Preparation of Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin-Curcumin Complex and Its Mechanism of Photodynamic Killing of Salmonella
-
摘要: 沙门氏菌是国内外引起人类食源性疾病最主要的食源性致病菌之一，开发新型有效的抗菌技术对保障食品安全至关重要。本研究利用羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）的包合作用，包合姜黄素（Curcumin，CUR）作为光敏剂，研究其介导光动力技术（Photodynamic Inactivation Technology，PDI）对食品样品中鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的杀菌效果及作用机制。设置乙醇浓度为40%、HP-β-CD与CUR摩尔比为2:1，在45 ℃条件下包合4 h时，所形成的CUR包合率最大，为60.08%，该包合物经结构表征后测定其水溶性显著（P<0.05）提高，达到3.98×103 μg/mL。结果表明，当包合物质量浓度（以CUR浓度计）为20 µg/mL，初始鼠伤寒沙门氏菌菌落数量级为106 CFU/mL时，LED蓝光（450 nm）照射40 min可使菌落数减少3.73 lg（CFU/mL），可杀灭47.92%~64.40%的耐药沙门氏菌，并且对即食生菜中的沙门氏菌也有一定的控制作用。在光动力技术处理后，沙门氏菌胞内产生了较高水平的活性氧，胞内容物明显减少，推测CUR-HP-β-CD介导的PDI可能通过破坏细胞膜结构达到杀菌抑菌的目的。本研究将光动力杀菌技术应用于食品安全领域，这为食品工业中防治沙门氏菌等食源性致病菌的污染提供了重要的理论基础和技术支撑。Abstract: Salmonella is one of the main foodborne pathogens causing foodborne diseases for human beings. How to effectively control the Salmonella contamination is an urgent question in the field of food safety. In this study, hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) and curcumin (CUR) were incubated to construct the inclusion complex, which was used as a photosensitizer. Then the CUR-HP-β-CD mediated photodynamic inactivation technology (PDI) on Salmonella typhimurium ATCC14028 in food samples was determined under light-activated, and the mechanisms of the antibacterial activities were studied. Using 40% of ethanol and 2:1 (n/n) of HP-β-CD, the highest CUR inclusion rate (60.08%) was observed at 45 ℃ for 4 h. The water solubility of the inclusion complex was significantly (P<0.05) improved to 3.98×103 μg/mL. The results indicated that with an initial cell concentration of 106 CFU/mL and 20 µg/mL of the inclusion complex (calculated as CUR), the survival of Salmonella typhimurium had a reduction of 3.73 lg (CFU/mL) and a 47.92% to 64.40% of antibacterial activities against drug-resistant Salmonella were observed under the LED (450 nm) irradiation for 40 minutes. This CUR-HP-β-CD mediated PDI technology could also be used to control the Salmonella contamination in ready-to-eat lettuce samples. After the PDI treatment, higher levels of reactive oxygen species was tested and the cellular contents were significantly reduced, suggesting that CUR-HP-β-CD mediated PDI presented antibacterial activities mainly by disrupting the cell membrane structures of Salmonella. This study aims to provide the PDI technology in the field of food safety, and give strong theoretical and technical supports for the prevention and control of contamination by Salmonella and other foodborne pathogens in food industry.
