Effects of Natural Extracts and Complex Phosphates on the Quality Characteristics of Yak Meat Minced during Cold Storage
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摘要: 为了研究天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜在冷藏过程中品质特性的影响，明确天然提取物与复合磷酸盐复配的抗氧化作用。本文以牦牛肉糜为研究对象，按0.015%、0.02%、0.10%比例将迷迭香、葡萄籽提取物和复合磷酸盐进行复配，测定肉糜在4 ℃条件下冷藏12、24、36、48、60 h后其食用品质、流变特性、脂质氧化及蛋白氧化等指标变化。结果表明，随着冷藏时间的延长，复配迷迭香、葡萄籽提取物及复合磷酸盐复配后处理的牦牛肉糜pH明显呈下降趋势，持水性显著提高（P<0.05），有效维持了牦牛肉糜的色泽，并减缓其氧化程度；天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜的硬度、弹性、凝聚性、回复性和咀嚼性都有积极影响；对牦牛肉糜流变特性中储能模量也有影响，随着温度的升高，储能模量值升高，即肉糜的弹性增大。综上所述，迷迭香、葡萄籽提取物和复合磷酸盐复配降低了牦牛肉糜冷藏过程中的氧化程度，提高了牦牛肉糜的品质。Abstract: In order to study the interaction and antioxidant effects of the combination of natural extract and complex phosphate on the quality characteristics of yak mince during cold storage. In this study, rosemary, grape seed extract and complex phosphate were mixed at the ratio of 0.015%, 0.02% and 0.10%, and the edible quality, rheological properties, lipid oxidation and protein oxidation of yak meat were measured after the meat was refrigerated at 4 ℃ for 12, 24, 36, 48 and 60 h. The results showed that with the extension of refrigeration time, the pH of yak mince treated with rosemary, grape seed extract and complex phosphate decreased significantly, and the water retention increased significantly (P<0.05), effectively maintain the color of yak meat, and slow down its oxidation degree. The combination of natural extract and complex phosphate had positive effects on the hardness, elasticity, cohesiveness, resilience and chewability of yak mince. It also had effect on the energy storage modulus in the rheological characteristics of yak mince. With the increase of temperature, the value of energy storage modulus increases, that was, the elasticity of mince increases. In conclusion, the combination of rosemary, grape seed extract and complex phosphate can reduce the oxidation degree and improve the quality of yak meat during cold storage.
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我国对肉和肉制品的需求量巨大，其中对牛肉的消费需求达到了全球牛肉总需求的13.28%[1]。但肉及肉制品因含有丰富的蛋白质、脂肪酸和其他促氧化因子，在加工过程中，肉中的油脂会因加热、氧气等因素发生氧化变质，进而影响肉制品的品质和货架期[2]。天然植物提取物由于提取物原料来源广、活性物质含量高、安全、抗氧化活性强等，常作为天然抗氧化剂广泛用于食品、医药等行业[3]。有研究发现，将天然提取物添加到肉和肉制品中充当抗氧化剂能起到很好的抗氧化效果，显著降低肉及肉制品的腐败变质程度[4]。
