Evaluation of Flavonoid Composition Differences in Dendrobium officinale of Different Growth Years Based on HPLC-ESI-MSn and Fingerprint Analysis
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摘要: 目的：分析广西铁皮兰种铁皮石斛中的黄酮类成分，并探究不同生长年限对黄酮类成分积累的影响。方法：用Kromasil 100-5 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-甲醇（v:v=1:1）−0.01 mol/L乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，质谱使用ESI离子源，在负离子模式下采集数据；采用HPLC法建立25批广西铁皮石斛HPLC特征图谱，并运用主成分分析和聚类分析探讨不同生长年限对广西铁皮石斛黄酮类成分积累的影响。结果：通过HPLC-ESI-MSn技术，从广西铁皮石斛中鉴定了19个黄酮类成分，涵盖了黄酮碳苷（9个）、黄酮醇氧苷（4个）、酰化黄酮碳苷（2个）、酰化黄酮醇氧苷（3个）及二氢黄酮（1个）。构建了广西铁皮石斛黄酮类成分特征图谱，并指认了9个共有峰；基于聚类与主成分分析，将25份样品按生长年限及杆色（绿杆1~3年、绿杆3~5年、红杆1~3年、红杆3~5年）划分为四类。此外，黄酮类特征峰峰面积随着生长年限的增长而增长；在1~3年生长年限时，‘红杆’与‘绿杆’间黄酮含量无显著差异；但3~5年，红杆样品中新西兰牡荆苷Ⅰ、Ⅲ、佛莱心苷及特定峰（峰8、峰9）含量显著高于绿杆。结论：本研究通过质谱分析结合化学模式识别，揭示了广西铁皮石斛黄酮类成分的共有特征，并强调了生长年限对黄酮类成分积累的关键作用。特别指出，生长至3~5年，‘红杆’样品中黄酮类成分含量显著高于‘绿杆’，此发现为铁皮石斛的药理活性探索、应用开发、种质资源评价及采收策略提供了坚实的理论基础。Abstract: Objective: To conduct an analysis of the flavonoids in Dendrobium officinale Kimura et Migo from Guangxi and to investigate the effects of different growth years on the accumulation of flavonoids. Methods: A Kromasil 100-5 C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used for chromatographic separation with a gradient elution of acetonitrile-methanol (v:v=1:1)−0.01 mol/L ammonium acetate solution as the mobile phase. Mass spectrometry data was collected using ESI ion source in negative ion mode. HPLC was used to establish the characteristic chromatographic fingerprints of 25 batches of Dendrobium officinale from Guangxi, and principal component analysis and cluster analysis were employed to investigate the effects of different growth periods on the accumulation of flavonoid components. Results: A total of 19 flavonoids were identified from Dendrobium officinale from Guangxi through the HPLC-ESI-MSn technique, encompassing 9 flavonoid glycosides, 4 flavonol glycosides, 2 acylated flavonoid glycosides, 3 acylated flavonol glycosides, and 1 dihydroflavone. The characteristic maps of flavonoids in Dendrobium officinale from Guangxi were established, and 9 common peaks were identified. Based on clustering and principal component analysis, 25 samples were categorized into four classes in accordance with growth years and rod color (green rod for 1~3 years, green rod for 3~5 years, red rod for 1~3 years, red rod for 3~5 years). Additionally, the peak area of the characteristic peak of flavonoids increased with the increase of growth years. There was no marked difference in flavonoid content between the 'red' and 'green' during the 1~3 years of growth. Nevertheless, the contents of moscatin I, moscatin III, chrysin, and specific peaks (peak 8, peak 9) in the red rod samples were significantly higher than those in the green rod samples during the 3~5 years. Conclusion: In this study, leveraging mass spectrometry analysis integrated with chemical pattern recognition, elucidated the common characteristics of flavonoid compounds in Dendrobium officinale sourced from Guangxi. It emphasized the crucial influence of growth years on the accumulation of flavonoid compounds. Specifically, after 3~5 years of growth, the flavonoid content in 'red stem' samples was significantly higher than that in 'green stem' samples. This finding provided a solid theoretical basis for the investigation of pharmacological activities, application development, evaluation of genetic resources, and optimization of harvesting strategies for Dendrobium officinale.
