Preparation, Digestive Stability and Biological Activity Evaluation of Goji (Lycium barbarum L.) Leaves Flavonoids Microcapsules
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摘要: 本文以明胶和羧甲基纤维素钠（CMC）为壁材制备了枸杞叶黄酮微胶囊（M-LBLF），并对其稳定性和生物活性进行了探究。通过响应面试验优化M-LBLF制备工艺，采用扫描电镜（SEM）、傅里叶红外光谱（FT-IR）、X-射线衍射（XRD）、热重分析和体外模拟消化等方法检测产物稳定性，通过自由基清除和酶活抑制实验评价产物生物活性。结果表明，M-LBLF的最佳制备工艺条件为芯壁比1:3.86，壁材浓度1.15%，搅拌温度45 ℃，包埋率为84.21%；SEM观察显示，微胶囊颗粒大部分表面光滑，囊壁的结构保持完整，壁材也无破裂痕迹；FT-IR检测显示枸杞叶黄酮（LBLF）中1594 cm−1处C=O发生偏移，推测与LBLF与CMC发生静电相互作用有关。XRD光谱显示，微胶囊化使非晶体结构部分转变为晶态，导致M-LBLF和LBLF的衍射峰强度上有细微的变化；热重分析发现微胶囊化改善了LBLF的高温分解，起到保护作用。体外模拟消化和抗氧化活性实验表明，微胶囊化提高了LBLF稳定性，可在消化过程中保留较好的抗氧化活性。此外，通过多元线性回归拟合方程得到微胶囊对胰脂酶的半抑制质量浓度（IC50）为2.2004±0.03 mg/mL，对α-淀粉酶半抑制质量浓度（IC50）为2.188±0.02 mg/mL，说明M-LBLF能够抑制胰脂肪酶活性和α-淀粉酶活性，提示其具有潜在的调节糖脂代谢活性，本实验为枸杞叶黄酮类提取物的稳定性提高及其相关营养健康产品开发提供了研究基础。Abstract: Goji (Lycium barbarum L.) leaves flavonoid microcapsules (M-LBLF) were prepared using gelatin and carboxymethyl cellulose sodium (CMC) as wall materials, and the stability and biological activities were investigated. The preparation process of M-LBLF was optimized through response surface methodology. The stability of the product was detected using scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), X-ray diffraction (XRD), thermogravimetric analysis and in vitro simulated digestion. The biological activity of the product was evaluated through free radical scavenging and enzyme activity inhibition experiments. Results showed that, the optimal process conditions for M-LBLF were a core to wall ratio of 1:3.86, a wall material concentration of 1.15%, a stirring temperature of 45 ℃, and an embedding rate of 84.21%. SEM observation showed that most of the surface of the microcapsule particles was smooth, the structure of the capsule wall remained intact, and there were no signs of rupture on the wall material. FT-IR spectra showed a shift in C=O at 1594 cm−1 in Lycium barbarum leaves flavonoids (LBLF), suggesting an electrostatic interaction between LBLF and CMC. XRD spectra showed that due to microencapsulation, the amorphous structure of the product was partially transformed into a crystalline state, resulting in slight changes in the diffraction peak intensity of M-LBLF and LBLF. Thermogravimetric analysis found that microencapsulation improved the high-temperature decomposition, playing a protective role for LBLF. In vitro simulated digestion and antioxidant activity experiments showed that microencapsulation improved the stability of LBLF and retained good antioxidant activity during digestion. In addition, the equations were fitted by multiple linear regression to obtain the semi-inhibitory mass concentration (IC50) of the microcapsules against pancreatic lipase (2.2004±0.03 mg/mL) and against α-amylase (2.188±0.02 mg/mL), suggesting that M-LBLF was able to inhibit both pancreatic lipase activity and α-amylase activity, which suggested that it had the potential to regulate the glycolipid metabolism activity. This research would provide a foundation for improving the stability of flavonoids extracted from goji leaves and developing the related nutritional and health foods.
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枸杞（Lycium barbarum L.）属于枸杞属（茄科），主要分布于宁夏、甘肃、青海、新疆、内蒙等地，以宁夏中宁枸杞为优。枸杞叶的营养物质和枸杞果一样，富含氨基酸、矿物质等营养成分及生物碱、黄酮类等活性成分[1]。现代《中药大辞典》中记载枸杞叶“补虚益精，清热明目。主治虚劳发热，烦渴，目赤昏痛，障翳夜盲，崩漏带下，热毒疮肿”[2]。枸杞叶中黄酮类化合物的含量高于枸杞果，是枸杞叶中最重要的生理活性成分之一。研究显示，黄酮类化合物能够防治肥胖、糖尿病、癌症、心脏病、骨质疏松等，具有副作用小、无耐药性、安全性高等特点，被视为营养健康食品、功能性食品和临床辅助药物的重要资源[3]。