天然植物提取物具有良好的生物相容性和较低的毒副作用，在肉类应用上可以与其它抗氧化剂协同作用。Hijazeen等[5]探索不同水平的迷迭香提取物（Rosemary extract）和其他防腐剂对鸡肉饼品质和稳定性的影响，发现迷迭香提取物有防腐作用，可以很好地替代肉类工业中使用的许多合成抗氧化剂。王强等[6]发现，4 ℃冷藏条件下，迷迭香提取物能够有效抑制微生物生长，改善鲊广椒肉丸储藏过程中的理化品质。葡萄籽提取物的抗氧化能力很强，是果蔬中VC的50倍，它能清除自由基，螯合金属离子以及与其他抗氧化剂协同抗氧化。蒋雨心等[7]发现在活性包装膜中加入葡萄籽提取物（Grape seed extract）、茶多酚（Tea polyphenols），能抑制罗非鱼的脂质和蛋白氧化，提高罗非鱼在贮藏过程的抗氧化能力。而复合磷酸盐对肉制品具有多种改良效果，可提高pH，螯合肉中的金属离子，使肌纤维膨胀，肉的持水性提高，同时随着离子强度的增加，还可以保持肉的嫩度[8]。张建友等[9]发现复合磷酸盐能提高鲣鱼腌制品的保水性，提高蛋白的抗氧化能力。Huang等[10]将复合磷酸掺入加工肉制品的配方中，发现可以提高水结合能力、乳液稳定性和质地特性（例如多汁性、内聚性和柔软度）。目前关于天然提取物和复合磷酸盐复配的研究并不是很多，并且复合磷酸盐在保鲜方面的研究主要是和鱼类、虾类有关，针对牦牛肉的研究并不多，因此探究天然提取物与复合磷酸盐复配对冷藏期间牦牛肉糜品质特性的影响显得尤为重要。
本试验以牦牛肉背最长肌为试验对象，通过正交试验获得迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐的最佳复配比例，按此比例将迷迭香、复合磷酸盐、葡萄籽提取物加入到牦牛肉糜中，并在4 ℃下冷藏12、24、36、48、60 h，测定牦牛肉糜的食用品质、流变特性、脂质氧化及蛋白氧化等指标的变化，探究天然提取物和复合磷酸盐复配对牦牛肉糜在冷藏过程中的品质影响，为天然提取物和复合磷酸盐复配在提升肉糜品质方面提供数据支持和理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
牦牛肉背最长肌 当地牛肉市场；迷迭香 河南禹州森源本草天然产物有限公司；葡萄籽提取物 山东金胜生物科技有限公司；复合磷酸盐 徐州恒世食品有限公司。
PH-STAR手持pH计 德国麦斯特有限公司；CM-700D色差仪 柯尼卡美能达股份有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 国华（常州）仪器制造有限公司；XHF-D高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；V-1000紫外分光光度计 翱艺仪器上海有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品处理及正交试验优化天然提取物和复合磷酸盐复配比例
取屠宰24 h内保存良好的牦牛肉背部里脊，剔去脂肪和筋膜，切成9块方正的肉块，搅成肉糜，在预实验基础上，将迷迭香（A）、葡萄籽提取物（B）、复合磷酸盐（C）以不同添加量进行三因素三水平正交试验设计（表1），置于冰箱中冷藏12 h，结合感官评分选出最佳复配比。各物质添加量为牦牛肉糜和冰水总质量的百分比（%）。
表 1 迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐三者配比选择的正交试验因素和水平Table 1. Orthogonal experimental factors and levels of ratio selection of rosemary, grape seed extract and complex phosphate水平 A迷迭香（%） B葡萄籽提取物（%） C复合磷酸盐（%） 1 0.01 0.01 0.1 2 0.015 0.015 0.15 3 0.02 0.02 0.2 1.2.2 贮藏条件
根据正交试验设计筛选出的最佳复配比，将迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐添加到650 g牦牛肉糜中，另取650 g牦牛肉糜做空白组。在添加了10%冰水的牦牛肉糜中加入2%的食盐，进行搅拌，牦牛肉的黏性会不断增强，最终形成一个整体，分装入自封袋后置于4 ℃的冰箱中冷藏12、24、36、48、60 h。测定牦牛肉糜贮藏期间的食用品质、流变特性、蛋白氧化、脂质氧化等指标的变化。
1.2.3 感官评价
由5位（2男3女，22岁）健康无陋习（饮食、生活规律健康，无抽烟酗酒现象等）人员参照GB/T 22210-2008《肉与肉制品感官评定规范》[11]对肉样进行感官评价（表2）。
表 2 牦牛肉糜感官评分标准Table 2. Sensory scoring standards of minced yak minced meat色泽 气味 黏度 汁液量 感官评分（分） 灰褐 腐败臭味 非常黏手 很多 1 暗红 有异味 黏手 较多 2~3 稍变暗红 稍有异味 稍黏 少量 4~5 浅红 无异味 顺滑 稍有 6~8 红色均匀 正常牛肉味 无黏度 无 9~10 1.2.4 pH测定
参考Vidal等[12]的方法，用pH计测定肉样pH。
1.2.5 色度值测定
色差仪校准后随机选择3个位置进行测量，其测量结果用亮度值L*、红度值a*和黄度值b*表示。
1.2.6 持水性测定
离心管称重去皮后装入牦牛肉糜，称其质量记为m1，放入80 ℃的恒温水浴锅中加热40 min，冷却至室温后擦去表面水分和油脂，称其质量为m2。按公式（1）计算蒸煮损失：
蒸煮损失(%)=m1−m2m1×100 (1) 式中：m1表示蒸煮前牦牛肉糜的质量；m2表示蒸煮后牦牛肉糜的质量。
参照倪学文等[13]的方法，称取牦牛肉糜放入-18 ℃冰箱冷冻24 h，取出在室温下解冻12 h，擦干表面水分进行称重。按公式（2）计算冻融损失：
冻融损失(%)=m3−m4m3×100 (2) 式中：m3表示冷冻前肉糜的质量；m4表示解冻后肉糜的质量。
1.2.7 质构特性分析
参照叶丹等[14]的方法并稍作改动。设定质构仪为TPA模式，探头型号P/35，压缩比50%，最小承载力为50 N，测前速度为1 mm/s，测中速度为1 mm/s，测后速度为2 mm/s。