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铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo（D.officinale）的干燥茎[1]；现代研究表明其有抗氧化[2]、抗炎[3−4]、抗肿瘤[5−6]、免疫调节[2]、护肝[7−8]、降血糖[9−11]、降血脂[12]、抗疲劳[13]、抗糖化、抗衰老[14]等药理作用；具有悠久食用历史，2019年国家将其纳入国家药食同源目录。铁皮石斛主要分布在广西、广东、浙江等地。魏刚课题组本草考证结合实地考察发现本草中所记载“始兴”、“广南”、“温台”等地的石斛为铁皮石斛，广西是铁皮石斛的道地产地之一，且广西以容县“都峤山”、桂平“白石山”石上产的铁皮石斛质量最佳[15−17]。
铁皮石斛的主要药效成分及质量标志物涵盖多糖、黄酮类、生物碱类、菲类、芪类（含联苄及其衍生物）及挥发性成分[18]。因此，单纯以多糖含量作为铁皮石斛质量评价标准存在局限性，应综合考量黄酮类与生物碱类化合物等多元指标以完善评价体系。此外，产地对铁皮石斛多糖含量、黄酮、生物碱等存在显著影响[19−20]。黄月纯等[21]建立了铁皮石斛叶黄酮类成分的特征图谱，发现丹霞地貌种源（广东、福建、浙江、江西）、浙江本地种、铁皮兰种（广西、云南）特征图谱存在显著差异；梁芷韵等[22]优化了铁皮石斛黄酮类成分的特征图谱方法，并初步确定鉴别丹霞地貌种源、浙江本地种、铁皮兰种的特征黄酮成分；张小凤等[23]通过HPLC、ESI-MSn、1H-NMR、13C-NMR技术手段鉴别了丹霞种、云南广南种、广西铁皮兰种、浙江本地种的共性及个性黄酮类成分。课题组前期发现广西铁皮兰种茎的颜色有紫红色（红杆）与绿色（绿杆）之分，且红杆、绿杆、不同生长年限样品的醇提物对Hela、HepG-2的抗增殖活性具有显著性差异[24]。《中国药典》铁皮石斛项下只列了铁皮石斛的采收季节，对于生长年限没有做出规定。因此，为进一步探讨不同生长年限对铁皮石斛黄酮类成分积累规律的影响，本研究结合课题组前期研究，采用HPLC-ESI-MSn技术对广西铁皮兰种黄酮类成分进行鉴定分析，同时采用HPLC法建立其黄酮类成分特征图谱，结合聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）等化学计量模式方法，探讨不同生长年限对铁皮石斛黄酮类成分积累的影响，及不同品种（红杆、绿杆）黄酮类成分的差异，为铁皮石斛的采收和临床应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新西兰牡荆苷 Ⅱ 纯度≥98%、新西兰牡荆苷 Ⅲ 纯度≥98%，购自上海诗丹德生物技术有限公司；新西兰牡荆苷 Ⅰ、佛莱心苷和异佛莱心苷 广州中医药大学课题组自制，经HPLC-ESI-MSn、13C-NMR 和 1H-NMR核磁共振等技术确认，面积归一化法计算，确定新西兰牡荆苷Ⅰ和异佛莱心苷纯度≥98%，佛莱心苷纯度≥90.2%；乙腈 色谱纯，德国Merk公司；甲醇 色谱纯，德国Merk公司；水为蒸馏水；其它试剂均为分析纯；25批铁皮石斛样品 广西仿野生铁皮石斛不同生长年限的样品（表1），经广州中医药大学魏刚研究员鉴定为铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo 的干燥茎。
表 1 25批广西铁皮石斛样品信息Table 1. Information of 25 batches of D.officinale from Guangxi序号 编号 栽培模式 生长年限 序号 编号 栽培模式 生长年限 1 WG-01 仿野生 1~3年 14 WR-02 仿野生 1~3年 2 WG-02 仿野生 1~3年 15 WR-03 仿野生 1~3年 3 WG-03 仿野生 1~3年 16 WR-04 仿野生 1~3年 4 WG-04 仿野生 1~3年 17 WR-05 仿野生 1~3年 5 WG-05 仿野生 1~3年 18 WR-06 仿野生 1~3年 6 WG-06 仿野生 3~5年 19 WR-07 仿野生 1~3年 7 WG-07 仿野生 3~5年 20 WR-08 仿野生 3~5年 8 WG-08 仿野生 3~5年 21 WR-09 仿野生 3~5年 9 WG-09 仿野生 3~5年 22 WR-10 仿野生 3~5年 10 WG-10 仿野生 3~5年 23 WR-11 仿野生 3~5年 11 WG-11 仿野生 3~5年 24 WR-12 仿野生 3~5年 12 WG-12 仿野生 3~5年 25 WR-13 仿野生 3~5年 13 WR-01 仿野生 1~3年 注：WG样品茎为绿色，WR样品茎为紫红色。 LCQ Fleet离子阱液质联用仪 美国Thermo Fisher Scientific 公司；Agilent HP1260高效液相色谱仪 美国 Agilent 公司；MS 204S（d=0.1 mg）电子天平、MS 105DU（d=0.01 mg）电子天平 瑞士 Mettler Toledo 公司；KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HWS24 型电热恒温水浴锅、DHG-9245A 型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 供试品溶液的制备
取铁皮石斛鲜品洗净，去除其根、叶，取其茎，切碎后采用60 ℃低温热风干燥，干品粉碎，过四号筛。样品粉末4 ℃存放，备用。精密称取样品粉末1 g，加入100%甲醇50 mL，超声处理1 h，取出，放至室温，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至1 mL容量瓶中，甲醇定容。使用前摇匀，过 0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液用于HPLC-ESI-MSn分析，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液用于HPLC特征图谱分析。
1.2.2 对照品溶液的制备
分别取新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、新西兰牡荆苷Ⅲ、佛莱心苷和异佛莱心苷对照品适量，精密称定，制成每1 mL含新西兰牡荆苷Ⅱ 23.594 μg、新西兰牡荆苷Ⅰ9.898 μg、新西兰牡荆苷Ⅲ 8.028 μg、佛莱心苷21.35 μg、异佛莱心苷24.03 μg的混合对照品溶液。
1.2.3 黄酮类成分分析
1.2.3.1 色谱条件
Kromasil 100-5 C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温40 ℃，体积流量0.8 mL/min，进样量10 μL，检测波长为340 nm；流动相采用乙腈-甲醇（v:v=1:1）（A）−0.01 mol·L−1 乙酸铵溶液（B）梯度洗脱：0~20 min，14%~18% A；20~35 min，18%~22% A；35~45 min，22%~26% A；45~55 min，26%~30% A；55~65 min，30%~36% A；65~75 min，36%~40% A；75~90 min，40%~60% A。
1.2.3.2 质谱条件
采用负离子扫描模式；离子化方式：ESI（−）；电喷雾电压3.0 kV；毛细管电压−45 kV；碰撞能量30%。毛细管温度350 ℃；鞘气流速30 L/min；辅助气流速10 L/min；扫描范围m/z 100~1500；碰撞气为氦气。数据处理采用Thermo Xcalibur Qual Browser软件。
1.2.4 HPLC特征图谱的建立及分析
1.2.4.1 色谱条件
同“1.2.3.1”项下色谱分析方法。
1.2.4.2 精密度试验
按“1.2.4.1”项下色谱条件，精密吸取同一供试品溶液（WG-01），连续进样6次，采集共有峰的保留时间和峰面积，计算其RSD值。
1.2.4.3 稳定性试验