目前，枸杞叶作为果用枸杞生产过程中的主要副产物，除少量作为茶饮外，有大量被废弃，造成资源浪费；而叶用枸杞仅以其嫩叶、芽作茶饮或时鲜蔬菜食用，市场销量有限，产业规模较小，枸杞叶深加工产品亟待开发。课题组前期从枸杞叶中提取了具有显著生物活性的黄酮类化合物[4−5]，本文以枸杞叶黄酮提取物（LBLF）为芯材，明胶和CMC为复合壁材，制备枸杞叶黄酮微胶囊（M-LBLF）。近期有关微胶囊的研究主要聚焦于明胶的改性及其在生物医用材料中的应用，其可作为水溶性蛋白质与黄酮类物质产生复合凝聚，改善黄酮的水溶性；CMC研究的重点包括化合物的性质、剂型、处方和规格的设计、工艺研究、质量控制和初步稳定性研究；其具有较强的负电荷，可诱导明胶产生更多静电吸引力，增强明胶与黄酮类物质的相互作用。通过三者复合作用制备M-LBLF，旨在寻找一种能够显著改善LBLF水溶性和稳定性而又能最大限度保留其活性的微胶囊化方法，为枸杞叶深加工利用提供研究基础与思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
枸杞叶 宁夏童子茶科技有限公司；羧甲基纤维素钠（CMC） 上海申光食用化学品有限公司；明胶 河南博洋生物科技有限公司；谷氨酰胺转氨酶（≥1.5 U/mg） 上海中秦化学有限公司；胃蛋白酶（3000~3500 U/g）、胰蛋白酶（250 U/mg）、单硬脂酸甘油酯（单甘酯） 北京索莱宝科技有限公司；2,2’-联氮基-双-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）-二铵盐（2,2’-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、1,1-二苯基-2-苦肼基（diphenyl picryl hydrazinyl radical，DPPH） Sigma-Aldrich；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS） 泰兴市东圣生物科技有限公司；棕榈酸对硝基苯酯（p-nitrophenyl esters of palmitic acid，p-NPP） 麦克林生物技术有限公司；曲拉通X-100 北京博奥拓达科技有限公司；大豆油 中粮集团有限公司。
ME203E型电子天平 Mettler有限公司；HWS12型恒温水浴锅 上海伍相仪器仪表；Zeiss Sigma 300扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 卡尔蔡司管理有限公司；Spectrum Two型傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR） 美国PerkinElmer公司；D/max 2200型X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD） 日本理学公司；Mastersizer 3000型全自动激光粒度分析仪 Malvern；纳米粒度及Zeta电位分析仪 安东帕（上海）商贸有限公司；V-5100紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限责任公司；JDG-0.2型真空冻干试验机 兰州科近冻干技术有限公司；SE-750高速粉碎机 永康市圣象电器有限公司；PHSJ-3F pH计 雷磁仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 枸杞叶黄酮提取物
参照杨晓花[5]的方法进行提取枸杞叶黄酮提取物。
1.2.2 枸杞叶黄酮提取物的总黄酮含量测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法[6]，510 nm下比色测定。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y=0.0198X+0.0083，R²=0.9994。按公式（1）计算出枸杞叶黄酮提取物的总黄酮含量：
X=Y×V1C×V2×1000 (1) 式中，X：总黄酮含量（mg/g）；Y：由曲线方程求得的黄酮质量浓度（μg/mL）；V1：待测样品溶液定容后的体积（mL）；C：待测品溶液浓度（mg/mL）；V2：待测品溶液体积（mL）。
1.2.3 枸杞叶黄酮微胶囊制备
取一定量的枸杞叶黄酮于乙醇中溶解和明胶-CMC复聚物溶液后混匀，按芯壁比1:4（v/v）的比例将枸杞叶黄酮溶液滴入复聚物溶液中，再取2%单甘酯作为乳化剂，用1%醋酸溶液调pH至4.5后利用磁力搅拌器搅拌反应30 min；用1% NaOH溶液调pH至6，4 ℃下加入谷氨酰胺转氨酶固化1 h，再经真空冷冻干燥得到枸杞叶黄酮微胶囊样品（M-LBLF）。
1.2.4 明胶和CMC复聚物最佳工艺参数研究
1.2.4.1 明胶和CMC复聚物溶液的制备
取一定量明胶和CMC，用超纯水溶解，并在60 ℃水浴中搅拌2 h。在8000 r/min、4 ℃、下离心20 min，除去杂质和气泡，得到复聚物溶液。
1.2.4.2 Zeta电位测定
分别配制质量浓度为0.01%的明胶和CMC溶液并置于磁力搅拌器上，45 ℃下搅拌并用1%的醋酸溶液调节样液pH至3.5、4、4.5、5、5.5、6，采用激光粒度分析仪测定各pH下Zeta电位。
1.2.4.3 浊度测定
分别配制质量浓度为0.1%（w/v）、混合比分别为7:1、9:1、11:1的明胶-CMC混合溶液。溶液置于磁力搅拌器上，在45 ℃下缓慢逐滴加入1%醋酸溶液来调节溶液pH，测定在600 nm处不同pH下反应液的吸光值。以pH作为横坐标，浊度值OD600为纵坐标，绘制浊度滴定曲线。
1.2.4.4 复聚物产率测定
将复聚物溶液在4 ℃、10000 r/min下离心15 min，去除上清液后沉淀物即为复聚物。冷冻干燥后，由公式（2）计算复聚物产率：
复聚物产率(%)=m0m×100 (2) 式中，m0：冷冻干燥后明胶-CMC复聚物的质量（g）；m：明胶和CMC的初始总质量（g）。
1.2.4.5 乳化稳定性（ESI）和乳化活性（EAI）测定
配制总浓度1%、质量比分别为7:1、9:1、11:1的明胶-CMC混合溶液，于45 ℃下调节至最适pH，后立刻加入0.5%的大豆油，高速剪切3 min，立刻于底部吸取50 µL样品，再加入0.1%的SDS溶液5 mL，记作A0。10 min后操作同上，记作A10。于500 nm波长处测定吸光值，按式（3）和式（4）计算：
EAI(m2/g)=2×2.303×A0C×θ×d×10000 (3) ESI(min)=A0A0−A10 (4) 式中，A0：0 min时的吸光值；A10：10 min时的吸光值；C：反应体系中明胶-CMC混合液总浓度，g/mL；θ：反应体系内油相的体积分数（0.5）；d：比色皿光程（0.01 m）；n：稀释倍数（100）。
1.2.5 枸杞叶黄酮微胶囊工艺优化
1.2.5.1 单因素实验
芯壁比对微胶囊包埋率的影响：在壁材浓度2%、搅拌温度45 ℃、2%单甘酯和搅拌时间30 min条件下，当芯壁比分别为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7时测定其包埋率并以此作为指标选取最佳芯壁比。
单甘酯用量对微胶囊包埋率的影响：在壁材浓度2%、芯壁比1:5，反应温度45 ℃，搅拌时间30 min时，在单甘酯用量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时，以包埋率为指标选取最佳单甘酯用量。
壁材浓度对微胶囊包埋率的影响：在芯壁比（枸杞叶黄酮:明胶-CMC复聚物溶液）1:5、搅拌温度45 ℃、2%单甘酯（以壁材总质量计，下同）和搅拌时间30 min条件下，当壁材浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时，测定其包埋率并以此作为指标选取最佳壁材浓度。
