Enzymatic Cleavage of Walnut Isolate Proteins by Dregea sinensis Hemsl. Protease and Its Anti-fatigue Effect In Vivo
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摘要: 为了研究核桃蛋白酶解物的抗疲劳作用，为其功能性产品的开发和利用提供科学依据。本文以超临界萃取的核桃粕为原料，提取核桃分离蛋白（WPI），使用贯筋藤蛋白酶酶解WPI，以水解度为指标，研究最佳酶解条件制备核桃肽，并研究不同分子量的核桃蛋白酶解物对小鼠运动性疲劳的缓解作用。将小鼠随机分为五组，每日经口灌胃受试样品，干预周期为一个月，最后进行负重及力竭游泳实验，测定血清尿素氮（BUN）、乳酸（LA）、肝糖原（HG）、肌糖原（MG）、谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量。SDS-PAGE凝胶电泳表明贯筋藤蛋白酶对WPI有明显的降解作用；单因素实验结合响应面试验表明，当料液比为9:100、pH9.6、酶添加质量9.4%、酶解时间180 min、酶解温度63 ℃时，水解度最高达30.1%；HE染色显示，使用贯筋藤蛋白酶提取的酶解物对小鼠无任何毒副作用；与其他组相比，分子量小于3000 Da的核桃蛋白酶解物干预小鼠的LA和BUN含量有所降低，HG和MG含量提高，延长负重游泳时间较为显著（P<0.05），核桃蛋白酶解物干预的各组小鼠血清中SOD酶、GSH-Px酶活性显著提高（P<0.05）。表明核桃蛋白酶解物可以缓解小鼠运动性疲劳，而小分子量的核桃蛋白酶解物效果更显著，这可能是通过调节体内抗氧化活性实现的。Abstract: To study the anti-fatigue effect of walnut proteolytic enzymes and to provide scientific basis for the development and utilization of its functional products. Walnut isolated protein (WPI) was extracted from supercritically extracted walnut meal, and the WPI was enzymatically digested by Dregea sinensis Hemsl. protease. The hydrolysis degree (DH) was used as an index to study the optimal conditions for the preparation of walnut peptides, and the effects of different molecular weights of walnut proteins on the alleviation of exercise fatigue in mice were also investigated. The mice were randomly divided into five groups, and the test samples were orally gavaged daily for one month. Finally, weight-bearing and exhaustion swimming experiments were performed to determine the serum urea nitrogen (BUN), lactic acid (LA), hepatic glycogen (HG), myo-glycogen (MG), glutathione peroxidase (GSH-Px), malondialdehyde (MDA), and superoxide dismutase (SOD) contents. SDS-PAGE gel electrophoresis showed that the WPI was significantly degraded by Dregea sinensis Hemsl. Protease. The one-way combined response surface experiment showed that the DH was up to 30.1% when the material-liquid ratio was 9:100, pH9.6, enzyme addition quality 9.4%, enzyme digestion time 180 min, and enzyme digestion temperature 63 ℃. HE staining showed that the enzyme extracted by the use of Dregea sinensis Hemsl. Protease did not have any toxicity side effects on mice. Compared with other groups, the enzymatic digests with molecular weight less than 3000 Da showed a decrease in LA and BUN content, an increase in HG and MG content, and a more significant prolongation of weight-bearing swimming time (P<0.05), and a significant increase in the activities of SOD enzyme and GSH-Px enzyme in serum of mice in each group in the sample (P<0.05). It indicated that walnut proteolytic digests could alleviate exercise fatigue in mice, and the effect of small molecular weight walnut proteolytic digests was more significant, which might be realized by regulating antioxidant activity in vivo.