按“1.2.4.1”项下色谱条件，精密吸取同一供试品溶液（WG-01），分别于0、4、8、12、16、24 h进样，采集共有峰的保留时间和峰面积，计算其RSD值。
1.2.4.4 重复性试验
取同一批样品6份（WG-01），按“1.2.4.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，采集共有峰的保留时间和峰面积，计算得到其RSD值。
1.2.4.5 样品分析
分别取25批不同生长年限的广西桂平仿野生红杆铁皮石斛及绿杆铁皮石斛样品，精密称定，按“1.2.1 ”项下供试品配制方法进行制样，按“1.2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录生成 HPLC图，将采集的所有样品数据转化为“CDF”格式文件，导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行分析，并对所得样品数据进行化学模式识别研究。
1.3 数据处理
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A 版）建立广西铁皮石斛样品照特征图谱及相似度分析；采用SPSS 20.0软件对25批次铁皮石斛色谱数据中的共有峰峰面积进行聚类分析和主成分分析及方差分析；采用SIMCA 13.0软件对共有峰峰面积进行OPLS-DA等多变量统计分析。
2. 结果与分析
2.1 黄酮类成分分析结果
通过HPLC-ESI-MSn分析，结合文献及对照品保留时间，共鉴别了19个黄酮类成分，包括9个黄酮碳苷，4个黄酮醇氧苷，2个酰化黄酮碳苷，3个酰化黄酮醇氧苷和1个二氢黄酮。广西铁皮石斛的总离子流图和紫外色谱图详见图1。其结构式和质谱碎片信息分别见图2和表2。
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图 1 广西铁皮石斛HPLC-ESI-MSn负离子模式总离子流图（A）和紫外色谱图（B）Figure 1. HPLC-ESI-MSn total ion current chromatogram (A) and UV chromatogram (B) of Guangxi D. officinale in negative ion mode![]()
图 2 广西铁皮石斛中黄酮类化合物的结构图Figure 2. Structures of flavonoids from D. officinale in Guangxi表 2 铁皮石斛中黄酮类成分HPLC-ESI-MSn分析Table 2. HPLC-ESI-MSn analysis of flavonoids from D. officinale in Guangxi峰号 tR
（min）化合物 分子式 相对分子质量 [M-H]− 碎片离子 1 17.74 芹菜素-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷（新西兰牡荆苷 Ⅱ）[25] C27H30O15 594 593.18 MS2：473.07（100），503.18（44），352.91（30），575.38（22），383.1（17），533.27（5），533.27（5），413.4（5）；MS3：353.18（100），383.27（15），455.22（4）；MS4：353.07（100），325.17（86），297.2（34） 2 18.98 金圣草黄素-6,8-二-C-β-D-葡萄糖苷[26] C28H32O16 624 623.22 MS2：503.17（100），383.17（41），413.06（24），532.96（13），443.32（4），329.1（2）；MS3：383.17（100），413.17（17），312.24（3）；MS4：312.1（100），383.07（55），355.39（44），327（12） 3 22.94 芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-葡萄糖苷 （新西兰
牡荆苷 Ⅰ）[25]C26H28O14 564 563.11 MS2：473.06（100），443.12（39），503.05（31），353.23（20），383.19（15），544.68（11），455.02（2）；MS3：353.23（100），383.12（25），455.11（25），473.45（20）；MS4：353.13（100），325.25（96），296.9（13） 4 32.11 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷 （新西兰
牡荆苷 Ⅲ）[26]C26H28O14 564 563.12 MS2：443.1（100），473.11（65），383.24（27），545.31（17），
352.79（11），413.14（5）；
MS3：353.05（100），383.41（6），442.91（4），311.19（4），425.12（4）；MS4：325.35（100），353.31（45），297.24（27），291.31（10）5 35.05 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷 C27H30O15 594 593.1 MS2：413.23（100），472.96（47），503.12（46），293.2（14），455.17（7），323.38（6），341.1（6）；MS3：293.18（100）；MS4：293.14（100），193（4） 6 36.07 芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷 C27H30O15 594 593.12 MS2：413.04（100），293.19（20），473.06（8），341.1（2）；MS3：293.18（100），335.19（2），365.46（1）383.39（1）；MS4：293（100），173.07（3），249.09（3），174.95（2） 7 38.62 槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖-（1→6）-β-D-葡萄糖苷 C27H30O16 610 609.22 MS2：301.09（100），300.11（57），549.03（29），297.24（16），578.89（14），519.08（12），255.03（12），297.9（10），270.98（8），526.22（6），213.07（6），465.23（6），572.84（6） 8 40.76 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-鼠李糖苷 （佛莱心苷）[26] C27H30O14 578 577.16 MS2：457.11（100），487.19（58），559.22（30），353.18（26），383.04（23），503.2（17），473.05（15），455.04（11），412.87（6），529.05（5），335.24（4）；MS3：353.16（100），383.18（47），457.37（17），439.07（7）；MS4：325.12（100），353.21（51），297.22（18） 9 41.03 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-（1→6）-β-D-葡萄糖苷（芦丁） C27H30O16 610 609.13 MS2：301.08（100），300.09（55），343.02（13），271.15（4），179.04（4），463.14（1）；MS3：179.05（100），150.98（99），271.04（28），254.9（24），301.17（17），300.07（12），193.22（6）；MS4：150.98（100），168.67（10） 10 41.95 