搅拌温度对微胶囊包埋率的影响：在壁材浓度为2%、芯壁比1:5、2%单甘酯和搅拌时间为30 min的条件下，当搅拌温度为30、35、40、45、50 ℃时测定其包埋率并以此作为指标选取最佳搅拌温度。
搅拌时间对微胶囊包埋率的影响：在壁材浓度2%、芯壁比1:5，搅拌温度45 ℃和2%单甘酯的条件下，在搅拌时间为20、25、30、35、40 min时以包埋率作为指标测定对微胶囊的影响，并选取最佳的搅拌时间。
1.2.5.2 响应面试验
经单因素实验，利用Box-Behnken试验设计原理，采用Design-Expert 11软件，如表1选择影响微胶囊包埋率较显著的因素芯壁比（A）、壁材浓度（B）、搅拌温度（C）作为自变量，包埋率为响应值，其他因素不变的条件下测定包埋率。
表 1 响应面试验因素与水平设计Table 1. Response surface test factors and horizontal design水平 因素 A 壁材浓度（%） B 芯壁比（v:v） C 搅拌温度（℃） −1 0.5 1:3 40 0 1 1:4 45 1 1.5 1:5 50 1.2.6 包埋率的测定
参照陈晶华[7]的方法，按公式（5）计算枸杞叶黄酮微胶囊包埋率：
包埋率(%)=A1−A0A1×1000 (5) 式中，A0：空白对照的吸光度值；A1：样品溶液的吸光度值。
1.2.7 枸杞叶黄酮微胶囊基本理化特性测定
参照廖霞等[8]的方法对枸杞叶黄酮微胶囊的粒度、水分含量、流动性、色度和微观形貌观察进行测定。
1.2.8 色度测定
用比色计对LBLF及M-LBLF的颜色进行分析，后记录CIE L*、a*、b*值。比色计在使用前需用标准白色平板进行标准化。
1.2.9 扫描电镜（SEM）观察
取适量的LBLF提取物与M-LBLF粉末粘到有导电胶样品台上，真空镀膜机中喷金，随后利用扫描电镜观察样品。
1.2.10 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）测定
取少量CMC、明胶、明胶-CMC混合物、LBLF提取物和M-LBLF通过红外光谱扫描，分别与干燥KBr进行混合，后研磨、压片[9]。
1.2.11 X-射线衍射（XRD）测定
分别称取0.5 g CMC、明胶、明胶-CMC混合物、LBLF提取物以及M-LBLF样品于全自动XRD仪样品盘内，通过步进扫描法进行分析[10]。
1.2.12 热重（TG）测定
称取2~4 mg CMC、明胶、明胶-CMC混合物、LBLF提取物以及M-LBLF，放入小坩埚内，进行热重分析，以探究产物受温度的影响[11]。
1.2.13 枸杞叶黄酮微胶囊在人胃肠消化模拟环境中的稳定性
取0.8 g胃蛋白酶和4.375 g NaCl溶于250 mL去离子水内，用3 mol/L盐酸调节pH1.2，即形成人工胃液。取0.100 g上文得到的最优工艺M-LBLF样品加入15 mL配制好的胃消化液中，离心管用锡纸包好并避光，37 ℃下恒温水浴消化4 h，每隔30 min取1 mL消化液用于测定胃消化阶段（SGF）中总黄酮含量（mg/mL），用胃消化240 min后的消化液作为胃消化组[12]，通过计算前后黄酮含量差值计算出样品的释放率。
称取0.268 g胰蛋白酶和1.714 g胆汁，溶于200 mL 0.2 mol/L NaHCO3溶液中制得人工肠液（pH6.8）。胃消化4 h后的样液中加入15 mL人工肠消化液，用锡纸将离心管包好后避光，于37 ℃恒温水浴消化4 h，每隔30 min取1 mL消化样液用于肠消化阶段（SIF）中总黄酮含量（mg/mL）的测定[13]，通过测定前后黄酮含量差值，释放率按公式（6）计算。
释放量(%)=X1X0×100 (6) 式中，X1：释放前的黄酮含量（mg/mL）；X2：释放后的黄酮含量（mg/mL）。
1.2.14 枸杞叶黄酮微胶囊在模拟人胃肠消化中抗氧化活性的测定
1.2.14.1 超氧阴离子清除能力
量取5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH8.2），在25 ℃预热20 min，分别加入1 mL不同浓度的样品液，再加入25 ℃预热的0.5 mL 3 mmol/L邻苯三酚溶液并混匀并于25 ℃水浴反应5 min，后取1 mL 8 mmol/L盐酸加入，终止反应，在299 nm处测定样品吸光度[14]。清除率按公式（7）计算：
清除率(%)=(1−Ai−AjA0)×100 (7) 式中，Ai：样品溶液的吸光度值；Aj：0.5 mL蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定的吸光度值；A0：蒸馏水代替样品溶液测定的吸光度。
1.2.14.2 ABTS+自由基清除活性
采用Fan等[15]方法稍加修改，将7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾等体积混合制成ABTS+自由基阳离子，室温下避光孵育14~16 h。734 nm处将ABTS溶液稀释至0.70±0.02吸光度值的浓度。0.1 mL样品和3.9 mL ABTS溶液避光反应15 min。在734 nm处测定吸光度，按公式（8）计算清除率：
清除率(%)=A0−A1A0×100 (8) 式中，A0：空白对照吸光值；A1：样品溶液吸光值。
1.2.14.3 DPPH+自由基清除活性
DPPH溶液现配现用，等体积0.2 mmol/L DPPH溶液和样品于37 ℃避光反应30 min混合。将等量DPPH溶液和乙醇混合作为空白对照。在517 nm处测定混合物吸光值[16]。按公式（9）计算清除率：
清除率(%)=(1−Ai−AjA0)×100 (9) 式中，Ai：DPPH与样品液吸光值；Aj：乙醇与样品液的吸光值；A0：DPPH与乙醇的吸光值。
1.2.14.4 羟自由基清除能力
依次加入2 mL样品液、9 mmol/L FeSO4、8.8 mmol/L H2O2和9 mmol/L水杨酸。37 ℃保存60 min，在510 nm处测定其吸光度[17]。羟自由基清除率按公式（10）计算：
清除率(%)=A1−A0A0×100 (10) 式中，A0：空白对照的吸光度值；A1：样品溶液的吸光度值。
1.2.14.5 铁还原抗氧化能力（FRAP）测定
分别取1 mL不同质量浓度的样品，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸钠缓冲液（pH6.6）和1%铁氰化钾溶液2.5 mL，混匀后50 ℃下恒温20 min，随后加入2.5 mL 10%三氯醋酸溶液，在3000 r/min下离心10 min后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和1 mL 0.1% FeCl3溶液，混匀后静置10 min后700 nm处测定吸光度[18]。
1.2.15 M-LBLF的酶活抑制实验
1.2.15.1 不同浓度M-LBLF溶液配制
分别取10、20、30、40、50、60 mg M-LBLF样品置于100 mL去离子水后溶解，摇匀备用。
1.2.15.2 M-LBLF对胰脂肪酶活性抑制测定
参考Franco等[19]方法稍作修改。取40 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液、20 μL不同浓度的微胶囊溶液和60 μL 10 mg/mL胰脂肪酶液加入96孔板，37 ℃下孵育10 min，加入80 μL p-NPP底物开始反应，37 ℃孵育30 min，酶标仪在405 nm波长处测定吸光值。对照组为缓冲液代替酶液的样品，反应体系见表2，胰脂肪的酶活性抑制率按公式（11）进行计算：
表 2 脂肪酶活性测定反应体系Table 2. Reaction system for pancreatic lipase activity assay组别 缓冲液（μL） 抑制剂（μL） 酶液（μL） p-NPP（μL） 对照实验组（A） 60 0 60 80 对照空白组（a） 120 0 0 80 样品实验组（B） 40 20 60 80 样品空白组（b） 100 20 0 80 抑制率(%)=(1−B−bA−a)×100 (11) 式中，A：对照实验组吸光值；a：对照空白组吸光值；B：样品实验组吸光值；b：样品空白组吸光值。