1.2.8 流变特性分析
参照Westpphalen等[15]的方法并适当修改。参数设定为：夹具 40 mm，gap 0.5 mm，频率1 Hz，应变0.0025%，肉样以2 ℃/min的速度升温，起始温度为25 ℃，终止温度为85 ℃。
1.2.9 硫代巴比妥酸（TBARS）值测定
参照Jongberg等[16]的方法并稍作修改。取5 g肉糜，加入25 mL 7.5%三氯乙酸（含0.1% EDTA），冰浴匀浆后离心5 min（5000 r/min，4 ℃），过滤后取5 mL滤液加5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，混匀后在沸水浴中反应40 min，冷却后在532 nm和600 nm波长处测定吸光度，并按公式（3）计算：
TBARS(mg/kg)=4.65×(A532−A600) (3) 式中：A532、A600分别为待测液在532、600 nm处的吸光值。
1.2.10 蛋白氧化程度分析
1.2.10.1 牦牛肉糜肌原纤维蛋白的提取
参考Huang等[17]的方法，并略作改动。向肉糜中加入4倍体积标准盐溶液（10 mmol/L磷酸钠缓冲液，0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，pH7.0），冰浴匀浆后离心15 min（2000×g，4 ℃），弃上清，重复上述步骤3次。最后一次离心后向沉淀中加入4倍体积0.1 mol/L NaCl溶液，匀浆后用4层纱布过滤，将滤液再次离心15 min（2000×g，4 ℃），沉淀即为肌原纤维蛋白。用双缩脲法测定蛋白浓度。在4 ℃的环境下保存，并在48 h内完成蛋白质氧化指标的测定。
1.2.10.2 羰基含量测定
参照瞿丞等[18]的方法并适当修改。用25 mmol/L的磷酸钠缓冲液（PBS，pH6.25）将肌原纤维蛋白溶液稀释至2 mg/mL。取1 mL蛋白溶液加入1 mL 2 mol/L HCl溶液（含0.02 mol/L DNPH），混匀后室温下避光反应40 min，再加入4 mL 20%三氯乙酸，混匀后离心5 min（11000×g，4 ℃），用2 mL乙醇-乙酸乙酯溶液（1:1，V/V）洗涤沉淀3次，再加入6.0 mL 6.0 mol/L盐酸胍溶液，37 ℃水浴30 min后在370 nm波长处测定吸光度。羰基含量按公式（4）计算：
羰基含量(nmol/mg)=A×106×NC×D×22000 (4) 式中：A为样品吸光值；C为蛋白提取液浓度2 mg/mL；D为比色直径；22000为摩尔吸光系数，mol/（L·cm）；N为稀释倍数。
1.2.10.3 巯基含量测定
参照瞿丞等[18]的方法并适当修改。取2 mg/mL蛋白溶液1 mL，依次加入4 mL尿素-SDS溶液（含8.0 mol/L尿素、30 g/L SDS、0.1 mol/L PBS、pH7.4）和1 mL 10 mmol/L DTNB溶液（溶于0.1 mol/L PBS中，pH7.4），混匀后室温下避光反应15 min，在412 nm波长处测定吸光度。用不含尿素的缓冲液以相同方法测定活性巯基含量。按照公式（5）计算蛋白中总疏基含量。
总巯基含量(nmol/mg)=A412×DF13600×C (5) 式中：A412为波长412 nm处样液的吸光值；DF为稀释倍数；13600为摩尔吸光系数，mol/（L·cm）；C为蛋白浓度，2 mg/mL。
1.2.10.4 表面疏水性测定
参考贾琴等[19]的方法，在离心管中加入2 mg/mL的蛋白溶液，1 mg/mL的溴酚蓝溶液400 μL，涡旋均匀后离心15 min（6000 r/min，4 ℃）。取1 mL上清液于离心管中并加入9 mL含0.6 mol/L的磷酸缓冲溶液，混匀后在波长为595 nm处测定样液的吸光值。样液的表面疏水性用溴酚蓝的结合量来表示，按公式（6）计算：
溴酚蓝结合量(µg)=200×A空白−A样品A空白 (6) 式中：A样品表示在595 nm处测定样液的吸光值；A空白表示磷酸缓冲液（20 mmol/L PBS，pH为6.0；0.6 mol NaCl）在595 nm处测定的吸光值。
1.2.10.5 二聚酪氨酸含量测定
参考邓思杨等[20]的方法，吸取适量的2 mg/mL的蛋白溶液于比色皿中，在电压为400 V、发射波长和激发波长分别为420和325 nm（狭缝为5 nm）处，用荧光光度计测定牦牛肉糜二聚酪氨酸的含量。二聚酪氨酸的含量用相对荧光值（AU）表示，按公式（7）计算：
相对荧光值(AU)=A样品P (7) 式中：A样品表示蛋白样液在发射波长为420 nm、激发波长为325 nm处的吸光值；P为蛋白溶液的质量浓度（2 mg/mL）。
1.3 数据处理
数据用平均值±标准偏差来表示，在不同时间点的每个指标都做3次平行试验，取3组的平均值为最终试验结果；用SPSS 17.0软件来进行数据的显著性分析；用Origin 8.0软件来进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 复配比例正交试验优化结果
正交试验结果见表3。由极差值（R）可知，对复配后的牦牛肉糜感官评价影响最大的因素是葡萄籽提取物的添加量，其次是复合磷酸盐的添加量，最后是迷迭香的添加量。由K值大小可得出最佳组合条件为A2B3C1，因此迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐的最佳复配添加量分别为0.015%、0.02%、0.10%。
表 3 迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐三者配比选择的正交试验结果Table 3. Orthogonal test results of proportionselection of rosemary, grape seed extract and complex phosphate组别 A迷迭香