芹菜素-6-C-鼠李糖-8-C-葡萄糖苷（异佛莱心苷）[26] C27H30O14 578 577.18 MS2：503.09（100），457.19（90），473.07（59），559.21（43），383.11（42），353.2（31），439.28（10），413.22（8），533.17（5），365.2（4），487.28（2）；MS3：383.19（100），413.37（12），365.37（7），467.44（4），454.74（3），485.57（2），MS4：383.21（100），365.2（30），324.1（17），325.16（9），354.3（6），355.14（5） 11 50.77 山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷 C27H30O15 594 593.15 MS2：284.98（100），283.92（21），367.38（20），327.16（15），267.28（10），205（8），430.97（7），246.67（7），227.05（6），224.12（6），197.03（5），366.65（5），492.85（5） 12 52.14 山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷 C27H30O15 594 593.1 MS2：285.21（100），511.23（34），367.1（19），326.97（11），368.16（9），532.92（8），284.19（6），502.19（5），239.38（5），412.97（5），255.21（4），548.1（4）；MS3：257.15（100），163.18（53），171.13（47），267.15（45），223.19（31），229.06（30），151.01（16），197.15（12）；MS4：211.12（100），239.02（60） 13 56.59 芹菜素-6,8-二-C-鼠李糖苷 C27H30O13 562 561.14 MS2：457.07（100），383.27（47），353.17（30），487.19（27），543.36（17），413.11（14），365.23（13），530.33（4）；MS3：353.17（100），439.08（47），383.17（35）；MS4：297.23（100），207.08（17），177.13（13） 14 59.78 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-（2′′,6′′-O-二-芥子酰基）-β-D-葡萄糖苷 C49H50O25 1038 1037.08 MS2：831.19（100），993.03（12），669.08（12），812.92（6），874.38（3），710.75（3），624.92（3），787.67（1），1037.47（1）；MS3：625.28（100），669.17（90），831.34（22），433.29（14），661.02（8）；MS4：352.83（100），625.17（65） 15 63.83 槲皮素-3-O-[2-O-芥子酰基-6-O-（4-（O-β-D-葡萄糖苷）-芥子酰基）]-β-D-葡萄糖苷-7-O-β-D-葡萄糖苷 C55H60O30 1200 1199.21 MS2：1037.13（100），831（41），668.87（40），463.07（17），669.5（9），1014.11（8），975.38（4），807.34（3） MS3：875.31（100），301.29（49） 16 64.39 芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-6′′-O-芥子酰基-（1→2）-β-D-
葡萄糖苷C38H40O19 800 799.19 MS2：413.01（100），293.07（54），593.25（16），679.08（16），716.77（9），325.12（7），473.24（5），431.25（2）；MS3：293.17（100）：MS4：293.17（100），249.02（6） 17 64.73 芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-6′′-O-阿魏酰基-（1→2）-β-D-
葡萄糖苷C37H38O18 770 769.19 MS2：413.09（100），293.08（28），592.79（11），341.07（8），648.39（7），593.65（5），739.27（3） 18 67.53 槲皮素-7-O-[2-（2′′-O-芥子酰基葡萄糖苷）-6′′-O-芥子酰基-葡萄糖苷]-葡萄糖苷 C49H50O25 1038 1037.11 MS2：669.05（100），831.02（8），463.05（6），973.09（3），735.29（1）；MS3：301.06（100），463.28（63），477.17（62），315.19（40），445.5（35），310.12（11），250.9（10）；MS4：301.28（100），106.72（61） 19 71.29 柚皮素[27−29] C15H12O5 272 271 MS2：151.07（100），177.06（25），107.07（15），93.17（3），199.09（3），227.26（3），165.17（2）；MS3：106.82（100），83.08（71） 2.2 铁皮石斛黄酮类成分裂解规律
铁皮石斛黄酮类成分具有一定的特征性和规律性，酰基常与糖基结合，常见的酰基主要为芥子酰基和阿魏酰基，酰基接在糖基2′′-O位时，可检测到脱去酰基和脱去整个酸分子的离子碎片；酰基接在6′′-O位时，则以检测到脱去酰基的离子碎片为主。常见的取代糖基多为葡萄糖、鼠李糖和木糖，在糖基环裂解过程中产生脱去120、104、90、74或60 Da的相关碎片离子。在黄酮碳苷中，糖基与黄酮苷元（Ag）的6-C或8-C结合时，可检测到特征碎片离子[Ag+41]−、[Ag+71]−、[Ag+41-18]−和[Ag+71-18]−；黄酮苷元的6-C和8-C位同时与糖基结合时，可检测到特征碎片离子[Ag+83]−、[Ag+113]−、[Ag+83-18]−和[Ag+113-18]−；糖基取代在6-C位时，糖基的0，2X和0，3X交叉环裂解碎片离子丰度比8-C位取代更高。在黄酮醇氧苷中，3-OH和7-OH为常见的糖基化位点，黄酮醇氧苷常以检测到脱去少一分子水的糖残基（−162、−132、−146、−324、−308 Da）和苷元碎片离子（Y0−或[Y0-H]−）为特点。在双-O-单糖苷中，糖基取代在3-O位时，会出现均裂产生的苷元碎片离子[Y3-H]−或异裂产生的碎片离子Y3−，取代在7-O位时，会出现苷元碎片离子Y7−并产生碎片离子[Y0-2H]−；在单-O-双糖苷中，一般只检测到自由基碎片离子[Y0-H]−）和碎片离子Y0−，检测不到[Y0-2H]−[29−31]。
峰1，2，3，4，8，10，13均含特征离子m/z 383 （[Ag+113]−）和m/z 353 （[Ag+41]−），推测峰1，3，4，8，10，13为芹菜素-6，8-二-C-糖苷，峰5，6，16，17均含特征离子m/z 293 （[Ag+41-18]−），推测这些峰为芹菜素-6/8-C-糖。
峰1和峰2一级质谱分别给出准分子离子m/z 593 [M-H]−和m/z 623 [M-H]−，峰1与峰2裂解途径一致，二级质谱和三级质谱均以脱去一分子葡萄糖基0，2X裂解产生的碎片（[M-H-120]−）为基峰。因此，峰1为芹菜素-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷（新西兰牡荆苷Ⅱ），峰2为金圣草黄素-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷。
