Effect of Ultrasonic Pretreatment on the Gel Properties and Structure of Flaxseed Gum-Soybean Protein Isolate Composite Gels
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摘要: 目的：探究不同超声功率和时间预处理对TG酶交联的亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合凝胶凝胶特性和结构的影响。方法：采用质构仪、激光粒度仪、圆二色光谱、内源荧光光谱、扫描电镜等技术，研究在不同超声条件下复合凝胶质构特性、蛋白质分子构象及微观网络结构的变化。结果：50%功率超声预处理10 min可以显著提升复合凝胶的硬度、胶粘性、咀嚼性、内聚性以及持水性，降低其粘附性；经过50%功率超声预处理10 min后的复合凝胶蛋白质的α-螺旋、β-转角含量降低，β-折叠、无规则卷曲含量增加，且荧光强度升高，有利于凝胶功能特性的改善；复合凝胶的微观结构由无序变得有序，网络密度增大，孔径变小，孔壁增厚；而增大超声功率到80%后，其凝胶特性仅小幅波动，并且微观结构被破坏。结论：50%功率超声预处理10 min可以显著改善TG酶交联的亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合的凝胶性能及网络结构。Abstract: Objective: This study aimed to investigate the impact of different ultrasonic power and time pretreatments on the structures and gel properties of the flaxseed gum and soybean protein isolate composite gel induced by TG enzyme. Methods: The structural characteristics, molecular conformation, and micro-network structures of the composite gel under varying ultrasonic conditions were analyzed using a texture analyzer, laser particle size meter, circular dichroism (CD), fluorescence spectrum, and scanning electron microscope (SEM). Results: The 50% power ultrasound pretreatment for 10 min could significantly improve the hardness, adhesiveness, chewiness, cohesiveness and water-holding property of the composite gel, and reduce its adhesiveness. After 50% power ultrasound pretreatment for 10 min, the α-helix and β-turn content of composite gel proteins decreased, and the content of β-folding and irregular curls increased, and the fluorescence intensity increased, which was conducive to the improvement of the functional properties of the gel. The microstructure of the composite gel became ordered from disorder, the network density increased, the pore diameter became smaller, and the pore wall was thickened. While after increasing the ultrasound power to 80%, the gel properties fluctuated only slightly and the microstructure was destroyed. Conclusion: 50% power ultrasound pretreatment for 10 min can significantly improve the gel properties and network structure of TG enzyme cross-linked flaxseed gum-soybean protein isolate composite.