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核桃是我国极其重要的木本油料树种，而云南省核桃种植面积极广，核桃产量、产值在中国位列第一，核桃大部分用于榨油，由此产生的大量核桃粕无法得到很好的利用，常被丢弃，利用率极低[1−2]。超临界萃取的核桃粕中蛋白质含量高达48%，脂肪含量为9.16%，灰分占5.33%，水分含量为5.35。而蛋白质是合成体内大多数免疫物质的原料的来源，适当的进食核桃蛋白能为机体补充优质蛋白，提高机体免疫力[3]。李汉阳等[4]、袁晋芳[5]研究发现，使用Alcalase和胰蛋白酶的复配蛋白酶酶解核桃蛋白得到的蛋白肽抗氧化能力极好，且分子量与抗氧化能力呈反比关系，此外，核桃蛋白肽还具有抗肿瘤[6]、益智健脑[7−8]、免疫调节[9]等多种生物活性。
贯筋藤多生长在山地灌木丛中，是萝藦科植物，多分布于云南、贵州等地，当地居民用贯筋藤制作乳扇，将其称为“奶浆藤”。研究表明从贯筋藤中提取的蛋白酶，该酶降解κ-CN位点为90~91之间的丙氨酸-谷氨酰胺（Ala90-Gln91），最适pH为8.6~8.8，并且可耐受85 ℃高温，是一种耐高温、耐酸碱且凝乳活力好的半胱氨酸蛋白酶[10−12]。制作乳饼时，使用贯筋藤蛋白酶进行凝乳，制成的乳饼口感极好，并且具有贯筋藤这种植物特有的芳香[13−14]，将贯筋藤凝乳酶加入水牛奶中制作奶酪，质量好、风味佳[15]。在预实验阶段，我们将贯筋藤蛋白酶用于酶解核桃分离蛋白，发现其可酶解核桃蛋白的35000 Da和60000 Da分子段，初探酶解物的抗氧化性得出，该酶解物的抗氧化能力良好。接着，在核桃蛋白酶解物混合物的功能初探阶段，我们发现其抗疲劳功效显著，于是将其进行超滤，以探究不同分子量酶解物的抗疲劳效果。本研究首次将贯筋藤蛋白酶用于酶解植物蛋白，得到核桃蛋白酶解物后超滤分离，并研究各分子量核桃蛋白肽的抗疲劳、抗氧化活性，除减少了核桃粕的浪费之外，还对植物蛋白资源奠定理论基础具有实际意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
超临界萃取核桃粕 实验室提供；贯筋藤 山上采摘（昆明）；透析袋（3500 Da） 上海源叶生物技术有限公司；柠檬酸、氢氧化钠、硫酸铵 成都金山化学试剂有限公司；氯化钠 天津市恒兴化学试剂制造有限公司；中性甲醛 天津市优谱化学试剂有限公司；其它试剂均为国产分析纯；实验小鼠 雄性KM小鼠（SCXK豫2020-0005）；糖原、血清尿素氮（BUN）、乳酸脱氢酶（LD）、谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒 南京建成生物工程研究生有限公司。
SK8210HP恒温超声波仪 上海科导超声仪器有限公司；PHS-3C酸度计 上海赫尔普国际贸易有限公司；WT2002电子天平 杭州万特衡器有限公司；TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器场；88-1磁力搅拌器、HH-8恒温水浴锅 常州智博瑞仪器制造有限公司；HF-5L喷雾干燥机 上海贺帆仪器有限公司；LGJ-12真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 核桃蛋白的制备
参照代晹鑫等[16]的方法并略作修改。取适量洁净且无虫害的核桃粕按料液比1:10的比例混于水中，置于胶体磨中研磨3 min，待泡沫消失后再调节pH，用1 mol/L的NaOH将核桃粕悬浊液pH调至9.5，将恒温超声波仪的温度调节在55 ℃，然后将调好pH的悬浊液超声1 h，超声结束后冷却至室温，后将其放入4 ℃、4500 r/min的离心机离心15 min，随后除去油层，滤出上清液，使用1 mol/L的HCl将上清液pH调至4.5，静置1 h后4500 r/min离心15 min，获得核桃分离蛋白沉淀，加入蒸馏水水洗沉淀3~5次，调回pH至中性，喷雾干燥设置进风温度180 ℃，蠕动泵数值70 Hz提取核桃蛋白备用。
1.2.2 贯筋藤蛋白酶的提取
参照赵琼等[17]的方法略作修改。将贯筋藤茎杆晒干，人工分成15~20 cm的小段，用流水除去表面异物，敲碎后在60 ℃水中浸泡后120目四层纱布反复过滤至无肉眼所见杂质，过滤后的滤液4000 r/min离心20 min。进行凝乳实验，保留凝乳时间小于0.5 h、凝乳状态好的滤液，并将滤液真空浓缩（55 ℃，−0.08 MPa）至20%。浓缩液采用等电点分离，缓缓加入硫酸铵粉末老化，4000 r/min离心20 min弃去上清液，沉淀加少量超纯水溶解作为盐析蛋白质样品，样品加入透析袋（MW3500）中透析除去硫酸铵等杂质，塑料烧杯收集透析后溶液放入−80 ℃冰箱迅速冷冻，然后放入真空冷冻干燥机（真空度1 Pa，冷阱温度−60 ℃，样品温度−40~−20 ℃）中冷冻干燥，制得贯筋藤蛋白酶干粉，−20 ℃下低温保藏。