以微胶囊的质量浓度为横坐标，胰脂酶的活性抑制率为纵坐标，绘制曲线并拟合，求得半抑制浓度（IC50）。
1.2.15.3 M-LBLF对α-淀粉酶抑制活性测定
以可溶性淀粉（1%）为底物，在PBS缓冲液（pH6.8）中测定α-淀粉酶活性[20]。实验操作方法如下：A. 50 µL α-淀粉酶溶液（20 U/mL）和50.0 mL PBS缓冲液（pH6.8）以及200 µL溶解在PBS缓冲液中的微胶囊充分混匀，25 ℃孵育10 min，加入50 µL的淀粉溶液（1%）混匀，25 ℃孵育10 min，加入100 µL的DNS终止反应，于沸水浴中煮5 min；B. 200 µL溶解在PBS缓冲液中的微胶囊与100 µL PBS缓冲液混匀，25 ℃孵育10 min，加入50 µL的淀粉溶液（1%）混匀，25 ℃孵育10 min，加入100 µL DNS终止反应，再沸水水浴5 min；C. 50 µL α-淀粉酶溶液与50 µL 抑制剂混匀，25 ℃孵育10 min，加入50 µL的淀粉溶液（1%）混匀，25 ℃孵育10 min，加入100 µL的DNS终止反应，在沸水浴中煮5 min；D. 50 µL PBS缓冲液与50 µL淀粉溶液（1%）混匀，25 ℃孵育10 min，加入100 µL DNS终止反应，并于沸水中煮5 min。最后将50 µL反应液和150 µL超纯水混匀加入96孔板中，在540 nm下进行测定，反应体系见表3，通过公式（12）计算：
表 3 α-淀粉酶活性测定反应体系Table 3. Reaction system for α-amylase activity assay组别 缓冲液
（μL）抑制剂
（μL）酶液
（μL）DNS
（μL）1%淀粉溶液
（μL）对照实验组（A） 50 0 50 100 50 对照空白组（B） 100 0 0 100 50 样品实验组（C） 0 50 50 100 50 样品空白组（D） 50 50 0 100 50 抑制率(%)=(1−A−BC−D)×100 (12) 式中，A：对照实验组吸光值；B：对照空白组吸光值；C：样品实验组吸光值；D：样品空白组吸光值。
1.3 数据处理
所有数据重复测定三次，结果以平均值±标准差表示。通过Origin 8.5软件绘图，后经SPSS 7.0软件进行单因素方差分析；当P<0.05时表明差异显著，P<0.01表明差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 明胶-CMC复聚物的工艺参数确定
2.1.1 Zeta电位变化
由图1可知明胶的等电点pH位于4.75左右，CMC的Zeta电位在pH3.5~6.0范围内带负电，且随着pH增大电位值逐渐降低；明胶pH在4.5~4.75之间带正电，说明在pH 3.5~4.75内，明胶与CMC可能生成复聚物。在此基础上，探究不同明胶-CMC混合比例下的最适pH。
2.1.2 浊度曲线测定结果
从图2可以看出，浊度曲线在起始阶段时，明胶与CMC分子携带的负电荷强度较大，浊度值在0左右时体系为澄清、均一的状态。随着pH逐渐上升，带正电荷的明胶分子与带负电荷的CMC分子结合生成少量可溶性复聚物，溶液呈乳白色，体系的浊度缓慢上升。随着pH的持续增加，可溶性凝聚物重新排列成不溶性复聚物，浊度值急剧上升，溶液呈现明显的乳白，大量不溶性凝聚物的积累导致明胶和CMC分子之出现相分离[21]。由图2可知，明胶与CMC混合比分别为7:1、9:1和11:1（w/w）时，复合凝聚反应的最佳pH分别为4.25、4.50和4.75。随着明胶与CMC的混合比的增大（7:1~11:1），CMC分子带的负电荷的逐渐减少，导致明胶分子的正电荷与负电荷反应形成的复合凝聚物更少[22]。
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图 2 不同混合质量比下明胶-CMC复聚物的浊度滴定曲线Figure 2. Turbidity curves of gelatin-CMC mixtures at different mass mixing ratios2.1.3 复聚物产率测定结果
在复合凝聚反应过程中，复合凝聚物产率越高，表明壁材利用率更高，因此疏水物质具有更强的包埋性。如图3所示，随着明胶-CMC混合比的增大（7:1~11:1），产率逐渐下降。其中，7:1与9:1的组分其复聚物产率显著性差异明显（P<0.01）；11:1组分的复聚物产率较其他两组差异非常显著（P<0.001）。当混合比为7:1时，复聚物产率最高；11:1时，复聚物产率最低。由于随着混合比的增大，溶液中CMC含量降低使得其与明胶反应没有足够的结合位点，致使复聚物产率的下降[23]。
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图 3 不同明胶-CMC混合质量比下的复聚物产率注：**表示与7:1比，P<0.01，***表示P<0.001；图4同。Figure 3. Complex coacervate yield at different gelatin-CMC mass mixing ratios2.1.4 乳化稳定性（ESI）与乳化活性（EAI）结果
选择EAI和ESI作为研究复物溶液体系乳化性能的指标。由图4A得，明胶-CMC混合比为9:1时的ESI最高（P<0.001），此时ESI值为29 min，说明混合比例在9:1时壁材降低油-水界面表面张力的能力最强。由图4B得，就EAI而言，明胶-CMC混合比例为9:1时低于7:1（P<0.01），但二者要显著高于11:1（P<0.001）。乳化活性代表油水相经均质乳化后立即表现出的乳化油相的能力[24]，而乳化稳定性表示油水两相不产生分层的现象，应优先选择乳化稳定性强的组分。综合ESI和EAI的测定结果，可得明胶-CMC混合比在9:1时壁材的乳化性能最强。
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图 4 不同明胶-CMC质量比下体系的ESI和EAIFigure 4. ESI and EAI for systems with different gelatin-CMC mass ratios因此，可确定复合凝聚反应体系的最佳壁材混合比为9:1，从而得出pH最佳值为4.5。
2.2 枸杞叶黄酮微胶囊基本理化特性测定结果
2.2.1 枸杞叶黄酮微胶囊单因素实验结果
由图5A结果显示，不同芯壁比对微胶囊的黄酮包埋率具有显著（P<0.05）影响；包埋率随着芯壁比的增大而增加，芯壁比1:4时包埋率最高，为82.51%，随后包埋率随芯壁比的变化逐渐降低，分析可能原因在于过多的壁材导致分子空腔内的疏水基团发生相互竞争，从而对黄酮的包埋率降低；由图5B结果显示，当单甘酯用量为2%时，包埋率最高为71.34%；由图5C结果显示，随着壁材浓度的增加，包埋率逐渐增大，当达到1%时包埋率最高为74.98%，超过1%后包埋率急剧下降，1.5%后下降趋势变缓。推测包埋率下降的原因可能是壁材浓度的增加使得壁材的乳能力不够，造成稳定性下降，从而导致包埋率降低[25]；由图5D结果显示，随着温度的增加，包埋率呈现先增大后减小的趋势；当温度为45 ℃包埋率最大为75.22%；由图5E结果显示，随着搅拌时间的增加包埋率呈现先增加后降低的趋势，当搅拌时间为30 min时，包埋率最大为71.09%。
由图5可知，单因素实验后结果表明，芯壁比为1:4、单甘酯用量2%、壁材浓度1%、搅拌温度45 ℃、搅拌时间30 min时微胶囊的包埋率最高，分别为82.51%、71.34%、74.98%、75.22%和71.09%，微胶囊形成较好。
2.2.2 枸杞叶黄酮微胶囊响应面试验结果
通过单因素实验表明，选取对枸杞叶黄酮包埋率有显著影响的因素：以A（壁材浓度）、B（芯壁比）、C（搅拌时间）为自变量，包埋率为指标响应值，单甘酯用量2%、搅拌温度45 ℃，试验结果如表4。对实验结果作二次响应面回归分析，得M-LBLF包埋率与各因变量的模拟方程为：Y=84.15+1.73×A−1.37×B+0.52×C+0.55×A×B−1.56×A×C−0.16×B×C−2.77×A2−4.21×B2−2.33×C2，其中，Y为微胶囊包埋率的预测值。