添加量B葡萄籽提取物
添加量C复合磷酸盐
添加量感官评分
（分）1 3 3 1 6.55±0.11 2 1 2 3 5.75±0.29 3 3 1 3 5.50±0.27 4 1 3 2 5.70±0.50 5 2 3 3 6.10±0.99 6 3 2 2 5.55±0.33 7 2 2 1 6.05±0.16 8 2 1 2 5.60±0.51 9 1 1 1 5.30±0.80 K1 16.75 16.40 17.90 K2 17.75 17.35 16.85 K3 17.60 18.35 17.35 k1 5.58 5.47 5.97 k2 5.92 5.78 5.62 k3 5.87 6.12 5.78 R 0.34 0.65 0.35 2.2 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间食用品质的影响
2.2.1 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间pH的影响
牛肉的pH是判别其新鲜度的参考指标之一。如图1知，复配组与空白组都随着冷藏时间的延长而逐渐降低，pH的下降是因为肌肉正处于排酸阶段，肌糖原会发生无氧酵解产生乳酸，以及三磷酸腺苷（ATP）分解后会产生无机磷酸[21]。其中复配组的pH在12~36 h和48~60 h期间显著降低（P<0.05），在36~48 h期间无显著差异（P>0.05）；空白组的pH在12~24 h期间36~60 h显著降低（P<0.05），在24~36 h期间无显著差异（P>0.05），且复配组始终高于空白组，这可能是葡萄籽提取物和迷迭香等多酚类物质导致pH下降[22]。
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2.2.2 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间色度的影响
肉色是由肌肉中血红蛋白和肌红蛋白含量来决定。由表4所示，随着冷藏时间延长，复配组与空白组L*和a*值都逐渐减小，而b*值则呈先增大后减小的变化趋势。12 h时，两组的L*值最高，分别是42.37和38.84，这可能是由于宰后鲜肉成熟期内的水分大量流出，并聚集在肉表面，增强光反射能力，使L*值增加[23]。复配组的L*值相对空白组较低，可能是天然提取物与复合磷酸盐减少了肉糜水分的流失。两组a*值在12~24 h时无显著差异（P>0.05），36 h时均显著降低（P<0.05），肉糜的褐色程度变大，原因可能是肉中的肌红蛋白在宰后成熟期间逐渐被氧化为高铁肌红蛋白，高铁肌红蛋白的积累会使a*值显著降低[24]。且各时间段复配组a*值显著高于空白组（P<0.05）。说明天然提取物和复合磷酸盐的添加可以减缓肉糜蛋白的氧化，使肉糜颜色保持稳定。复配组的b*值在12~36 h期间显著升高（P<0.05）的原因是迷迭香和葡萄籽提取物粉呈浅黄色和浅紫红色，添加到牦牛肉糜中，会增大其黄度，导致b*值增大。
表 4 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间色度的影响Table 4. Effects of natural extracts and complex phosphates on the chromaticity of yak meat during refrigeration组别 冷藏时间（h） L*值 a*值 b*值 12 42.37±0.83Aa 15.40±0.16Ba 12.79±0.02Be 24 40.28±0.32Ab 14.98±0.23Ba 15.48±0.05Bb 空白组 36 39.86±0.17Ab 14.28±0.55Bb 16.47±0.05Ba 48 38.06±1.30Ac 12.64±0.48Bc 13.45±0.10Bd 60 37.90±1.28Ac 12.26±0.44Bc 14.10±0.17Bc 12 38.84±0.60Ba 21.27±0.71Aa 13.05±0.07Ae 24 37.58±1.12Ba 20.71±1.09Aa 15.62±0.02Ab 复配组 36 37.58±1.12Ba 16.15±0.92Ab 17.13±0.04Aa 48 35.21±0.95Bb 14.84±0.45Ac 13.69±0.04Ad 60 35.03±1.02Bb 13.22±0.11Ad 15.09±0.10Ac 2.2.3 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间持水性的影响
蒸煮损失能体现肉及肉制品的保水能力，蒸煮损失值越大，表明该肉保水能力越差[25]。12~60 h，蒸煮损失随着贮藏时间的延长整体呈上升趋势，是因为pH下降诱导肌原纤维网格结构收缩，同时在加热条件下，由于蛋白质的热变性作用使肌原纤维紧缩，能储留不易流动水的空间变小，部分不易流动水变成自由水流出[26]。空白组显著高于复配组（P<0.05），可能是因为在冷藏过程中，随着时间的延长，肉糜中的血水逐渐渗出，部分水分在蒸煮前已经损失，使肉糜的持水能力逐渐下降。与空白组相比，复配组在36~60 h上升趋势缓慢，可能是因为迷迭香和葡萄籽具有一定的抗氧化、抗菌能力，可延缓牦牛肉糜脂质和蛋白氧化分解的速度，延缓了蒸煮损失的增加。这与倪学文等[13]的研究结果一致。
