Anti-skin Aging Effect of Ulva lactuca L. Extract
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摘要: 目的：研究石莼酶解提取物对D-半乳糖致衰老模型小鼠的抗衰老作用。方法：按800 mg/kg·d进行颈背部皮下注射D-半乳糖6周，建立小鼠亚急性衰老模型；提取物和VC给药28 d后，表征小鼠皮肤老化及氧化应激水平。结果：与水浸提物相比，石莼酶解提取物中可溶性总糖、蛋白质、还原糖、多酚固形物含量显著提高（P<0.05），且对羟自由基和DPPH自由基清除率及SOD活力提高5.72、7.95、13.26倍。动物实验显示，石莼酶解提取物显著改善衰老性皮肤GSH-Px、T-SOD、CAT、T-AOC活力及MDA、蛋白质羰基水平，缓解小鼠脏器萎缩；皮肤中胶原蛋白含量提高71.63%，I/III型胶原比例提高55.40%；显著提高机体抗氧化酶GSH-Px、T-SOD、CAT活力和T-AOC水平；抑制机体生物大分子的氧化降解，如降低蛋白质羰基和MDA水平（P<0.05）。结论：石莼酶解提取物可降低小鼠氧化应激水平，延缓小鼠皮肤衰老。Abstract: Objective: The anti-aging effect of enzymatic hydrolysate extract of Ulva lactuca L. on D-galactose-induced aging model mice was studied. Methods: D-galactose was subcutaneously injected into the neck and back of mice at a dose of 800 mg/kg·d for 6 weeks to establish a subacute aging model. After 28 days of administration of the extract and Vitamin C, the skin aging and oxidative stress levels of the mice were characterized. Results: Compared with the water extract, the enzymatic hydrolysate extract of Ulva lactuca L. showed significantly higher levels of soluble total sugars, proteins, reducing sugars, and polyphenol solids (P<0.05), and increased the clearance rates of hydroxyl and DPPH free radicals and superoxide dismutase (SOD) activity by 5.72, 7.95, and 13.26 times, respectively. Animal experiments showed that the enzymatic hydrolysate extract of Ulva lactuca L. significantly improved the glutathione peroxidase (GSH-Px), total superoxide dismutase (T-SOD), catalase (CAT), total antioxidant capacity (T-AOC), and malondialdehyde (MDA) and protein carbonyl levels in aging skin, and alleviated organ atrophy in mice. The collagen content in the skin increased by 71.63%, and the ratio of type I/III collagen increased by 55.40%. The enzymatic hydrolysate extract of Ulva lactuca L. significantly increased the GSH-Px, T-SOD, and CAT activity and T-AOC level in the body, and inhibited the oxidative degradation of biomolecules in the body, such as reducing protein carbonyl and MDA levels (P<0.05). Conclusion: The enzymatic hydrolysate extract of Ulva lactuca L. can reduce oxidative stress levels in mice and delay skin aging.
