Characterization and Discrimination of Prefabricated Grilled Fish with Different Packaging Methods Using Non-targeted Metabolomics
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摘要: 为探究不同包装预制烤鱼的代谢物差异，采用液相色谱-串联质谱技术，基于非靶向代谢组学方法分析比较托盒包装、真空包装和气调包装预制烤鱼的代谢物组成。结果表明，在二级质谱信息下，3种包装的预制烤鱼共鉴定出318种代谢物。依据正交偏最小二乘法判别分析模型的变量重要性投影值（variable importance projection value, VIP，VIP>1）和P<0.05，共筛选出47种差异代谢物，包括脂肪酸类10种，核苷酸类10种，氨基酸类9种，有机酸及衍生物类7种，苯及衍生物类3种，醇胺类2种，其他类6种。通过对47种差异代谢物相对含量的聚类热图分析，发现3种不同包装方式预制烤鱼的代谢物相对含量存在差异。其中，气调包装烤鱼的多种呈味氨基酸和单磷酸腺苷相对含量明显高于常规的真空和托盒包装。研究结果初步表明，气调包装对保持烤鱼鲜味有积极作用，将为烤鱼包装多样化发展提供方向。Abstract: To explore the metabolites differences of grilled fish in different packages, liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used to analyze and compare the metabolite profile of prefabricated grilled fish in tray packaging, vacuum packaging and modified atmosphere packaging through non-targeted metabolomics. The results showed that 318 metabolites were identified under secondary mass spectrometry information in the prefabricated grilled fish with different packaging. In this study, 47 differential metabolites were identified, including 10 fatty acids, 10 nucleotides, 9 amino acids, 7 organic acids and derivatives, 3 benzene and derivatives, 2 alcohol amines, and 6 unconfirmed metabolites, based on the variable importance projection value (VIP, VIP>1) and P<0.05 of the orthogonal partial least squares discriminant analysis model. Clustering heat map analysis of the relative content of 47 different metabolites was performed and the results showed differences in the relative content of metabolites in three types of packages. The relative contents of multiple flavor amino acids and adenosine monophosphate (AMP) were significantly higher in the modified atmosphere packaging than in the conventional vacuum package and tray package. The results revealed that modified atmosphere packaging effectively preserved the umami flavor of grilled fish, offering a basis for the development of novel and effective packaging for grilled fish.