表 4 响应面试验设计及结果Table 4. Response surface experimental design and results实验号 因素 包埋率（%） A B C 1 −1 1 0 73.21±0.95 2 0 0 0 84.06±0.90 3 1 −1 0 80.04±1.36 4 0 0 0 85.22±0.50 5 1 1 0 77.71±0.91 6 0 −1 −1 78.06±0.82 7 −1 −1 0 77.74±0.60 8 0 0 0 83.38±1.06 9 0 0 0 84.78±1.39 10 0 1 −1 76.32±1.38 11 0 0 0 83.32±1.14 12 1 0 −1 81.76±0.69 13 −1 0 −1 75.11±0.96 14 1 0 1 79.87±0.77 15 −1 0 1 79.47±1.84 16 0 −1 1 79.24±0.75 17 0 1 1 76.85±0.79 由表5可得，模型P<0.0001，模型极显著。失拟项P=0.2503>0.1不显著，表明模型的拟合度良好。回归系数R2=0.9807，模型拟合度良好，R2Adj=0.95559，说明该模型能解释95.59%响应值的变化，可用于M-LBLF工艺参数的优化。根据各因素P值得，AC各交互项显著，存在交互作用；一次项影响M-LBLF包埋率的重要程度排序为：A（壁材浓度）>B（芯壁比）>C（搅拌温度）。
表 5 回归方程系数显著性检验及方差分析Table 5. Coefficient significance test and variance analysis of regression equation来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 195.72 9 21.75 43.05 <0.0001 ** A-壁材浓度 23.98 1 23.98 52.11 0.0003 ** B-芯壁比 15.02 1 15.07 23.86 0.0012 ** C-搅拌温度 2.20 1 2.20 11.48 0.0858 AB 1.20 1 1.20 3.62 0.1825 AC 9.75 1 9.75 9.80 0.0040 ** BC 0.11 1 0.11 0.011 0.6727 A2 32.31 1 32.31 56.39 0.0001 ** B2 74.43 1 74.43 162.14 <0.0001 ** C2 22.85 1 22.82 41.27 0.0004 ** 残余 3.85 7 0.55 失拟 1.01 3 0.34 0.48 0.7154 纯误差 2.83 4 0.71 总和 199.57 16 R2=0.9808；R2Adj=0.9560；模型精密度=18.708 由图6可知，壁材浓度与温度交互作用的响应图较陡峭，即两者间交互作用对包埋率影响更大，且随着比例的增加，包埋率呈现先上升后下降的趋势。由等高线图可壁材浓度与温度中心呈现出椭圆形，即两者交互作用对包埋率影响较大[26]。
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图 6 芯壁比、壁材浓度与温度的交互作用对M-LBLF包埋率的影响Figure 6. Effect of the interaction between wall ratio, wall material concentration and temperature on the embedding rate of M-LBLF2.2.3 验证实验
通过响应面试验得枸杞叶黄酮微胶囊最佳工艺条件分别为壁材浓度1.15%，芯壁比1:3.86，搅拌温度45.09 ℃，理论包埋率为84.51%。适当调整最佳工艺为：芯壁比为1:4、单甘酯用量2%、壁材浓度1%、搅拌温度45 ℃、搅拌时间30 min，以此开展验证实验，包埋率为84.21%±0.15%，接近理论值。
2.3 枸杞叶黄酮微胶囊基本理化特性
在制备的过程中M-LBLF的L*、a*和b*值变化如表6所示。结果表明，枸杞叶黄酮和微胶囊的a*值差异较大（P<0.05），这可能是因为黄酮含量高所致。微胶囊的b*与枸杞叶黄酮无显著差异，说明微胶囊的黄橙色来源于枸杞叶黄酮。
表 6 枸杞叶黄酮微胶囊及其主要组分的色泽分析Table 6. Color analysis of M-LBLF and its main components样品 L* a* b* 明胶-CMC 86.09±0.49a 4.41±0.03b 10.61±0.44b LBLF提取物 71.14±070b 3.77±0.17c 25.19±0.13a M-LBLF 35.84±0.13c 8.07±0.03a 26.79±0.03a 注：不同小写英文字母表示同行数据差异显著，P<0.05。 从图7可以看出，LBLF的微观形态为不规则的碎片状晶体，结构较为疏松（图7A和图7B），在5 μm下观察M-LBLF内部结构紧密（图7C），在2 μm下M-LBLF表面结构近似球状，大部分表面光滑完整，是粗糙密集结构（图7D），制备的微胶囊颗粒结构无明显裂痕，壁材没有出现破裂，对于保护囊心、避免氧化和提高稳定性至关重要[27]。
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图 7 LBLF和M-LBLF的SEM图注：A. LBLF（2000×）；B. LBLF（5000×）；C. M-LBLF（2000×）；D. M-LBLF（5000×）。Figure 7. SEM images of LBLF and M-LBLF2.4 傅里叶红外光谱分析
如图8所示，红外图谱中的明胶最为明显的是三组波数分别为1653、1543、1236 cm−1，它们是三组酰胺带的特征峰；酰胺I带代表-C=O的伸缩振动；酰胺II带代表-N-H的弯曲振动；酰胺III代表着C-N的弯曲振动[28]。而位于1443 cm−1处的较强吸收代表着肽键的顺式构型是由含较多羟脯氨酸和脯氨酸的明胶分子所决定的[29]。在CMC图谱中，3430 cm−1为纤维素环上受氢键影响的-OH伸缩振动峰。位于1600 cm−1与1422 cm−1处的两个强吸收峰，分别表示离子化-COO-基团的对称与非对称伸缩振动[30]。998~562 cm−1处的吸收峰是苯环上取代基位置引起的，黄酮样品羟基取代位置不同，出峰位置也不同[31]。在M-LBLF图谱中，1578 cm−1处存在特征峰可能是LBLF中1594 cm−1处C=O发生偏移，位于1422 cm−1的吸收峰移向较低波数，可能是由于处CMC发生静电相互作用[32]。明胶-CMC复聚物的图谱中明胶于1560 cm−1处的吸收峰蓝移至1554 cm−1处，说明原吸收峰中除-N-HR振动，-NH3＋振动峰消失。1600 cm−1和1422 cm−1分别为CMC分子中-COO−伸缩振动的吸收峰，可知明胶-NH3＋与CMC的-COO−之间发生了静电相互作用。经分析，发现复聚物的生成过程中除静电相互作用无其它化学键发生改变。
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图 8 M-LBLF及其主要组分的傅里叶红外光谱图注：a. CMC；b. 明胶；c. 明胶-CMC；d. LBLF；e. M-LBLF。Figure 8. Fourier infrared spectra of M-LBLF and its main components2.5 X-射线衍射分析