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Keywords:
- Ulva lactuca L. /
- enzymatic hydrolysate extract /
- D-galactose /
- model mice /
- skin ageing /
- antioxidant
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石莼（Ulva lactuca L.）是我国海边的一种常见海藻，属于绿藻门，石莼目，石莼科，石莼属，又名海白菜、绿菜、菜石莼。石莼属于暖海种类，多生于内湾中、低潮间带的石沼或岩礁中[1]。石莼的营养成分主要是多糖、蛋白质、粗纤维、脂肪、矿物质等。研究表明，石莼多糖、石莼蛋白及石莼多酚具有免疫调节、抗氧化、抑菌、降胆固醇、抗炎等作用[2−4]。据报道，石莼提取物对皮肤具有保湿、抗炎症、抗氧化、抗痤疮、抗炎、抑制黑色素生成、抗黑素瘤等保护作用[5−6]。在极端应激条件下，石莼提取物具有改善内脏重量指数、脂肪代谢、肝脏抗氧化防御和减少脂质过氧化的作用[3−7]。因此，石莼有较好的营养和保健价值。
目前，人口老龄化速度不断加快，对社会发展造成一系列影响，衰老问题已不容忽视。衰老是人体不可避免的自然规律，因氧化而加速，因抗氧化而延缓，通过增强机体的抗氧化能力进而延缓机体衰老是十分重要的研究方向。正常情况下，体内代谢所产生的少量自由基，可以在酶与非酶类抗氧化防御系统的作用下，得到迅速清除，不会出现因自由基积累过多而造成的细胞和组织损伤[4]。但如果机体内抗氧化防御系统功能出现下降，堆积过多的自由基就会对细胞造成损伤，导致皮肤衰老，而细胞损伤的增龄型累计则是衰老的原因[8]。皮肤衰老是机体衰老的主要特征，表现为皮肤失去弹性和柔软性，出现皱纹、干燥角化、色素过量沉积等[9]。因此，可通过开发天然而具有抗氧化活性的石莼酶解提取物增强机体抗氧化能力，减轻自由基对细胞的损伤，缓解皮肤衰老。
研究表明，藻类在皮肤的改善治疗中有着巨大的应用潜力[5−7]。据报道，刺海门冬（Asparagopsis armata）红藻提取物，可改善弹性蛋白皮肤组织、减少皱纹、增强抗氧化能力[10]；掌状海带（Laminaria digitata）提取物，可美白肌肤和抗紫外线[11]；目前，国内外对于石莼提取物的应用研究主要集中于食用或饲料方面，在水产养殖、废水处理等方面也有报道[3−7]，对于其活性研究，则主要集中在其对润肤、保湿、抗炎症、抗氧化保护、改善弹性蛋白作用等方面[12]。但石莼酶解提取物在小鼠体内的抗氧化作用研究鲜见报道。因此，本实验利用衰老模型，研究石莼酶解提取物对D-半乳糖诱导小鼠的抗衰老作用，为石莼酶解产品开发及利用提供理论研究基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
石莼 购于荣成市旭丰水产有限公司；雌性ICR小鼠60只，平均体质量18~22 g 购于青岛琴大生物科技有限公司；总蛋白定量测试盒、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒、过氧化氢酶（CAT）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒、谷胱甘肽（GSH）测试盒 均采购于南京建成生物科技公司；小鼠羟脯氨酸（HYP）、ELISA检测试剂盒 采购于美国R&D公司；D-半乳糖（D-galactose，D-gal）、维生素C（Vitamin C，VC）、冰醋酸、硫化钠、氯化钠 均为国产分析纯，采购于国药集团化学试剂有限公司；β-葡聚糖酶（酶活40000 U/g） 采购于宁夏和氏璧生物技术有限公司；石莼多糖降解酶（酶活2 U/mL） 由中国海洋大学食品科学与工程学院提供[13]。
722N分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；ME16202精密天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司；FD-1-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；DHG-9147A电热鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；Thermo Fisher高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TECAN Infinite E Plex酶标仪 帝肯（上海）贸易有限公司；Bioprep-6生物样品均质仪 杭州奥盛仪器有限公司；OLYMPUS（BX60）金相显微镜 日本奥林巴斯株式会社；OLYMPUS（BX41）偏光显微镜 日本奥林巴斯株式会社。