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烤鱼营养丰富、风味鲜美，是重庆特色美食。在预制菜高速发展背景下，预制烤鱼因打破传统堂食烤鱼消费的时效性和地域性，成为烤鱼产业新的经济增长点[1−3]。包装方式影响肉品品质和风味[4]。目前，市售预制烤鱼主要以普通托盒和真空包装为主，烤鱼多种包装方式的研究有利于烤鱼产品多样化发展。
近年来，不同包装方式对肉制品保鲜和风味的影响研究较多[5−6]，据文献报道，水产及制品的包装方式主要有真空、充氮、气调包装等，用于冰鲜黄颡鱼[7]、鲈鱼[8]、油炸带鱼[9]、脆肉皖鱼[10]及牡蛎肉[11]中，能有效减少脂质氧化，维持鱼肉鲜度及延缓风味劣变。Dang等[12]研究发现真空包装能更有效地抑制鲶鱼片的脂肪氧化，在减少腥味物质、保持鱼肉风味方面表现出了较大优势。气调包装结合低温处理方式可控制鱼肉不良风味产生，实现较好的水产品风味保持效果[13−14]。风味是鱼肉重要的品质特征，鱼肉的风味包括气味和滋味，鱼肉中某些非挥发性物质如氨基酸类、核苷类、有机酸类、脂质类等物质除具有一定的营养功能外，同时是构成熟肉特征风味与口感的前体物质，这类物质的代谢物决定着肉质的滋味，影响鱼肉品质[15−16]。目前，预制烤鱼主要集中在单一真空包装方式下质构、水分分布及脂质氧化等品质方面[17−18]及挥发性风味物质分析方面[19−20]的研究，而针对不同包装方式预制烤鱼非挥发性化合物如脂肪酸、氨基酸、核苷酸等的代谢物研究鲜有报道。
非靶向代谢组学可分析鱼肉中蛋白质、脂质的代谢及风味变化情况，常用于食品研究中[21−23]。目前，运用非靶向代谢组学探究预制烤鱼代谢产物组成的研究较少。本实验以托盒包装（tray packaging，TP）、真空包装（vacuum packaging，VP）和气调包装（modified atmosphere packaging，MAP）的预制烤鱼为研究对象，利用液相色谱-串联质谱技术，基于非靶向代谢组学分析不同包装方式下烤鱼非挥发性物质的代谢产物组成，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）进行差异代谢物筛选，探究不同包装方式下烤鱼的代谢产物差异，以期为烤鱼包装多样化发展及品质评价提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
鲤鱼（Cyprinus carpio） 梁平养殖基地；食盐、料酒等香辛料 均购于重庆万州区家益超市；PA/EVOH/PE盖膜 希悦尔（中国）有限公司；PP包装托盒、PE真空袋 福建元晟新材料科技有限公司；甲醇、乙腈、氯仿 色谱纯，北京迪科马科技有限公司；2-氯苯丙氨酸 色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PTFE滤膜（0.22 µm） 天津市津腾实验设备有限公司。
ACQUITY型液相色谱仪（色谱柱：Waters, Milford, MA, USA） 美国Waters公司；Q-Exactive型质谱仪 美国Thermo公司；YXD-90C型电烤箱 广州市赛思达机械设备有限公司；MAP-430型气调真空包装机 浙江瑞宝包装机械有限公司；H2050R型冷冻离心机 湘仪仪器有限公司；SCRC MV54型混匀仪 国药集团化学试剂有限公司；MB-96S型组织研磨器 浙江美壁仪器有限公司；XZ-10DTD型超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 烤鱼样品制备
鲜活鲤鱼（1~1.2 kg）宰杀、清洗，背部剖开，放入6%的食盐、少许料酒、老姜的腌制液中湿法腌制20 min（鱼肉完全浸没于腌制液），50~60 ℃干燥45 min后，刷香油，250 ℃电烤箱中烤制20 min[20]。无菌冷却后，每个包装中随机放入1条烤鱼，分别进行气调包装（30% CO2+70% N2）、真空包装和托盒包装。样品于−2 ℃条件贮藏。30 d后，每组样品分别于鱼体两侧的背部、腹部和尾部3个位置6个点取样，混匀。每组样品平行取样3份，液氮冷冻后贮存于−80 ℃冰箱中，待测。
1.2.2 样品制备