-
食源性致病微生物引起的食源性疾病是全球关注的公共卫生问题之一。其中由沙门氏菌造成的食品安全事件较为常见[1]。据报道，每年全球约有四十多万人因食用被沙门氏菌污染的食物而患病，其中三分之一是五岁以下的儿童[2]。目前，食品工业中常用的杀灭微生物的方法主要包括加热杀菌、抗生素杀菌[3]、超高压脉冲电场杀菌[4]等，但这些杀菌方式因成本较高或杀菌效果欠佳，可能会对食品的营养价值、质地和感官等产生影响[5]，也可能会诱导细菌产生耐药性[6]。因此，建立经济、高效、安全的方法杀灭食品中的病原微生物从而延长食品货架期尤为重要。
光动力杀菌技术（Photodynamic Inactivation Technology，PDI）是一种新型的非热杀菌技术，因其杀菌效果良好、安全、成本低廉而受到越来越多研究者的关注[7]。这种技术通过特定波长的光激活光敏剂（Photosensitizer，PS）并催化生成活性氧（ROS），从而引起细胞毒性反应，导致微生物死亡。基态光敏剂在其特定波长光的激发下吸收能量跃迁至激发态，一部分激发态光敏剂失去能量变成基态光敏剂；另一部分则通过系间窜越转变为三重激发态光敏剂后再通过Ⅰ型机制产生ROS物质；三重态光敏剂也可以通过Ⅱ型机制与基态分子3O2反应，生成极具氧化作用的单线态氧（1O2），1O2与多种底物相互作用，进而达到灭活微生物的效果[8]。
姜黄素（Curcumin，CUR）作为一种天然色素，已被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准为食品添加剂[9]。由于姜黄素具有杀菌抑菌活性、能够清除自由基，因此也被认为是一种具有应用前景的光敏剂，由其介导的光动力杀菌技术（CUR-PDI）在水果保鲜[10]、水产品贮藏[11]等方面均有应用。然而，姜黄素在水溶液中溶解性较差以及在碱性溶液中易分解的性质极大地限制了其在食品工业中的应用。
羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）是超分子大环化合物β-环糊精羟基中的氢原子由羟丙基取代的产物，具有比β-环糊精更高的水溶性和更低的毒性，且保留有β-环糊精外亲水、内疏水的特征，是第一个被FDA批准的可静脉注射环糊精衍生物[12]。由于羟丙基-β-环糊精具有良好的主客体包合能力，在促进化合物增溶、提高化合物活性等[13]方面作用显著。HP-β-CD常被用于制药方面，通过主客体包合作用可以改善难溶物的性质，如水溶性与稳定性，进而提高其生物利用度[14]。但是，HP-β-CD与CUR的包合效率常常会受到两者浓度比例、包合条件等因素的影响，而且包合物在食品病原微生物的防控效果也鲜有研究。因此，本研究为提高姜黄素的水溶性，利用羟丙基-β-环糊精的主客体包合作用制备了CUR-HP-β-CD包合物，对其进行表征和性质分析，测定以其为光敏剂介导的光动力技术杀灭革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的作用效果，探究其作用机理，并将其应用于生菜样品中沙门氏菌污染。该研究为光敏剂的开发和优化及其介导的光动力杀菌技术在沙门氏菌等食源性致病菌污染控制中的应用提供了重要的理论基础和技术指导。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
姜黄素 色谱级，纯度≥98%，索莱宝生物科技有限公司；羟丙基-β-环糊精 取代度为6.48，山东滨州智源生物科技有限公司；ROS活性氧荧光检测探针（2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，DCFH-DA） 碧云天生物技术有限公司；生菜 武汉市洪山区中百超市华农店；鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、ATCC13311、肠炎沙门氏菌ATCC13076、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌NCTC12900、耐药鼠伤寒沙门氏菌114、206 由本实验室保存；耐药菌鼠伤寒沙门氏菌SJTUF10984、肠炎沙门氏菌11561、10960 由上海交通大学惠赠。
ZNCL-BS恒温磁力搅拌器 巩义市科瑞仪器有限公司；UV-2600型紫外分光光度计 日本津岛有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；F-4600荧光光谱仪 丹麦福斯集团公司；Nicolet iS50傅立叶变换红外光谱仪 苏州奥普斯等离子体科技有限公司；Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位分析仪 北京华航精仪科技有限公司；LED灯带 自组装，深圳市灯电乐实业有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 包合物的制备