参照Arima[18]法，取50 mL新鲜山羊乳，加热至85 ℃后同温度下水浴，加入为羊奶体积35%（17.5 mL）的贯筋藤溶液，充分混合后继续水浴。准确记录从加入贯筋藤溶液到羊乳凝固的时间。凝乳酶活力定义为：40 min凝固1 mL山羊乳的酶量（贯筋藤溶液用量）为1单位（Soxhelt Unit，Su）。
SU=2400×50×D/(t×17.5) 式中，t为凝乳时间（s），D为贯筋藤溶液或粗酶液的稀释倍数。
1.2.3 核桃蛋白酶解物的制备
参照田洋等[19]和姜荣庆[20]的方法并略作修改。将核桃蛋白与水按照一定料液比混合，60 ℃超声10 min，迅速调节pH至碱性，加酶，在特定温度水浴锅中酶解2~5 h，沸水灭酶10 min，降至常温，使用4 ℃离心机进行离心（4500 r/min，15 min），取出上清液，冷冻干燥备用。
1.2.4 单因素实验
根据前期预实验，以水解度为指标，固定酶浓度为10%、酶解时间3 h、酶解pH9、酶解温度60 ℃，考察料液比（3:100、6:100、9:100、12:100、15:100）对水解度的影响；固定酶解时间180 min、料液比9:100、酶解pH9、酶解温度60 ℃，考察酶添加量（6%、8%、10%、12%、14%）对水解度的影响；固定酶浓度为10%、料液比9:100、酶解pH9、酶解温度60 ℃，考察酶解时间（120、150、180、210、240 min）对水解度的影响；固定酶浓度为10%、酶解时间3 h、料液比9:100、酶解温度60 ℃，考察酶解pH（7、8、9、10、11）对水解度的影响；固定酶浓度为10%、酶解时间3 h、酶解pH9、料液比9:100，考察酶解温度（45、50、55、60、65 ℃）对水解度的影响。
1.2.5 响应面优化试验
在单因素实验的基础上，结合响应面优化试验数据，将核桃蛋白酶解物的水解度作为响应值，如表1所示，选取水解度较为显著的酶添加质量（%）、酶解pH和酶解温度（℃），确定核桃蛋白的最佳酶解条件。
表 1 响应面试验因素水平设计Table 1. Level design of response surface test factors水平 酶浓度（%） 酶解pH 酶解温度（℃） −1 8 7 50 0 10 8 55 1 12 9 60 1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
参照沈敏江[21]的方法并略作改动。采用浓度为12%分离胶，浓度为5%浓缩胶。精确称取4.5 mg核桃蛋白及核桃蛋白酶解物样品，加入上样缓冲液，混匀后置于金属浴中加热3 min，在5000 r/min的条件下离心10 min。吸取15 μL核桃蛋白及核桃蛋白酶解物进行上样，浓缩胶的电压设置为80 V，待样品跑完浓缩胶后将电压增加至130 V直至结束。再进行染色、脱色、拍照。
1.2.7 核桃蛋白酶解物的超滤
使用超滤技术将核桃蛋白酶解物分成不同分子量的三部分，分别为≤3000 Da、3000~5000 Da、≥5000 Da。超滤完成后使用冷冻干燥技术将其冻干，置于−20 ℃条件下保藏。
1.2.8 不同分子量核桃肽的体外抗氧化实验
参考赵才东等[22]的方法测定其对DPPH、ABTS+自由基清除率。将DPPH粉末加入甲醇中制得0.26 mmol/L DPPH溶液。取100 μL DPPH溶液与20 μL样品加入96孔板中，室温避光条件中反应30 min，在波长517 nm处用全自动酶标仪测定其吸光度，平行测定3次。ABTS+自由基清除能力的测定将5 mL 7.4 mmol/L ABTS储备液与88 μL 2.6 mmol/L K2S2O8溶液混匀，暗处静置12~16 h，配成ABTS工作液。ABTS工作液用80%乙醇稀释，使混合溶液在734 nm波长处的吸光值为0.7。将200 μL ABTS工作液与20 μL样品加入96孔板中，常温避光混合6 min，在波长734 nm处测定吸光度，平行测定3次。
DPPH自由基清除率(%)=A0−(Ai−Aj)A0×100 式中，A0—不加样品，加入DPPH时的吸光度；Ai—加入样品和DPPH的吸光度；Aj—加入样品，不加DPPH的吸光度。
ABTS+自由基清除率(%)=A0−Ai−AjA0×100 式中，A0—不加样品，加入ABTS时的吸光度；Ai—加入样品和ABTS的吸光度；Aj—加入样品，不加ABTS的吸光度。
1.2.9 动物分组与游泳实验
选择5周龄、18~22 g的雄性KM小鼠90只，饲养于SPF级洁净动物实验室，饲养期间不限制小鼠的饮食和饮水，一周适应期后进行筛选，选出适合实验条件的80只小鼠进行实验。将KM小鼠随机分为5组：分别为空白对照组（Control）、阳性对照西洋参组（PC）、<3000 Da核桃蛋白酶解物（WPPL）、3000~5000 Da核桃蛋白肽酶解物（WPPM）、>5000 Da核桃蛋白酶解物组（WPPH），每组16只小鼠，其中随机取8只标为Y，剩下8只标记为N，小鼠每天灌胃200 mg/kg的核桃蛋白酶解物及西洋参，对照组每天灌胃相应剂量的生理盐水，其余组都使用生理盐水溶解样品，实验周期为31 d，每天对小鼠进行称重并做好记录。一个月后标记为N的小鼠进行负重游泳实验，Y进行力竭游泳实验[23−24]。
