.24B2−11.02C2

    表  3  响应面试验设计与结果
    Table  3.  Experimental design and results of response surface
    实验号 A:液固比 B:提取温度 C:提取时间 得率(mg/g)
    1 0 −1 1 163.27±5.33
    2 0 1 1 161.23±3.57
    3 −1 −1 0 154.50±3.66
    4 0 0 0 183.25±4.75
    5 0 −1 −1 162.73±4.51
    6 0 0 0 185.23±4.21
    7 −1 1 0 156.48±3.79
    8 0 1 −1 153.33±4.32
    9 1 −1 0 165.29±5.01
    10 1 0 −1 163.43±2.73
    11 0 0 0 183.47±3.55
    12 −1 0 −1 156.43±2.89
    13 0 0 0 187.33±3.04
    14 1 0 1 168.21±4.36
    15 0 0 0 187.71±3.57
    16 1 1 0 156.25±4.21
    17 −1 0 1 157.34±3.62
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    表  4  方差分析及显著性检验结果
    Table  4.  Results of variance analysis and significance tests
    方差来源平方和自由度均方FP显著性
    模型2536.909281.8871.85<0.0001**
    A101.031101.0325.750.0014**
    B42.78142.7810.910.0131*
    C24.96124.966.360.0397*
    AB30.36130.367.740.0272*
    AC3.7413.740.95450.3611不显著
    BC13.54113.543.450.1055不显著
    A2714.621714.62182.17<0.0001**
    B2853.831853.83217.65<0.0001**
    C2511.121511.12130.29<0.0001**
    残差27.4673.92
    失拟误差10.0233.340.76640.5694不显著
    纯误差17.4444.36
    总误差2564.3616
    注:**表示差异极显著(P<0.01);*表示差异显著(P<0.05)。
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    对回归模型进行方差分析,从表4可以看出,该模型F=71.85,P<0.0001,表明石莼MAAs提取效果回归模型极显著;失拟值P=0.5694>0.05,表明失拟项与纯误差相关不显著,拟合程度好;决定系数R2=0.9893,C.V.=1.218%。因此,该方程可用于分析和预测石莼MAAs得率。

    模型自变量一次项A对MAAs得率影响呈极显著水平(P<0.01),B、C对MAAs得率影响呈显著水平(P<0.05);液固比和提取温度交互项显著(P<0.05),其他交互因素不显著;在二次项中A2、B2、C2效果极显著(P<0.01),说明各影响因素不是简单的线性关系;由F值大小可以看出,石莼MAAs得率的影响因素顺序为A>B>C,即液固比>提取温度>提取时间。

    图2可知,AB交互作用对响应值影响的响应面图坡度陡峭,其对应的等高线图相对AC、BC密集,且趋于椭圆,说明AB交互作用对响应值有显著影响,此与方差结果一致。

    图  2  各交互因素对石莼MAAs得率的响应面图和等高线图
    Figure  2.  Response surface and contour of the interaction on MAAs yield from Ulva lactuca

    利用Design-Expert13.1.0.1软件进行数据分析,预测摇床振荡提取石莼MAAs的最佳工艺参数为液固比25.443:1 mL/g、提取温度为40.161 ℃、提取时间为118.214 min,得率为185.154 mg/g。为方便操作,修正液固比为25 mL/g、提取温度为40 ℃、提取时间为118 min。在此条件下,进行3次验证试验测得石莼MAAs得率为179.34±3.91 mg/g,与预测值接近,表明在该试验模型下得到的最佳工艺条件具有较高的可靠性,可以较好地预测石莼MAAs的实际提取效果。与江蓠、海萝和海带等大型海藻MAAs[911]提取不同的是,石莼MAAs的提取温度更低或者提取时间更短,并且最明显的差异是石莼MAAs得率明显高于已报道的大型海藻MAAs得率,例如,红毛苔[9]、海萝[10]、江蓠[11]和羊栖菜[13]等。这表明,大型绿藻也可能是MAAs的理想来源,需要进一步挖掘。礁膜(Monostroma sp.)、厥藻(Caulerpa sp.)等全世界经济栽培大型绿藻尚未见MAAs提取等相关报道,在后续工作中,可开展这些大型绿藻MAAs提取、分离与活性研究。