称量适量样品，加入1 mL提取液（9:1甲醇-氯仿:H2O=3:1），加入3颗钢珠后放入组织研磨器中研磨（50 Hz，1 min），重复操作2次；超声（功率200 W）30 min，冰上放置30 min，离心10 min（12000 r/min，4 ℃），取上清液浓缩干燥；准确加入200 μL 2-氯苯丙氨酸（4 ng/mL）复溶样品，过膜，用于检测[24]。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm, 1.8 µm）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：2 μL。正离子模式流动相：0.1%甲酸乙腈（B1）和0.1%甲酸水（A1）；梯度洗脱程序：0~1 min，8% B1；1~8 min，8%~98% B1；8~10 min，98% B1；10~10.1 min，98%~8% B1；10.1~12 min，8% B1。负离子模式流动相：乙腈（B2）和 5 mol/L 甲酸铵水（A2），梯度洗脱程序：0~1 min，8% B2；1~8 min，8%~98% B2；8~10 min，98% B2；10~10.1 min，98%~8% B2；10.1~12 min，8% B2[25]。
1.2.4 质谱条件
使用电喷雾离子源（ESI），正负离子模式采集数据。正离子喷雾电压：3.50 kV，负离子喷雾电压：−2.50 kV；鞘气40 arb，辅助气10 arb。毛细管温度：325 ℃。以分辨率 70000进行一级全扫描扫描范围100~1000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞能量为30 eV，二级分辨率为17500，采集信号前3离子进行碎裂，同时采用动态排除无必要的MS/MS信息[26]。
1.3 数据处理
采用RXCMS（V3.12.0）软件包进行峰检测、过滤、对齐处理，得到代谢物定量列表，通过总峰面积归一化的方法进行数据矫正。通过诺米代谢自建数据库及公共数据库进行检索比对后定性。使用SIMCA-P14.1软件进行PCA和OPLS-DA分析，通过VIP值、P值进行差异物筛选。当VIP>1和P<0.05时，认为代谢物分子具有统计学显著差异。通过Origin绘图。
2. 结果与分析
2.1 预制烤鱼代谢物的鉴定概况
对托盒、真空和气调包装的烤鱼样品中提取的代谢物进行鉴定，正负离子模式下，分别鉴定出1566、1185个代谢物。将定量列表中含有二级谱图的代谢物与数据库中每个二级谱图的碎片离子等信息进行比较、匹配，实现代谢物的二级定性鉴定。在二级质谱信息中，3种包装的烤鱼共鉴定出318种代谢物。主要包括69种有机酸及衍生物、48种氨基酸类及代谢物、35种脂质及类脂质分子、33种核苷酸及衍生物、26种醇胺类、16种有机氧化合物、11种苯及衍生物、8种生物碱及衍生物、4种醛酮类化合物和68种其他物质。318种代谢物的化学分类及数量占比如图1所示。由此得出，烤鱼中代谢物种类较多的物质为有机酸、氨基酸、脂质、核苷酸及衍生物类，这与Li等[15]曾报道的热加工处理的罗非鱼肉中代谢物物质种类及数量占比的结果较为相似。鱼肉中氨基酸、脂质和核苷酸被认为是味觉相关化合物[23]，对烤鱼风味有重要影响。
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图 1 烤鱼中代谢物种类及数量占比Figure 1. Types and quantity proportion of metabolites in grilled fish2.2 不同包装预制烤鱼代谢产物的多元统计分析
2.2.1 主成分分析
PCA可反映各组样品间的总体差异和组内样品间的变异程度[27]。对不同包装方式预制烤鱼代谢物进行PCA分析，如图2所示。正离子和负离子模式下PC1和PC2累计贡献率分别为71.1%和71.5%，能反映样品大部分信息。得分图中3组烤鱼样品代谢物分布在不同象限，可明显区分开，说明3种包装预制烤鱼代谢产物有一定差异。正负离子模式下，VP组3个平行样代谢物较为聚集，而TP和MAP组的3个平行样有一定的离散性，这可能是因为组内样品间烤鱼个体差异导致。
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图 2 不同包装预制烤鱼代谢物的PCA得分图注：A正离子模式；B负离子模式；MAP为气调包装组；TP为托盒包装组；VP为真空包装组；图3同。Figure 2. PCA score plot of metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging2.2.2 OPLS-DA分析
