Screening and Process Optimization of Hybrid Probiotics for Fermented Potato Juice
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摘要: 马铃薯浓汁为生产马铃薯口服液后剩余料液，其本身含有丰富的营养物质，为增强浓汁的保健功能，以其为原料，选择4株益生菌对其进行发酵，经过单菌株发酵实验，以产酸效率与活菌数为指标，得到适合浓汁发酵的植物乳杆菌A（Lactiplantibacillus plantarum A）、植物乳杆菌B（Lactiplantibacillus plantarum B）、副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei），再将其进行复配，以活菌数与感官评分为指标，对马铃薯浓汁复合益生菌发酵工艺进行优化。结果表明，复合益生菌发酵浓汁最佳工艺条件为：发酵温度37 ℃，菌株接种量1.5‰，发酵时间12 h，菌株复配比例1:1:2，此条件下得到的复合益生菌发酵马铃薯浓汁活菌数可达到12.63×108 CFU/mL，感官评分81.7分。Abstract: Concentrated juice was the remaining material liquid after the production of potato oral liquid, which itself contained rich nutrients. In order to enhance the health function of concentrated juice, four strains of probiotics were selected for fermentation using concentrated juice as raw material. After single strain fermentation experiment, Lactobacillus plantarum A, Lactobacillus plantarum B and Lactobacillus paracei suitable for concentrated juice fermentation were obtained by acid production efficiency and viable bacteria number as indicators, and then compounded, and the compound probiotics fermentation process of potato concentrated juice was optimized by using viable bacteria number and sensory score as indicators. The results showed that the optimum compound probiotics fermentation conditions of concentrated juice were as follows: fermentation temperature 37 ℃, inoculum size 1.5‰, fermentation time 12 h, strain combination ratio 1:1:2. Under these conditions, the viable bacteria number in the compound probiotics fermentation of potato concentrated juice could reach 12.63×108 CFU/mL, and sensory score was 81.7 points.
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益生菌是一种具有活性的有益微生物，乳杆菌属和双歧杆菌属为常见益生菌[1]。当其达到一定使用量（106 CFU/mL）时，对调节胃肠道生物平衡、治疗抑郁精神疾病、治疗非酒精性脂肪肝病、抗病毒等方面都具有一定作用[2−5]。目前益生菌发酵应用最成熟的食品领域主要是在乳制品方面，由于一部分人群存在乳糖不耐受等情况，导致益生菌发酵乳制品具有一定的局限性[6]。因此选用益生菌发酵除乳制品以外原料成为研究热点。
马铃薯作为四大主粮之一，在全球已经登上近1亿人的餐桌[7]，其在农业中的地位紧随玉米、小麦和大米等谷物[8]。作为拥有领先世界的马铃薯种植面积以及产量大国[9−10]，我国的马铃薯早已成为餐桌上常见的主食，因此人们对马铃薯所含有的营养物质以及保健功效也在不断深入探索。有研究表明马铃薯可以为人类日常饮食提供关键营养素[11]，其中包括维生素C、钾、氨基酸和膳食纤维[12−14]。维生素C具有抗氧化、抗病毒以及预防心血管疾病等作用[15−17]，是人体不可或缺的营养素；钾作为人体不可缺少的矿物质，在马铃薯中也具有一定含量，在预防骨质疏松等疾病方面有一定的作用[18]；在氨基酸方面，马铃薯更是拥有着非常全面的人体所必需氨基酸，比如其他谷物所缺少的赖氨酸更是含量丰富[19−20]；并且马铃薯中的其他化合物也已被证明在抗氧化、抗炎和抗高血脂方面具有一定作用[21]。