1.2 实验方法
1.2.1 石莼酶解提取物的制备
取10 g石莼片烘干，粉碎后过100目筛可得石莼粉，加入250 mL蒸馏水混匀。于50 ℃保温半小时后，调节pH为4，加入500 U/g的β-葡聚糖酶，搅拌反应5 h；降温至35 ℃保温，调节pH至8，加入5 U/g石莼多糖降解酶，搅拌反应4 h。反应结束后，煮沸灭酶。4000 r/min离心15 min，上清即为石莼酶解提取液。同一操作条件下加酶98 ℃灭酶10 min，制备得到的提取物记为石莼水提液；冷冻干燥，分别记为石莼酶解提取物和石莼水提物，冷藏保存，备用。
1.2.2 石莼提取物还原糖、总糖、固形物、蛋白含量测定
还原糖：采用3,5-二硝基水杨酸法[14]，测定提取物中还原糖含量；总糖：参考GB/T 15672-2009《食用菌中总糖含量的测定》[15]，采用苯酚硫酸法测定提取物中总糖含量；多酚：参考GB/T 8313-2018 《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[16]，采用Folin-Ciocalteu法测定提取物中多酚含量。
固形物：参考NY/T 2637-2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定》[17]，采用折射仪法测定提取物中固形物含量；蛋白质：采用福林酚法[18]，测定提取物中蛋白质含量。
1.2.3 石莼提取物体外抗氧化指标测定
分别取一定量的石莼酶解提取物和石莼水提物，用蒸馏水配置成1%溶液，按照下述方法测其DPPH、羟自由基清除率及超氧化物歧化酶（SOD）活力。
DPPH的清除率采用的方法参考GB/T 39100-2020《多肽抗氧化性测定 DPPH和ABTS法》[19]进行测定。在试管中加入0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液2 mL、酶解液2 mL混匀，避光反应30 min。后于517 nm处测定反应体系的吸光值Ai。同时以蒸馏水代替酶解液测定反应体系空白吸收值A0，以甲醇代替DPPH甲醇溶液测定反应体系本底吸收值Ai0。按照公式（1）计算DPPH自由基清除能力：
DPPH自由基清除率(%)=A0−(Ai−Ai0)A0×100 (1) SOD测定方法参考GB/T 41906-2022《超氧化物歧化酶活性检测方法》[20]进行测定。在25 ℃左右，于试管中依次加入pH8.2的0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（内含1 mmol/L EDTA·2Na）2.35 mL、蒸馏水2 mL、4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液0.15 mL，加入后立即混匀并倒入比色皿中，分别测定反应体系在325 nm处的初始吸光值A0和1 min后吸光值A1，两者之差即为邻苯三酚自氧化速率为△A。以适当浓度的酶解液代替蒸馏水进行上述实验，抑制邻苯三酚自氧化速率△A'约为1/2 △A。按照公式（2）计算SOD活力：
SOD活力(U/mL)=ΔA−ΔA'ΔA×100%50%×4.5×12×样品稀释倍数 (2) 羟自由基的清除率采用水杨酸比色法[21]进行测定。取1 mL样液于试管中，加入1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，再加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，启动Fenton反应，37 ℃水浴30 min，在510 nm波长下测其吸光度为Ai；用1 mL蒸馏水代替H2O2，反应后测其吸光度为Ai0；用1 mL蒸馏水替代样液，反应后测其吸光度为A0。按照公式（3）计算羟基自由基清除率：
羟自由基清除率(%)=A0−(Ai−Ai0)A0×100 (3) 1.2.4 动物实验
1.2.4.1 模型建立
选取18~22 g健康成年雌性ICR小鼠，除正常对照组（NC组）12只外，其余小鼠按照800 mg/kg·d 剂量经颈背部皮下注射D-gal溶液进行造模，每日1次；NC组小鼠注射等体积的生理盐水；连续造模为期6周。
1.2.4.2 分组与给药