1.2.10 疲劳相关生化指标的测定及苏木精-伊红（HE）染色
在实验的最后1 d，先灌胃受试物，等待30 min后，每组标记为N的8只小鼠放于事先准备好的游泳箱中运动30 min，结束后休息45 min取血、右腿肌肉和肝脏。从血液中分离出血清，用于BUN、LD、GSH-Px、SOD、MDA测定，肝脏用于HG的测定，右腿肌肉用于MG的测定。在每组的N中分别取3只小鼠进行病理性考察，取右腿肌肉，进行HE染色评价小鼠肌肉病理变化。
1.3 数据处理
应用OriginPro 2021处理所得数据并做图，多组数据相比较采用t检验，所有数据均以“平均值±标准差”表示，显著水平为P<0.05。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验分析结果
如图1所示，随着核桃粕与水比值的增加，水解度呈先升后降的趋势，核桃粕与水的比值是9:100时，水解度为21.9%，此时水解度达到最高值。在pH位于7~11的区间里，水解度依然呈现先增后减的趋势，当酶解pH为9时，水解度最高达27.2%。而对于酶添加量，本方法提取的贯筋藤蛋白酶酶活力为216.16 SU/mg，核桃蛋白酶解物的水解度一直增加，在酶添加质量低于10%时，水解度提升幅度较大，此后继续增加酶用量，水解度继续增加，但是增幅较小并趋于平缓，因此酶添加量选择10%。由单因素趋势分析结果也可看出，在反应前期核桃蛋白的水解度随着酶解时间的延长有较快的提升，根据酶反应动力学可以得知，在水解初期，由于蛋白质中存在着大量的酶切位点，因此反应较为剧烈[25]；随着反应时间的延长，酶切位点逐渐被断开，此时水解速度就会变得越来越缓慢，最终酶切作用位点被完全打开后，蛋白的水解度将不会再升高，因此酶解时间选择180 min。当反应温度为60 ℃时，蛋白组的水解度达到最高。综合各因素对核桃蛋白水解度的影响，选择酶解条件为：酶添加质量10%，料液比9:100，反应时间180 min，酶解pH为9，酶解温度60 ℃。
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图 1 贯筋藤酶解核桃蛋白的单因素趋势分析Figure 1. Single factor trend analysis of the enzymatic degradation of walnut protein by Dregea sinensis Hemsl. protease2.2 响应面优化结果
采用Design-Expert 10.0.7软件对酶解工艺进行响应面优化，试验结果如表2所示，得到水解度的多元二次回归方程为：水解度Y1=28.40+1.00A+2.63B+2.38C−2.00AB−1.00AC+0.25BC−4.58A2−2.32B2−0.32C2。由表3可知，此模型极显著（P<0.001），失拟项均不显著（P>0.05），说明此模型拟合程度好，可靠性高。模型的决定系数R2为0.9956，说明水解度有99.56%来源于所选变量，因此，此模型的回归方程可用于分析和预测水解度。由表3亦可知，对于水解度模型，A（酶添加量）、B（酶解pH）、C（酶解温度）、A2、B2对水解度有极显著影响（P<0.01）；AB有显著影响（P<0.05），AC、BC、C2无显著影响。
表 2 核桃分离蛋白酶解工艺优化响应面试验设计及结果Table 2. Experimental design and results of optimal response surface for walnut separation proteolytic hydrolysis process实验号 A酶添加量 B酶解pH C酶解温度 水解度（%） 1 −1 −1 0 16.12±0.12 2 1 −1 0 22.21±0.15 3 −1 1 0 24.97±0.12 4 1 1 0 23.22±0.16 5 −1 0 −1 18.32±0.12 6 1 0 −1 22.31±0.11 7 −1 0 1 26.95±0.09 8 1 0 1 27.18±0.43 9 0 −1 −1 22.24±0.26 10 0 1 −1 27.48±0.14 11 0 −1 1 24.11±0.22 12 0 1 1 30.46±0.14 13 0 0 0 28.21±0.11 14 0 0 0 29.16±0.23 15 0 0 0 28.36±0.18 16 0 0 0 28.42±0.24 17 0 0 0 29.42±0.22 根据软件分析，将酶解液的水解度设置为maximize最大值，得到水解度最高的酶解条件为：酶解温度63.06 ℃，酶添加质量9.41%，酶解pH9.59，水解度的预测值为30.4%。为了实验便捷，确定最佳酶解条件为酶解温度63 ℃，酶添加质量9.4%，酶解pH9.6，在此条件下进行多次验证试验，水解度平均为30.1%，与预测值较为接近。
