Effects of Abalone Visceral Polysaccharide-protein Complex Selenium Nanoparticles on Alcohol-induced Injury in AML12 Cells
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摘要: 目的：探讨鲍鱼内脏多糖-蛋白质复合硒纳米颗粒（Abalone Visceral Polysaccharide-protein Complex Selenium Nanoparticles，PSP-SeNPs）对AML12细胞酒精性损伤的保护作用及其机制。方法：本研究用不同浓度（0.1、0.2、0.3和0.4 µg/mL）PSP-SeNPs对AML12细胞进行干预24 h，再换为酒精浓度300 mmol/L的完全培养基处理24 h，诱导建立酒精性损伤细胞模型。通过Hoechst染色法判断各组细胞损伤的情况，之后测定细胞氧化应激的相关生化指标，最后通过qRT-PCR 法测定细胞内氧化应激相关基因的表达。结果：与正常对照组相比，酒精造模组细胞内的谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）酶活性显著性降低（P<0.05），丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的水平显著升高（P<0.05）。这些变化在PSP-SeNPs的干预下发生显著逆转（P<0.05）。qRT-PCR结果表明，与对照组相比，酒精处理可显著降低AML12细胞中核因子E2相关因子2（Nrf2）、超氧化物歧化酶 2（SOD2）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱氨酸连接酶调节亚基（GCLM）的mRNA表达水平（P<0.05），提高Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白 1（Keap1）的mRNA表达水平（P<0.05），并且PSP-SeNPs干预可显著逆转以上改变（P<0.05）。结论：PSP-SeNPs可通过调节氧化应激相关基因的表达水平，从而调控抗氧化酶活性来缓解由酒精诱导的AML12细胞酒精性损伤。
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关键词:
- 纳米硒 /
- 酒精性肝病 /
- 氧化应激 /
- Keap-1/Nrf2 通路
Abstract: Objective: To investigate the protective effect and mechanism of abalone visceral polysaccharide-protein complex selenium nanoparticles (Abalone Visceral Polysaccharide-protein Complex Selenium Nanoparticles, PSP-SeNPs) on alcohol-induced damage in AML12 cells. Methods: After pretreated with different levels of PSP-SeNPs (0.1, 0.2, 0.3, and 0.4 µg/mL) for 24 h, AML12 cells were further treated with 300 mmol/L alcohol for 24 h to establish cell injury model. Hoechst staining was used to assess the degree of cell injury, and biochemical indicators related to oxidative stress were measured. Finally, qRT-PCR was used to measure the expression of oxidative stress-related genes in AML-12 cells. Results: Compared with the normal control group, the levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), and catalase (CAT) in the alcohol model group were significantly decreased (P<0.05), while the levels of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) were significantly increased (P<0.05). These changes were significantly reversed by PSP-SeNPs (P<0.05). qRT-PCR results showed that the mRNA levels of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2), superoxide dismutase 2 (SOD2), catalase (CAT), and glutamate-cysteine ligase regulatory subunit (GCLM) were significantly decreased in the alcohol model group as compared with the control group (P<0.05). Additionally, the alcohol induced up-regulation of Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) mRNA was significantly reversed by PSP-SeNPs (P<0.05). Conclusion: PSP-SeNPs can alleviate alcohol-induced AML12 cell injury by regulating the expression levels of oxidative stress-related genes and modulating the activities of antioxidant enzymes.-
Keywords:
- nano-selenium /
- alcoholic liver disease /
- oxidative stress /
- Keap-1/Nrf2 pathway
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酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease，ALD）是由于长期摄入酒精导致的肝脏疾病，临床上包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和肝硬化及其并发症[1]，是全球肝脏相关疾病发病率和死亡率上升的主要驱动因素[2−3]。ALD的发病被认为是多因素多机制的重叠效应结果[4−5]，其中活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在肝细胞中过度累积导致的氧化应激被认为是ALD发病的原因之一[6]。肝脏是负责酒精代谢的主要器官，能通过一系列酶促反应将酒精转化为毒性较小的乙酸盐[7−8]。而当过量的酒精超过肝脏的代谢能力时，代谢中间产物ROS在肝脏中聚积，且与大多数细胞大分子反应，干扰细胞内信号传导途径，导致脂质过氧化，使细胞内抗氧化酶失活，最终导致肝细胞损伤[9]。因此维持细胞内氧化平衡对于预防ALD具有重要意义。
硒（Selenium，Se）是人体必需的微量元素[10]，硒以硒代半胱氨酸的形式，在硒蛋白中参与并调节多种生物化学反应，展现出其独特的生物活性[11]，能够参与各种抗氧化酶的合成，保护机体免受氧化损伤[12]。酒精性肝损伤是典型的氧化应激类损伤，补充硒可作为防治酒精性肝损伤的一个重要切入点[13]。中国存在大量缺硒地域，且由于硒在人体内无法自主合成，这些地区居民无法从膳食中获取足量的硒元素，需要额外进行补充。目前作为补剂的无机硒的有效浓度和毒性浓度之间阈值较窄，限制其应用[14]。硒纳米颗粒（SeNPs）是一种无机元素纳米型硒颗粒，它在保持硒生物活性、增加效力的同时，还能降低硒元素的毒性[15−16]。Bai等[17]的研究发现，在小鼠体内纳米硒的LD50是亚硒酸钠的8倍，说明利用元素态硒（Se0）制作的纳米尺寸的SeNPs，具有更优异的抗氧化特性和更低的毒性[18−19]，但缺乏封端剂的纳米硒容易聚集沉淀，因此极大地限制了对纳米硒生物活性的深入研究。多糖-蛋白质复合物（PSP）是以鲍鱼为原料，通过蛋白酶水解制备的平均分子量为25.38±0.75 kDa的多糖-蛋白复合物，具有高比表面积且蛋白质结构中含有大量羟基、亚氨基和巯基，这些都使其对纳米材料展现较高的亲和力[20]。Ren等[19]的研究表明，PSP作为封端剂，能在不限制纳米硒优异性促生长作用的同时，保证它的稳定性，将二者结合起来获得的新材料鲍鱼内脏多糖-蛋白质复合硒纳米颗粒（Abalone Visceral Polysaccharide-protein Complex Selenium Nanoparticles，PSP-SeNPs）的尺寸在5~200 nm之间，具有更高的生物利用度。但目前对于PSP-SeNPs抗氧化性能没有更进一步的挖掘。
本研究应用的鲍鱼内脏多糖-蛋白质复合硒纳米颗粒，是由不可食用的鲍鱼内脏制作而成的鲍鱼内脏多糖-蛋白复合物，与单质硒纳米颗粒一同反应得到的绿色新材料[19]。在此基础上，本研究对PSP-SeNPs是否通过激活氧化应激相关通路调节抗氧化酶活性，进而对酒精导致的肝脏细胞损伤起保护作用及其机制进行探讨。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