马铃薯丰富的碳源以及多种营养成分可以作为理想的益生菌发酵基质。刘媛等[22]以马铃薯全粉为原料，得到一款新型甜酒曲发酵马铃薯饮料，其具有细腻柔和的口感以及较好的香味，感官评分高达9.2。何维[23]用植物乳杆菌HQ-3为菌株，紫色马铃薯为原料在最佳工艺条件下得到一款发酵饮料，活菌数为9.38 lg（CFU/mL），感官评分为85.23。刘聪慧等[24]利用复合益生菌对马铃薯进行发酵，在经过优化的最佳发酵条件下其产品活菌数为9.3×108 CFU/mL。这说明益生菌发酵马铃薯不仅能够赋予其特殊的风味与保健功能，还可以改善马铃薯自身缺陷等问题。
马铃薯口服液由新鲜马铃薯采用低温提取和凝胶过滤层析法处理后得到的马铃薯提取液制备[25]。在制备马铃薯提取液过程中会产生大量滤渣，将其称之为浓汁，工厂生产过程中这部分浓汁通常被当作无法利用的废料被直接排放。但这些浓汁中仍然含有大量可溶性淀粉，因此将其经过酶解后可以得到足量的还原糖，这部分还原糖恰好可以为益生菌的生长和繁殖提供碳源。
本研究以浓汁为原料，植物乳杆菌A（Lactobacillus plantarum A）、植物乳杆菌B（Lactobacillus plantarum B）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracei）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）为发酵菌株，选出三株在发酵浓汁时活菌数与产酸效率都较高的菌株，将选出的几株菌进行复配，对不同菌种配比、接种量、发酵温度发酵后产品的活菌数及感官评分进行研究分析，开发一款“变废为宝”的饮料，为后续马铃薯发酵饮料的工艺优化奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
植物乳杆菌A 宁夏大学食品科学与工程学院分离保存；植物乳杆菌B、副干酪乳杆菌 丹麦Chr.Hansen公司；马铃薯 内蒙古薯元康生物科技有限公司；MRS液体培养基、MRS固体培养基 广东环凯微生物科技有限公司；氢氧化钠、氯化钠 天津鑫铂特化工有限公司；酚酞 天津永晟精细化工有限公司。
SW-CJ-2D型超净台 上海皓庄仪器有限公司；HWS-250B型恒温恒湿培养箱 天津市泰斯仪器有限公司；SX-700型灭菌锅 日本汤米仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 马铃薯浓汁的制备及发酵前处理
工艺流程如图1所示。
1.2.2 菌种活化
将冻干菌置于MRS液体培养基，以说明书要求温度培养48 h后传代2次，再将活化后的菌液接种到灭菌的马铃薯浓汁中。
1.2.3 单菌株筛选
1.2.3.1 单菌株筛选与发酵特性研究
将活化后的植物乳杆菌A、植物乳杆菌B、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracei）、嗜酸乳杆菌以1.5‰的接种量接入经过灭菌的马铃薯浓汁中，在37 ℃的条件下发酵12 h，期间每隔2 h测一次酸度。待到达发酵终点时测发酵液活菌数与酸度，选出活菌数高且产酸快的3株菌进行后续益生菌复合协同发酵试验。
1.2.3.2 复合菌株协同发酵特性研究
将挑选出的3株菌以1.5‰的接种量（双菌株接种配比1:1，3菌株接种配比1:1:1）接入马铃薯浓汁中，在37 ℃条件下发酵12 h。
1.2.4 复合菌株发酵工艺条件的确定
1.2.4.1 单因素实验
实验选择菌种接种量（0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰），发酵温度（31、34、37、40、43 ℃），菌种配比（1:1:2、2:1:1、1:2:1、1:1:1、2:1:2、1:2:2、2:2:1），发酵时间（4、6、8、10、12 h）进行单因素实验，以活菌数和酸度为指标，研究不同因素对发酵工艺的影响。
1.2.4.2 正交试验
以马铃薯浓汁发酵时间、发酵温度、复合菌种配比、发酵菌株接种量为因素，结合分析单因素结果和L9（34）正交试验设计方法（表1），得到浓汁最佳发酵工艺条件。
表 1 发酵工艺正交试验因素水平设计Table 1. Fermentation process orthogonal test factor level design水平 A发酵温度（℃） B接种量（‰） C菌种配比 D发酵时间（h） 1 34 0.5 2:1:1 8 2 37 1 2:2:1 10 3 40 1.5 1:1:2 12 1.2.5 指标测定方法
酸度：氢氧化钠直接滴定法，最后得到的酸度数值均以乳酸计；活菌数：MRS固体培养基平板计数法，37 ℃培养48 h[26]；
1.2.6 感官评定