表 3 水解度回归模型分析Table 3. Analysis of regression model of hydrolysis degree方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 246.55 9 27.39 16.75 0.0006 ** A 8 1 8 4.89 0.0027 ** B 55.12 1 55.12 33.70 0.0007 ** C 45.12 1 45.12 27.59 0.0012 ** AB 16 1 16 9.78 0.0167 * AC 4 1 4 2.45 0.1618 BC 0.25 1 0.25 0.15 0.7075 A2 88.13 1 88.13 53.88 0.0002 ** B2 22.76 1 22.76 13.91 0.0074 ** C2 0.44 1 0.44 0.27 0.6182 总残差 11.45 7 1.64 失拟项 10.25 3 3.42 11.39 0.1199 净误差 1.2 4 0.3 总和 258 16 注：“*”表示对结果影响显著（P<0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P<0.01）。 2.3 SDS-PAGE
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种根据分子量去分离蛋白质的技术，结果如图2所示。核桃分离蛋白的电泳条带主要分布在10~70 kDa，使用贯筋藤蛋白酶酶解核桃蛋白后，35 kDa、60 kDa的蛋白条带明显被降解为小分子在下层堆积，说明贯筋藤蛋白酶对核桃蛋白具有良好的酶解作用。
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图 2 核桃蛋白与酶解物的SDS-PAGE图Figure 2. SDS-PAGE gel electrophoresis of walnut proteins and enzyme digests2.4 体外抗氧化结果
将维生素C作为阳性组，由图3可知，在0.25~4.00 mg/mL浓度范围内，各组的DPPH、ABTS+自由基清除能力都较为良好，且具有剂量依赖性。其中，WPPs-1（<3000 Da）相比于较大分子量核桃酶解物的DPPH、ABTS+自由基清除活性皆为最强，最接近阳性对照组。采用碱性蛋白酶水解核桃蛋白，获得分子质量小于3000 Da的核桃蛋白肽具有一定的抗氧化能力，核桃蛋白肽对DPPH自由基的清除率在20 mg/mL时达到最大，为66%[26]。而采用贯筋藤蛋白酶酶解核桃蛋白得到的小于3000 Da的酶解物在1 mg/mL时就已经达到了63%。可见，使用贯筋藤蛋白酶酶解产生的小分子酶解物具备较好的抗氧化活性，可为后续的相关研究提供理论基础。
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2.5 核桃蛋白肽对小鼠负重游泳时间的影响
小鼠的负重游泳时间可以反映其是否疲劳及疲劳的程度[27]。由表4可以看出，与空白对照组相比，阳性对照组（PC）小鼠的负重游泳时间相比于空白对照组显著延长（P<0.05），分子量小于3 kDa的WPPL组的小鼠负重游泳时间为10.79±2.52 min，相对于空白对照组的负重游泳时间显著延长（P<0.05），约为空白对照组的2.24倍。而WPPM与WPPH组小鼠的负重游泳时间与空白组无显著性差异，说明小分子量的核桃蛋白酶解物可能具备更好的抗疲劳效果。
表 4 核桃蛋白肽对小鼠负重游泳时间的影响Table 4. Effects of walnut protein peptides on weight-bearing swimming time in mice组别 负重游泳时间（min） Control 4.81±2.59c PC 15.41±4.96a WPPL 10.79±2.52b WPPM 8.46±1.38bc WPPH 8.75±1.58bc 注：同列右肩不同的小写字母表示具有显著差异（P<0.05）。 2.6 核桃蛋白酶解物对小鼠体重、脏器指数及肝脏HE染色的影响
由表5可知，各组小鼠的体重都有10~12 g左右的增加，各组小鼠的体重增长幅度均没有显著性差异。脏器指数反应了一定的小鼠的健康状况，如表6所示，WPPL组、WPPM组和WPPH组的小鼠心脏、肝脏、肾脏、脾脏与阳性组及空白对照组都无显著性差异，说明核桃蛋白酶解物对小鼠的各脏器无任何毒副作用。