细胞株 AML12小鼠正常肝细胞 购自大连美仑生物科技有限公司；鲍鱼内脏多糖-蛋白质复合硒纳米颗粒 由简文杰老师惠赠，由普通纳米硒与鲍鱼内脏制作的多糖-蛋白复合物制备的具有高稳定和分散性的新型纳米颗粒，平均粒径和区域电势分别为63.33 nm和−37.1 mV[19]；胎牛血清 新西兰Newzerum公司；0.25% 胰酶-EDTA、胰岛素、转铁蛋白、地塞米松、DMED/F-12培养基、1%青霉素-链霉素-两性霉素 B 混合液 大连美仑生物科技有限公司； CCK-8 试剂盒 安徽兰杰柯科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒 上海雅酶生物医药科技有限公司；ROS、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测盒 上海碧云天生物科技有限公司；无水乙醇、异丙醇 国药集团化学试剂有限公司；AG RNAex Pro RNA 提取试剂、Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒 湖南艾科瑞生物工程有限公司。
HF-safe1200 型生物安全柜 力康科学仪器有限公司；Forma 系列 CO2 培养箱、Quant Studio 5 荧光定量 PCR 仪 美国 Thermo 公司；CLARIOstar plus多功能酶标仪 德国BMG公司； DM500 型倒置生物显微镜 德国 Leica 公司；5430R 型高速冷冻台式离心机 美国 Denovix 公司：DS-11 型超微量紫外分光光度计 德国 eppendorf 公司；CFX96实时定量PCR仪 美国Bio-Rad公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
在37 ℃ 5% CO2培养箱培养AML12细胞，培养瓶中加入含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素-两性霉素 B 混合液、10 μg/mL胰岛素、0.1 μmol/L地塞米松以及5 μg/mL转铁蛋白的DMED/F-12完全培养基培养。
1.2.2 细胞干预
AML12细胞按15×104个/孔接种在六孔板中，在倒置显微镜下观察均匀生长至密度约 80%时进行实验干预。预实验每孔分别加入含不同浓度酒精（0、100、200、300、400、500、600、700、800、1000 mmol/L）的培养基干预24 h确定造模浓度。正式实验分为正常对照组、酒精造模组和PSP-SeNPs干预组（分别用含有0.1、0.2、0.3、0.4 µg/mL PSP-SeNPs的培养基处理24 h后，再加入含300 mmol/L酒精的培养基处理24 h），每组设三个重复。参考文献[21]中的方法，正常对照组和酒精造模组用完全培养基培养24 h，PSP-SeNPs干预组按实验组进行干预24 h；弃原培养基，PBS清洗2遍，酒精造模组和PSP-SeNPs干预组均使用含300 mmol/L酒精的培养基进行24 h的造模干预，正常对照组则换用新鲜培养基继续培养24 h。
1.2.3 CCK-8法测定AML12细胞活性
将AML12细胞按1×104个/孔接种于96孔板中，次日换液时，使用不同浓度干预物的培养基培养24 h，各设置六个复孔。第三天，弃原培养基，每孔加入100 µL含CCK-8试剂的培养基（CCK-8试剂与完全培养基的比例为1:10），之后置于37 ℃恒温培养箱孵育40 min，再于450 nm处测定吸光度值。细胞存活率按以下公式计算：
细胞存活率(%)=(OD加药−OD空白)/(OD0干预−OD空白)×100 式中：OD加药：具有细胞、培养基、药物和CCK-8溶液孔的吸光度值；OD空白：具有培养基、CCK-8溶液孔的吸光度值；OD0干预：具有细胞、培养基和CCK-8溶液孔的吸光度值。
1.2.4 Hoechst染色观察细胞损伤情况
对细胞进行分组干预后，吸净培养液，加入0.5 mL固定液固定10 min，吸去固定液，用PBS洗两遍；吸净液体加入0.5 mL Hoechst33258 染色液染5 min；弃染色液，再用PBS洗涤后，滴一滴抗荧光猝灭封片液于孔板上。在荧光显微镜下观察，激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右。
1.2.5 细胞内氧化应激相关指标的测定
进行干预处理后收集细胞沉淀，按80 µL每孔加入2% Triton X-100裂解30 min。之后按试剂盒说明书对细胞内AST、ALT、GSH-Px、SOD、CAT的酶活性以及MDA含量和活性氧水平进行检测，同时对对应BCA蛋白浓度进行测定以方便后续比较。
1.2.6 qRT-PCR 测定氧化应激相关基因的表达情况