OPLS-DA通过设置预设分类变量来剔除未控制变量对数据造成的影响，能进一步量化各处理组间的差异程度，是一种适用于建立物质表达量与样品类别间关系模型的有效判别分析方法[28]。TP、VP和MAP的烤鱼代谢物OPLS-DA得分图和置换检验图如图3、图4所示。在图3中得出，正负离子模式下，TP、VP和MAP组均分布于不同象限，3种包装的烤鱼代谢物具有较好的聚类效果，说明不同包装方式对预制烤鱼代谢物存在较大影响。
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图 3 不同包装预制烤鱼代谢产物的OPLS-DA得分图Figure 3. OPLS-DA score plots of metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging![]()
图 4 不同包装预制烤鱼代谢产物的置换检验图注：A正离子模式；B负离子模式。Figure 4. Permutation test plots of metabolites in prefabricated grilled fish with different packagingOPLS-DA模型中R2Y代表模型对变量Y的解释性，Q2代表模型的可预测性，R2和Q2越接近1，且差值小（差值<0.3），表明模型准确性好，有较好的解释和预测能力。由图4可知，正离子模式下，R2Y=0.968、Q2=0.804，负离子模式下R2Y=1、Q2=0.938，说明模型可很好解释不同包装预制烤鱼的代谢物差异。为避免模型出现过度拟合，对模型进行了200 次置换检验，正负离子模式下，左边随机实验值R2和Q2均低于最右边的R2和Q2值，即均小于原模型的真实值，并且R2总是大于Q2，说明原模型不存在过拟合现象，能较好分析鱼肉的代谢物信息。
2.3 不同包装预制烤鱼差异代谢物筛选
基于OPLS-DA模型，以VIP>1、P<0.05的代谢物作为3种包装烤鱼的差异代谢物，结果见表1。由表1可知，共筛选出47种差异代谢物，分别为脂肪酸类代谢物10种，核苷酸类代谢物10种，氨基酸类代谢物9种，有机酸及衍生物类7种，苯及衍生物类3种，醇胺类2种，其他类6种。脂肪酸类代谢物主要由脂肪降解和氧化产生，对鱼肉风味有重要影响。3种不同包装烤鱼样品中，硬脂酸、棕榈酸等饱和脂肪酸，亚油酸、9-十四烯酸等不饱和脂肪酸等物质在3个样品中差异显著（P<0.05），可能与包装方式影响鱼肉脂质水解及氧化程度不同有关；氨基酸具有呈味特性，如L-谷氨酸、氨甲酰天冬氨酸呈鲜味，L-苏氨酸为甜味，L-酪氨酸、组氨酸呈苦味，这些氨基酸对烤鱼滋味形成有重要贡献作用[29]；核苷酸类代谢物参与滋味物质形成及脂质降解，且AMP、鸟苷酸等为呈味核苷酸，能与谷氨酸等物质有协同增鲜作用，对烤鱼风味有促进作用；有机酸类具有呈香作用，部分有机酸因肉质变质而成。脂肪酸、氨基酸、核苷酸及有机酸类代谢物均与鱼肉的滋味密切相关[30−31]。
表 1 不同包装预制烤鱼的差异代谢物Table 1. Differential metabolites of prefabricated grilled fish with different packaging序号 ID 差异代谢物 类别 质荷比（mz） 保留时间（s） P值 VIP值 离子模式 1 M137T571 L-苏氨酸 氨基酸类 137.047 571.000 0.018 1.693 正 2 M141T177 组氨酸 氨基酸类 141.092 176.800 0.010 1.186 正 3 M148T68_2 L-谷氨酸 氨基酸类 148.061 68.100 0.024 1.628 正 4 M195T422 3-甲基-L-酪氨酸 氨基酸类 195.102 422.400 0.046 1.423 正 5 M198T53 N-乙酰-组氨酸 氨基酸类 198.088 52.900 0.004 1.780 正 6 M162T156 L-酪氨酸 氨基酸类 162.054 156.400 0.003 1.233 负 7 M285T188 N-乙酰天冬氨酰谷氨酸 氨基酸类 285.078 188.000 0.025 1.283 负 8 M177T42 氨甲酰天冬氨酸 氨基酸类 177.052 42.500 0.040 1.543 正 9 M159T107 二氨基甲酰胺 氨基酸类 159.056 106.800 0.042 1.529 正 10 M209T509 9-十四烯酸 脂肪酸类 209.191 508.600 0.035 1.615 正 11 M263T486 硬脂酸 脂肪酸类 263.238 486.300 0.000 1.764 正 12 M284T644 硬脂酰胺 脂肪酸类 284.294 644.200 0.036 