    将石莼MAAs进行薄层层析检测(图3A)和紫外光谱分析(图3B)。从图3A可以看出,石莼MAAs在硅胶板上呈现含氮化合物的阳性反应,出现一个明显的黄色斑点,表明石莼MAAs中很可能存在MAAs成分。图3B能清晰地看出,石莼MAAs在310~330 nm范围内存在明显吸收,为MAAs特征吸收范围。石莼MAAs的高效液相色谱表明,保留时间3.56 min吸收峰最明显,同时还有其它杂质峰(图3C)。

    图  3  石莼MAAs的薄层层析(A)、紫外光谱(B)和高效液相色谱检测(C)
    Figure  3.  Thin-layer chromatography (A), Ultraviolet spectroscopy (B) and HPLC (C) of MAAs of Ulva lactuca

    进一步测定了石莼MAAs化合物组成。从表5可以看出,石莼MAAs主要含有MAAs/MAA,还含有蛋白质、多酚、糖脂和甾醇。这表明后续需要分离去除糖脂等化合物。

    表  5  石莼MAAs化合物组成分析
    Table  5.  Compound composition analysis of MAAs of Ulva sp.
    指标MAAs/MAA蛋白质多酚糖脂甾醇
    含量(mg/g)58.33±1.749.68±1.3214.75±0.2531.85±0.7112.69±1.15
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    表6可见,石莼MAAs对副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用,其对副溶血弧菌的抑制效果明显,最小抑菌浓度(MIC)为3 mg/mL,其它细菌均无抑制作用。在1×MIC可显著观察到抑制副溶血弧菌的生长(图4)。与对照相比,随着石莼MAAs浓度增加到2×MIC,副溶血弧菌在3 h后没有明显的菌落生长。

    表  6  石莼MAAs的抑菌活性
    Table  6.  Antibacterial activity of MAAs of Ulva lactuca
    供试菌 空白组 石莼MAAs提取物浓度(mg/mL)
    1 2 3 4 5 6
    Vibrio parahaemolyticus CICC 21618 + + + +
    Shewanella putrefaciens ATCC 49138
    Bacillus cereus CICC 23828
    Staphylococcus aureus CICC 23656 +
    注:“+”表示该浓度下对对应菌有抑制作用;“−”表示无抑菌作用。
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    图  4  石莼MAAs对副溶血弧菌生长的影响
    Figure  4.  Effects of MAAs of Ulva lactuca on the growth of Vibrio parahaemolyticus

    石莼MAAs不仅影响了副溶血弧菌的生长,还能影响其形态,并破坏细胞膜,导致内容物外泄(图5~图7)。在图5中,未经处理的副溶血弧菌呈现典型的短杆状,细胞形态完整,内部组织致密;当用1×MIC石莼MAAs处理2 h后,细胞出现明显破裂。

    图  5  在电子显微镜下石莼MAAs提取物对副溶血弧菌形态影响
    注:(A)为对照组;(B)为实验组。
    Figure  5.  Effects of MAAs of Ulva lactuca extract on the morphology of Vibrio parahaemolyticus underelectron microscopy
    图  7  石莼MAAs作用下副溶血弧菌核酸和蛋白质泄露情况
    Figure  7.  Nucleic acid and protein leakage of Vibrio parahaemolyticus under the action of MAAs of Ulva lactuca

    同时,在石莼MAAs作用下,细胞膜结构遭到了破坏。PI作为核染料与核DNA结合发出红色荧光被用来进一步证明细菌膜的完整性。从图6可以看出,经1×MIC石莼MAAs处理后,在1 h时,视野中就出现较多红色荧光,且随时间增加,红色荧光面积逐渐增多。当用2×MIC石莼MAAs处理后,红色荧光面积与1×MIC相比,相同时间要增加更为明显。如图7所示,1×MIC和2×MIC石莼MAAs处理后,核酸和蛋白质特征吸收值都显著(P<0.01)增大,且存在明显的时间-剂量依赖性。核酸和蛋白是细胞胞内重要的大分子物质,正常情况下不能透过细胞膜,这就表明石莼MAAs致使副溶血弧菌内容物外泄。

    图  6  石莼MAAs对副溶血弧菌细胞膜的影响(40×)
    Figure  6.  Effects of MAAs of Ulva lactuca on Vibrio parahaemolyticus cell membrane (40×)