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Keywords:
- composite gel /
- flaxseed gum /
- ultrasonic pretreatment /
- textural property /
- protein structure /
- microstructure
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由于单一大豆分离蛋白凝胶存在结构松散、不易成型、成品率低、保水性差等问题，在食品加工中受到限制[1]。多糖-蛋白质混合体系相比于单一的蛋白凝胶结构更加稳定牢固，但蛋白质和多糖容易产生相分离影响混合溶液的连续性和分散性[2]。Chen等[3]研究发现，在大豆分离蛋白凝胶体系中添加适量的亚麻籽胶可以增加大豆分离蛋白的凝胶强度，而过量的亚麻籽胶则会因为由于相分离而产生的凝胶结构紊乱使得其凝胶体系稳定性下降。因此，可以通过不同的改性手段进行复合处理以促进混合体系溶胀，解决混合体系结构不均匀的问题进而改善其凝胶特性。
超声波作为极短的机械波可以在不同的介质中传导以改善不同食品的物理化学性质，提升食品品质[4−5]，尤其是在富含蛋白质的食品加工过程中可以显著改善食品的凝胶特性，从而使得产品具有更好的质构特性[6]。刘冉等[7]研究发现中功率的超声处理可以提高大豆分离蛋白凝胶的凝胶特性。丁俭等[8]发现超声改性可以有效改善大豆分离蛋白与大豆可溶性多糖形成的复合乳液的空间结构，从而影响大豆分离蛋白-多糖界面结构特性和乳化体系的冻融稳定性。此外，谷氨酰胺转氨酶与蛋白交联形成的复合凝胶可以显著改善复合凝胶的凝胶特性[9]，而超声作为物理改性的一种方法，与酶制剂交联的化学改性相结合，可以显著改善蛋白的凝胶特性。王莹[10]研究发现超声协同谷氨酰胺转氨酶处理可以显著增强核桃蛋白的凝胶特性，同时形成均匀致密、孔径均一的凝胶三维网状结构，但蛋白凝胶的结构从有序变为无序，热稳定性降低。目前已有一些关于超声处理对多糖-蛋白复合凝胶的影响[11−15]，但未有系统探究不同超声功率和时间预处理对亚麻籽胶-大豆蛋白复合凝胶凝胶和结构特性影响等方面的研究。
本研究基于谷氨酰胺转氨酶（Glutamine Transaminase，TG酶）交联法，对亚麻籽胶-大豆分离蛋白混合溶液进行超声预处理，通过测定混合复合凝胶的质构特性、持水能力表征复合凝胶的凝胶特性；通过圆二色谱、内源性荧光光谱、扫描电镜分析超声预处理对复合凝胶结构的影响。以期对蛋白复合凝胶的结构功能特性进行有效改善，拓宽超声处理在多糖-蛋白质复合体系功能特性改善方面的应用，并为超声预处理改善食品凝胶特性在食品加工行业的研究开发提供了理论依据和数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
大豆分离蛋白（蛋白质含量为95.3%±1.2%） 宁波市素莲食品有限公司；亚麻籽胶（高纯） 浙江一诺生物科技；TG酶（102型豆制品用） 泰兴市东圣生物科技有限公司；柠檬酸 潍坊英轩实业有限公司；纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司。
TMS-PRO 型TA-XT Plus 物性分析仪 美国 FTC公司；HH-3A数显恒温水浴锅 国华（常州）仪器制造有限公司；PB-10台式酸度计 金博仕（苏州）生物科技有限公司；AR223CN电子天平 奥豪斯仪器（常州）有限公司；MS-PB磁力搅拌器 上海双旭电子有限公司；SEM7冷场高分辨扫描电镜 日本电子株式会社；F-380荧光分光光度计 天津港东科技股份有限公司；Zetasizer Nano ZS激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司；MOS-500圆二色光谱仪 法国Bio-Logic公司；Centrifuge 5804 R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；JY92-IIDN超声波细胞粉碎机 宁波新艺超声设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 亚麻籽胶-大豆分离蛋白混合溶液的配制
称取大豆分离蛋白9 g，亚麻籽胶0.072 g（亚麻籽胶质量:大豆分离蛋白=0.008:1）。将亚麻籽胶溶于75 ℃下预热的20 mL纯净水中，均匀混合后冷却至室温。大豆分离蛋白先与纯净水混合，再将亚麻籽胶溶液倒入，充分搅拌混合，然后在磁力搅拌器上高速搅拌1 h，保鲜膜封口，置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2 超声预处理亚麻籽胶-大豆分离蛋白混合溶液
将混合溶液置于磁力搅拌器上，边搅拌边滴加10%柠檬酸，使溶液pH维持在7.3，平衡10 min。使用超声细胞破碎仪对混合溶液进行超声预处理。混合溶液置于冰水浴中，超声探头下降至液面下2 cm处。超声功率（最大额定功率为900 W）设置3个梯度（20%、50%、80%），超声总时间设置3个梯度（1、5、10 min），探头超声2 s，间隔1 s。各组样品具体预处理如表1。