1.394 正 13 M297T494 α-二吗啉酸 脂肪酸类 297.244 493.700 0.006 1.623 正 14 M263T526 亚油酸 脂肪酸类 263.238 525.600 0.010 1.697 正 15 M338T550 芥酸 脂肪酸类 338.342 550.300 0.033 1.265 正 16 M280T430 3-酮鞘氨醇 脂肪酸类 280.265 430.000 0.020 1.677 正 17 M284T664 鞘氨醇 脂肪酸类 284.295 663.800 0.012 1.667 正 18 M255T638 棕榈酸 脂肪酸类 255.231 637.600 0.031 1.446 负 19 M369T608 胆固醇 脂肪酸类 369.349 608.200 0.009 1.678 正 20 M269T63 肌苷 核苷酸类 269.088 62.800 0.036 1.245 正 21 M243T62 尿苷 核苷酸类 243.059 62.500 0.029 1.272 负 22 M112T37 尿嘧啶 核苷酸类 112.018 36.900 0.001 1.871 正 23 M268T60 腺苷 核苷酸类 268.105 60.500 0.035 1.544 正 24 M330T331 腺苷酸 核苷酸类 330.219 330.700 0.001 1.421 正 25 M364T571 鸟苷酸 核苷酸类 364.343 570.800 0.000 1.560 正 26 M229T45 α-D-核糖核酸 核苷酸类 229.010 45.300 0.032 1.123 负 27 M134T191 腺嘌呤 核苷酸类 134.046 191.100 0.039 1.054 负 28 M137T353 次黄嘌呤 核苷酸类 137.047 352.80 0.046 1.573 正 29 M153T60 黄嘌呤 核苷酸类 153.041 59.80 0.002 1.813 正 30 M135T348 对烯丙基苯酚 苯及衍生物类 135.081 347.500 0.024 1.219 正 31 M136T641_2 4-甲氧基苯甲醛 苯及衍生物类 136.049 640.600 0.028 1.428 正 32 M154T51 3-羟基-2氨基-苯甲酸 苯及衍生物类 154.059 51.100 0.034 1.256 正 33 M133T54 苹果酸 有机酸类 133.049 53.5 0.0018 1.813 正 34 M191T38 柠檬酸 有机酸类 190.926 37.700 0.002 1.807 负 35 M137T51 尿刊酸 有机酸类 137.034 50.700 0.022 1.583 负 36 M173T240 喹啉-4-羧酸 有机酸类 173.116 240.300 0.030 1.554 负 37 M215T671 12-羟基十二烷酸 有机酸类 215.008 671.000 0.014 1.704 负 38 M146T688_2 （S）-2-氨基-6-氧代己酸 有机酸类 146.081 688.200 0.000 1.672 正 39 M148T70 2-羟基戊二酸 有机酸类 148.043 70.200 0.004 1.189 正 40 M182T45 半乳糖醇 醇类 182.093 45.300 0.021 1.431 正 41 M226T312 胆色素原 胺类 226.181 312.400 0.032 1.655 正 42 M116T147 谷氨酸半醛 其他类 116.048 147.200 0.043 1.309 负 43 M111T126 （1H）-咪唑-4-乙醛 其他类 111.056 126.200 0.000 1.586 正 44 M118T327 吲哚 其他类 118.066 326.900 0.010 1.035 正 45 M179T50 D-甘露糖 其他类 179.054 50.100 0.036 1.772 负 46 M104T50 胆碱 其他类 104.108 50.100 0.007 1.480 正 47 M172T501 1-（氨甲基）环己烷乙酸盐酸盐 其他类 172.134 501.200 0.047 1.491 正 2.4 预制烤鱼差异代谢物的热图分析