    图8中,当不添加石莼MAAs和较低浓度1/2×MIC石莼MAAs,DNA琼脂糖凝胶电泳在同一位置有明显条带出现;条带的亮度随着石莼MAAs浓度的增加逐渐降低。结果表明,石莼MAAs作用下,副溶血弧菌菌体内DNA发生了明显分解,石莼MAAs能影响副溶血弧菌DNA复制过程。

    图  8  石莼MAAs对基因DNA的作用
    注:泳道1:Control;泳道2:1/2×MIC(1.5 mg/mL);泳道3:1×MIC(3 mg/mL);泳道4:2×MIC(6 mg/mL)。
    Figure  8.  Effects of MAAs of Ulva lactuca on genetic DNA

    MAAs具有抗氧化和抗紫外辐射等多种生理活性[7],然而,国内外尚未见MAAs的抑菌活性报道[28],本文第一次发现了石莼MAAs对副溶血弧菌的明显抑制作用,不仅改变了副溶血弧菌细胞形态,致使细胞膜破裂、细胞内蛋白质和核酸等内容物泄露,还能影响副溶血弧菌体内DNA复制,导致副溶血弧菌的不可逆损伤。这给副溶血弧菌的生物防治提供了一条新的途径。

    采用硅胶柱层析,对石莼MAAs进行分离,洗脱曲线见图9图9表明,石莼MAAs经分离得到2个馏分H1和H2(第4管,0.031g和第9管,0.005 g),并对馏分H2进行HPLC和ESI-MS检测。

    图  9  石莼MAAs硅胶柱层析洗脱曲线
    Figure  9.  Chromatographic elution curve of silicone column of MAAs of Ulva lactuca

    经过硅胶柱层析分离,石莼MAAs获得了较好的分离见图10。与图3C相比,馏分H2的HPLC杂质峰明显减少,保留时间为3.56 min。根据HPLC和ESI-MS的检测结果,并和Orfanoudaki等[30]对比,能鉴定出馏分H2为Shinorine。从表5可知,石莼MAAs中MAAs/MAA平均含量为58.33 mg/g,而Shinorine鉴定为石莼的唯一MAA,这就说明石莼中Shinorine含量可占到干粉末的10.32 mg/g,该数值高于很多种类大型红藻中shinorine含量[31]。Shinorine已被证实具有良好的抗氧化活性[30],本文结果表明,石莼是Shinorine的理想来源。

    图  10  石莼MAAs硅胶柱层析馏分H2的HPLC(A)和ESI-MS(B)检测结果以及Shinorine的分子结构式(C)
    Figure  10.  HPLC (A) and ESI-MS (B) results for fraction H2 isolated from MAAs of Ulva lactucaand the molecular structural formula of shinorine (C)

    本文采用单因素实验和响应面试验,建立了石莼MAAs的提取工艺。当液固比、提取温度和时间分别为25:1 mL/g、40 ℃和118 min时,制备到的MAAs得率最大,为179.34±3.91 mg/g。此外,Shinorine很可能是石莼MAAs对副溶血弧菌产生抑菌作用的主要原因。在后续研究中,将从基因水平方面深入开展石莼MAAs对副溶血弧菌的抑菌机理研究。同时,为了推动大型海藻MAAs的应用,将围绕更多种类大型绿藻开展其MAAs的提取与分离制备。

  • 图  1   液固比(A)、温度(B)和时间(C)对石莼MAAs得率的影响

    注:不同字母表示数据之间存在显著差异,P<0.05。

    Figure  1.   Effects of liquid-solid ratio (A), temperature (B) and time (C) on MAAs yield from Ulva lactuca

    图  2   各交互因素对石莼MAAs得率的响应面图和等高线图

    Figure  2.   Response surface and contour of the interaction on MAAs yield from Ulva lactuca

    图  3   石莼MAAs的薄层层析(A)、紫外光谱(B)和高效液相色谱检测(C)

    Figure  3.   Thin-layer chromatography (A), Ultraviolet spectroscopy (B) and HPLC (C) of MAAs of Ulva lactuca

    图  4   石莼MAAs对副溶血弧菌生长的影响

    Figure  4.   Effects of MAAs of Ulva lactuca on the growth of Vibrio parahaemolyticus

    图  5   在电子显微镜下石莼MAAs提取物对副溶血弧菌形态影响

    注:(A)为对照组;(B)为实验组。

    Figure  5.   Effects of MAAs of Ulva lactuca extract on the morphology of Vibrio parahaemolyticus underelectron microscopy