表 1 超声预处理参数设定Table 1. Ultrasonic pretreatment parameter setting组别 超声功率（%） 超声时间（min） Control 0 0 1 20 1 2 20 5 3 20 10 4 50 1 5 50 5 6 50 10 7 80 1 8 80 5 9 80 10 1.2.3 亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合凝胶制备
将超声预处理后的溶液加入TG酶（0.225 g TG酶溶于1 mL纯净水中），其中TG酶加入量是大豆分离蛋白质量的2.5%。在磁力搅拌器上搅拌3 min，将溶液分装在小量杯中，在48 ℃的水浴锅中水浴2.3 h，水浴过程中，TG酶与大豆蛋白进行酶交联，由溶液状态转变为凝胶状态。水浴结束后将小量杯迅速转移到90 ℃水浴中灭酶5 min。灭酶结束后取出在冰水浴中冷却到室温，置于4 ℃冰箱中保存，待测质构。
1.2.4 复合凝胶质构测定
质构测定参考Jin等[16]的方法并稍作修改。将制备好的凝胶取出在室温下放置30 min，用小平铲轻轻取出凝胶，采用物性测试仪对大豆分离蛋白凝胶进行质构特性测定。测定模式选择TPA模式，探头类型选择R/40圆盘形挤压探头，参数设置探头距离样品台高度30 mm，样品挤压形变量30%，探头挤压速度60 mm/min，最小触发力0.1 N。
1.2.5 复合凝胶持水性测定
参考戴慧敏等[17]的实验方法，并稍作修改。将复合凝胶用手术刀切成立方体小块，准确称取质量w1（约2 g）凝胶至50 mL离心管中，用滤纸包裹后置于离心管中离心（8000 r/min，10 min）。离心完成后从离心管中取出滤纸，将滤纸上的凝胶小心刮下，称取离心后凝胶质量w2。凝胶持水性按公式计算：
WHC(%)=w2w1×100 (1) 1.2.6 混合溶液粒径测定
取超声预处理后的混合溶液，使用蒸馏水稀释100倍。使用激光粒度分析仪测定混合溶液粒度分布。参数设定：折射率：1.322；形状：不规则形状。
1.2.7 复合凝胶圆二色光谱测定
取超声预处理后的溶液5 mL，加入40 mL蒸馏水，制得浓度为0.01 g/mL的混合溶液。按比例加入TG酶进行交联反应，反应结束后使用蒸馏水将混合溶液稀释至0.1 mg/mL。使用MOS-500圆二色光谱仪和石英比色皿。设置氮气流速为2 L/min，在190~260 nm波长处测定，使用CD-Pro软件进行二级结构分析。
1.2.8 复合凝胶内源荧光光谱测定
用蒸馏水将样品稀释至蛋白浓度为0.2 mg/mL。为了便于测定，利用蛋白质内部含有的荧光基团作为探针进行荧光发散光谱分析，荧光光谱在250 nm激发，扫描激发波长扫描范围为190~320 nm，激发和发射狭缝宽5 nm，电压为700 mV，每个样液重复扫描3次。
1.2.9 复合凝胶微观结构测定
将制备好的凝胶切成长方体块状，冷冻干燥。将冷冻干燥后的样品按纵面切开，用氮气吹去碎屑，截面喷金处理。扫描电子显微镜上样品的微观结构放大倍数为150、500倍进行观察。
1.3 数据处理
所有试验重复3次，采用IBM SPSS Statistics 25软件的单因素方差分析进行显著性差异分析，使用GraphPad 8.4.2和Origin 2021软件绘图。试验数据以平均数±平均偏差表示，P<0.05代表样品间存在显著性差异，在图中用不同字母表示。
2. 结果与分析
2.1 复合凝胶质构分析
超声预处理对亚麻籽胶-大豆分离蛋白凝胶质构特性的影响如图1所示。由图1可知，复合凝胶的硬度随着超声预处理的时间和功率的上升逐渐增大（最高达到了1.439 N，对照组为1.156 N），粘附性则与之相反（最低达到了0.05475 mJ，对照组为0.07264 mJ）。当时间为10 min，随着超声功率增大，其硬度呈现先上升后平缓的趋势；当超声功率为80%时，随着时间的增加，硬度同样呈现先上升后平缓的趋势，可能是超声预处理使得蛋白粒径变小，分子层呈现应力状态，导致凝胶硬度提高、粘附性降低[18−19]。复合凝胶的胶粘性、咀嚼性和内聚性随着超声功率和时间的增大而增大，并且在控制时间为10 min时，超声功率的增大对复合凝胶胶粘性、咀嚼性、内聚性的影响呈现先上升后平缓的趋势。复合凝胶的内聚性与其抗破坏能力相关[20]，超声处理会引起疏水基团暴露经过TG酶交联形成更加致密的三维网状结构[21]，导致其抗破坏能力增强。复合凝胶的弹性随着超声时间和功率的增大呈先上升后下降的趋势，原因可能是经过高功率或较长时间的超声预处理后凝胶内部分子间聚集导致产生不溶性聚集体使得内部结构更加致密，分子间的柔性变化导致凝胶回弹效果变差[22]。经过50%功率超声预处理10 min后，显著提升了复合凝胶的凝胶特性（P<0.05），这与胡雪娇等[23]、刘竞男等[24]、刑邵平[25]研究结果类似。
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2.2 复合凝胶持水性分析