按照1.2.2对细胞进行处理后，抛弃原培养基，用PBS清洗两遍。每孔加入1 mL Trizol冰上裂解20 min，移入1.5 mL EP管中，加0.2 mL 氯仿，涡旋混匀15 s；4 ℃离心机12000 r/min离心5 min；转移上层无色水相至新EP管中，加入同体积异丙醇混匀，4 ℃离心机12000 r/min离心20 min；弃上清，加入预冷的75%乙醇1mL混匀，4 ℃离心机12000 r/min离心5 min；弃上清，倒扣干燥3 min；加入40 μL DEPC 水溶解，测定其浓度。使用 Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒将RNA逆转录为 cDNA，再取 2 µL cDNA 样本按照 SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒进行 PCR 扩增。
以β-actin基因为内标参照，使用比较法 2−ΔΔCt 来计算目的基因 mRNA 相对表达量。引物序列见表1。
表 1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1. Real-time PCR primer sequences引物名称 引物序列（5’-3’） β-actin F：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC
R：ATGGAGCCACCGATCCACANrf2 F：TGCTCCTATGCGTGAATCCCA
R：CTTTTGCCCTAAGCTCATCTCGTKeap1 F：GACCTGGACTTTCGTAGCCC
R：CCGGGTCATAGCATTCCACANQO1 F：CCCAGATATTGTGGCCGAAC
R：AGCACTCTCTCAAACCAGCHO-1 F：AGGTACACATCCAAGCCGAG
R：TGCTTGTTGCGCTCTATCTCCCAT F：CAGTGCGCTGTAGATGTGAAAC
R：GGTGGACGTCAGTGAAATTCTTGSOD2 F：CAGACCTGCCTTACGACTATGG
R：CTGAAGAGCGACCTGAGTTGTA1.3 数据分析
数据使用IBM SPSS 20.0软件进行统计学分析。结果用均数±标准误（¯x±SEM）表示，各指标数据经过正态性检验和方差齐性检验，进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），若方差齐采用LSD法进行两两比较，若方差不齐则采用Dunnet’s T3进行两两比较，检验水准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 酒精造模条件与PSP-SeNPs干预剂量的探索
2.1.1 不同浓度酒精干预24 h对AML12细胞活性的影响
参考前人的经验[22]，本研究选用AML12细胞构建酒精性肝损伤体外模型。为确定后续造模条件，前期使用含有不同浓度酒精的完全培养基对AML12细胞进行处理24 h，对细胞存活率情况进行检测。结果如图1所示，酒精处理能够致使AML12细胞存活率下降，且该影响具有剂量效应关系。选取细胞存活率在50%~60%左右时的处理条件进行作为细胞氧化损伤模型构造条件[23]，当酒精浓度在300 mmol/L时，细胞存活率为61.7%，在该浓度酒精暴露下AML12细胞的受损程度接近一半，尚且处于可逆转阶段，比较符合酒精性肝病前期状况。因此后续实验中的酒精性肝损伤体外模型的造模条件一律为使用含300 mmol/L酒精完全培养基处理24 h。
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图 1 不同浓度酒精干预24 h对AML12细胞存活率的影响注：*表示与0 mmol/L组间差异具有统计学意义，P<0.05。Figure 1. Effects of different concentrations of ethanol intervention for 24 h on the survival rate of AML12 cell2.1.2 PSP-SeNPs对AML12细胞活性的影响
为选择适宜的PSP-SeNPs干预剂量，使用CCK-8测定PSP-SeNPs对AML12细胞活性的影响。如图2A所示，AML12细胞的存活率会随着PSP-SeNPs的浓度升高而降低，0.1 mg/L PSP-SeNPs干预后，AML12细胞的存活率在95%以上，与正常对照组相比差异并未出现统计学意义。后续实验建立在PSP-SeNPs不对细胞产生明显的毒性作用的基础上，干预剂量在0~0.1 mg/L之间进一步选择。