    图  7   石莼MAAs作用下副溶血弧菌核酸和蛋白质泄露情况

    Figure  7.   Nucleic acid and protein leakage of Vibrio parahaemolyticus under the action of MAAs of Ulva lactuca

    图  6   石莼MAAs对副溶血弧菌细胞膜的影响(40×)

    Figure  6.   Effects of MAAs of Ulva lactuca on Vibrio parahaemolyticus cell membrane (40×)

    图  8   石莼MAAs对基因DNA的作用

    注:泳道1:Control;泳道2:1/2×MIC(1.5 mg/mL);泳道3:1×MIC(3 mg/mL);泳道4:2×MIC(6 mg/mL)。

    Figure  8.   Effects of MAAs of Ulva lactuca on genetic DNA

    图  9   石莼MAAs硅胶柱层析洗脱曲线

    Figure  9.   Chromatographic elution curve of silicone column of MAAs of Ulva lactuca

    图  10   石莼MAAs硅胶柱层析馏分H2的HPLC(A)和ESI-MS(B)检测结果以及Shinorine的分子结构式(C)

    Figure  10.   HPLC (A) and ESI-MS (B) results for fraction H2 isolated from MAAs of Ulva lactucaand the molecular structural formula of shinorine (C)

    表  1   单因素实验的因素水平

    Table  1   Factors and levels of single-factor experiments

    考察因素 水平 固定因素
    液固比(mL/g) 10:1 15:1 20:1 25:1 30:1 提取温度和时间设定为45 ℃和120 min
    提取温度(℃) 36 38 40 42 44 液固比和提取时间设定为25:1 mL/g和120 min
    提取时间(min) 60 120 180 240 300 液固比和提取温度设定为25:1 mL/g和40 ℃
    下载: 导出CSV

    表  2   响应面试验的因素与水平

    Table  2   Factors and levels of response surface tests

    因素 水平
    −1 0 1
    A:液固比(mL/g) 20:1 25:1 30:1
    B:提取温度(℃) 38 40 42
    C:提取时间(min) 90 120 150
    下载: 导出CSV

    表  3   响应面试验设计与结果

    Table  3   Experimental design and results of response surface

    实验号 A:液固比 B:提取温度 C:提取时间 得率(mg/g)
    1 0 −1 1 163.27±5.33
    2 0 1 1 161.23±3.57
    3 −1 −1 0 154.50±3.66
    4 0 0 0 183.25±4.75
    5 0 −1 −1 162.73±4.51
    6 0 0 0 185.23±4.21
    7 −1 1 0 156.48±3.79
    8 0 1 −1 153.33±4.32
    9 1 −1 0 165.29±5.01
    10 1 0 −1 163.43±2.73
    11 0 0 0 183.47±3.55
    12 −1 0 −1 156.43±2.89
    13 0 0 0 187.33±3.04
    14 1 0 1 168.21±4.36
    15 0 0 0 187.71±3.57
    16 1 1 0 156.25±4.21
    17 −1 0 1 157.34±3.62
    下载: 导出CSV

    表  4   方差分析及显著性检验结果

    Table  4   Results of variance analysis and significance tests

    方差来源平方和自由度均方FP显著性
    模型2536.909281.8871.85<0.0001**
    A101.031101.0325.750.0014**
    B42.78142.7810.910.0131*
    C24.96124.966.360.0397*
    AB30.36130.367.740.0272*
    AC3.7413.740.95450.3611不显著
    BC13.54113.543.450.1055不显著
    A2714.621714.62182.17<0.0001**
    B2853.831853.83217.65<0.0001**
    C2511.121511.12130.29<0.0001**
    残差27.4673.92
    失拟误差10.0233.340.76640.5694不显著
    纯误差17.4444.36
    总误差2564.3616
    注:**表示差异极显著(P<0.01);*表示差异显著(P<0.05)。
    下载: 导出CSV

    表  5   石莼MAAs化合物组成分析

    Table  5   Compound composition analysis of MAAs of Ulva sp.