参考Lei等[22]的方法分组灌胃，石莼酶解提取物低剂量组（LD），灌胃量为石莼酶解提取物50 mg/kg·d（以体质量计，下同）；石莼酶解提取物高剂量组（HD），灌胃量为石莼酶解提取物300 mg/kg·d；阳性对照组（PC），灌胃量为VC 50 mg/kg·d；衰老模型对照组（SLM）按照0.1 mL/10 g，灌胃蒸馏水；正常对照组（NC），按照0.1 mL/10 g，灌胃蒸馏水。连续给药4周，每两天称量小鼠体重并记录。最后一次灌胃后24 h，眼球采血，处死小鼠，测定各项生化指标。
1.2.5 脏器指数
脏器指数：处死后的小鼠在冰浴条件下解剖，观察各脏器有无明显异常。分离小鼠的肝脏、脾脏、胸腺、肾脏，清洗，吸干表面水分后。称重记录并计算各脏器的脏器指数，表示为器官重量（mg）/小鼠体重（g）[23]。
1.2.6 皮肤组织形态分析
取部分皮肤组织放置于固定液中，经石蜡包埋、切片、HE染色后，使用光学显微镜观察皮肤组织形态变化；取部分皮肤组织采用天狼猩红染色法，使用OLYMPUS（BX41）偏光显微镜来观察胶原纤维种类与分布，采用Image-pro plus 6.0软件统计分析切片中各颜色所占比例，判断不同组之间皮肤组织中I型与III型胶原蛋白的比例变化[24−25]。
1.2.7 样品生化指标测定
血清指标：测定血清MDA含量、抗氧化酶（GSH-Px、T-SOD、CAT）活力，总抗氧化力T-AOC，蛋白质羰基含量，具体操作参照试剂盒说明书。
皮肤组织生化指标：取部分皮肤组织制备组织匀浆，测定皮肤组织匀浆中HYP含量，抗氧化酶（GSH-Px、T-SOD、CAT）活力，总抗氧化力T-AOC，MDA含量，蛋白质羰基含量，具体操作参照试剂盒说明书。
1.3 数据处理
用SPSS 21.0软件对结果进行统计分析，测定结果数据均用¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 酶解处理对石莼营养成分的影响
石莼水提物和酶解提取物主要成分如表1所示。石莼酶解提取物可溶性总糖、蛋白质、还原糖、多酚及固形物含量显著高于石莼水提物含量（P<0.05）。其中，因石莼经过酶解作用后，细胞壁被破坏，细胞内容物溶出，总糖含量提高2.64倍，多酚含量提高1.36倍；石莼中的细胞壁多糖、硫酸多糖被降解为具有还原性的小分子糖；提取液中的固形物主要包括糖、可溶性蛋白、维生素、多酚、矿物质等，固形物含量增加，也说明β-葡聚糖酶和石莼多糖降解酶降解效果显著，与报道的酶解藻类效果一致[26]。
表 1 石莼提取物主要成分对比（mg/g）Table 1. Comparison of the main components of Ulva stramonium extracts (mg/g)成分 总糖 还原糖 蛋白质 多酚 固形物 石莼水提物 95.0±3.2 7.0±0.6 1.8±0.2 1.87±0.22 240.7±7.6 石莼酶解物 346.0±4.5* 140.3±4.2* 153.3±7.3* 4.42±0.31* 821.3±14.5* 注：石莼酶解物与石莼水提物比较，*表示P<0.05，差异显著。 2.2 石莼酶解提取物在不同氧化体系中的清除率
石莼提取物对羟自由基、DPPH自由基的清除能力及SOD活力如表2所示。
表 2 石莼提取物在不同氧化体系中的抗氧化能力对比Table 2. Scavenging rates of different extracts in different oxidation systems提取物 SOD活力
（U/mL）羟自由基
清除率（%）DPPH自由基
清除率（%）1%石莼水提物溶液 0.62±0.08 12.50±0.51 8.05±0.43 1%石莼酶解提取物溶液 8.84±0.32* 84.04±1.75* 72.08±1.37* 注：石莼酶解提取物溶液与石莼水提物溶液比较，*表示P<0.05，差异显著。 石莼水提物在上述三种抗氧化体系中的抗氧化能力极弱。而酶解提取物的抗氧化能力得到显著提升；其羟自由基和DPPH自由基清除率为84.04%和72.08%，较水提物提高6倍以上；其SOD活力相对水提物提高了13.26倍。已有研究表明，石莼多酚剂量为2 mg/mL时，DPPH清除率为46.5%[27]，而1%石莼酶解提取物溶液中多酚含量为0.019 mg/mL，由多酚产生的DPPH清除率应远低于46.5%。因此，石莼多酚对提取物抗氧化能力的提升影响较小。但本研究所用降解酶作用于石莼胞壁多糖，降解为具有还原性的寡糖或低分子糖。寡糖或低聚糖往往具有比多糖更高的抗氧化能力，如Xu等[2]用果胶酶水解浒苔多糖，获得的小分子量寡糖，浒苔还原糖剂量为0.93 mg/g时，DPPH清除率为58.3%。而1%石莼酶解提取物溶液中还原糖含量为1.4 mg/g时，DPPH清除率为72.08%。而酶解过程的加入，显著提高了提取物的抗氧化能力，这也与主要营养成分含量的变化一致。综上，石莼酶解提取物的抗氧化能力较水提物显著提高。