对上述47种差异代谢物定量矩阵数据进行数据标准化，进行差异代谢物聚类，绘制聚类热图。如图5所示，红色越深代表该代谢物相对含量越高，蓝色越深代表该代谢物相对含量越低。MAP组烤鱼中有8种代谢物相对含量较高，分别为5种氨基酸类、2种核苷酸类和1种其他类小分子物质。氨基酸类代谢物主要是蛋白质降解生成，具有一定营养价值，也是鱼肉重要的滋味物质和香味前体物质[28]。MAP组中相对含量较高的氨基酸分别为L-苏氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、3-甲基-L-酪氨酸和N-乙酰-组氨酸。这5种氨基酸在3组样品中的相对含量存在差异，可能是因为3种包装烤鱼的氨基酸代谢程度不同导致。据报道，气调包装能有效抑制肉制品中优势腐败菌的生长，改变肉品菌群结构，从而降低氨基酸代谢速率，因而表现为氨基酸相对含量较高[10,32]。MAP组中相对含量较高的核苷酸类代谢物为单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）和肌苷。其中，AMP是重要的呈味核苷酸，是衡量肉品鲜味物质指标肌苷酸（IMP）的前体物质，由鱼肉中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）在酶的催化下降解而成。据报道，AMP对鱼肉风味有增强作用，可抑制水产品的苦味，从而对提高肉品滋味有重要作用[15]。AMP在脱胺酶作用下，生成肌苷酸（inosinemonphosphate，IMP）、肌苷等下游物质，肌苷具有苦味，对鱼肉风味亦有重要影响。AMP、肌苷在3组烤鱼样品中的相对含量存在差异，可能与核苷酸代谢程度有关。综上所述，MAP组样品中，多种呈味氨基酸及鲜味核苷酸AMP相对含量较高，说明MAP对烤鱼鲜味的保持有积极作用。
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图 5 不同包装预制烤鱼差异代谢物的聚类热图注：MAP为气调包装组；TP为托盒包装组；VP为真空包装组。Figure 5. Heat map of different metabolites in prefabricated grilled fish with different packagingVP组烤鱼中有8种代谢物相对含量高，分别为4种脂肪酸类，2种氨基酸类和2种核苷酸类。脂肪酸氧化形成的醛、酮类物质是形成鱼肉风味的主要挥发成分[19]，因此脂肪酸也是烤鱼风味的前体物质。VP组中硬脂酸、9-十四烯酸、亚油酸和棕榈酸4种游离脂肪酸相对含量最高，这可能与VP组烤鱼包装内部缺氧，脂肪氧化程度减缓有关[12]。其次，VP组中N-乙酰天冬氨酰谷氨酸、L-谷氨酸相对含量高，对烤鱼鲜味有重要贡献作用。核苷酸代谢物中，尿苷和鸟苷酸（guanylate，GMP）相对含量较高，尿苷是构成动物细胞核酸的有关成分，是尿嘧啶前体物质。GMP有特殊的香菇鲜味，是重要的呈味核苷酸[33]。
TP组烤鱼的差异代谢物较多，其含量较高的代谢物主要有核苷酸类、有机酸类及醛类等小分子物质。核苷酸类代谢物主要有腺苷、腺嘌呤、次黄嘌呤和尿嘧啶，此类代谢物均为AMP降解的下游物质，其含量较高，这可能是因为TP组烤鱼核苷酸代谢进程较快，AMP脱氨降解生成下游产物，表现为AMP相对含量降低，降解产物增加。相较于VP和MAP组，TP组烤鱼的鲜味物质指标AMP、IMP相对含量低，鲜味和新鲜度下降。有机酸类代谢物中主要有尿刊酸、脲基琥珀酸、喹啉-4-羧酸、2-羟基戊二酸和α-二吗啉酸等，因为TP组中氧气含量高，微生物增长速度快，导致鱼肉产生酸性代谢产物，这与温冬玲[34]报道的鸡肉贮藏中有机酸类物质随微生物活动增加而含量增高的结果相似。TP组烤鱼中鞘氨醇、3-酮鞘氨醇、硬脂酰胺、谷氨酸半醛、1H-咪唑-4-乙醛相对含量高于VP和MAP组，可能是因为TP组烤鱼因包装内的氧气，加快烤鱼中蛋白质和脂质氧化进程，产生胺类、酸类和醛类等物质，而这些物质的积累，可能导致鱼肉风味劣变[35]。此外，TP组烤鱼中吲哚含量明显高于VP和MAP组，吲哚主要为氨基酸代谢的低级产物，产生腐败的臭味。
综上所述，3种不同包装烤鱼的差异代谢物相对含量存在差异。MAP组中相对含量较高的差异代谢物主要为游离氨基酸、AMP和肌苷；VP组的差异代谢物主要为游离脂肪酸；TP组烤鱼脂质氧化、氨基酸代谢及核苷酸代谢程度高，反映出脂质氧化产物如醛类、氨基酸代谢产物如吲哚及核苷酸代谢产物嘌呤等物质相对含量高。因此，3种包装烤鱼中，MAP能较好保持烤鱼鲜味物质，VP减少了脂质氧化程度，VP和MAP组烤鱼在指示鲜味的代谢物指标上优于TP组。
3. 结论