1.2.1.1 检测波长的选择
准确称取CUR粉末5.00 mg，溶于少量无水乙醇中，定容至50 mL，得到100 μg/mL （m/v） 的CUR母液。再用无水乙醇配制得到终浓度为4.00 μg/mL的CUR溶液，以无水乙醇为空白，在200~800 nm波长范围内进行全波段扫描，确定最大吸收波长。
1.2.1.2 标准曲线的建立
从上述母液中分别吸取0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mL CUR溶液，用无水乙醇定容至10 mL，得到质量浓度为0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 μg/mL的CUR溶液，以CUR质量浓度为横坐标（μg/mL），最大吸收波长处测定的吸光度值（A）为纵坐标，进行线性拟合，绘制标准曲线。
1.2.1.3 包合物主体环糊精的选择
称取一定量的CUR于100 mL烧杯中，按照主客体摩尔比2:1分别称取对应质量的β-CD和HP-β-CD，设置溶液总体积为50 mL，乙醇浓度为40%。分别将环糊精和CUR的混合溶液在磁力搅拌器上以相同转速搅拌相同时间，离心过滤取上清溶液进行全波长扫描，以 波长扫描的吸光度值判定环糊精包合CUR的浓度，从而确定后续包合物中主体的环糊精。
1.2.1.4 CUR-HP-β-CD包合物的制备及优化
采用冷冻干燥法制备CUR-HP-β-CD包合物[15]。称取 3.8 mg CUR粉末溶于一定体积的乙醇中，与HP-β-CD搅拌混合一段时间后，10000 r/min离心10 min，取上清液过滤得到CUR-HP-β-CD包合物溶液，冷冻干燥后得到CUR-HP-β-CD包合物冻干粉。分别设置乙醇浓度（10%、20%、30%、40%、50%）、包合时间（1、2、4、6、12 h）、包合温度（25、35、45、55、65 ℃）、CUR与HP-β-CD投料摩尔比（2:1、1:1、1:2、1:3、1:4）为单因素变量，利用CUR的标准曲线按式（1）计算CUR的包封率，以此为考察指标进行包合物制备工艺的优化，每组实验重复三次。
包封率(%)=包合物中CUR的质量(mg)初始时加入CUR的质量(mg)×100 (1) 1.2.2 CUR-HP-β-CD包合物的表征和溶解度的测定
1.2.2.1 最大吸收波长的测定
采用紫外可见分光光度法测定包合物的最大吸收波长。取适量CUR粉末溶于无水乙醇中，取等摩尔CUR-HP-β-CD包合物和HP-β-CD溶于蒸馏水中，充分溶解后，在室温条件下以200～800 nm范围进行全波段波长扫描，排除HP-β-CD自身的干扰[16]。
1.2.2.2 包合物粒径的测定
采用马尔文激光粒径分析法测定包合物的粒径[14]。称取适量的CUR粉末溶于无水乙醇中，等量的CUR-HP-β-CD包合物和HP-β-CD溶于蒸馏水中，采用Nano-ZS-90纳米粒度仪测定两者的粒径变化及对应的Zeta电位，测试的条件为25.0±1 ℃。
1.2.2.3 傅立叶红外光谱分析
采用KBr压片法，分别对CUR粉末、HP-β-CD粉末、CUR-HP-β-CD包合物和物理混合物（CUR与HP-β-CD的摩尔比为1:2）于室温进行红外扫描，其中扫描波数范围为4000～400 cm−1。
1.2.2.4 溶解度的测定
CUR和CUR-HP-β-CD包合物最大溶解度的测定参考赵芳等[17]的方法：分别称取5.00 mg CUR粉末和50 mg CUR-HP-β-CD包合物于2 mL蒸馏水中，避光振荡48 h，10000 r/min离心10 min，测定滤液在425 nm处吸光值，计算两者的最大溶解度。
1.2.3 水溶性CUR介导PDI的杀菌实验
1.2.3.1 杀菌条件的确定
配制CUR质量浓度为10、20、30、40、50、60 μg/mL的包合物水溶液，分别与100 μL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028菌液（106 CFU/mL）混合后加入酶标板中，37 ℃避光孵育10 min，蓝光照射30 min，与酶标板距离设置为14 cm，光照装置示意图如图1所示。以PBS作为阴性对照，不光照作为空白对照。光动力作用处理后，采用平板计数法检测沙门氏菌的菌落数，以菌落形成单位（CFU/mL）来表示，其中L+/L-表示光照/不光照，P+/P-表示加入/不加光敏剂，每组实验重复三次。