2.3 石莼酶解提取物对小鼠体重的影响
石莼酶解提取物在体外显示出良好的抗氧化活性，为其抗衰老作用提供了理论基础。为研究其抗衰老作用，建立国内最为常用的人为致衰老动物模型D-gal诱导模型。D-gal在代谢过程中，破坏机体抗氧化防御系统，产生大量的自由基，引发脂质过氧化反应，进而促使机体出现衰老症状[28]。伴随衰老进程，皮肤的变化是机体衰老最为显著的外在体现，如皮肤弹性下降、逐渐松弛、出现皱纹等[7]。本实验重点研究口服石莼酶解提取物对皮肤衰老及氧化应激的作用。
已有研究证明，小鼠体重稳态情况是衡量衰老的重要指标，随着衰老进程，机体代谢机能下降，体重呈现与年龄相关性的降低[29]。结果表明，D-gal诱导的衰老小鼠的体重增加从第3周开始减慢，并且在第4~8周明显低于健康小鼠，这与上述研究一致。VC治疗小鼠的体重增加与健康小鼠相似，表明VC可以延缓D-gal引起的体重减轻。此外，如图1所示，经石莼酶解提取物处理小鼠的体重增加高于VC处理的小鼠和健康小鼠，最终体重显著高于D-gal处理的小鼠（P<0.05）。表明，石莼酶解提取物可以改善D-gal诱导的体重减轻，发挥有益的健康作用，并且作为营养补充剂具有广阔的应用前景。
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图 1 石莼酶解提取物对D-gal致衰老小鼠体质量的影响（¯x±s，n=12）注：“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05。Figure 1. Effects of enzymatic extract of Ulva lucida on body mass of D-gal senescence mice (¯x±s, n=12)2.4 石莼酶解提取物对小鼠脏器指数的影响
机体衰老可导致脏器指数减小，表现为脏器萎缩及其他退行性改变[30]。SLM组小鼠的各脏器指数均明显低于NC组（P<0.05）。经VC治疗后小鼠的各脏器指数增加，与健康小鼠相似，表明VC可以延缓D-gal引起的脏器萎缩。如图2所示，石莼酶解提取物受试，可以显著提高小鼠肝脏、脾脏、胸腺和肾脏的脏器指数，且呈现剂量依赖性。低剂量的石莼酶解提取物受试可使衰老小鼠肝脏指数提高至健康小鼠水平。而对于脾脏、胸腺和肾脏的指数则需要更高剂量的石莼酶解提取物，才可恢复到健康小鼠水平。
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LD组、HD组小鼠的肝脏指数提高9.27%、14.86%（P<0.05），LD组、HD组小鼠的脾脏指数提高2.57%、13.95%（P<0.05，P<0.01），LD组、HD组小鼠的胸腺指数提高29.83%、47.57%（P<0.05，P<0.01），LD组、HD组小鼠肾脏指数提高3.06%、13.11%（P<0.05，P<0.01），表明石莼酶解提取物中的抗氧化物质可拮抗小鼠脏器萎缩，减缓器官退行性变化，进而具有延缓衰老的作用。
2.5 石莼酶解提取物对衰老小鼠皮肤组织老化的影响
研究表明，皮肤衰老时，皮肤结构发生损伤，真皮层变薄，细胞数减少，基底膜不清晰[31]。如图3所示，相比NC组，SLM组小鼠皮肤表皮明显变薄，结构不够完整，成纤维细胞数量明显减少。真皮层胶原纤维排列松散紊乱，分布不均匀，D-gal损伤小鼠皮肤结构，引起类似皮肤老化的病理变化[32]。与SLM组相比，LD组、HD组小鼠表皮组织厚度增加，成纤维细胞数量增多，皮肤结构更加完整，真皮层胶原纤维排列更整齐，分布更均匀，且呈现量效关系。HD组小鼠皮肤形态与NC组接近，胶原纤维排列整齐且均匀。上述结果表明石莼酶解提取物可以延缓模型小鼠皮肤衰老。
2.6 石莼酶解提取物对衰老小鼠皮肤中胶原蛋白的影响
在皮肤衰老过程中，过量的自由基与活性氧攻击细胞生物膜，会使具有胶原蛋白合成能力的成纤维细胞受损，导致胶原蛋白产生量减少，胶原纤维合成出现障碍，相应的外在表现为皮肤松弛，皱纹增多，皮肤弹性下降[33]。因此，胶原蛋白的含量可以提示皮肤的老化程度。羟脯氨酸（HYP）是胶原蛋白的主要成分，且含量相对恒定，可以用于来反映皮肤组织中胶原蛋白含量[34]。另一方面，I型胶原是维持组织承受能力和拉伸性能的重要成分，可以使皮肤具有张力和弹力，III型胶原属于重建性胶原，常与I型胶原相结合，保证皮肤组织的弹性[35]。I/III型胶原蛋白比例则可反映皮肤组织的结构强度和机械稳定性，且随着衰老过程的进行，皮肤中胶原蛋白含量及I/III型胶原蛋白比例会逐渐下降[36]。由图4可知，SLM组小鼠皮肤组织的HYP含量及I/III型胶原比例显著低于NC组（P<0.01），胶原纤维排列散乱，束状结构被破坏，形状不规则，与已报道皮肤衰老状态相似[31]。与SLM组相比，LD组、HD组的HYP含量分别提高45.81%、71.63%（P<0.05，P<0.01），I/III型胶原比例分别提高5.97%、55.40%（P<0.05，P<0.01），且HD组效果与PC组无显著差异（74.4%、55.53%），胶原纤维排列整齐，形状完整。表明石莼酶解提取物能有效抑制胶原蛋白含量及I/III型胶原比例的衰老性损失，对防止皮肤组织衰老性变化有积极作用，这与皮肤组织形态的变化情况一致。