参照葛永辉等[27]、袁辛锐等[28]的方法制定发酵饮料感官评分标准，产品在4 ℃条件下后熟1 d，请10名具有专业背景的老师与同学从色泽、口感、香气、形态方面进行评分。评分标准见表2。
表 2 感官评分标准Table 2. Sensory rating criteria指标 评分标准 分数（分）
色泽
（0~25分）呈现棕黑色，色泽均匀透彻 20~25 呈现较不明显棕黑色，色泽较均匀 10~19 不能呈现棕黑色，色泽不均匀，有杂色 <8
口感
（0~25分）口感协调，酸甜适中 20~25 口感较协调，酸味稍重 10~19 口感不协调，酸味过重 <8
香气
（0~25分）香气协调，具有特殊薯汁发酵香味 20~25 香气适中，特殊薯汁发酵香味较淡 10~19 香气不协调，无特殊薯汁发酵香味，有其他杂味 <8
形态
（0~25分）饮料形态均匀，无沉淀 20~25 饮料形态较均匀，略有沉淀 10~19 饮料形态不均匀，有沉淀 <8 1.3 数据处理
运用SPSS22.0进行方差分析和差异显著性分析，P<0.05表示具有显著性差异。并采用Origin软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 单菌株筛选与发酵特性的研究
2.1.1 单菌株活菌数
由图2可知经过12 h的发酵，发酵浓汁中的活菌数均在108 CFU/mL以上，符合益生菌发酵饮料的活菌数要求标准。到达发酵终点时，植物乳杆菌A、植物乳杆菌B、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌在发酵浓汁中活菌数有明显差异，嗜酸乳杆菌的活菌数为4.1×108 CFU/mL显著（P<0.05）低于其他3株菌；植物乳杆菌A的活菌数为1.03×109 CFU/mL，显著（P<0.05）高于其他菌株，这一结果说明植物乳杆菌A相较于嗜酸乳杆菌更适合在马铃薯浓汁中生长。
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2.1.2 单菌株产酸性能
由图3可知，随着发酵时间的增加，发酵浓汁的酸度显著升高，各菌株之间的产酸能力也存在一定差异。植物乳杆菌A和植物乳杆菌B的酸度在发酵12 h分别达到了9.36 g/kg和9.68 g/kg，并且由斜率可以看出其产酸速度均高于其他2株菌，由此可知在马铃薯浓汁中2株植物乳杆菌的性能都得到了很好的发挥，并且其高效得产酸效率也大大降低了发酵过程中马铃薯浓汁被污染的风险。副干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌在发酵0~8 h之间产酸效率较高，随着发酵时间的增加其产酸能力逐渐下降，这有可能是因为繁殖过程中代谢产出大量乳酸等酸类化合物[29]，在后续发酵过程中对菌株的生长发育与性能造成一定的影响。
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图 3 单菌株发酵马铃薯浓汁酸度变化Figure 3. Acidity change of potato juice fermented by single strain2.2 复合菌株协同发酵性能的研究
2.2.1 复合菌株协同发酵活菌数
由上可知嗜酸乳杆菌在马铃薯浓汁中的发酵性能相较于其他3株菌较差，因此只选用植物乳杆菌A、植物乳杆菌B、副干酪乳杆菌进行复合菌株协同发酵。不同菌株组合发酵浓汁活菌数如图4所示。
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图 4 复合菌株发酵马铃薯浓汁12 h活菌数注：A：植物乳杆菌A；B：植物乳杆菌B；C：副干酪乳杆菌。Figure 4. Viable number at 12 h of fermented potato juice by composite strains由图4可以看出，复合菌株协同发酵与单菌株发酵活菌数具有一定差异。经过12 h发酵复合菌株发酵浓汁活菌数均高于单菌株发酵浓汁，这有可能是复合菌株之间存在互利共生机制。其中ABC组合活菌数相较于其他组合略高，发酵12 h后达到了1.43×109 CFU/mL。
2.2.2 复合菌株协同发酵产酸性能
发酵条件与接种量见1.2.3.2，不同菌株组合协同发酵浓汁酸度如图5所示。
由图5可知，复合菌株发酵过程中各组合产酸性能差异明显，ABC组合在4~6 h之间产酸效率达到了1.44 g/kg·h−1，根据斜率可以判断其产酸速度高于组合AB（0.22 g/kg·h−1）、组合AC（0.62 g/kg·h−1）和组合BC（0.43 g/kg·h−1）。发酵速度快，不止可以降低产品被污染风险，还可以减少成本、降低不必要的能源损耗。
2.3 复合菌株协同发酵单因素实验
2.3.1 发酵时间对复合菌株发酵马铃薯浓汁的影响
由图6可知，活菌数与发酵时间呈正相关，在发酵10 h之后其活菌数达到了109 CFU/mL以上；感官评分则呈现出了先上升后下降的趋势，这一原因的出现有可能是菌株发酵过程中将大量碳源转化为乳酸，从而使得其口感逐渐酸化所导致的。因此综合考虑最佳发酵时间应该为10 h，此时感官评分仅出现细微变化，而且活菌数也达到了1.01×109 CFU/mL，完全符合益生菌发酵饮料的要求。