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图 2 不同浓度PSP-SeNPs干预24 h对AML12细胞存活率的影响注：A. 不同浓度PSP-SeNPs干预24 h后细胞存活率；B. 0.1~1000 µg/L PSP-SeNPs干预后酒精损伤模型细胞存活率；C. 0.1~1 µg/L PSP-SeNPs干预后酒精损伤模型细胞存活率；*表示与0 mg/L组间差异具有统计学意义，#表示与造模组间差异具有统计学意义，P<0.05。Figure 2. Effects of different concentrations of PSP-SeNPs intervention for 24 h on the survival rate of AML12 cell如图2B所示，与酒精造模组相比，细胞在0.1 µg/L PSP-SeNPs溶液干预的情况下，存活率有明显升高（P<0.05）；而随着PSP-SeNPs的浓度升高，对存活率的改善效果出现下降；PSP-SeNPs浓度为100 µg/L时，细胞相对存活率比损伤组更低（P<0.05）。通过实验进一步探究PSP-SeNPs的干预浓度，结果如图2C所示，各干预浓度组间细胞活力改善效果没有显著性差异，但PSP-SeNPs对酒精损伤的改善效果在0.1~0.3 µg/L之间呈递增关系，在0.3~1 µg/L之间呈递减关系。因此最终选取0.1、0.2、0.3和0.4 µg/L的PSP-SeNPs进行后续实验。
2.2 Hoechst染色观察AML12细胞损伤情况
细胞受到损伤时会促进细胞凋亡来清除受损细胞。利用Hoechst的染色性质，显微镜下观察不同PSP-SeNPs干预后 AML12 细胞的凋亡情况推测细胞损伤变化，结果如图3所示。与正常对照组相比，酒精损伤组的荧光显微镜图片出现更多颜色发白的碎块状致密浓染，并且细胞间距较大，表示酒精导致的细胞凋亡程度比正常对照组高。与酒精损伤组相比，PSP-SeNPs干预可逆转以上改变。亮白色细胞碎片显著减少，细胞密集无明显间距，可见其对酒精所导致的细胞损伤有改善作用。
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图 3 不同干预情况下AML12细胞 Hoechst 染色结果注：A.正常对照组；B.酒精造模组；C.0.1 µg/L PSP-SeNPs干预+酒精组；D.0.2 µg/L PSP-SeNPs干预+酒精组；E.0.3 µg/L PSP-SeNPs干预+酒精组；F.0.4 µg/L PSP-SeNPs干预+酒精组。Figure 3. Hoechst staining results of AML12 cells under different intervention scenarios2.3 PSP-SeNPs对AML12细胞内氧化应激水平的影响
谷草转氨酶（AST）与谷丙转氨酶（ALT）主要分布在肝细胞内，肝细胞受到损伤时，二者从细胞进入血液，细胞内AST、ALT含量会大幅度降低，是反应肝损伤的重要指标。细胞AST、ALT的检测结果如图4所示，给予酒精处理后，细胞中AST、ALT活力显著降低（P<0.05）；与造模组相比，PSP-SeNPs预处理后细胞的AST、ALT活力显著提高（P<0.05）。
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图 4 不同干预情况下AML12细胞内生化指标结果注：A.谷草转氨酶相对活力；B.谷丙转氨酶相对活力；C.丙二醇；D.活性氧相对荧光强度；E.谷胱甘肽过氧化物酶相对活力；F.超氧化物歧化酶相对活力；G.过氧化氢酶相对活力；*表示与对照组组间差异具有统计学意义，#表示与造模组间差异具有统计学意义，P<0.05。Figure 4. Results of intracellular biochemical indices of AML12 under different intervention scenarios酒精可以引起细胞内ROS和自由基的大量累积，引发氧化应激损坏细胞功能；同时ROS作用于细胞生物膜上的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应生成MDA，二者含量可以反应细胞膜的损坏程度。对AML12细胞内MDA和ROS的含量进行测定，结果如图4所示，细胞在酒精处理后细胞MDA和ROS的含量显著上升（P<0.05）。而给予PSP-SeNPs预处理后，细胞内MDA和ROS的含量显著降低（P<0.05），与PSP-SeNPs具有一定剂量依赖关系。
为证明PSP-SeNPs干预能够提高AML12细胞内抗氧化酶活性，减少酒精对细胞带来的氧化损伤，对AML12细胞内GSH-Px、SOD、CAT活性进行检测。如图4所示，细胞在给予酒精处理后，细胞GSH-Px、SOD、CAT活力显著降低（P<0.05）；相较于造模组，PSP-SeNPs预处理后的细胞GSH-Px活力显著提高（P<0.05），但是0.4 µg/L PSP-SeNPs干预组的细胞GSH-Px活力出现显著下降；SOD、CAT活力显著提高（P<0.05），与PSP-SeNPs具有一定剂量依赖关系。硒作为硒代半胱氨酸掺入包括GSH-Px在内多种硒蛋白的活性位点，有研究认为，过量的CAT和SOD导致硒代半胱氨酸转化为脱氢丙氨酸，从而导致GSH-Px的失活和降解[24−25]，这可能是0.4 µg/L PSP-SeNPs干预组的细胞GSH-Px活力出现显著下降的原因。但结合SOD、CAT活力变化，PSP-SeNPs能帮助提高AML12细胞抗氧化水平。