表 5 核桃蛋白酶解物对小鼠体重的影响Table 5. Effects of peach protein digests on the body weight of mice分组 初始体重（g） 最终体重（g） Control 20.21±0.94 32.29±1.17 PC 20.41±0.98 31.54±0.91 WPPL 20.43±0.94 30.34±1.22 WPPM 20.31±0.85 30.50±1.18 WPPH 20.36±0.51 30.10±0.62 表 6 核桃蛋白酶解物对小鼠脏器指数的影响Table 6. Effects of walnut protease hydrolysate on organ indexes in mice组别 心脏系数（mg/g） 肝脏系数（mg/g） 肾脏系数（mg/g） 脾脏系数（mg/g） Control 44.97±1.26 11.1±0.65 20.83±2.06 7.59±1.35 PC 46.05±2.56 10.68±1.12 21.65±1.63 7.97±1.07 WPPL 44.20±2.71 10.96±1.05 21.99±1.94 8.26±1.07 WPPM 41.01±3.04 10.62±1.67 18.88±2.01 6.74±1.17 WPPH 44.18±1.09 9.72±0.99 18.63±0.75 6.49±1.05 如图4所示，小鼠后腿肌肉组织可见横切面与纵切面相间分布的肌细胞，纵切面中的肌细胞是细长呈圆柱状的细胞，肌质内含有许多沿细胞长轴平行排列的肌原纤维，细胞核位于细胞周边近肌膜处，呈椭圆形；横切面显示数个边界清楚的肌纤维束，肌束内的肌纤维排列紧密，多数呈角状外观，可见典型的明暗相间排列的横纹，未见明显异常。说明阳性组的西洋参和核桃蛋白酶解物对小鼠都无任何毒副作用。
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图 4 小鼠后腿肌肉的HE染色注：2.0×表示放大倍数为2；20.0×表示放大倍数为20；lwp、mwp和hwp分别表示低、中、高剂量的核桃蛋白酶解物。Figure 4. HE staining of mouse hind leg muscles2.7 核桃蛋白肽对小鼠血清BUN、LD的影响
由图5可以看出，与Control组相比，PC组和WPPL、WPPM、WPPH组小鼠的血清BUN含量均降低，说明小鼠在长时间负重游泳前，补充西洋参与核桃蛋白肽，小鼠肌肉蛋白质的分解代谢出现显著降低的状况，其中，WPPL组的BUN降低最为显著（P<0.05），可能是由于WPPL中含有大量的功能性短肽及壳寡糖，而糖代谢的调节正需要两者的参与，导致肌肉中蛋白质消耗量减少，从而减少尿素的产生，达到抗疲劳的效果[28]。与Control组相比，PC组小鼠的血清乳酸含量显著（P<0.05）降低，WPPL组小鼠的血清LD含量降低了26.04%、WPPM组降低17.71%，WPPH降低12.50%，说明核桃蛋白肽对小鼠运动性疲劳有较好的缓解作用，其中WPPL的缓解作用最好。说明使用贯筋藤蛋白酶酶解的核桃蛋白酶解物可能增加小鼠糖原的储备，使实验鼠体内的有氧代谢能力得到提升，减少肌肉中乳酸的形成，从而缓解疲劳。
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图 5 核桃蛋白肽对小鼠BUN、LD含量的影响Figure 5. Effects of walnut protein peptide on BUN and LD content in mice2.8 核桃蛋白肽对小鼠HG和MG含量的影响
从图6可以看出，与对照组相比，阳性组及核桃蛋白酶解物组小鼠的肝糖原均有一定的提高，说明西洋参与核桃蛋白酶解物都能促进小鼠运动后肝糖原的恢复，其中WPPM的肝糖原有显著提升（P<0.05）且效果优于西洋参。机体运动的主要贮能物质为糖原，包括肌糖原和肝糖原，而机体运动能力减弱的主要原因也是因为肝/肌糖原的过量消耗[29]，当小鼠食用核桃蛋白肽后，体内的MG含量显著增加（P<0.05），猜测是由于核桃蛋白肽调节了糖的代谢，其中，WPPL组MG含量提高尤为显著（P<0.05），可能是与WPPL共价结合的壳寡糖分解代谢，使机体血糖含量得到补充，从而提高了小鼠的运动耐力。
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图 6 核桃蛋白肽对小鼠HG和MG含量的影响Figure 6. Effects of walnut protein peptide on HG and MG content in mice2.9 核桃蛋白肽对小鼠SOD、GSH-Px、MDA的影响