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图 6 复合菌株发酵时间对马铃薯浓汁感官评分与活菌数的影响Figure 6. Effects of fermentation time of composite strains on sensory score and viable bacteria count of potato juice2.3.2 发酵温度对复合菌株发酵马铃薯浓汁的影响
由图7可知，当发酵温度为37 ℃时，产品活菌数为1.22×109 CFU/mL，感官评分82分，与34 ℃相比略高，相较于其他几个温度活菌数差异显著（P<0.05），当温度达到40 ℃时活菌数开始明显下降，感官评分也逐步下降，导致产品中活菌数下降的原因有可能是因为菌株耐热性较差，持续的高温发酵对其繁殖发育造成了一定的影响，进而抑制了发酵马铃薯浓汁中的活菌数；感官评分的改变则有可能是因为较高的温度使其香味物质的化学组成遭到破环，又或者是因为菌株在温度较高的条件下性能受到影响，无法产出具有特殊香味的风味物质，从而对整个发酵饮料的品质造成影响，因该饮料为益生菌发酵饮料，其中的活菌数为关键指标，所以马铃薯浓汁的最佳发酵温度应该为37 ℃。
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图 7 复合菌株发酵温度对马铃薯浓汁感官评分与活菌数的影响Figure 7. Effects of fermentation temperature of composite strains on sensory score and viable bacteria count of potato juice2.3.3 接种量对复合菌株发酵马铃薯浓汁的影响
由图8可知，随着菌株接种量不断增加，其产品中的活菌数也呈现上升趋势，接种量超过1‰之后活菌数上升趋势逐渐平稳；感官评分在接种量为1‰时最高达到81.8分，当接种量由1.5‰增加到2.5‰时感官评分显著（P<0.05）降低，这有可能是因为浓汁中的营养成分有限，不能供更多的菌株生长发育，而感官评分的下降极有可能是因为菌株添加量太高，合成大量酸类化合物，影响了产品的最终口感[30]。对感官评分与活菌数进行综合考虑，最佳接种量应为1‰。
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图 8 复合菌株接种量对发酵马铃薯浓汁感官评分与活菌数的影响Figure 8. Effects of inoculation amount of composite strains on sensory score and viable bacteria count of fermented potato juice2.3.4 复合菌株配比对发酵马铃薯浓汁的影响
为得到适宜3株菌种发酵的复配比例，以活菌数与感官评分为指标，对植物乳杆菌A、植物乳杆菌B、副干酪乳杆菌在马铃薯浓汁中的发酵情况进行分析。由图9可知，植物乳杆菌A、植物乳杆菌B、副干酪乳杆菌复配比例为1:1:2时活菌数为1.24×109 CFU/mL，感官评分82.8分；略高于2:1:1和2:2:1，差异不明显，但显著（P<0.05）高于其他复配比例，因此选择1:1:2、2:1:1、2:2:1为最佳复合菌株配比进行后续正交试验。
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图 9 复合菌株配比对发酵马铃薯浓汁感官评分与活菌数的影响Figure 9. Effects of composite strain ratio on sensory score and viable bacteria count of fermented potato juice2.4 复合菌株协同发酵马铃薯浓汁工艺正交试验结果
为获得复合菌种发酵马铃薯浓汁最佳工艺条件，在单因素实验的基础上，以发酵温度、发酵时间、接种量、菌株配比为因素，活菌数与感官评分为评价指标，进行4因素3水平正交试验结果见表3；方差分析结果见表4。
表 3 复合益生菌发酵马铃薯浓汁正交试验结果Table 3. Orthogonal experiment results of hybrid probiotics fermented potato juice试验号 发酵
温度A接种
量B菌株
配比C发酵
时间D感官
评分（分）活菌数