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图 4 小鼠HYP含量、I/III型胶原比例及皮肤组织切片天狼猩红染色图Figure 4. Mouse HYP content, type I/III collagen ratio and Sirius scarlet staining of skin tissue sections2.7 石莼酶解提取物对衰老小鼠血清氧化相关生物标志物的影响
自由基可导致多种生物大分子尤其是蛋白质的改变，蛋白质不可逆的氧化修饰便是蛋白质的羰基化，进而影响蛋白质的功能。因此，蛋白质羰基含量可作为检测机体氧化应激作用的评价指标[37]。D-gal诱导小鼠皮肤衰老可引起皮肤组织中氧化应激反应的发生，产生MDA及其他脂质过氧化，MDA的分解产物引起细胞的损伤，因此MDA含量是氧化应激作用的重要指标[38]。相比之下，抗氧化酶（GSH-Px、T-SOD、CAT）通过清除体内自由基来保护宿主细胞免受氧化损伤[39−40]，因此总抗氧化力（T-AOC）及GSH-Px、T-SOD、CAT也可作为衡量氧化应激作用的重要指标。
由图5可知，与健康小鼠相比，SLM组小鼠血清MDA和蛋白质羰基水平显著升高（P<0.05），GSH-Px、T-SOD、CAT活性和T-AOC水平显著降低（P<0.05），表明D-gal破坏了氧化还原稳态。VC和石莼酶解提取物受试可显著降低MDA和蛋白质羰基水平，提高GSH-Px、T-SOD、CAT活性和T-AOC水平。与SLM组相比，LD组、HD组小鼠血清MDA水平显著降低9.62%、26.05%（P<0.05，P<0.01），蛋白质羰基水平显著降低8.08%、29.80%（P<0.05，P<0.01）；GSH-Px酶活力分别提高48.36%、62.13%（P<0.05，P<0.01），T-SOD酶活力分别提高69.12%、253.04%（P<0.05，P<0.01），CAT酶活力分别提高26.59%、64.47%（P<0.05，P<0.01），T-AOC水平分别提高84.78%、109.94%（P<0.05，P<0.01），且呈现剂量依赖性。HD组小鼠血清的上述指标接近或优于PC组。结果表明，石莼酶解提取物通过恢复抗氧化酶活性和减少过氧化来调节D-gal诱导的衰老小鼠的氧化应激作用，其氧化还原平衡方面与VC具有相似的效果。
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图 5 小鼠血清抗氧化相关生物标志物的测定结果Figure 5. Determination of serum antioxidant-related biomarkers in mice2.8 石莼酶解提取物对衰老小鼠皮肤组织氧化相关生物标志物的影响
研究数据表明，在D-gal诱导的衰老过程中，血清、心脏、肝脏、肺、肾脏和脑组织中的GSH、SOD和CAT显著降低，MDA显著增加，生物体氧化损伤增加[22−23,25]。
进一步表征皮肤组织中氧化相关生物标志物结果如图6所示。与血清中氧化相关生物标志物结果相似，相对健康正常小鼠，SLM组小鼠皮肤组织GSH-Px、T-SOD、CAT、T-AOC活力均显著降低（P<0.05），而MDA和蛋白质羰基水平显著升高（P<0.05），表明D-半乳糖诱导小鼠衰老过程伴随皮肤组织氧化损伤增加。与SLM组相比，LD组、HD组小鼠皮肤组织MDA含量显著降低34.25%、44.42%（P<0.05，P<0.01），蛋白质羰基水平显著降低8.76%、16.70%（P<0.05，P<0.01），呈现剂量依赖性。石莼酶解提取物可提高小鼠皮肤组织GSH-Px、T-SOD、CAT、T-AOC活力，如LD组、HD组的GSH-Px酶活力分别提高9.12%、50.22%（P<0.05，P<0.01），T-SOD酶活力分别提高6.61%、36.95%（P<0.05，P<0.01），CAT酶活力分别提高16.41%、29.81%（P<0.05，P<0.01），T-AOC水平分别提高43.43%、109.71%（P<0.05，P<0.01）。此外，高剂量石莼酶解提取物对衰老小鼠皮肤组织MDA水平的降低能力与PC组无显著差异（P>0.05），在增强抗氧化酶活性方面优于PC组。结果表明，石莼酶解提取物可增强皮肤组织抗氧化酶活性，降低皮肤组织中过氧化水平，通过提高皮肤组织抗氧化能力，维持氧化还原平衡，来延缓皮肤衰老。