本研究通过测定各组实验小鼠的血清SOD、GSH-Px、MDA含量来评价核桃蛋白肽对小鼠抗氧化能力的影响。如图7所示，与空白对照组相比，WPPL、WPPM、WPPH组小鼠血清中SOD及GSH-Px活力均明显升高（P<0.05），其中WPPL效果最为显著（P<0.05），可能是由于核桃蛋白酶解物在小鼠体内加快了自由基清除的代偿性反应，MDA各组间无显著性差异。由此说明，分子量小于3000 Da的核桃蛋白酶解物能显著提高小鼠的抗氧化能力。
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图 7 核桃蛋白肽对小鼠SOD、GSH-Px和MDA含量的影响Figure 7. Effects of walnut protein peptide on SOD, GSH-Px and MDA content in mice3. 结论
本文使用贯筋藤蛋白酶水解核桃蛋白，单因素实验结合响应面试验表明，当料液比为9:100、pH9.6、酶添加质量9.4%、酶解时间180 min、酶解温度63 ℃时，水解度最高达30.1%；HE染色显示，使用贯筋藤蛋白酶提取的酶解物对小鼠无任何毒副作用。
本文还研究了核桃蛋白酶解物的抗疲劳及抗氧化效应，发现WPPL、WPPM、WPPH均能使实验小鼠的力竭游泳时间得到不同程度的延长，实验小鼠负重游泳后MG和HG的消耗以及LD的沉积呈现降低的趋势，小鼠体内蛋白质的分解代谢得到一定的改善，有效地清除了实验小鼠体内的血清BUN，具有显著的抗疲劳效果。其中，WPPL组力竭游泳时间最长约为10.79±2.52 min，小鼠体内血液生化指标SOD、GSH-Px的结果显示抗氧化活性最强的是小分子的核桃蛋白酶解物。
此外，灌胃核桃蛋白酶解物后，各组小鼠的脏器指数并无显著性差异，HE染色无明显异常，说明核桃蛋白肽并未对小鼠产生任何毒副作用。目前，在国内外的市场上关于核桃蛋白肽的研究与开发利用较少，因此核桃蛋白肽作为一种天然的抗疲劳功能性食品，其用于食品添加剂或功能性肽粉的研发，有着巨大的发展空间。后续可研究其降脂活性，而本文也可为该核桃蛋白肽的抗疲劳机制研究奠定一定的基础。
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图 1 贯筋藤酶解核桃蛋白的单因素趋势分析
Figure 1. Single factor trend analysis of the enzymatic degradation of walnut protein by Dregea sinensis Hemsl. protease
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图 2 核桃蛋白与酶解物的SDS-PAGE图
Figure 2. SDS-PAGE gel electrophoresis of walnut proteins and enzyme digests
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图 4 小鼠后腿肌肉的HE染色
注：2.0×表示放大倍数为2；20.0×表示放大倍数为20；lwp、mwp和hwp分别表示低、中、高剂量的核桃蛋白酶解物。
Figure 4. HE staining of mouse hind leg muscles
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图 5 核桃蛋白肽对小鼠BUN、LD含量的影响
Figure 5. Effects of walnut protein peptide on BUN and LD content in mice
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图 6 核桃蛋白肽对小鼠HG和MG含量的影响
Figure 6. Effects of walnut protein peptide on HG and MG content in mice
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图 7 核桃蛋白肽对小鼠SOD、GSH-Px和MDA含量的影响
Figure 7. Effects of walnut protein peptide on SOD, GSH-Px and MDA content in mice
表 1 响应面试验因素水平设计
Table 1 Level design of response surface test factors
水平 酶浓度（%） 酶解pH 酶解温度（℃） −1 8 7 50 0 10 8 55 1 12 9 60 
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表 2 核桃分离蛋白酶解工艺优化响应面试验设计及结果
Table 2 Experimental design and results of optimal response surface for walnut separation proteolytic hydrolysis process