（108 CFU/mL）1 1 1 1 1 78.6±0.35 0.77±0.11 2 1 2 2 2 77.8±0.15 6.63±0.05 3 1 3 3 3 81.8±0.45 12.57±0.32 4 2 1 2 3 80.3±0.25 1.10±0.21 5 2 2 3 1 81.3±0.35 11.73±1.46 6 2 3 1 2 77.6±0.21 10.70±1.67 7 3 1 3 2 79.2±0.10 1.03±0.21 8 3 2 1 3 77.7±0.32 10.77±1.76 9 3 3 2 1 77.3±0.21 10.33±1.62 活菌数 K1 6.66 0.97 7.41 7.61 K2 7.84 9.71 6.02 6.22 K3 7.38 11.20 8.44 8.14 R 1.19 10.23 2.42 2.02 感官评分 K1 79.40 79.37 77.96 79.07 K2 79.73 78.93 78.47 78.20 K3 78.07 78.90 80.77 79.93 R 1.66 0.47 2.81 1.73 表 4 方差分析结果Table 4. Results analysis of variance指标 来源 平方和 自由度 均方 F 显著性
感官评分A发酵温度 14 2 7 700 ** B接种量 1.22 2 0.61 61 ** C菌株配比 40.14 2 20.07 2007 ** D发酵时间 13.52 2 6.76 676 ** 误差 0.18 18 0.01
活菌数A发酵温度 641.869 2 320.934 1.109 B接种量 55033.616 2 27516.808 95.086 ** C菌株配比 2657.602 2 1328.801 4.592 * D发酵时间 1981.447 2 990.723 3.424 误差 5208.993 18 289.389 注：*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著。 由表3可知，各因素对复合益生菌发酵马铃薯浓汁感官评分影响顺序为：菌株配比>发酵时间>发酵温度>接种量。由表4方差分析可知，接种量和菌株配比对感官评分及活菌数具有显著性影响（P<0.05），而发酵温度和发酵时间对其没有显著影响（P>0.05）。以活菌数为指标得到的复合益生菌发酵马铃薯浓汁最佳工艺为A2B3C3D3，以感官评分为指标得到的最佳工艺为A2B1C3D3，考虑到接种量（B）对感官评分的影响极小（R为0.47），而接种量（B）对活菌数影响较大（R为10.23），综合考虑复合益生菌发酵马铃薯浓汁最佳工艺为A2B3C3D3，即发酵温度37 ℃、接种量1.5‰、菌株配比1:1:2、发酵时间12 h，在此工艺条件下得到的产品活菌数为12.63×108 CFU/mL，感官评分81.7分。从接种量的单因素实验中发现，当接种量超过1‰时，产品感官评分出现下降趋势。所以造成最佳工艺感官评分略低于单因素感官评分的原因有可能是接种量超过1‰所导致的。由于本结果优于文献中何维[23]与刘聪慧等[24]在最佳发酵工艺条件下所得马铃薯发酵饮料的活菌数，说明本研究所筛选出的复合益生菌在马铃薯浓汁中具有良好的发酵性能，适合于益生菌发酵马铃薯浓汁的生产。
3. 结论
本研究通过单菌株发酵性能研究，筛选出适合马铃薯浓汁发酵的植物乳杆菌A（Lactobacillus plantarum A）、植物乳杆菌B（Lactobacillus plantarum B）和副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracei），又经过复合菌株发酵性能的研究确定出适合马铃薯浓汁发酵的复合益生菌组合，最后以单因素实验与正交试验得到了马铃薯浓汁最佳发酵工艺条件为：发酵温度37 ℃、接种量1.5‰、菌株配比1:1:2、发酵时间12 h。在此工艺条件下得到的产品活菌数为12.63×108 CFU/mL，感官评分81.7分。
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图 3 单菌株发酵马铃薯浓汁酸度变化
Figure 3. Acidity change of potato juice fermented by single strain
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图 4 复合菌株发酵马铃薯浓汁12 h活菌数
注：A：植物乳杆菌A；B：植物乳杆菌B；C：副干酪乳杆菌。
Figure 4. Viable number at 12 h of fermented potato juice by composite strains
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图 6 复合菌株发酵时间对马铃薯浓汁感官评分与活菌数的影响
Figure 6. Effects of fermentation time of composite strains on sensory score and viable bacteria count of potato juice
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图 7 复合菌株发酵温度对马铃薯浓汁感官评分与活菌数的影响
Figure 7. Effects of fermentation temperature of composite strains on sensory score and viable bacteria count of potato juice