如图9所示，明胶和CMC在20°附近呈宽峰衍射模式，与明胶和CMC相比，M-LBLF的峰强减小，表明明胶和CMC结构发生变化，可能是由于静电相互作用导致分子排列发生变化。明胶于11°和19°附近拥有两个较强的宽峰，CMC在9°和19°附近有尖锐的衍射峰，而M-LBLF在6.9°、20.1°和31°附近有衍射峰，表明明胶和CMC发生复凝聚反应后，因静电的相互作用对结晶性质和能力产生了影响。LBLF在衍射角19.1°附近有衍射峰，说明LBLF以结晶形式存在。明胶-CMC复聚物分别于7.8°、20.1°附近拥有两个程度较强的特征峰，M-LBLF在以上特征衍射峰处强度减弱，与明胶-CMC复聚物相比，衍射峰的宽度变宽，表明LBLF在复合凝聚反应包埋后。以无定形状态存在，水溶性被改善，生物利用率有所增加且分散性更好。M-LBLF和LBLF的衍射峰位置基本一致，只是峰强度上有变化，在（2θ）20°衍射峰强度增强，是由于微胶囊化使非晶体结构部分转变为晶态[33]，说明枸杞叶黄酮在微胶囊中其结晶性质部分发生变化。
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图 9 M-LBLF及其主要组分的XRD图谱注：a. CMC；b. 明胶；c. 明胶-CMC；d. LBLF；e. M-LBLF。Figure 9. XRD profiles of M-LBLF and its main components2.6 热稳定性分析
图10为CMC、明胶、明胶-CMC、LBLF及M-LBLF的热失重曲线。在图10A中，CMC复聚物的热失重曲线比较平稳，当温度在800 ℃时有40%左右的质量保留，说明壁材物质的耐热性较高[34]。在图10B中，LBLF提取物在300 ℃附近出现较强的负峰，说明在该温度下LBLF提取物的热分解速度最快。由DTG曲线得，样品热分解反应分为3个阶段：第1阶段，温度在270 ℃之前，样品的热失重均较少，重量损不超过5%，其中M-LBLF的重量损失最多，其次为LBLF提取物，CMC最少；结果表明M-LBLF复聚物中的水分含量最多；第2阶段，在270~500 ℃之间，M-LBLF热失重曲线几乎为平线，热失重最少，LBLF热失重均不超过5%，明胶和明胶-CMC的热失重几乎相同，约15%，而CMC的热失重约20%，说明此时主要为纳米胶囊表面吸附的芯材释放[35]；第3阶段，500 ℃之后，各曲线趋向平稳。综上所述，微胶囊化对LBLF提取物的高温分解存在缓解作用，壁材也为芯材提供了保护，LBLF提取物的热稳定性得到了提高[36]。
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图 10 M-LBLF及其主要组分的热重分析图Figure 10. Thermogravimetric analysis of M-LBLF and its main components2.7 体外模拟消化稳定性分析
食物通过人体摄入，需经口腔、胃及小肠的吸收后再进入人体血液当中循环，口腔可消化部分淀粉类食物，对淀粉类含量低的食品影响不大[37]。现研究表明，食物中大多数黄酮类化合物都以酯类、糖苷类或聚合物形式存在，一般经肠道酶或微生物的水解后再吸收[38]。
如表7所示，SGF中未包埋黄酮释放量显著上升（P<0.05）是因为强酸环境下胃蛋白酶对黄酮有促进释放的作用。SGF中M-LBLF黄酮释放量显著上升（P<0.05）是由于表面少量未包埋的黄酮释放以及壁材水解。240 min时胃消化LBLF和M-LBLF中黄酮释放量分别达79.18%和44.01%，未包埋黄酮释放量低于被包埋黄酮释放量，这是由于芯材被包埋在壁材内而避免与胃酸直接接触[39]，壁材的结构可更好的保护芯材，故微胶囊化的LBLF稳定性更高，表明在胃液中微胶囊对黄酮有一定缓释作用，从而避免了黄酮降解的损失。
表 7 M-LBLF的体外模拟消化稳定性Table 7. In vitro simulated digestion stability of M-LBLF消化阶段 样品 黄酮的释放率（%） 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min 180 min 210 min 240 min SGF M-LBLF 5.92±0.44g 12.60±0.97f 18.38±1.16e 29.70±1.82d 38.08±2.22c 43.30±2.48b 43.39±2.51b 44.01±2.52a LBLF 11.94±0.49h 45.06±1.64g 59.06±2.07f 64.78±2.00e 72.46±2.59d 73.37±2.38c 78.00±2.42b 79.18±1.79a SIF M-LBLF 8.99±0.34h 18.59±0.72g 29.88±1.42f 41.03±1.77e 48.69±1.98d 64.61±2.53c 71.41±2.68b 76.69±2.71a LBLF 11.61±0.5f 28.12±1.20e 35.03±1.55d 61.30±2.60c 67.26±2.70b 75.36±2.56a 81.16±2.80a 83.28±2.87a 注：同一行不同的上标小写字母表示数据显著差异（P<0.05）。 SIF中由于胰蛋白酶为可水解部分壁材的蛋白水解酶，因此其黄酮释放量显著高于SGF（P<0.05）[22]。说明在胃消化过程中M-LBLF微胶囊结构的存在降低了黄酮的释放速度，而在肠消化时大量释放，有利于人体吸收利用黄酮。
2.8 体外模拟消化后M-LBLF的抗氧化活性分析
2.8.1 超氧阴离子清除能力分析
由图11A可知，溶解在Tris-HCl缓冲液中的M-LBLF具有清除超氧阴离子的活性，有研究表明CMC具有较好的稳定性，将黄酮包裹减缓了外界环境的影响[40]。肠道消化后的抗氧化活性显著高于胃消化阶段（P<0.05），说明微胶囊起到了缓释效果。
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图 11 体外模拟消化后抗氧化活性分析Figure 11. Analysis of the antioxidant activity after in vitro mock digestion2.8.2 ABTS+自由基清除能力分析
由图11B知，抗氧化活性高低与枸杞叶总黄酮浓度有关，SIF对ABTS+自由基的清除能力最高。相较于胃部环节，肠道环境下微胶囊自由基活性更高，可能是由于物质从胃肠消化阶段到达了小肠消化阶段，并随着环境pH的改变进一步释放了有效成分[41]。
2.8.3 DPPH清除能力分析
采用DPPH法测定M-LBLF在模拟消化环境下的抗氧化活性。图11C得，M-LBLF对自由基的清除率在肠消化阶段明显高于胃消化阶段。胃消化阶段微胶囊的抗氧化活性较低，可能是由于微胶囊的包埋作用及pH、酶等限制了抗氧化活性有效成分的释放[42]。到达肠液后，M-LBLF中的有效成分被进一步释放[43]，使得肠液中样品的抗氧化活性显著增加。
2.8.4 羟基自由基清除能力分析
由图11D可知，从胃消化阶段到肠消化过程中，SIF的羟基自由基的清除率大于SGF。抗氧化活性在肠道环境下增加可能是由于枸杞叶黄酮的芳香环中存在的羟基在从酸性介质向碱性介质过渡的过程中发生了脱质子作用[44-45]。
2.8.5 铁还原抗氧化性分析（ferric-reducing antioxidant power，FRAP）
FRAP的值和还原能力与抗氧化活性呈正相关[46]。由图11E可得，在胃和肠消化阶段开始，样品都具有较强的抗氧化能力，0.2~0.4 mg/mL时两者的清除率差距较大，原因可能是FRAP测定的酸性环境对胃消化组份有利。从最高浓度来看，肠消化阶段的抗氧化活性高于胃腔消化阶段，可能因为碱性环境有利于微胶囊中黄酮的释放，表明微胶囊化可以明显提高黄酮的稳定性，这为M-LBLF在功能性食品方面的发展前景打下一定基础。
2.9 M-LBLF的酶活抑制活性
2.9.1 M-LBLF对胰脂肪酶的抑制作用
由图12A可知，微胶囊质量浓度与胰脂肪酶受抑制作用程度呈正相关。经拟合得微胶囊对胰脂酶的半抑制质量浓度（IC50）为2.2004±0.03 mg/mL；由图12B可知，底物浓度在1~8 mmol/L时，空白对照组和微胶囊抑制剂组曲线交于X轴负半轴上，反应速率随抑制剂浓度的升高而降低，直线在横轴上的截距不变，Km不变，Vmax变小，即微胶囊对胰脂肪酶的抑制作用为非竞争性抑制[47]。表8为通过计算得到的酶动力学参数和半抑制质量浓度。