凝胶的持水性与凝胶品质有着紧密的联系，凝胶的持水性直接反映了凝胶网络结合水的能力[21]。超声预处理对亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合凝胶持水性的影响如图2所示。由图2可得，与对照组相比，经过超声预处理的凝胶持水性显著提升（最高达到了67.25%，P<0.05）。在低功率组和中功率组中，随着超声时间的增加，凝胶持水性呈上升趋势，各时间梯度中变化显著（P<0.05）。在高功率组中，随着超声时间的延长，凝胶持水性呈先上升后趋于平缓的趋势，超声时间为5和10 min持水性没有显著差异（P>0.05）。对比相同时间下，不同功率对凝胶持水性的影响。在控制超声1和5 min条件下，随着功率的增加，凝胶的持水性逐渐增强。在控制超声10 min条件下，随着功率的增加，凝胶的持水性呈先上升后平缓的趋势。可能是超声预处理后，蛋白质内部的疏水基团会接到蛋白质分子表面，有利于产生蛋白质-水之间的相互作用，提高蛋白凝胶持水性[26]，并且随着超声时间的增加，将会促进TG酶的交联使得水在凝胶网状结构中聚集，增加凝胶的持水性[8]。有研究表明，随着持水性的提升，凝胶样品的硬度也会增加[27]，这与前文超声预处理对复合凝胶硬度的影响变化趋势一致。
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图 2 超声预处理对复合凝胶持水性的影响Figure 2. Effect of ultrasonic pretreatment on water-holding capacity of composite gel2.3 混合溶液粒径分析
超声预处理对亚麻籽胶-大豆分离蛋白混合溶液的粒径分布和平均粒径的影响如图3和图4所示。在相同超声功率条件下，随着超声时间的延长，亚麻籽胶-大豆分离蛋白混合溶液的粒径呈减小趋势，且各组间均有显著差异（P<0.05）。在相同超声时间条件下，随着超声功率的增大，亚麻籽胶-大豆分离蛋白混合溶液的粒径呈减小趋势，且各组间均有显著差异（P<0.05）。超声预处理组与空白对照组相比，溶液中粒径显著减小（从856.0 nm降低至最低217.5 nm，P<0.05）。说明超声预处理能够促进混合体系的颗粒分散更加均匀，使得结构更加稳定，且超声时间越长，超声功率越高，混合体系的粒径越小。推测原因可能是超声预处理导致肽键断裂引起亲水氨基酸残基的暴露，导致可溶性蛋白增加使混合体系的粒径减小；也可能是超声预处理的空化效应减弱了分子间的相互作用，降低了蛋白质分子的聚集程度[28−29]，使得复合凝胶具有更加均匀和精细的结构。而凝胶结构更加精细同样会让复合凝胶的持水性得到提升，这与前文经过超声预处理后持水性得到提升的结论一致。李杨等[30]同样发现，经过超声处理后蛋白结构展开，粒径减小，更有利于TG酶的作用。高俊炉等[13]、王喜波等[14]、孙佳等[15]的研究结果相似。
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图 3 亚麻籽胶-大豆分离蛋白混合溶液粒径分布Figure 3. Particle size distribution of flaxseed gum-soybean protein isolate mixed solution![]()
图 4 超声预处理对混合溶液平均粒径的影响Figure 4. Effect of ultrasonic pretreatment on average particle size of mixed solution2.4 复合凝胶圆二色光谱分析
圆二色光谱可以通过测定蛋白二级结构的变化表征凝胶样品宏观、微观变化。圆二色光谱分为两个波长区段，肽键的圆二色光谱信息在178~250 nm的远紫外波段内。在210 nm波长处的负峰是α-螺旋的特征峰，与β-折叠和无规则卷曲相比，α-螺旋结构更稳。超声预处理对复合凝胶圆二光谱的影响见图5。超声预处理对蛋白二级结构的影响见表2。由表2可得，经超声预处理后，蛋白二级结构中α-螺旋和β-转角占比减少，β-折叠与无规则卷曲占比上升，推测原因为超声预处理使得蛋白内部的疏水残基暴露在分子外部，蛋白结构变得不稳定，也有可能是超声的空化效应导致刚性的蛋白结构被破坏，蛋白质分子柔性增强，导致蛋白结构从有序向无序发展[8]。此外也有相关研究表明，蛋白质分子变性和展开使得α-螺旋结构向β-折叠转变，而β-折叠和β-转角的含量增加可以增加凝胶强度[31−32]，这也与质构结果互相印证。超声预处理会使得复合凝胶的蛋白二级结构变得不稳定，有利于凝胶功能特性的改善，与马素敏等[33]、曹涓泉等[34]的结论一致。
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图 5 亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合凝胶圆二光谱图Figure 5. Circular dichroism of flaxseed gum-soybean protein isolate composite gel表 2 超声预处理对蛋白二级结构的影响Table 2. Effect of ultrasonic pretreatment on secondary structure of protein样品 α-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） Control 