冻融损失反映肉及肉制品结合水和保留水的能力[27]。由图2可知，空白组与复配组牦牛肉糜的冻融损失随着冷藏时间的延长整体呈上升趋势，空白组的冻融损失在贮藏24 h后显著上升（P<0.05），可能是因为冷冻过程中冰晶的形成与肌纤维的变形可能促进了水分的迁移，加剧了汁液的流失，汁液渗出越多，冻融损失越大，解冻后的肉糜品质越差。复配组的冻融损失显著低于空白组（P<0.05），且与空白组相比，上升趋势缓慢，可能是迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐复配添加可以与肌肉蛋白相互作用形成的致密有序的网状结构，限制了凝胶中的水分子，使水不容易渗出，减少了冻融损失，增强了牦牛肉糜的保水能力。黄群等[28]发现一定质量分数的盐能使肌原纤维蛋白的负电荷增加，提高其静电斥力，有利于肌原纤维丝之间的伸展，形成稳定的网络结构，从而增强肉糜对水的束缚能力，降低解冻时汁液的损失。
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图 2 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间蒸煮损失和冻融损失的影响Figure 2. Effects of natural extracts and complex phosphate complexes on cooking loss and freeze-thaw loss during refrigeration of yak meat mince2.2.4 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间质构特性的影响
硬度、弹性、凝聚性、回复性和咀嚼性都随着贮藏时间的延长而逐渐升高，复配组各项指标均显著低于空白组（P<0.05）。肉糜中的金属离子被复合磷酸盐螯合，增加了肉糜中蛋白质与水的结合能力，最终使肉糜持水能力增加，弹性增大[29]。迷迭香、葡萄籽提取物和复合磷酸盐的复配添加使肉糜体系的凝胶结构更加稳定，促使水分流动性下降，且部分自由水转变为结合水，导致硬度和咀嚼性显著升高（P<0.05），减少因贮藏带来的牦牛肉糜质构劣化。
表 5 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间质构特性的影响Table 5. Effects of natural extracts and complex phosphates on texture properties of yak meat minced during refrigeration组别 时间（h） 硬度（g） 弹性 凝聚性 回复性 咀嚼性（N） 12 134.00±1.127Ae 0.62±0.003Ae 0.60±0.011Ad 0.16±0.001Be 51.60±0.126Aa 24 145.60±1.293Ad 0.63±0.001Ad 0.61±0.002Ac 0.16±0.000Ad 54.25±0.811Ab 空白组 36 149.46±1.112Ac 0.65±0.004Ac 0.62±0.002Ac 0.18±0.001Bc 57.12±0.243Ac 48 154.30±0.612Ab 0.66±0.001Ab 0.64±0.002Ab 0.18±0.001Ab 60.52±1.470Ab 60 168.48±0.599Aa 0.68±0.004Aa 0.66±0.002Aa 0.19±0.001Ba 70.61±1.818Aa 12 81.65±0.518Be 0.55±0.001Be 0.56±0.000Be 0.15±0.002Ae 33.56±1.612Be 24 86.14±0.399Bd 0.60±0.001Bd 0.59±0.001Bd 0.16±0.001Ad 39.6±1.213Bd 复配组 36 95.41±0.391Bc 0.61±0.001Bc 0.61±0.002Bc 0.17±0.001Ac 43.52±1.426Bc 48 103.62±0.450Bb 0.62±0.002Bb 0.63±0.004Bb 0.18±0.000Ab 46.4±0.503Bb 60 114.95±0.278Ba 0.62±0.046Ba 0.64±0.003Ba 0.18±0.001Aa 59.74±1.656Ba 2.2.5 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间流变特性的影响
储能模量可以反映出肌原纤维蛋白凝胶的黏弹性，G'值越大表示弹性越好[30]。如图3所示，G'值总体呈现上升趋势。在加热过程中肉糜蛋白质变性，涉及3个阶段：在25~45 ℃，G'值轻微上升；46~69 ℃，G'值稳步上升，这是由于蛋白质之间发生相互作用导致凝胶化；最后，70~85 ℃，G'值快速上升，其原因是温度升高导致肌球蛋白分子的构象松散展开，活性基团暴露，实现交联，形成牢固、不可逆、具有弹性的三维凝胶结构[31]。说明添加迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐三者复配添加可以提高牦牛肉糜的黏弹性。
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图 3 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间流变特性的影响Figure 3. Effects of natural extracts and complex phosphates on rheological properties of yak meat minced during refrigeration2.3 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间TBARS值的影响