实验号 A酶添加量 B酶解pH C酶解温度 水解度（%） 1 −1 −1 0 16.12±0.12 2 1 −1 0 22.21±0.15 3 −1 1 0 24.97±0.12 4 1 1 0 23.22±0.16 5 −1 0 −1 18.32±0.12 6 1 0 −1 22.31±0.11 7 −1 0 1 26.95±0.09 8 1 0 1 27.18±0.43 9 0 −1 −1 22.24±0.26 10 0 1 −1 27.48±0.14 11 0 −1 1 24.11±0.22 12 0 1 1 30.46±0.14 13 0 0 0 28.21±0.11 14 0 0 0 29.16±0.23 15 0 0 0 28.36±0.18 16 0 0 0 28.42±0.24 17 0 0 0 29.42±0.22
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表 3 水解度回归模型分析
Table 3 Analysis of regression model of hydrolysis degree
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 246.55 9 27.39 16.75 0.0006 ** A 8 1 8 4.89 0.0027 ** B 55.12 1 55.12 33.70 0.0007 ** C 45.12 1 45.12 27.59 0.0012 ** AB 16 1 16 9.78 0.0167 * AC 4 1 4 2.45 0.1618 BC 0.25 1 0.25 0.15 0.7075 A2 88.13 1 88.13 53.88 0.0002 ** B2 22.76 1 22.76 13.91 0.0074 ** C2 0.44 1 0.44 0.27 0.6182 总残差 11.45 7 1.64 失拟项 10.25 3 3.42 11.39 0.1199 净误差 1.2 4 0.3 总和 258 16 注：“*”表示对结果影响显著（P<0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P<0.01）。
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表 4 核桃蛋白肽对小鼠负重游泳时间的影响
Table 4 Effects of walnut protein peptides on weight-bearing swimming time in mice
组别 负重游泳时间（min） Control 4.81±2.59c PC 15.41±4.96a WPPL 10.79±2.52b WPPM 8.46±1.38bc WPPH 8.75±1.58bc 注：同列右肩不同的小写字母表示具有显著差异（P<0.05）。
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表 5 核桃蛋白酶解物对小鼠体重的影响
Table 5 Effects of peach protein digests on the body weight of mice
分组 初始体重（g） 最终体重（g） Control 20.21±0.94 32.29±1.17 PC 20.41±0.98 31.54±0.91 WPPL 20.43±0.94 30.34±1.22 WPPM 20.31±0.85 30.50±1.18 WPPH 20.36±0.51 30.10±0.62
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表 6 核桃蛋白酶解物对小鼠脏器指数的影响
Table 6 Effects of walnut protease hydrolysate on organ indexes in mice
组别 心脏系数（mg/g） 肝脏系数（mg/g） 肾脏系数（mg/g） 脾脏系数（mg/g） Control 44.97±1.26 11.1±0.65 20.83±2.06 7.59±1.35 PC 46.05±2.56 10.68±1.12 21.65±1.63 7.97±1.07 WPPL 44.20±2.71 10.96±1.05 21.99±1.94 8.26±1.07 WPPM 41.01±3.04 10.62±1.67 18.88±2.01 6.74±1.17 WPPH 44.18±1.09 9.72±0.99 18.63±0.75 6.49±1.05
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