采用非靶向代谢组学研究不同包装预制烤鱼的非挥发性物质的代谢物情况。通过多元统计分析，3种包装方式烤鱼的代谢物具有较大差异，共筛选出47种差异代谢物，主要有脂肪酸类代谢物10种，核苷酸类代谢物10种，氨基酸类代谢物9种，有机酸及衍生物类7种，醇胺类2种，苯及衍生物类3种，其他类6种。聚类热图分析发现，MAP组烤鱼相对含量较高的代谢物主要为游离氨基酸、鲜味核苷酸AMP和肌苷；VP组含量较高的差异代谢物主要为游离脂肪酸；TP组与MAP、VP组烤鱼相比，氨基酸、脂肪酸和核苷酸代谢程度高，主要表现为其代谢的下游产物含量高。由此得出，相较于传统的烤鱼包装方式，MAP能较好保持烤鱼的鲜味物质。
风味影响预制烤鱼的品质。目前，预制烤鱼的研究主要集中在真空包装下不同原料、不同热制工艺烤鱼的挥发性风味成分等方面，本研究以预制烤鱼的不同包装方式为切入点，进行非挥发性物质代谢物的差异分析，明确了不同包装预制烤鱼的差异代谢物情况，为预制烤鱼风味的研究提供理论依据，并为拓展预制烤鱼包装多样化发展提供数据支撑。后期工作将结合不同包装方式下烤鱼贮藏过程中理化、感官、安全等品质指标进行综合分析，为预制烤鱼包装优化提供指导依据。
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图 1 烤鱼中代谢物种类及数量占比
Figure 1. Types and quantity proportion of metabolites in grilled fish
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图 2 不同包装预制烤鱼代谢物的PCA得分图
注：A正离子模式；B负离子模式；MAP为气调包装组；TP为托盒包装组；VP为真空包装组；图3同。
Figure 2. PCA score plot of metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging
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图 3 不同包装预制烤鱼代谢产物的OPLS-DA得分图
Figure 3. OPLS-DA score plots of metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging
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图 4 不同包装预制烤鱼代谢产物的置换检验图
注：A正离子模式；B负离子模式。
Figure 4. Permutation test plots of metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging
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图 5 不同包装预制烤鱼差异代谢物的聚类热图
注：MAP为气调包装组；TP为托盒包装组；VP为真空包装组。
Figure 5. Heat map of different metabolites in prefabricated grilled fish with different packaging
表 1 不同包装预制烤鱼的差异代谢物
Table 1 Differential metabolites of prefabricated grilled fish with different packaging
序号 ID 差异代谢物 类别 质荷比（mz） 保留时间（s） P值 VIP值 离子模式 1 M137T571 L-苏氨酸 氨基酸类 137.047 571.000 0.018 1.693 正 2 M141T177 组氨酸 氨基酸类 141.092 176.800 0.010 1.186 正 3 M148T68_2 L-谷氨酸 氨基酸类 148.061 68.100 0.024 1.628 正 4 M195T422 3-甲基-L-酪氨酸 氨基酸类 195.102 422.400 0.046 1.423 正 5 M198T53 N-乙酰-组氨酸 氨基酸类 198.088 52.900 0.004 1.780 正 6 M162T156 L-酪氨酸 氨基酸类 162.054 156.400 0.003 1.233 负 7 M285T188 N-乙酰天冬氨酰谷氨酸 氨基酸类 285.078 188.000 0.025 1.283 负 8 M177T42 氨甲酰天冬氨酸 氨基酸类 177.052 42.500 0.040 1.543 正 9 M159T107 二氨基甲酰胺 氨基酸类 159.056 106.800 0.042 1.529 正 10 M209T509 9-十四烯酸 脂肪酸类 209.191 508.600 0.035 1.615 正 