人们常用硫代巴比妥酸值即TBARS值来表示肉及肉制品的脂肪氧化程度，TBARS值越大就表示肉及肉制品的脂肪氧化程度越高，肉及肉制品的品质就越低。由图4可知，空白组与复配组的TBARS值均随着贮藏时间的延长而增大，且复配组始终低于空白组。12~36 h时两组差异不显著（P>0.05），48~60 h时复配组显著低于空白组（P<0.05），说明天然提取物与复合磷酸盐的添加可以有效抑制牦牛肉糜的脂质氧化现象，这可能与迷迭香和葡萄籽含有的酚羟基与自由基作用，延缓脂质氧化过程中氢过氧化物的分解形成醛、酮等物质有关[32]。
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图 4 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间TBARS值的影响Figure 4. Effects of natural extracts and complex phosphates on the effect of TBARS values during refrigeration of yak meat minced2.4 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间蛋白氧化的影响
2.4.1 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间羰基含量和巯基含量的影响
蛋白质氧化的另一显著变化是羰基化合物的形成，通过测定羰基含量可判定蛋白质氧化的程度[33]。由图5可知，空白组与复配组的羰基含量随着贮藏时间的延长整体呈上升趋势，且空白组显著高于复配组（P<0.05），表明迷迭香、葡萄籽提取物和复合磷酸盐的复配可有效减少牦牛肉糜中蛋白质的氧化损伤。在12~60 h期间，两组羰基含量均显著增加（P<0.05），其中空白组羰基含量从12.73 nmol/mg增加到54 nmol/mg，复配组羰基含量从11.23 nmol/mg增加到44.09 nmol/mg，蛋白质的氧化程度越大，羰基含量越高，说明迷迭香、葡萄籽提取物与复合磷酸盐的联合作用能抑制牦牛肉糜蛋白质的氧化。这和蒋雨心等[7]的研究结果相似。
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图 5 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间羰基含量和巯基含量的影响Figure 5. Effects of natural extracts and complex phosphates on carbonyl content and sulfhydryl content during refrigeration of yak meat minced巯基也同羰基一样可以反映出牦牛肉糜蛋白质的氧化程度大小[34]。如图5所示，空白组和复配组的巯基含量都随着冷藏时间的延长而显著减少（P<0.05），且空白组显著低于复配组（P<0.05），原因可能是多酚类物质中的羟基可以和蛋白质侧链的巯基结合，降低巯基的被检测度，从而使被检测到巯基含量减少[35]。而迷迭香与葡萄籽提取物都是属于酚类物质，所以在牦牛肉糜贮藏过程中，可以降低牦牛肉糜巯基含量，抑制牦牛肉糜氧化。
2.4.2 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间表面疏水性和二聚酪氨酸的影响
表面疏水性也是反应肉及肉制品蛋白质氧化程度的指标之一，表面疏水性高，说明存在于蛋白质分子内部的疏水氨基酸残基的暴露程度大，进一步说明肉样的蛋白氧化程度大。如图6所示，表面疏水性整体趋势都是随着贮藏时间的延长而逐渐上升，且空白组显著高于复配组（P<0.05）。这可能是由于氧化改变部分疏水性氨基酸结构，使更多疏水性基团暴露于蛋白质表面，从而促进蛋白质与溴酚蓝的结合，使得表面疏水性呈增加趋势[36]。结果说明迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐的添加能显著减小牦牛肉糜肌原纤维蛋白中疏水性氨基酸残基的暴露程度，降低蛋白质的氧化程度，从而增强牦牛肉糜的抗氧化能力。
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图 6 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间表面疏水性和二聚酪氨酸的影响Figure 6. Effects of natural extracts and complex phosphates on surface hydrophobicity and dimeric tyrosine during refrigeration of yak meat mince二聚酪氨酸的产生在一定程度上反映蛋白质的结构发生了变化，也能反映出肉及肉制品在贮藏期间的蛋白氧化程度。如图6所示，随着贮藏时间的延长，空白组与复配组的二聚酪氨酸含量都显著增大（P<0.05），且空白组显著高于复配组（P<0.05），这可能是因为在贮藏过程中，蛋白质发生氧化反应，酪氨酸被氧化成二聚酪氨酸，通过共价键和非共价键形成蛋白聚集体，使二聚酪氨酸含量升高[37]。说明迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐联合作用，能降低牦牛肉糜在冷藏过程中蛋白组结构的变化程度，从而降低蛋白质的氧化程度。
2.5 各指标的相关性分析
Pearson相关性分析结果见图7。相关性分析发现，羰基与表面疏水性呈强正相关（P<0.001），与冻融损失、硬度呈极显著正相关（P<0.01），与蒸煮损失、TBARS、二聚酪氨酸、凝聚力和咀嚼性显著正相关（P<0.05），与L*呈极显著负相关（P<0.01），与a*和巯基显著负相关（P<0.05）。说明蛋白氧化程度越高，脂质氧化程度越高，蒸煮损失和冻融损失越大，L*和a*越小，硬度、弹性、凝聚性、回复性和咀嚼性越高。这与Huff-Lonergan等[38]和Rowe等[39]研究结果一致。pH与L*和巯基呈显著正相关（P<0.05），与弹性强负相关（P<0.001），与凝聚性呈极显著负相关（P<0.01），与蒸煮损失、冻融损失、TBARS、二聚酪氨酸、回复性显著负相关（P<0.05），说明pH越低，蛋白氧化程度、脂质氧化程度越高，蒸煮损失、冻融损失越大，弹性、凝聚性和回复性越高。