21.78 32.16 28.14 17.92 20% 1 min 21.42 32.87 27.65 18.06 20% 5 min 21.08 33.01 27.39 18.52 20% 10 min 20.97 33.42 27.18 18.43 50% 1 min 21.27 32.46 27.54 18.73 50% 5 min 20.87 32.71 27.46 18.96 50% 10 min 20.63 32.85 27.31 19.21 80% 1 min 21.09 32.55 27.50 18.86 80% 5 min 20.76 32.79 27.32 19.13 80% 10 min 20.61 32.90 27.25 19.24 2.5 复合凝胶荧光光谱分析
内源荧光光谱可用于反映蛋白质三级结构的变化。蛋白质分子中的色氨酸和酪氨酸残基在特定情况下能激发出荧光，并且受到微观环境的影响，可用于蛋白质三级结构构象变化的观察[35]。超声预处理对复合凝胶蛋白荧光强度影响见图6。超声预处理对蛋白三级结构的影响见表3。由表3可得，超声预处理后蛋白荧光强度提高，在相同功率的条件下，荧光强度随着超声时间的延长而增强。在相同时间的条件下，荧光强度随着超声功率的增大而增强。荧光强度的增加是因为超声预处理使蛋白结构舒展开，蛋白分子的疏水功能被破坏，分子内部的发色基团被释放出来，从而影响复合凝胶的荧光强度[36]。谷俊华等[37]探究了超声处理对豌豆蛋白结构的影响同样得到类似的结论。
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图 6 亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合凝胶荧光谱图Figure 6. Fluorescence spectrum of flaxseed gum-soybean protein isolate composite gel表 3 超声预处理对蛋白三级结构的影响Table 3. Effect of ultrasonic pretreatment on tertiary structure of protein样品 荧光强度 Control 3250.552 20% 1 min 3613.096 20% 5 min 3819.205 20% 10 min 4010.98 50% 1 min 3623.713 50% 5 min 4213.278 50% 10 min 4508.920 80% 1 min 3870.219 80% 5 min 4238.324 80% 10 min 4534.667 2.6 复合凝胶微观结构分析
不同超声预处理对亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合凝胶微观结构的影响见图7。由图7可得，未经超声预处理的亚麻籽胶-大豆分离蛋白凝胶在低倍数下结构杂乱无序，孔洞无规则，在高倍数下凝胶的壁较薄。空白组凝胶样品凝胶结构较超声组更粗糙，有一定的交联孔洞更大，更不规则。超声预处理后会使凝胶的微观结构有一定的改善，凝胶空间结构由无序变得有序，凝胶孔径变小，凝胶孔壁增厚。在相同超声功率的条件下，随着超声时间的延长，凝胶结构由无序转变为有序，凝胶壁也变得厚实饱满。在相同超声时间的条件下，随着超声功率的增大，也表现出同样的变化趋势。超声波的机械效应和空化效应使得复合凝胶中蛋白分子间的交联作用较对照组更充分，形成的凝胶网格结构更加致密均匀，对网格结构中的水分束缚作用更强[38]。其原因可能是在超声作用下，空化效应减小了混合溶液中蛋白分子的粒径大小，功能基团暴露于蛋白分子表面，更有利于TG酶的交联，加强蛋白质分子彼此之间的相互作用，使得蛋白质之间的交联密度更大，形成的凝胶网络更细致有序[39−40]，这些细致有序的凝胶网络结构能够使得复合凝胶具有更好的凝胶特性。但同时过高的超声功率也可能会使得蛋白质分子变性，蛋白分子彼此之间相互作用减弱，破坏蛋白质之间的疏水相互作用，形成的凝胶网络空穴分布不均匀，机械性能变差[41]。李健[42]、赵城彬等[43]、尹丽莎等[44]分别探究超声处理对燕麦球蛋白、大豆分离蛋白/麦芽糊精混合物、藜麦分离蛋白结构的影响中同样得到类似的结论。
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图 7 超声预处理对复合凝胶微观结构的影响Figure 7. Effect of ultrasonic pretreatment on microstructure of composite gel3. 结论
本研究通过对超声预处理复合凝胶分子结构（蛋白二级结构、蛋白三级结构）、凝胶特性（持水性、质构特性）的测定并对凝胶微观结构观察可知：50%功率超声预处理10 min可以促进多糖和蛋白分子间作用力，显著增强其凝胶强度和持水性（P<0.05）；同时，混合溶液的粒径显著减小（P<0.05）进一步证实了超声预处理对复合凝胶保水性的改善。另一方面，超声预处理促使复合凝胶中的α-螺旋向β-折叠转化，并使复合凝胶的蛋白三级结构舒展开，有利于其凝胶功能的改善。此外，电镜结果同样显示50%功率的超声预处理10 min有利于形成更加均匀致密的凝胶结构，更好地揭示了一定程度的超声预处理对复合凝胶的改善机制。本研究为超声预处理改善食品凝胶特性在食品加工行业的研究开发提供了理论依据和数据支撑。