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图 8 复合菌株接种量对发酵马铃薯浓汁感官评分与活菌数的影响
Figure 8. Effects of inoculation amount of composite strains on sensory score and viable bacteria count of fermented potato juice
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图 9 复合菌株配比对发酵马铃薯浓汁感官评分与活菌数的影响
Figure 9. Effects of composite strain ratio on sensory score and viable bacteria count of fermented potato juice
表 1 发酵工艺正交试验因素水平设计
Table 1 Fermentation process orthogonal test factor level design
水平 A发酵温度（℃） B接种量（‰） C菌种配比 D发酵时间（h） 1 34 0.5 2:1:1 8 2 37 1 2:2:1 10 3 40 1.5 1:1:2 12 
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表 2 感官评分标准
Table 2 Sensory rating criteria
指标 评分标准 分数（分）
色泽
（0~25分）呈现棕黑色，色泽均匀透彻 20~25 呈现较不明显棕黑色，色泽较均匀 10~19 不能呈现棕黑色，色泽不均匀，有杂色 <8
口感
（0~25分）口感协调，酸甜适中 20~25 口感较协调，酸味稍重 10~19 口感不协调，酸味过重 <8
香气
（0~25分）香气协调，具有特殊薯汁发酵香味 20~25 香气适中，特殊薯汁发酵香味较淡 10~19 香气不协调，无特殊薯汁发酵香味，有其他杂味 <8
形态
（0~25分）饮料形态均匀，无沉淀 20~25 饮料形态较均匀，略有沉淀 10~19 饮料形态不均匀，有沉淀 <8
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表 3 复合益生菌发酵马铃薯浓汁正交试验结果
Table 3 Orthogonal experiment results of hybrid probiotics fermented potato juice
试验号 发酵
温度A接种
量B菌株
配比C发酵
时间D感官
评分（分）活菌数
（108 CFU/mL）1 1 1 1 1 78.6±0.35 0.77±0.11 2 1 2 2 2 77.8±0.15 6.63±0.05 3 1 3 3 3 81.8±0.45 12.57±0.32 4 2 1 2 3 80.3±0.25 1.10±0.21 5 2 2 3 1 81.3±0.35 11.73±1.46 6 2 3 1 2 77.6±0.21 10.70±1.67 7 3 1 3 2 79.2±0.10 1.03±0.21 8 3 2 1 3 77.7±0.32 10.77±1.76 9 3 3 2 1 77.3±0.21 10.33±1.62 活菌数 K1 6.66 0.97 7.41 7.61 K2 7.84 9.71 6.02 6.22 K3 7.38 11.20 8.44 8.14 R 1.19 10.23 2.42 2.02 感官评分 K1 79.40 79.37 77.96 79.07 K2 79.73 78.93 78.47 78.20 K3 78.07 78.90 80.77 79.93 R 1.66 0.47 2.81 1.73
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表 4 方差分析结果
Table 4 Results analysis of variance
指标 来源 平方和 自由度 均方 F 显著性
感官评分A发酵温度 14 2 7 700 ** B接种量 1.22 2 0.61 61 ** C菌株配比 40.14 2 20.07 2007 ** D发酵时间 13.52 2 6.76 676 ** 误差 0.18 18 0.01
活菌数A发酵温度 641.869 2 320.934 1.109 B接种量 55033.616 2 27516.808 95.086 ** C菌株配比 2657.602 2 1328.801 4.592 * D发酵时间 1981.447 2 990.723 3.424 误差 5208.993 18 289.389 注：*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著。
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