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图 7 各指标相关性分析注：*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。Figure 7. Correlation analysis of various indicators3. 结论
通过正交试验得出迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐的最佳添加比例为0.015%、0.02%和0.10%。在牦牛肉糜的贮藏过程中，随着贮藏时间的延长，两组的羰基含量、表面疏水性和二聚酪氨酸含量均呈上升趋势，且空白组显著高于复配组（P<0.05），巯基则呈下降趋势。试验表明迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐复配添加缓解了肉色的褐变，降低了牦牛肉糜的汁液流失，增强了牦牛肉糜的持水能力；延缓了牦牛肉糜在贮藏期间的蛋白氧化和脂质氧化，对牦牛肉糜的硬度、弹性、凝聚性、回复性和咀嚼性也有积极影响，可以作为天然抗氧化剂添加在肉制品中，提高肉制品抗氧化活性的同时还可以保持肉制品较好的色泽和口感。天然提取物不仅能改善产品品质风味，还能抑制有害微生物生长、抗氧化、抑制化学危害物的生成，但在传统肉制品加工中与其他抗氧化性物质复配研究比较单一，仍需要进一步加强。
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图 2 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间蒸煮损失和冻融损失的影响
Figure 2. Effects of natural extracts and complex phosphate complexes on cooking loss and freeze-thaw loss during refrigeration of yak meat mince
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图 3 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间流变特性的影响
Figure 3. Effects of natural extracts and complex phosphates on rheological properties of yak meat minced during refrigeration
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图 4 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间TBARS值的影响
Figure 4. Effects of natural extracts and complex phosphates on the effect of TBARS values during refrigeration of yak meat minced
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图 5 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间羰基含量和巯基含量的影响
Figure 5. Effects of natural extracts and complex phosphates on carbonyl content and sulfhydryl content during refrigeration of yak meat minced
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图 6 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间表面疏水性和二聚酪氨酸的影响
Figure 6. Effects of natural extracts and complex phosphates on surface hydrophobicity and dimeric tyrosine during refrigeration of yak meat mince
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图 7 各指标相关性分析
注：*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。
Figure 7. Correlation analysis of various indicators
表 1 迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐三者配比选择的正交试验因素和水平
Table 1 Orthogonal experimental factors and levels of ratio selection of rosemary, grape seed extract and complex phosphate