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图 12 M-LBLF对胰脂肪酶的活性抑制作用注：A. 抑制率（拟合方程为y=−2.09627x2+26.59988x+1.6187）；B. Lineweaver-Burk双倒数曲线图。Figure 12. Inhibition effect of M-LBLF on pancreatic lipase表 8 M-LBLF抑制胰脂肪酶的半抑制浓度和动力学参数Table 8. Semi-inhibitory concentration and kinetic parameters of M-LBLF inhibition of pancreatic lipase组别 IC50（mg/mL） Vmax（min） Km（mg/mL） 对照组 0.024 1 mg/mL M-LBLF 2.200 0.021 2.4 2 mg/mL M-LBLF 2.200 0.020 4.8 2.9.2 M-LBLF对α-淀粉酶的抑制作用
由图13A可得，微胶囊质量浓度逐渐增大时，微胶囊对胰脂肪酶的抑制率也逐渐增大。通过拟合方程得微胶囊对α-淀粉酶半抑制质量浓度（IC50）为2.188±0.02 mg/mL；由图13B可知，底物浓度在1~5 mmol/L时，发现空白对照组和微胶囊组的曲线分别相交于X轴的负半轴上，随着抑制剂浓度的升高，反应速率随之降低，即Km不变，Vmax变小，表明微胶囊对α-淀粉酶为非竞争性抑制。表9为由计算获得的酶动力学参数与半抑制质量浓度。
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图 13 M-LBLF对α-淀粉酶的抑制作用注：A. 抑制率（y=−1.4732x2+24.99921x+2.35643）；B. Lineweaver-Burk双倒数曲线图。Figure 13. The inhibition effect of M-LBLF on α-amylase表 9 M-LBLF抑制α-淀粉酶的半抑制浓度和动力学参数Table 9. Semi-inhibitory concentrations and kinetic parameters of M-LBLF inhibition α-amylase组别 IC50（mg/mL） Vmax（min） Km（mg/mL） 对照组 0.067 1 mg/mL M-LBLF 2.188 0.040 3.05 2 mg/mL M-LBLF 2.188 0.036 4.36 3. 结论
本文以明胶和羧甲基纤维素钠为壁材，利用复合凝聚法制备了枸杞叶黄酮微胶囊（M-LBLF），结果表明M-LBLF的最佳制备工艺条件为芯壁比1:3.86，壁材浓度1.15%，搅拌温度45 ℃，包埋率为84.21%；采用扫描电镜（SEM）、傅里叶红外光谱（FT-IR）、X-射线衍射（XRD）、热重分析和体外模拟消化等方法检测产物稳定性，通过自由基清除和酶活抑制实验评价产物生物活性。其中体外模拟消化和生物活性评价实验证实微胶囊化提高了黄酮提取物的热稳定性，且能够使其在胃肠道模拟消化过程中起到保护和缓释作用。此外，M-LBLF能够抑制胰脂肪酶和α-淀粉酶，表明其具有潜在的糖脂代谢调控活性。本研究为提高枸杞叶黄酮提取物的稳定性提供了方法，有利于促进枸杞叶活性物质的开发与应用，同时也为提高植物活性成分的稳定性奠定了基础，为活性成分的开发与利用提供方法。后续可开展枸杞叶黄酮微胶囊的体内活性研究与实际应用开发，进一步提升其应用价值。
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图 2 不同混合质量比下明胶-CMC复聚物的浊度滴定曲线
Figure 2. Turbidity curves of gelatin-CMC mixtures at different mass mixing ratios
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图 3 不同明胶-CMC混合质量比下的复聚物产率
注：**表示与7:1比，P<0.01，***表示P<0.001；图4同。
Figure 3. Complex coacervate yield at different gelatin-CMC mass mixing ratios
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图 4 不同明胶-CMC质量比下体系的ESI和EAI
Figure 4. ESI and EAI for systems with different gelatin-CMC mass ratios
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图 6 芯壁比、壁材浓度与温度的交互作用对M-LBLF包埋率的影响
Figure 6. Effect of the interaction between wall ratio, wall material concentration and temperature on the embedding rate of M-LBLF
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图 7 LBLF和M-LBLF的SEM图
注：A. LBLF（2000×）；B. LBLF（5000×）；C. M-LBLF（2000×）；D. M-LBLF（5000×）。
Figure 7. SEM images of LBLF and M-LBLF
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图 8 M-LBLF及其主要组分的傅里叶红外光谱图
注：a. CMC；b. 明胶；c. 明胶-CMC；d. LBLF；e. M-LBLF。
Figure 8. Fourier infrared spectra of M-LBLF and its main components
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图 9 M-LBLF及其主要组分的XRD图谱
注：a. CMC；b. 明胶；c. 明胶-CMC；d. LBLF；e. M-LBLF。
Figure 9. XRD profiles of M-LBLF and its main components
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图 10 M-LBLF及其主要组分的热重分析图
Figure 10. Thermogravimetric analysis of M-LBLF and its main components
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图 11 体外模拟消化后抗氧化活性分析
Figure 11. Analysis of the antioxidant activity after in vitro mock digestion
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图 12 M-LBLF对胰脂肪酶的活性抑制作用
注：A. 抑制率（拟合方程为y=−2.09627x2+26.59988x+1.6187）；B. Lineweaver-Burk双倒数曲线图。
Figure 12. Inhibition effect of M-LBLF on pancreatic lipase
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图 13 M-LBLF对α-淀粉酶的抑制作用
注：A. 抑制率（y=−1.4732x2+24.99921x+2.35643）；B. Lineweaver-Burk双倒数曲线图。