    指标MAAs/MAA蛋白质多酚糖脂甾醇
    含量(mg/g)58.33±1.749.68±1.3214.75±0.2531.85±0.7112.69±1.15
    下载: 导出CSV

    表  6   石莼MAAs的抑菌活性

    Table  6   Antibacterial activity of MAAs of Ulva lactuca

    供试菌 空白组 石莼MAAs提取物浓度(mg/mL)
    1 2 3 4 5 6
    Vibrio parahaemolyticus CICC 21618 + + + +
    Shewanella putrefaciens ATCC 49138
    Bacillus cereus CICC 23828
    Staphylococcus aureus CICC 23656 +
    注:“+”表示该浓度下对对应菌有抑制作用;“−”表示无抑菌作用。
    下载: 导出CSV
  • [1]

    LETCHUMANAN V, CHAN K G, LEE L H. Vibrio parahaemolyticus:a review on the pathogenesis, prevalence, and advance molecular identification techniques[J]. Frontiers in Microbiology,2014,5(11):705.

    [2]

    BROBERG C A, CALDER T J, ORTH K. Vibrio parahaemolyticus cell biology and pathogenicity determinants[J]. Microbes and Infection,2011,13(12):992−1001.

    [3]

    ASHRAFUDOULLA M, MIZAN M F R, HA A J, et al. Antibacterial and antibiofilm mechanism of eugenol against antibiotic resistance Vibrio parahaemolyticus[J]. Food Microbiology,2020,91:103500. doi: 10.1016/j.fm.2020.103500

    [4]

    YUAN C Y, ZHAN W H, CUI Q M. Antibacterial activity and mechanism of the gallnut water extract against Vibrio parahae molyticus[J]. Journal of Aquatic Animal Health,2022,34(4):159−166. doi: 10.1002/aah.10152

    [5]

    PARK K, MOK J S, KWON J Y, et al. Food-borne outbreaks, distributions, virulence, and antibiotic resistance profiles of Vibrio parahaemolyticus in Korea from 2003 to 2016:a review[J]. Fisheries and Aquatic Sciences,2018,21:1−10. doi: 10.1186/s41240-017-0078-4

    [6]

    SUN Y Y, ZHANG N S, ZHOU J, et al. Distribution, contents, and types of mycosporine-like amino acids (MAAs) in marine macroalgae and a database for MAAs based on these characteristics[J]. Marine Drugs,2020,18(1):43−66. doi: 10.3390/md18010043

    [7]

    FIGUEROA F L. Mycosporine-like amino acids from marine resource[J]. Marine Drugs,2021,19(1):18. doi: 10.3390/md19010018

    [8]

    OREN A, GUNDE-CIMERMAN N. Mycosporines and mycosporine-like amino acids:UV protectants or multipurpose secondary metabolites?[J]. Fems Microbiology Leters,2007,269(1):1−10. doi: 10.1111/j.1574-6968.2007.00650.x

    [9] 韩秀, 钱亮亮, 程同杰, 等. 4种大型红藻类菌胞素氨基酸的提取工艺优化与分离鉴定[J]. 食品工业科技,2022,43(18):208−216. [HAN X, QIAN L L, CHEN T J, et al. Optimization of extraction process, isolation and characterization of mycosporine-like amino acids from four species of marine red macroalgaes[J]. Science and Technology of Food Industry,2022,43(18):208−216.]

    HAN X, QIAN L L, CHEN T J, et al. Optimization of extraction process, isolation and characterization of mycosporine-like amino acids from four species of marine red macroalgaes[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(18): 208−216.

    [10] 张婉. 海萝藻中类菌胞素氨基酸的提取与抗氧化保湿特性研究[D]. 上海:上海海洋大学, 2016. [ZHANG W. Moisturizing activities of MAAs from Gloiopeltis furcata[D]. Shanghai:Shanghai Ocean University, 2016.]

    ZHANG W. Moisturizing activities of MAAs from Gloiopeltis furcata[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University, 2016.

    [11] 金宁宁. 江蓠中类菌胞素氨基酸(MAAs)分离纯化及应用研究[D]. 青岛:中国海洋大学, 2012. [JIN N N. Study on the isolation, purification and application of mycosporine-like amino acids (MAAs) in Gracilaria changii[D]. Qingdao:Ocean University of China, 2012.]

    JIN N N. Study on the isolation, purification and application of mycosporine-like amino acids (MAAs) in Gracilaria changii[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2012.