峰3和峰4的一级质谱均给出准分子离子峰m/z 563 [M-H]−。峰3的二级质谱以碎片离子m/z 473 [M-H-90]−为基峰，提示取代糖为戊糖，三级质谱以脱去一分子葡萄糖环裂解碎片离子m/z 353 [M-H-210]−为基峰。峰4的二级质谱以脱去一分子葡萄糖环裂解碎片离子m/z 443 [M-H-120]−为基峰，三级质谱以碎片离子m/z 353 [M-H-210]−为基峰。结合离子对照品在液相中的保留时间，峰3和峰4分别为芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-葡萄糖苷（新西兰牡荆苷Ⅰ）和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷（新西兰牡荆苷Ⅲ）。
峰5和峰6一级质谱均给出准分子离子峰m/z 593 [M-H]−，二级质谱均以脱去苷元外侧一分子完整的葡萄糖分子的碎片离子m/z 413 [M-H-180]−为基峰，三级质谱以脱去苷元内侧糖残基的碎片离子m/z 293 [M-H-180-120]−为基峰，提示外侧葡萄糖接在内侧葡萄糖的2′′-O位。因峰5的二级质谱中葡萄糖基0，2X和0，3X交叉环裂解碎片离子m/z 473 [M-H-120]−，m/z 503 [M-H-90]−丰度高，所以推断峰5为芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷，峰6为芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷。
峰7和峰9在一级质谱中均给出准分子离子峰m/z 609 [M-H]−，二级质谱中检测到槲皮素苷元的离子碎片m/z 301 [M-H-308]−（Y0−）和m/z 300 [M-H-309]− （[Y0-H]−）以及脱去一分子鼠李糖残基的离子碎片m/z 463 [M-H-146]−，提示一个鼠李糖和葡萄糖连接在氧苷上，由于并未检出葡萄糖基的0，2X裂解产生的离子碎片，提示糖基的连接方式为鼠李糖-（1→6）-葡萄糖。结合文献和对照品在液相中的保留时间，推断峰7和峰9分别为槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖-（1→6）-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-（1→6）-β-D-葡萄糖苷（芦丁）。
峰8和峰10一级质谱均给出准分子离子m/z 577 [M-H]−，峰8二级质谱以碎片离子m/z 457 [M-H-120]−为基峰并检测到高丰度的m/z 487 [M-H-90]−，提示6-C位为葡萄糖基取代。三级质谱以m/z 353 [M-H-120-104]−为基峰，提示8-C位为鼠李糖取代。峰10二级质谱以m/z 503 [M-H-74]−为基峰，三级质谱以m/z 383 [M-H-74-120]−为基峰；结合对照品在液相中的保留时间，推断峰8为芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-鼠李糖苷（佛莱心苷），峰10为芹菜素-6-C-鼠李糖-8-C-葡萄糖苷（异佛莱心苷）。
峰11和12在一级质谱中均给出准分子离子峰m/z 593 [M-H]−，二级质谱中检测到山奈酚苷元的离子碎片m/z 285 [M-H-308]−和m/z 284 [M-H-309]−以及脱去一分子葡萄糖残基的离子碎片m/z 431 [M-H-162]−和鼠李糖0，2X裂解产生的离子碎片m/z 327 [M-H-162-104]−，因此，推断峰11和12分别为山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷。
峰13一级质谱给出准分子离子峰m/z 561 [M-H]−，二级质谱与三级质谱均以脱去一分子鼠李糖基0，2X裂解产生的碎片（[M-H-104]−）为基峰，因此推测峰13为芹菜素-6，8-二-C-β-D-鼠李糖苷。
峰14和峰18在一级质谱中都给出准分子离子峰m/z 1037 [M-H]−。峰14的二级质谱和三级质谱都以脱去一分子芥子酰基的碎片离子m/z 831 [M-H-206]−和m/z 625 [M-H-206-206]−为基峰。这表明峰14含有两分子芥子酰基。二级质谱中检测到的均裂产生的离子碎片m/z 874 [M-H-163]−（[Y3-H]−）提示葡萄糖基单取代在3-O位。二级质谱还检测到脱去整个酸分子的离子碎片m/z 813 [M-H-224]−，提示两个芥子酰基分别取代在7-O位葡萄糖基的2′′-O和6′′-O位。因此，峰14被推断为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-（2′′,6′′-O-二-芥子酰基）-β-D-葡萄糖苷。峰18的二级质谱和三级质谱均以脱去368 Da的碎片离子m/z 669 [M-H-368]−和m/z 301 [M-H-368-368]−为基峰。此外，二级质谱和三级质谱还检测到脱去芥子酰基的离子碎片m/z 831 [M-H-206]−和m/z 463 [M-H-368-206]−。这表明18以槲皮素为苷元，并包含两分子芥子酰基-葡萄糖残基。在质谱中仅检测到苷元碎片m/z 301（Y0−），未检测到m/z 300（[Y0-H]−），提示其为7-O位的单取代双糖苷。此外，三级质谱还检测到了脱去整个酸分子的离子碎片m/z 445 [M-H-368-224]−，提示在内侧的芥子酰基-葡萄糖残基为2′′-O位取代。因此，峰18为槲皮素-7-O-[2-O-芥子酰基-（6-O-芥子酰基-葡萄糖苷）]-葡萄糖苷。
峰15在一级质谱中给出准分子离子峰m/z 1199 [M-H]−、碎片离子m/z 831 [M-H-368]−、m/z 463 [M-H-368-368]−、m/z 301 [M-H-162-368-368]−提示峰15的苷元为槲皮素，并含有三分子葡萄糖和两分子芥子酰基。离子碎片m/z 975 [M-H-224]−提示有一分子芥子酰基接为2′′-O位取代。二级和三级质谱均以脱去一分子葡萄糖残基的离子碎片m/z 1037 [M-H-162]−和m/z 875 [M-H-162-162]−，但没有发现脱去两分子葡萄糖的碎片。结合7-O位产生的碎片离子丰度较大，推测7-O位为葡萄糖基单取代。又因有直接脱去芥子酰基-葡萄糖残基的碎片离子m/z 831，且3-O位的葡萄糖不相连，因此推测峰15为槲皮素-3-O-[2-O-芥子酰基-6-O-（4-（O-β-D-葡萄糖苷）-芥子酰基）]-β-D-葡萄糖苷-7-O-β-D-葡萄糖苷。
峰16和峰17 在一级质谱中给出准分子离子峰m/z 799 [M-H]−和m/z 769 [M-H]−，二级质谱中，它们均以碎片离子m/z 413 [M-H-Acyl-180]−为基峰，并检测出相应的脱去酰基的离子碎片m/z 593 [M-H-Acyl]−。然而，并未检测到脱去整个酸分子的离子碎片，提示峰16和峰17分别脱去了接在糖基6′′-O位的分子量为206 Da的芥子酰基和176 Da的阿魏酰基。因此，峰16被推断为芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-6′′-O-芥子酰基-（1→2）-β-D-葡萄糖苷，峰17被推断为芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-6′′-O-阿魏酰基-（1→2）-β-D-葡萄糖苷。
峰19在一级质谱中给出准分子离子峰m/z 271 [M-H]−，二级质谱检测到由RDA裂解产生的碎片离子m/z 151和丢失中性分子的碎片离子m/z 227 [M-H-44]−，三级质谱进一步丢失中性分子产生碎片离子m/z 107，峰19推断为柚皮素。
2.3 黄酮类成分特征图谱分析
2.3.1 精密度试验
测得连续进样6次各共有峰的保留时间的RSD均小于1.6%，各共有峰面积RSD均小于2.7%，表明仪器精密度良好。
2.3.2 稳定性试验
测得0、4、8、12、16、24 h进样样品各共有峰的保留时间的RSD均小于2.1%，各共有峰面积RSD均小于3.0%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.3 重复性试验