固定包合物溶液为20 μg/mL，调整光照作用时间（10、20、30、40、50、60 min），设置对照组，采用平板计数法计算沙门氏菌的菌落数，每组实验重复三次。
1.2.3.2 PDI杀菌活性的测定
采用最优包合物浓度和光照时间，分别选取鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、ATCC13311、肠炎沙门氏菌ATCC13076、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌NCTC12900以及耐药菌鼠伤寒沙门氏菌114、206、SJTUF10984、耐药肠炎沙门氏菌11561、10960为作用菌液，与包合物孵育后在蓝光下照射处理，计算菌落数，每组实验重复三次。
1.2.3.3 PDI对生菜中沙门氏菌的抑菌作用研究
将新鲜生菜叶片用蒸馏水清洗干净，在超净工作台中将生菜剪成大小为1 cm×1 cm的小片，正反面各紫外杀菌30 min，涂布平板确保生菜叶片无菌。将生菜样品置于一次性无菌培养皿中，接种100 μL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，使其表面菌量数量级分别为108、106、103 CFU/mL，再将样品置于生物安全柜中干燥15 min，然后加入100 μL CUR-HP-β-CD包合物溶液（CUR质量浓度为20 μg/mL），孵育10 min，光照40 min，同时设置空白对照组。光照结束后，将带有菌液的菜叶放入800 μL无菌PBS缓冲液中充分振荡，稀释涂板计数，每组实验重复三次。同时吸取等量菌液和包合物溶液于生菜叶表面，设置未光照组和空白组，置于4 ℃观察菜叶表面状况。
1.2.4 PDI处理对沙门氏菌杀灭机理的研究
1.2.4.1 活性氧的测定
使用荧光探针DCFH-DA通过荧光光谱定量PDI作用前后ROS的浓度[18]。吸取1 mL浓度为108 CFU/mL菌悬液，在其中加入1 μL荧光探针DCFH-DA，使其终浓度为10 μmol/L，轻柔吹打混匀，黑暗条件下孵育30 min。吸取该溶液与CUR-HP-β-CD包合物各500 μL混合孵育10 min，蓝光照射40 min，每间隔一定时间测定溶液的荧光强度，同时设置不光照（L-）、不加光敏剂（P-）作为对照组，测定条件为：488 nm激发波长、525 nm发射波长。
1.2.4.2 扫描电子显微镜分析
将浓度为108 CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028经光动力作用处理，收集菌液于10000 r/min离心5 min，沉淀用无菌PBS洗涤2次，并用2.5%的戊二醇固定过夜，然后依次用25%、50%、75%和95%（v/v）乙醇逐步脱水，再经无水乙醇脱水、CO2干燥后的菌样品进行喷金涂布处理，用扫描电镜观察沙门氏菌表面形态变化。
1.2.4.3 细胞质内容物的泄漏
参考Liang等[19]的方法并稍作修改，将L-P-（不光照、不加光敏剂）、L-P+（不光照、加光敏剂）、L+P-（光照、不加光敏剂）和L+P+（光照、加光敏剂）处理的菌液于10000 r/min离心5 min，收集上清液于超微量紫外-可见分光光度计上分别测定其在260 nm和280 nm处的吸光度值。
1.3 数据处理
每组样品做三个平行，单因素方差分析过程采用SPSS 20.0软件，P<0.05表示具有显著性差异；最后通过Origin 8.0软件作图。
2. 结果与分析
2.1 CUR-HP-β-CD包合物的制备
2.1.1 CUR检测标准曲线的建立
通过对CUR乙醇溶液进行全波段扫描，在425 nm波长处有明显吸收峰，是CUR的特征吸收波长，选择425 nm为检测波长。以CUR质量浓度（µg/mL）为横坐标，吸光度（OD425nm）为纵坐标进行线性拟合，得到回归方程Y=0.0916X+0.0404，R2=0.9998，其中CUR溶液的线性检测范围为0.5～16 μg/mL。
2.1.2 环糊精包合物扫描波长的比较
由于包合物最大吸收波长的峰值与CUR浓度呈正相关，通过比较环糊精包合物的峰值可以推断两者的包合效率。以β-CD和HP-β-CD为主体制备的包合物扫描波长如图2所示。由图2可以看出，在相同制备条件下，CUR-HP-β-CD包合物扫描波长的最大吸收峰值比CUR-β-CD包合物的高近一倍，这表明进入HP-β-CD空腔的CUR要比β-CD包合的多，包封率要高。通过计算包合物中CUR的水溶性发现，CUR-HP-β-CD包合物中CUR的水溶性相较于CUR-β-CD包合物提高了0.76倍。因此后续实验采用HP-β-CD作为包合CUR的主体以便增大CUR的水溶性。