Figure 13. The inhibition effect of M-LBLF on α-amylase
表 1 响应面试验因素与水平设计
Table 1 Response surface test factors and horizontal design
水平 因素 A 壁材浓度（%） B 芯壁比（v:v） C 搅拌温度（℃） −1 0.5 1:3 40 0 1 1:4 45 1 1.5 1:5 50 
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表 2 脂肪酶活性测定反应体系
Table 2 Reaction system for pancreatic lipase activity assay
组别 缓冲液（μL） 抑制剂（μL） 酶液（μL） p-NPP（μL） 对照实验组（A） 60 0 60 80 对照空白组（a） 120 0 0 80 样品实验组（B） 40 20 60 80 样品空白组（b） 100 20 0 80
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表 3 α-淀粉酶活性测定反应体系
Table 3 Reaction system for α-amylase activity assay
组别 缓冲液
（μL）抑制剂
（μL）酶液
（μL）DNS
（μL）1%淀粉溶液
（μL）对照实验组（A） 50 0 50 100 50 对照空白组（B） 100 0 0 100 50 样品实验组（C） 0 50 50 100 50 样品空白组（D） 50 50 0 100 50
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表 4 响应面试验设计及结果
Table 4 Response surface experimental design and results
实验号 因素 包埋率（%） A B C 1 −1 1 0 73.21±0.95 2 0 0 0 84.06±0.90 3 1 −1 0 80.04±1.36 4 0 0 0 85.22±0.50 5 1 1 0 77.71±0.91 6 0 −1 −1 78.06±0.82 7 −1 −1 0 77.74±0.60 8 0 0 0 83.38±1.06 9 0 0 0 84.78±1.39 10 0 1 −1 76.32±1.38 11 0 0 0 83.32±1.14 12 1 0 −1 81.76±0.69 13 −1 0 −1 75.11±0.96 14 1 0 1 79.87±0.77 15 −1 0 1 79.47±1.84 16 0 −1 1 79.24±0.75 17 0 1 1 76.85±0.79
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表 5 回归方程系数显著性检验及方差分析
Table 5 Coefficient significance test and variance analysis of regression equation
来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 195.72 9 21.75 43.05 <0.0001 ** A-壁材浓度 23.98 1 23.98 52.11 0.0003 ** B-芯壁比 15.02 1 15.07 23.86 0.0012 ** C-搅拌温度 2.20 1 2.20 11.48 0.0858 AB 1.20 1 1.20 3.62 0.1825 AC 9.75 1 9.75 9.80 0.0040 ** BC 0.11 1 0.11 0.011 0.6727 A2 32.31 1 32.31 56.39 0.0001 ** B2 74.43 1 74.43 162.14 <0.0001 ** C2 22.85 1 22.82 41.27 0.0004 ** 残余 3.85 7 0.55 失拟 1.01 3 0.34 0.48 0.7154 纯误差 2.83 4 0.71 总和 199.57 16 R2=0.9808；R2Adj=0.9560；模型精密度=18.708
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表 6 枸杞叶黄酮微胶囊及其主要组分的色泽分析
Table 6 Color analysis of M-LBLF and its main components
样品 L* a* b* 明胶-CMC 86.09±0.49a 4.41±0.03b 10.61±0.44b LBLF提取物 71.14±070b 3.77±0.17c 25.19±0.13a M-LBLF 35.84±0.13c 8.07±0.03a 26.79±0.03a 注：不同小写英文字母表示同行数据差异显著，P<0.05。
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表 7 M-LBLF的体外模拟消化稳定性
Table 7 In vitro simulated digestion stability of M-LBLF
消化阶段 样品 黄酮的释放率（%） 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min 180 min 210 min 240 min SGF M-LBLF 5.92±0.44g 12.60±0.97f 18.38±1.16e 29.70±1.82d 38.08±2.22c 43.30±2.48b 43.39±2.51b 44.01±2.52a LBLF 11.94±0.49h 45.06±1.64g 59.06±2.07f 64.78±2.00e 72.46±2.59d 73.37±2.38c 78.00±2.42b 79.18±1.79a SIF M-LBLF 8.99±0.34h 18.59±0.72g 29.88±1.42f 41.03±1.77e 48.69±1.98d 64.61±2.53c 71.41±2.68b 76.69±2.71a LBLF 11.61±0.5f 28.12±1.20e 35.03±1.55d 61.30±2.60c 67.26±2.70b 75.36±2.56a 81.16±2.80a 83.28±2.87a 注：同一行不同的上标小写字母表示数据显著差异（P<0.05）。
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表 8 M-LBLF抑制胰脂肪酶的半抑制浓度和动力学参数
Table 8 Semi-inhibitory concentration and kinetic parameters of M-LBLF inhibition of pancreatic lipase
组别 IC50（mg/mL） Vmax（min） Km（mg/mL） 对照组 0.024 1 mg/mL M-LBLF 2.200 0.021 2.4 2 mg/mL M-LBLF 2.200 0.020 4.8
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表 9 M-LBLF抑制α-淀粉酶的半抑制浓度和动力学参数
Table 9 Semi-inhibitory concentrations and kinetic parameters of M-LBLF inhibition α-amylase
组别 IC50（mg/mL） Vmax（min） Km（mg/mL） 对照组 0.067 1 mg/mL M-LBLF 2.188 0.040 3.05 2 mg/mL M-LBLF 2.188 0.036 4.36
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