测得6份样品各共有峰的保留时间的RSD均小于3.0%，各共有峰面积RSD均小于3.0%，表明该方法重复性较好。
2.3.4 广西铁皮石斛黄酮类成分特征图谱的建立及共有峰的指认
将采集到的25批次铁皮石斛数据文件以CDF文件格式导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年版）》中，以WG-01样品图谱为参照图谱，时间窗宽度设为0.5 min，采用多点校正法得到25批次铁皮石斛叠加指纹图谱以及对照指纹图谱（R），详见图3。本研究的25批样品共指认出9个峰为共有峰。结合“2.1”质谱分析结果，9个共有峰分别为新西兰牡荆苷Ⅱ（峰1）、新西兰牡荆苷Ⅰ（峰2）、新西兰牡荆苷Ⅲ（峰3）、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷（峰4+5）、佛莱心苷（峰6）、异佛莱心苷（峰7）以及两个未知成分峰峰8和峰9。依据峰8与峰9的紫外光谱及课题组前期研究[23,25,29]，推测其应为酰化的花色苷。
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图 3 25批广西铁皮石斛样品特征图谱重叠图（A）及其共有模式图（B）Figure 3. Overlapping chromatographic fingerprints (A) and common pattern map (B) of 25 batches of D. officinale from Guangxi2.3.5 化学模式识别研究
2.3.5.1 聚类分析（HCA）
对25批广西铁皮石斛特征图谱9个共有峰峰面积进行聚类分析和主成分分析。采用组间连接法，以平方欧氏距离为分类依据，对样品进行系统聚类分析。结果如图4A所示，绿杆样品分布比较集中，相似度较高；红杆样品比较分散，差异比较大；以距离10为标准，25个批次可分为4类，红杆及其生长年限为3~5年的（WR-08、WR-09、WR-10、WR-12、WR-13）为Ⅰ类；WG-01为Ⅱ类；WR-11为Ⅲ类；其余剩下的样品为Ⅳ类；可以看出‘红杆’3~5生长年限样品与‘红杆’1~3生长年限样品、‘绿杆’1~3生长年限样品、‘绿杆’3~5生长年限样品共有峰含量差异比较大。主成分分析筛选出3个主成分，累计方差贡献率为88.583%，能够反映25批广西铁皮石斛黄酮类特征性质量差异，结果如图4B和表3所示。
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图 4 25批广西产铁皮石斛样品9个共有峰峰面积聚类树状关系图（A）和碎石图（B）Figure 4. Cluster tree of diagram of nine peak area (A) and gravel map (B) of D. officinale samples from Guangxi表 3 25批广西产铁皮石斛样品主成分特征值及方差贡献率Table 3. Eigenvalues and variance contribution rate of 25 batches of D. officinale from Guangxi主成分 特征值 方差贡献率（%） 累计方差贡献率（%） 1 4.552 56.906 56.906 2 1.412 17.649 74.554 3 1.122 14.029 88.583 2.3.5.2 偏最小二乘法-判别分析
采用SIMCA 13.0软件对25批广西铁皮石斛特征图谱共有峰峰面积进行OPLS-DA 等多变量统计分析。在PCA中，结果同HCA，绿杆样品比较集中；红杆样品存在分散情况，表明红杆样品1~3年生和3~5年生铁皮石斛黄酮相对含量存在较大差异；如图5所示。当数据经过均一化之后，OPLS-DA可清晰的区分不同品种及不同年限的样品。如图6所示，可分为4组，分别为绿杆铁皮石斛1~3年生长年限样品（WG1-3）、绿杆铁皮石斛3~5年生长年限样品（WG3-5）、红杆铁皮石斛1~3年生长年限样品（WR1-3）、红杆铁皮石斛3~5年生长年限样品（WR3-5）。
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图 6 25批广西产铁皮石斛样品OPLS-DA图Figure 6. OPLS-DA plot of 25 batches of D. officinale from Guangxi2.3.5.3 25批不同年份的广西产铁皮石斛样品共有成分分析
根据偏最小二乘法-判别分析及聚类分析的结果将25批广西铁皮石斛按照茎的颜色及其生长年份进行分类分析，分为4组，分别为第一组：铁皮石斛茎颜色为绿色、生长年限为1~3年（WG1-3）；第二组：铁皮石斛茎颜色为绿色、生长年限为3~5年（WG3-5）；第三组：铁皮石斛茎颜色为紫红色、生长年限为1~3年（WR1-3）；第四组：铁皮石斛茎颜色为紫红色、生长年限为3~5年（WR3-5），分类详见样品表。将分类后的每组广西铁皮石斛共有峰峰面积进行统计分析，结果详见图7。与WG1-3组比较，WG3-5组峰1、峰4+峰5、峰6的峰面积均明显增高（P<0.05）；WR3-5组7个共有峰峰面积均显著性增高（P<0.01）；与WR1-3组比较，WR3-5组7个共有峰峰面积均明显增高（P<0.05）；结果表明，生长年限是影响铁皮石斛黄酮类成分积累的主要原因之一，且随着生长年限的增加而增加。与WG1-3组比较，WR1-3组一个共有峰（峰8）峰面积均显著性增高（P<0.01）；与WG3-5组比较，WR3-5组5个共有峰峰峰面积均明显增高（P<0.05）；表明，1~3年生‘红杆’与‘绿杆’共有黄酮类成分含量差异不明显；3~5年生‘红杆’样品的新西兰牡荆苷Ⅰ、新西兰牡荆苷Ⅲ、佛莱心苷、峰8、峰9含量明显比与‘绿杆’的高，其中以佛莱心苷、峰8、以及峰9的差异最为明显。
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图 7 25批不同年份的广西产铁皮石斛样品共有峰峰面积柱形图注：“*” 与WG1-3组比较，P<0.05，“**” P<0.01；“#” 与WR1-3组比较，P<0.05，“##” P<0.01；“ΔΔ”与WG3-5组比较，P<0.01。Figure 7. Bar chart of the peak area of common peaks in 25 batches of D. officinale from Guangxi from different years3. 讨论与结论
广西为铁皮石斛的道地产地之一，‘红杆’铁皮石斛、‘绿杆’铁皮石斛为其最为常见的两个品种，为比较这两品种黄酮类成分积累规律，本研究采集了‘红杆’1~3年生的样品7个，‘红杆’1~3年生的样品6个，‘绿杆’1~3年生的样品5个，‘绿杆’3~5年生的样品7个。25批样品的指纹图谱相似度较低，聚类分析分为4类，分析相对峰面积，表明生长年限是影响铁皮石斛黄酮类成分积累的重要原因。生长年限为3-5年时，‘红杆’的黄酮类成分新西兰牡荆苷Ⅰ、新西兰牡荆苷Ⅲ、佛莱心苷等含量比‘绿杆’的高。Yu等[32]研究也表明‘红杆’铁皮石斛黄酮类成分含量比‘绿杆’较高；Liu等[33]研究表明霍山石斛、铁皮石斛1~4年生长年限黄酮类黄酮含量存在明显差异；表明生长年限是影响黄酮积累的重要因素，而且不同品种皮石斛中黄酮类成分具有一定的差异。而且，黄酮类物质的积累还受到F30′H基因（LOC110096779）和两个F30′5′H基因[33]、光信号[34]、转录因子DoHY5[35]的调控。
本研究通过对广西不同品种（‘红杆’、‘绿杆’）不同生长年限铁皮石斛样品中黄酮类成分的研究，探讨其黄酮类成分的差异积累，这对铁皮石斛的种植、加工和利用具有重要的指导意义。然而，本研究的样本量较少，只对广西仿野生‘红杆’和‘绿杆’铁皮石斛样品进行了分析，可能会影响结果的稳定性和可靠性。进一步的研究可以扩大样本量，并结合其他地区和品种的铁皮石斛进行比较，以更全面地了解不同因素对铁皮石斛中黄酮类成分的影响。此外，本研究没有对黄酮类成分与生长环境因素之间的关系进行深入探究，这也是未来研究的方向之一。