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图 6 小鼠皮肤组织氧化相关生物标志物的测定结果Figure 6. Measurement of oxidation-related biomarkers in mouse skin tissue3. 结论
本研究表明，石莼经酶解破壁后，各营养成分含量均有明显增加。石莼酶解提取物提高羟自由基、DPPH自由基清除率及SOD活力，表明其具有较高的体外抗氧化能力。进一步的体内实验表明，石莼酶解提取物可显著改善D-gal诱导的衰老小鼠的体重和脏器指数，提高皮肤组织I/III型胶原比例与胶原蛋白含量，显著提升机体中T-AOC水平及抗氧化酶（GSH-Px、T-SOD、CAT）活力水平，降低MDA含量及蛋白羰基化水平（P<0.05），表明石莼酶解提取物可显著抑制衰老小鼠器官退化，增强皮肤组织机械强度及厚度，提高抗氧化酶活力，降低氧化应激水平。综上所述，石莼酶解提取物具有抗衰老作用，其机制可能与清除自由基，增强机体抗氧化能力有关。
本研究有助于阐明石莼酶解提取物作为天然产物延缓皮肤衰老的作用机制，为深入探讨其抗衰老机理提供理论基础和实验依据，为进一步开发抗皮肤衰老化妆品及新型抗衰老食品提供了相关理论依据和技术支持，具有重要的社会经济价值。
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图 1 石莼酶解提取物对D-gal致衰老小鼠体质量的影响（±s，n=12）
注：“**”表示P<0.01，“*”表示P<0.05。
Figure 1. Effects of enzymatic extract of Ulva lucida on body mass of D-gal senescence mice (±s, n=12)
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图 4 小鼠HYP含量、I/III型胶原比例及皮肤组织切片天狼猩红染色图
Figure 4. Mouse HYP content, type I/III collagen ratio and Sirius scarlet staining of skin tissue sections
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图 5 小鼠血清抗氧化相关生物标志物的测定结果
Figure 5. Determination of serum antioxidant-related biomarkers in mice
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图 6 小鼠皮肤组织氧化相关生物标志物的测定结果
Figure 6. Measurement of oxidation-related biomarkers in mouse skin tissue
表 1 石莼提取物主要成分对比（mg/g）
Table 1 Comparison of the main components of Ulva stramonium extracts (mg/g)
成分 总糖 还原糖 蛋白质 多酚 固形物 石莼水提物 95.0±3.2 7.0±0.6 1.8±0.2 1.87±0.22 240.7±7.6 石莼酶解物 346.0±4.5* 140.3±4.2* 153.3±7.3* 4.42±0.31* 821.3±14.5* 注：石莼酶解物与石莼水提物比较，*表示P<0.05，差异显著。 
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表 2 石莼提取物在不同氧化体系中的抗氧化能力对比
Table 2 Scavenging rates of different extracts in different oxidation systems
提取物 SOD活力
（U/mL）羟自由基
清除率（%）DPPH自由基
清除率（%）1%石莼水提物溶液 0.62±0.08 12.50±0.51 8.05±0.43 1%石莼酶解提取物溶液 8.84±0.32* 84.04±1.75* 72.08±1.37* 注：石莼酶解提取物溶液与石莼水提物溶液比较，*表示P<0.05，差异显著。
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