水平 A迷迭香（%） B葡萄籽提取物（%） C复合磷酸盐（%） 1 0.01 0.01 0.1 2 0.015 0.015 0.15 3 0.02 0.02 0.2 
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表 2 牦牛肉糜感官评分标准
Table 2 Sensory scoring standards of minced yak minced meat
色泽 气味 黏度 汁液量 感官评分（分） 灰褐 腐败臭味 非常黏手 很多 1 暗红 有异味 黏手 较多 2~3 稍变暗红 稍有异味 稍黏 少量 4~5 浅红 无异味 顺滑 稍有 6~8 红色均匀 正常牛肉味 无黏度 无 9~10
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表 3 迷迭香、葡萄籽提取物、复合磷酸盐三者配比选择的正交试验结果
Table 3 Orthogonal test results of proportionselection of rosemary, grape seed extract and complex phosphate
组别 A迷迭香
添加量B葡萄籽提取物
添加量C复合磷酸盐
添加量感官评分
（分）1 3 3 1 6.55±0.11 2 1 2 3 5.75±0.29 3 3 1 3 5.50±0.27 4 1 3 2 5.70±0.50 5 2 3 3 6.10±0.99 6 3 2 2 5.55±0.33 7 2 2 1 6.05±0.16 8 2 1 2 5.60±0.51 9 1 1 1 5.30±0.80 K1 16.75 16.40 17.90 K2 17.75 17.35 16.85 K3 17.60 18.35 17.35 k1 5.58 5.47 5.97 k2 5.92 5.78 5.62 k3 5.87 6.12 5.78 R 0.34 0.65 0.35
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表 4 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间色度的影响
Table 4 Effects of natural extracts and complex phosphates on the chromaticity of yak meat during refrigeration
组别 冷藏时间（h） L*值 a*值 b*值 12 42.37±0.83Aa 15.40±0.16Ba 12.79±0.02Be 24 40.28±0.32Ab 14.98±0.23Ba 15.48±0.05Bb 空白组 36 39.86±0.17Ab 14.28±0.55Bb 16.47±0.05Ba 48 38.06±1.30Ac 12.64±0.48Bc 13.45±0.10Bd 60 37.90±1.28Ac 12.26±0.44Bc 14.10±0.17Bc 12 38.84±0.60Ba 21.27±0.71Aa 13.05±0.07Ae 24 37.58±1.12Ba 20.71±1.09Aa 15.62±0.02Ab 复配组 36 37.58±1.12Ba 16.15±0.92Ab 17.13±0.04Aa 48 35.21±0.95Bb 14.84±0.45Ac 13.69±0.04Ad 60 35.03±1.02Bb 13.22±0.11Ad 15.09±0.10Ac
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表 5 天然提取物与复合磷酸盐复配对牦牛肉糜冷藏期间质构特性的影响
Table 5 Effects of natural extracts and complex phosphates on texture properties of yak meat minced during refrigeration
组别 时间（h） 硬度（g） 弹性 凝聚性 回复性 咀嚼性（N） 12 134.00±1.127Ae 0.62±0.003Ae 0.60±0.011Ad 0.16±0.001Be 51.60±0.126Aa 24 145.60±1.293Ad 0.63±0.001Ad 0.61±0.002Ac 0.16±0.000Ad 54.25±0.811Ab 空白组 36 149.46±1.112Ac 0.65±0.004Ac 0.62±0.002Ac 0.18±0.001Bc 57.12±0.243Ac 48 154.30±0.612Ab 0.66±0.001Ab 0.64±0.002Ab 0.18±0.001Ab 60.52±1.470Ab 60 168.48±0.599Aa 0.68±0.004Aa 0.66±0.002Aa 0.19±0.001Ba 70.61±1.818Aa 12 81.65±0.518Be 0.55±0.001Be 0.56±0.000Be 0.15±0.002Ae 33.56±1.612Be 24 86.14±0.399Bd 0.60±0.001Bd 0.59±0.001Bd 0.16±0.001Ad 39.6±1.213Bd 复配组 36 95.41±0.391Bc 0.61±0.001Bc 0.61±0.002Bc 0.17±0.001Ac 43.52±1.426Bc 48 103.62±0.450Bb 0.62±0.002Bb 0.63±0.004Bb 0.18±0.000Ab 46.4±0.503Bb 60 114.95±0.278Ba 0.62±0.046Ba 0.64±0.003Ba 0.18±0.001Aa 59.74±1.656Ba
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