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图 1 广西铁皮石斛HPLC-ESI-MSn负离子模式总离子流图（A）和紫外色谱图（B）
Figure 1. HPLC-ESI-MSn total ion current chromatogram (A) and UV chromatogram (B) of Guangxi D. officinale in negative ion mode
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图 2 广西铁皮石斛中黄酮类化合物的结构图
Figure 2. Structures of flavonoids from D. officinale in Guangxi
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图 3 25批广西铁皮石斛样品特征图谱重叠图（A）及其共有模式图（B）
Figure 3. Overlapping chromatographic fingerprints (A) and common pattern map (B) of 25 batches of D. officinale from Guangxi
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图 4 25批广西产铁皮石斛样品9个共有峰峰面积聚类树状关系图（A）和碎石图（B）
Figure 4. Cluster tree of diagram of nine peak area (A) and gravel map (B) of D. officinale samples from Guangxi
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图 6 25批广西产铁皮石斛样品OPLS-DA图
Figure 6. OPLS-DA plot of 25 batches of D. officinale from Guangxi
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图 7 25批不同年份的广西产铁皮石斛样品共有峰峰面积柱形图
注：“*” 与WG1-3组比较，P<0.05，“**” P<0.01；“#” 与WR1-3组比较，P<0.05，“##” P<0.01；“ΔΔ”与WG3-5组比较，P<0.01。
Figure 7. Bar chart of the peak area of common peaks in 25 batches of D. officinale from Guangxi from different years
表 1 25批广西铁皮石斛样品信息
Table 1 Information of 25 batches of D.officinale from Guangxi
序号 编号 栽培模式 生长年限 序号 编号 栽培模式 生长年限 1 WG-01 仿野生 1~3年 14 WR-02 仿野生 1~3年 2 WG-02 仿野生 1~3年 15 WR-03 仿野生 1~3年 3 WG-03 仿野生 1~3年 16 WR-04 仿野生 1~3年 4 WG-04 仿野生 1~3年 17 WR-05 仿野生 1~3年 5 WG-05 仿野生 1~3年 18 WR-06 仿野生 1~3年 6 WG-06 仿野生 3~5年 19 WR-07 仿野生 1~3年 7 WG-07 仿野生 3~5年 20 WR-08 仿野生 3~5年 8 WG-08 仿野生 3~5年 21 WR-09 仿野生 3~5年 9 WG-09 仿野生 3~5年 22 WR-10 仿野生 3~5年 10 WG-10 仿野生 3~5年 23 WR-11 仿野生 3~5年 11 WG-11 仿野生 3~5年 24 WR-12 仿野生 3~5年 12 WG-12 仿野生 3~5年 25 WR-13 仿野生 3~5年 13 WR-01 仿野生 1~3年 注：WG样品茎为绿色，WR样品茎为紫红色。 
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表 2 铁皮石斛中黄酮类成分HPLC-ESI-MSn分析
Table 2 HPLC-ESI-MSn analysis of flavonoids from D. officinale in Guangxi
峰号 tR
（min）化合物 分子式 相对分子质量 [M-H]− 碎片离子 1 17.74 芹菜素-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷（新西兰牡荆苷 Ⅱ）[25] C27H30O15 594 593.18 MS2：473.07（100），503.18（44），352.91（30），575.38（22），383.1（17），533.27（5），533.27（5），413.4（5）；MS3：353.18（100），383.27（15），455.22（4）；MS4：353.07（100），325.17（86），297.2（34） 2 18.98 金圣草黄素-6,8-二-C-β-D-葡萄糖苷[26] C28H32O16 624 623.22 MS2：503.17（100），383.17（41），413.06（24），532.96（13），443.32（4），329.1（2）；MS3：383.17（100），413.17（17），312.24（3）；MS4：312.1（100），383.07（55），355.39（44），327（12） 3 22.94 芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-β-D-葡萄糖苷 （新西兰
牡荆苷 Ⅰ）[25]C26H28O14 564 563.11 MS2：473.06（100），443.12（39），503.05（31），353.23（20），383.19（15），544.68（11），455.02（2）；MS3：353.23（100），383.12（25），455.11（25），473.45（20）；MS4：353.13（100），325.25（96），296.9（13） 4 32.11 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷 （新西兰
牡荆苷 Ⅲ）[26]C26H28O14 564 563.12 MS2：443.1（100），473.11（65），383.24（27），545.31（17），
352.79（11），413.14（5）；
MS3：353.05（100），383.41（6），442.91（4），311.19（4），425.12（4）；MS4：325.35（100），353.31（45），297.24（27），291.31（10）5 35.05 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷 C27H30O15 594 593.1 MS2：413.23（100），472.96（47），503.12（46），293.2（14），455.17（7），323.38（6），341.1（6）；MS3：293.18（100）；MS4：293.14（100），193（4） 6 36.07 芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷 C27H30O15 594 593.12 MS2：413.04（100），293.19（20），473.06（8），341.1（2）；MS3：293.18（100），335.19（2），365.46（1）383.39（1）；MS4：293（100），173.07（3），249.09（3），174.95（2） 7 38.62 槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖-（1→6）-β-D-葡萄糖苷 