因此，PSP-SeNPs干预对AML12细胞内的抗氧化酶有正向调节功能，能够有效抵抗酒精对肝细胞的氧化损伤，减少细胞内MDA和ROS的累积，保持细胞完整。
2.4 PSP-SeNPs对AML12细胞氧化应激相关基因表达的影响
为进一步探讨PSP-SeNPs的抗氧化作用机制，对不同干预后AML12细胞中Nrf2-Keap1及其通路下游基因的表达量进行测定。由图5可知，与正常对照组相比，酒精造模组中Nrf2的mRNA表达水平出现明显下降趋势；Keap1的mRNA表达水平出现显著性增长（P<0.05）；SOD2的mRNA表达水平显著性降低（P<0.05）；CAT和HO-1的mRNA表达水平显著性降低（P<0.05）；NQO1的mRNA表达水平出现明显下降趋势；GCLC的mRNA表达水平显著性降低（P<0.05）；GCLM的mRNA表达水平出现明显下降趋势。与酒精造模组相比，PSP-SeNPs干预组中Nrf2的mRNA表达水平上升差异具有显著性（P<0.05）；Keap1的mRNA表达水平显著性下降（P<0.05）；SOD2的mRNA表达水平显著性上升（P<0.05），且上升趋势与PSP-SeNPs具有一定剂量效应；CAT的mRNA表达水平显著性降低（P<0.05）；HO-1和NQO1的mRNA表达水平出现明显上升趋势，GCLC的mRNA表达水平下降，在0.2~0.4 µg/L PSP-SeNPs干预组出现显著性（P<0.05）；GCLM的mRNA表达水平出现一定的上升趋势。
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图 5 PSP-SeNPs对AML12细胞内氧化应激相关基因mRNA表达量的影响注：A. Nrf2 mRNA表达水平；B. Keap1 mRNA表达水平；C. SOD2 mRNA表达水平；D. CAT mRNA表达水平；E. HO1 mRNA表达水平；F. NQO1 mRNA表达水平；G. GCLC mRNA表达水平；H. GCLM mRNA表达水平；*表示与对照组组间差异具有统计学意义，#表示与造模组间差异具有统计学意义；P<0.05。Figure 5. Effects of PSP-SeNPs on mRNA expression of oxidative stress-related genes in AML12 cells由此可见，PSP-SeNPs可以调节AML12细胞内的氧化应激代谢通路，逆转酒精对Nrf2通路上基因表达的改变，上调后续抗氧化酶活性。
3. 讨论
本研究对PSP-SeNPs抵抗酒精导致肝细胞损伤的能力进行研究。以AML12细胞构建酒精性肝损伤体外模型，利用不同浓度PSP-SeNPs进行预防性处理后与单纯酒精造模组进行对比。经过对PSP-SeNPs预处理后的AML12细胞损伤相关指标进行测定，发现PSP-SeNPs可以有效抑制酒精引起的细胞内AST和ALT水平的降低，改善酒精导致的细胞损伤。再通过对细胞内氧化应激相关指标进行测定，发现相较单纯酒精干预PSP-SeNPs预处理可以增强细胞内GSH-Px、SOD以及CAT的活性，减少MDA、ROS含量。作为体内多种抗氧化酶的关键性组成元素，硒对体内抗氧化防御系统有正向调节作用[10]。有研究表明，在小鼠胚胎成纤维细胞中，纳米硒可以抑制细胞内ROS的产生，增加GSH-Px的活性[26]。Yang等[27]通过实验证实，以牦牛肠蜡样芽孢杆菌为材料生物合成的被多糖、蛋白包裹的纳米硒，可以通过激活Keap1/Nrf2信号通路从而减轻心肌细胞中ROS诱导氧化应激，同时平衡Bax/Bcl-2比值在心肌细胞中发挥抗凋亡活性。目前关于多糖-蛋白复合硒纳米颗粒抗氧化性能的研究较少，本实验的结果与现有研究结果一致认为多糖-蛋白硒纳米颗粒具有上调抗氧化酶活性，抵御氧化应激的作用，说明PSP-SeNPs确实对酒精性肝损伤起到一定的保护作用。
本研究通过进一步对细胞内氧化应激相关基因的表达量进行测定，发现Nrf2、NQO1、SOD、CAT、HO-1、GCLC和GCLM的mRNA表达量变化趋势与抗氧化酶活性的变化一致。Nrf2/Keap1通路是体内调节氧化应激的重要靶点[28−29]，有研究发现，补充岩藻多糖能够显著提升细胞核中Nrf2的表达，同时增加肝脏中SOD、CAT的活性，改善对酰氨基酚对小鼠造成的肝毒性[30]。HO-1被证实能够维持肝细胞完整性，提高机体内抗氧化水平[31]。NQO1能够通过维持泛醌的还原从而在内源性抗氧化中发挥作用[32]，GCLC和GCLM作为GSH合成限速酶的组成成分，二者可以梯控GSH的合成，进而影响体内ROS的清除速率[33]。Nrf2通过调控下游抗氧化代谢酶，在抗氧化中发挥重要作用[34−35]。因此，PSP-SeNPs可能是通过增加促进抗氧化酶合成基因的表达，减少细胞内氧化ROS、MDA的累积，发挥保护肝细胞的作用。
4. 结论
鲍鱼内脏多糖-蛋白质复合硒纳米颗粒可以通过激活Nrf2/Keap1通路上抗氧化相关转录标靶基因的表达，增加抗氧化酶活性，减少AML12细胞内氧化应激的程度，从而保护肝细胞免受酒精损伤。本研究有助于更进一步研究PSP-SeNPs的抗氧化能力，也为进一步研究PSP-SeNPs在肝脏酒精代谢中的作用机制提供了理论依据，对于PSP-SeNPs的后续开发应用具有重要意义。