    [12] 张苗苗. 紫菜中类菌孢素氨基酸(MAAs)制备工艺的研究[D]. 青岛:中国海洋大学, 2015. [ZHANG M M. The preparation techniques of mycosporine-like amino acid from Porohyra yezoensis[D]. Qingdao:Ocean University of China, 2015.]

    ZHANG M M. The preparation techniques of mycosporine-like amino acid from Porohyra yezoensis[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2015.

    [13]

    WANG X M, ZHANG Z S, ZHANG S Y, et al. Antiaging compounds from marine organisms[J]. Food Research International (Ottawa, Ont. ),2021,143:110313. doi: 10.1016/j.foodres.2021.110313

    [14]

    APPRILL A M, LESSER M P. Effects of ultraviolet radiation on Laminaria saccharina in relation to depth and tidal height in the gulf of maine[J]. Marine Ecology Progress Sries,2003,256:75−85. doi: 10.3354/meps256075

    [15]

    GRÖNIGER A, SINHA R P, KLISCH M, et al. Photoprotective compounds in cyanobacteria, phytoplankton and macroalgae-adatabase[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology,2000,58(2-3):115−122. doi: 10.1016/S1011-1344(00)00112-3

    [16]

    HOYER K, KARSTEN U, SAWALL T, et al. Photoprotective substances in antarctic macroalgae and their variation with respect to depth distribution, different tissues and developmental stages[J]. Marine Ecology Progress Series,2001,211:117−129. doi: 10.3354/meps211117

    [17]

    KARSTEN U, SAWALL T, HANELT D, et al. An inventory of UV-absorbing mycosporine-likeamin acids in macroalgae from polar to warm-temperate regions[J]. Botanica Marina,1998,41:443−453.

    [18]

    CHUANG L F, HOU H N, SUNG P J. Porphyra-334 isolated from the marine algae Bangia atropurpurea:Conformational performance for energy conversion[J]. Marine Drugs,2014,12(9):4732−4740. doi: 10.3390/md12094732

    [19] 孙颖颖, 杨子轩, 周静, 等. 大型海藻类菌孢素氨基酸提取工艺及定性检测研究[J]. 食品科技,2021,46(3):205−211. [SUN Y Y, YANG Z X, ZHOU J, et al. Extraction process and a qualitative detection method of mycosporine-like amino acids from six species of marine macroalgae[J]. Food Science and Technology,2021,46(3):205−211.]

    SUN Y Y, YANG Z X, ZHOU J, et al. Extraction process and a qualitative detection method of mycosporine-like amino acids from six species of marine macroalgae[J]. Food Science and Technology, 2021, 46(3): 205−211.

    [20]

    RADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding[J]. Anal Biochem,1976,72(5):248−254.

    [21] 牛广财, 闫公昕, 朱丹, 等. Folin-Ciocalteu比色法测定沙棘酒中总多酚含量的工艺优化[J]. 食品与机械,2016,32(4):80−83,142. [NIU G C, YAN G X, ZHU D, et al. Optimization on determination of total polyphenolcontent in sea buckthorn wine by Folin-Ciocalteu colorimetric method[J]. Food and Machiery,2016,32(4):80−83,142.]

    NIU G C, YAN G X, ZHU D, et al. Optimization on determination of total polyphenolcontent in sea buckthorn wine by Folin-Ciocalteu colorimetric method[J]. Food and Machiery, 2016, 32(4): 80−83,142.

    [22] 王红, 彭励, 宋乐, 等. 银柴胡多糖超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性分析[J]. 食品工业科技,2024,45(1):185−191. [WANG H, PENG L, SONG L, et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction processand analysis of antioxidant activity of polysaccharide from Stellariae radix[J]. Science and Technology of Food Industry,2024,45(1):185−191.]

    WANG H, PENG L, SONG L, et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction processand analysis of antioxidant activity of polysaccharide from Stellariae radix[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(1): 185−191.

    [23] 龚受基, 覃媚, 戴梓茹, 等. 响应面法优化相思藤黄酮提取工艺及其体外抗氧化活性分析[J]. 食品工业科技,2024,45(6):178−185. [GONG S J, TAN M, DAI Z R, et al. Optimization of extraction process by response surface method and analysis of antioxidant activity in vitro of total flavonoids from Abrus precatorius Linn[J]. Science and Technology of Food Industry,2024,45(6):178−185.]