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图 2 超声预处理对复合凝胶持水性的影响
Figure 2. Effect of ultrasonic pretreatment on water-holding capacity of composite gel
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图 3 亚麻籽胶-大豆分离蛋白混合溶液粒径分布
Figure 3. Particle size distribution of flaxseed gum-soybean protein isolate mixed solution
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图 4 超声预处理对混合溶液平均粒径的影响
Figure 4. Effect of ultrasonic pretreatment on average particle size of mixed solution
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图 5 亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合凝胶圆二光谱图
Figure 5. Circular dichroism of flaxseed gum-soybean protein isolate composite gel
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图 6 亚麻籽胶-大豆分离蛋白复合凝胶荧光谱图
Figure 6. Fluorescence spectrum of flaxseed gum-soybean protein isolate composite gel
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图 7 超声预处理对复合凝胶微观结构的影响
Figure 7. Effect of ultrasonic pretreatment on microstructure of composite gel
表 1 超声预处理参数设定
Table 1 Ultrasonic pretreatment parameter setting
组别 超声功率（%） 超声时间（min） Control 0 0 1 20 1 2 20 5 3 20 10 4 50 1 5 50 5 6 50 10 7 80 1 8 80 5 9 80 10 
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表 2 超声预处理对蛋白二级结构的影响
Table 2 Effect of ultrasonic pretreatment on secondary structure of protein
样品 α-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） Control 21.78 32.16 28.14 17.92 20% 1 min 21.42 32.87 27.65 18.06 20% 5 min 21.08 33.01 27.39 18.52 20% 10 min 20.97 33.42 27.18 18.43 50% 1 min 21.27 32.46 27.54 18.73 50% 5 min 20.87 32.71 27.46 18.96 50% 10 min 20.63 32.85 27.31 19.21 80% 1 min 21.09 32.55 27.50 18.86 80% 5 min 20.76 32.79 27.32 19.13 80% 10 min 20.61 32.90 27.25 19.24
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表 3 超声预处理对蛋白三级结构的影响
Table 3 Effect of ultrasonic pretreatment on tertiary structure of protein
样品 荧光强度 Control 3250.552 20% 1 min 3613.096 20% 5 min 3819.205 20% 10 min 4010.98 50% 1 min 3623.713 50% 5 min 4213.278 50% 10 min 4508.920 80% 1 min 3870.219 80% 5 min 4238.324 80% 10 min 4534.667
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