11 M263T486 硬脂酸 脂肪酸类 263.238 486.300 0.000 1.764 正 12 M284T644 硬脂酰胺 脂肪酸类 284.294 644.200 0.036 1.394 正 13 M297T494 α-二吗啉酸 脂肪酸类 297.244 493.700 0.006 1.623 正 14 M263T526 亚油酸 脂肪酸类 263.238 525.600 0.010 1.697 正 15 M338T550 芥酸 脂肪酸类 338.342 550.300 0.033 1.265 正 16 M280T430 3-酮鞘氨醇 脂肪酸类 280.265 430.000 0.020 1.677 正 17 M284T664 鞘氨醇 脂肪酸类 284.295 663.800 0.012 1.667 正 18 M255T638 棕榈酸 脂肪酸类 255.231 637.600 0.031 1.446 负 19 M369T608 胆固醇 脂肪酸类 369.349 608.200 0.009 1.678 正 20 M269T63 肌苷 核苷酸类 269.088 62.800 0.036 1.245 正 21 M243T62 尿苷 核苷酸类 243.059 62.500 0.029 1.272 负 22 M112T37 尿嘧啶 核苷酸类 112.018 36.900 0.001 1.871 正 23 M268T60 腺苷 核苷酸类 268.105 60.500 0.035 1.544 正 24 M330T331 腺苷酸 核苷酸类 330.219 330.700 0.001 1.421 正 25 M364T571 鸟苷酸 核苷酸类 364.343 570.800 0.000 1.560 正 26 M229T45 α-D-核糖核酸 核苷酸类 229.010 45.300 0.032 1.123 负 27 M134T191 腺嘌呤 核苷酸类 134.046 191.100 0.039 1.054 负 28 M137T353 次黄嘌呤 核苷酸类 137.047 352.80 0.046 1.573 正 29 M153T60 黄嘌呤 核苷酸类 153.041 59.80 0.002 1.813 正 30 M135T348 对烯丙基苯酚 苯及衍生物类 135.081 347.500 0.024 1.219 正 31 M136T641_2 4-甲氧基苯甲醛 苯及衍生物类 136.049 640.600 0.028 1.428 正 32 M154T51 3-羟基-2氨基-苯甲酸 苯及衍生物类 154.059 51.100 0.034 1.256 正 33 M133T54 苹果酸 有机酸类 133.049 53.5 0.0018 1.813 正 34 M191T38 柠檬酸 有机酸类 190.926 37.700 0.002 1.807 负 35 M137T51 尿刊酸 有机酸类 137.034 50.700 0.022 1.583 负 36 M173T240 喹啉-4-羧酸 有机酸类 173.116 240.300 0.030 1.554 负 37 M215T671 12-羟基十二烷酸 有机酸类 215.008 671.000 0.014 1.704 负 38 M146T688_2 （S）-2-氨基-6-氧代己酸 有机酸类 146.081 688.200 0.000 1.672 正 39 M148T70 2-羟基戊二酸 有机酸类 148.043 70.200 0.004 1.189 正 40 M182T45 半乳糖醇 醇类 182.093 45.300 0.021 1.431 正 41 M226T312 胆色素原 胺类 226.181 312.400 0.032 1.655 正 42 M116T147 谷氨酸半醛 其他类 116.048 147.200 0.043 1.309 负 43 M111T126 （1H）-咪唑-4-乙醛 其他类 111.056 126.200 0.000 1.586 正 44 M118T327 吲哚 其他类 118.066 326.900 0.010 1.035 正 45 M179T50 D-甘露糖 其他类 179.054 50.100 0.036 1.772 负 46 M104T50 胆碱 其他类 104.108 50.100 0.007 1.480 正 47 M172T501 1-（氨甲基）环己烷乙酸盐酸盐 其他类 172.134 501.200 0.047 1.491 正 
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