C27H30O16 610 609.22 MS2：301.09（100），300.11（57），549.03（29），297.24（16），578.89（14），519.08（12），255.03（12），297.9（10），270.98（8），526.22（6），213.07（6），465.23（6），572.84（6） 8 40.76 芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-鼠李糖苷 （佛莱心苷）[26] C27H30O14 578 577.16 MS2：457.11（100），487.19（58），559.22（30），353.18（26），383.04（23），503.2（17），473.05（15），455.04（11），412.87（6），529.05（5），335.24（4）；MS3：353.16（100），383.18（47），457.37（17），439.07（7）；MS4：325.12（100），353.21（51），297.22（18） 9 41.03 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-（1→6）-β-D-葡萄糖苷（芦丁） C27H30O16 610 609.13 MS2：301.08（100），300.09（55），343.02（13），271.15（4），179.04（4），463.14（1）；MS3：179.05（100），150.98（99），271.04（28），254.9（24），301.17（17），300.07（12），193.22（6）；MS4：150.98（100），168.67（10） 10 41.95 芹菜素-6-C-鼠李糖-8-C-葡萄糖苷（异佛莱心苷）[26] C27H30O14 578 577.18 MS2：503.09（100），457.19（90），473.07（59），559.21（43），383.11（42），353.2（31），439.28（10），413.22（8），533.17（5），365.2（4），487.28（2）；MS3：383.19（100），413.37（12），365.37（7），467.44（4），454.74（3），485.57（2），MS4：383.21（100），365.2（30），324.1（17），325.16（9），354.3（6），355.14（5） 11 50.77 山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷 C27H30O15 594 593.15 MS2：284.98（100），283.92（21），367.38（20），327.16（15），267.28（10），205（8），430.97（7），246.67（7），227.05（6），224.12（6），197.03（5），366.65（5），492.85（5） 12 52.14 山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷 C27H30O15 594 593.1 MS2：285.21（100），511.23（34），367.1（19），326.97（11），368.16（9），532.92（8），284.19（6），502.19（5），239.38（5），412.97（5），255.21（4），548.1（4）；MS3：257.15（100），163.18（53），171.13（47），267.15（45），223.19（31），229.06（30），151.01（16），197.15（12）；MS4：211.12（100），239.02（60） 13 56.59 芹菜素-6,8-二-C-鼠李糖苷 C27H30O13 562 561.14 MS2：457.07（100），383.27（47），353.17（30），487.19（27），543.36（17），413.11（14），365.23（13），530.33（4）；MS3：353.17（100），439.08（47），383.17（35）；MS4：297.23（100），207.08（17），177.13（13） 14 59.78 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-（2′′,6′′-O-二-芥子酰基）-β-D-葡萄糖苷 C49H50O25 1038 1037.08 MS2：831.19（100），993.03（12），669.08（12），812.92（6），874.38（3），710.75（3），624.92（3），787.67（1），1037.47（1）；MS3：625.28（100），669.17（90），831.34（22），433.29（14），661.02（8）；MS4：352.83（100），625.17（65） 15 63.83 槲皮素-3-O-[2-O-芥子酰基-6-O-（4-（O-β-D-葡萄糖苷）-芥子酰基）]-β-D-葡萄糖苷-7-O-β-D-葡萄糖苷 C55H60O30 1200 1199.21 MS2：1037.13（100），831（41），668.87（40），463.07（17），669.5（9），1014.11（8），975.38（4），807.34（3） MS3：875.31（100），301.29（49） 16 64.39 芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-6′′-O-芥子酰基-（1→2）-β-D-
葡萄糖苷C38H40O19 800 799.19 MS2：413.01（100），293.07（54），593.25（16），679.08（16），716.77（9），325.12（7），473.24（5），431.25（2）；MS3：293.17（100）：MS4：293.17（100），249.02（6） 17 64.73 芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖-6′′-O-阿魏酰基-（1→2）-β-D-
葡萄糖苷C37H38O18 770 769.19 MS2：413.09（100），293.08（28），592.79（11），341.07（8），648.39（7），593.65（5），739.27（3） 18 67.53 槲皮素-7-O-[2-（2′′-O-芥子酰基葡萄糖苷）-6′′-O-芥子酰基-葡萄糖苷]-葡萄糖苷 C49H50O25 1038 1037.11 MS2：669.05（100），831.02（8），463.05（6），973.09（3），735.29（1）；MS3：301.06（100），463.28（63），477.17（62），315.19（40），445.5（35），310.12（11），250.9（10）；MS4：301.28（100），106.72（61） 19 71.29 柚皮素[27−29] C15H12O5 272 271 MS2：151.07（100），177.06（25），107.07（15），93.17（3），199.09（3），227.26（3），165.17（2）；MS3：106.82（100），83.08（71）
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表 3 25批广西产铁皮石斛样品主成分特征值及方差贡献率
Table 3 Eigenvalues and variance contribution rate of 25 batches of D. officinale from Guangxi
主成分 特征值 方差贡献率（%） 累计方差贡献率（%） 1 4.552 56.906 56.906 2 1.412 17.649 74.554 3 1.122 14.029 88.583
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