    GONG S J, TAN M, DAI Z R, et al. Optimization of extraction process by response surface method and analysis of antioxidant activity in vitro of total flavonoids from Abrus precatorius Linn[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(6): 178−185.

    [24] 张云焕, 冯亚净, 崔兆蕙, 等. 小麦胚芽中植物甾醇提取条件优化的研究[J]. 粮食与油脂,2018,31(5):35−38. [ZHANG Y H, FENG Y J, CUI Z H, et al. Optimization on extraction of phytosterol fromwheat germ by ultrasoundassisted method[J]. Cereals and Oils,2018,31(5):35−38.] doi: 10.3969/j.issn.1008-9578.2018.05.011

    ZHANG Y H, FENG Y J, CUI Z H, et al. Optimization on extraction of phytosterol fromwheat germ by ultrasoundassisted method[J]. Cereals and Oils, 2018, 31(5): 35−38. doi: 10.3969/j.issn.1008-9578.2018.05.011

    [25]

    ALADHAM I S, ASHOUR H, AlKAISSI E, et al. Studies on the kinetics of killing and theproposed mechanism of action of microemulsions against fungi[J]. International Journal of Pharmaceutics,2013,454(1):226−232. doi: 10.1016/j.ijpharm.2013.06.049

    [26] 石超, 陈怡飞, 贾振宇, 等. 50种植物源化合物对阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌活性评价[J]. 食品科学,2018,39(13):47−54. [SHI C, CHEN Y F, JIA Z Y, et al. Evaluation of antibacterial activities of fifty plant-derived compounds against Cronobacter sakazakii[J]. Food Science,2018,39(13):47−54.] doi: 10.7506/spkx1002-6630-201813008

    SHI C, CHEN Y F, JIA Z Y, et al. Evaluation of antibacterial activities of fifty plant-derived compounds against Cronobacter sakazakii[J]. Food Science, 2018, 39(13): 47−54. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201813008

    [27]

    CUI H Y, ZHAO C T, LIN L. Antibacterial activity of helichrysum italicum oil on vegetables and its mechanism of action[J]. Journal of Food Processing and Preservation,2015,39:2663−2672. doi: 10.1111/jfpp.12516

    [28]

    HOU X Y, FENG C Y, LI S S, et al. Mechanism of antimicrobial peptide NP-6 from Sichuan pepper seeds against E. Coli and effects of different environmental factors on its activity[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2019,103(16):6593−6604. doi: 10.1007/s00253-019-09981-y

    [29] 朱文轩, 钱亮亮, 程同杰, 等. 4种大型褐藻类菌胞素氨基酸的提取工艺和鉴定[J]. 食品研究与开发,2023,44(4):114−121. [ZHU W X, QIAN L L, CHEN T J, et al. Extraction process and identification of mycosporine-like amino acids from 4 species of brown macroalga[J]. Food Research and Development,2023,44(4):114−121.] doi: 10.12161/j.issn.1005-6521.2023.04.017

    ZHU W X, QIAN L L, CHEN T J, et al. Extraction process and identification of mycosporine-like amino acids from 4 species of brown macroalga[J]. Food Research and Development, 2023, 44(4): 114−121. doi: 10.12161/j.issn.1005-6521.2023.04.017

    [30]

    ORFANOUDAKI M, HARTMANN A, KARSTEN U, et al. Chemical profiling of mycosporine-like amino acids in twenty-three red algal species[J]. Journal of Phycology,2019,55(2):393−403. doi: 10.1111/jpy.12827

    [31]

    ELIPE M V. Advantages and disadvantages of nuclear magnetic resonance spectroscopy as a hyphenated technique[J]. Analytica Chimica Acata,2003,497(1):1−25.

  • 期刊类型引用(1)

    1. 刘一帆,萨如拉,金佳瑶,代钢. 不同碳源下芽孢杆菌4B21对环境pH的影响研究. 内蒙古石油化工. 2024(08): 28-33 . 百度学术

    其他类型引用(1)

  • 其他相关附件

图(10)  /  表(6)
计量
  • 文章访问数:  81
  • HTML全文浏览量:  24
  • PDF下载量:  13
  • 被引次数: 2
出版历程
  • 收稿日期:  2023-10-26
  • 网络出版日期:  2024-07-17
  • 刊出日期:  2024-09-14

目录

/

返回文章
返回
x 关闭 永久关闭