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图 1 不同浓度酒精干预24 h对AML12细胞存活率的影响
注：*表示与0 mmol/L组间差异具有统计学意义，P<0.05。
Figure 1. Effects of different concentrations of ethanol intervention for 24 h on the survival rate of AML12 cell
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图 2 不同浓度PSP-SeNPs干预24 h对AML12细胞存活率的影响
注：A. 不同浓度PSP-SeNPs干预24 h后细胞存活率；B. 0.1~1000 µg/L PSP-SeNPs干预后酒精损伤模型细胞存活率；C. 0.1~1 µg/L PSP-SeNPs干预后酒精损伤模型细胞存活率；*表示与0 mg/L组间差异具有统计学意义，#表示与造模组间差异具有统计学意义，P<0.05。
Figure 2. Effects of different concentrations of PSP-SeNPs intervention for 24 h on the survival rate of AML12 cell
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图 3 不同干预情况下AML12细胞 Hoechst 染色结果
注：A.正常对照组；B.酒精造模组；C.0.1 µg/L PSP-SeNPs干预+酒精组；D.0.2 µg/L PSP-SeNPs干预+酒精组；E.0.3 µg/L PSP-SeNPs干预+酒精组；F.0.4 µg/L PSP-SeNPs干预+酒精组。
Figure 3. Hoechst staining results of AML12 cells under different intervention scenarios
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图 4 不同干预情况下AML12细胞内生化指标结果
注：A.谷草转氨酶相对活力；B.谷丙转氨酶相对活力；C.丙二醇；D.活性氧相对荧光强度；E.谷胱甘肽过氧化物酶相对活力；F.超氧化物歧化酶相对活力；G.过氧化氢酶相对活力；*表示与对照组组间差异具有统计学意义，#表示与造模组间差异具有统计学意义，P<0.05。
Figure 4. Results of intracellular biochemical indices of AML12 under different intervention scenarios
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图 5 PSP-SeNPs对AML12细胞内氧化应激相关基因mRNA表达量的影响
注：A. Nrf2 mRNA表达水平；B. Keap1 mRNA表达水平；C. SOD2 mRNA表达水平；D. CAT mRNA表达水平；E. HO1 mRNA表达水平；F. NQO1 mRNA表达水平；G. GCLC mRNA表达水平；H. GCLM mRNA表达水平；*表示与对照组组间差异具有统计学意义，#表示与造模组间差异具有统计学意义；P<0.05。
Figure 5. Effects of PSP-SeNPs on mRNA expression of oxidative stress-related genes in AML12 cells
表 1 实时荧光定量PCR引物序列
Table 1 Real-time PCR primer sequences
引物名称 引物序列（5’-3’） β-actin F：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC
R：ATGGAGCCACCGATCCACANrf2 F：TGCTCCTATGCGTGAATCCCA
R：CTTTTGCCCTAAGCTCATCTCGTKeap1 F：GACCTGGACTTTCGTAGCCC
R：CCGGGTCATAGCATTCCACANQO1 F：CCCAGATATTGTGGCCGAAC
R：AGCACTCTCTCAAACCAGCHO-1 F：AGGTACACATCCAAGCCGAG
R：TGCTTGTTGCGCTCTATCTCCCAT F：CAGTGCGCTGTAGATGTGAAAC
R：GGTGGACGTCAGTGAAATTCTTGSOD2 F：CAGACCTGCCTTACGACTATGG
R：CTGAAGAGCGACCTGAGTTGTA
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