![]()
图 2 不同CUR-CD包合物的扫描波长Figure 2. Scanning wavelengths of different CUR-CD inclusion complexes2.1.3 包合物制备条件优化
包合物的包封率与制备条件有关，为了使包合物的包封率达到最大，需要对包合条件进行优化，在不同条件下测定CUR-HP-β-CD包合物水溶液的包封率确定最佳制备条件。随着初始CUR溶液中乙醇浓度越高、包合时间越长，包合物包封率越大；但当乙醇浓度大于40%或者包合时间大于4 h时，其包封率显著（P<0.05）下降（图3a和图3b）。包合时作用温度也会影响包合物的生成效率，包合温度为45 ℃时包封率最大为（59.88%±5.67%），当温度大于45 ℃时，包封率显著（P<0.05） 下降（图3c），可能是由于温度较高影响姜黄素的稳定性。包合物投料摩尔比（CUR：HP-β-CD）在1:2时，所得包封率最高，为60.08% （图3d），此时HP-β-CD疏水空腔达到饱和。本研究所得包合物的包封率较低的原因可能与制备方式有关，采用冷冻干燥法进行包合物粉末制备的过程中，CUR的质量可能会随着乙醇干燥蒸发而减少，导致冻干样品总质量随之减少[20]；也有可能是包合物合成后CUR的最大吸收波长发生了些许位移，在一定程度上影响了包合物浓度的测定。
![]()
图 3 CUR-HP-β-CD包合条件的优化注：（a）乙醇浓度；（b）包合时间；（c）包合温度；（d）投料摩尔比。Figure 3. Optimization of CUR-HP-β-CD inclusion conditions2.2 CUR-HP-β-CD包合物的表征和性质分析
2.2.1 最大吸收波长分析
通过测定包合前后最大吸收波长是否偏移，可以判断包合物是否生成。CUR-乙醇溶液的最大吸收波长为425 nm，CUR-HP-β-CD包合物的最大吸收光谱图发生了一定程度的位移（图4a），其最大吸收波长由425 nm蓝移至420 nm，而且CUR在259 nm处的吸收峰在包合物CUR-HP-β-CD扫描光谱中消失，这些都说明新物质的生成。同时HP-β-CD在425 nm处无吸收，可以排除HP-β-CD的干扰。
![]()
图 4 CUR-HP-β-CD包合物的表征和水溶性分析注：（a）最大吸收波长；（b）粒径变化；（c）FT-IR红外光谱（1. CYR；2. HP-β-CD；3. 物理混合物；4. 包合物）；（d）包合物（左）、HP-β-CD（中）、CUR（右）固体粉末及其水溶液。Figure 4. Characterization and water solubility analysis of CUR-HP-β-CD inclusion complexes2.2.2 粒径及电位分析
通过分析CUR和CUR-HP-β-CD包合物的粒径大小可以表征包合物是否制备成功。分析结果显示（图4b），与CUR相比，通过冷冻干燥所制备包合物的粒径大小明显增大，所占比例也随之增大。CUR-乙醇溶液的Zeta电位为−1.2 mV，在其外部包裹HP-β-CD后，CUR受到保护，得到CUR-HP-β-CD包合物水溶液的Zeta电位为−27.6 mV，稳定性提高。包合物的粒径和Zeta电位与CUR相比均发生显著变化，说明CUR已经成功包合进HP-β-CD的内腔中。
2.2.3 傅立叶红外光谱（FT-IR）分析
通过分析CUR、HP-β-CD、CUR和HP-β-CD的物理混合物（摩尔比为1:2）以及CUR-HP-β-CD包合物的FT-IR定性表征包合前后的红外光谱变化（图4c）。CUR在3510 cm−1处特征吸收峰由苯酚O-H的伸缩振动引起；1634 cm−1对应于苯环的伸缩振动，1515 cm−1为C=O和C=C的伸缩振动[21]。HP-β-CD在3393、2934、1041和853 cm−1的特征吸收峰分别对应于O-H、C-H、C-O和C-O-C的伸缩振动。在物理混合物的红外光谱中，出现了CUR和HP-β-CD的特征峰，表明混合时两者之间的相互作用较弱，特征峰只是两者之间的相互叠加[22]。在包合物的红外光谱中可以看出，CUR的部分特征峰（1515~1287 cm−1）在包合物中几乎消失，并且CUR在1287 cm−1的特征峰被分成三个弱峰（1361~1297 cm−1），表明HP-β-CD可能与姜黄素分子烯醇侧的苯环相互作用。而CUR-HP-β-CD包合物和HP-β-CD的FT-IR特征峰差异不显著，说明CUR-HP-β-CD包合物的形成。
2.2.4 水溶性分析
通过计算包合物生成前后CUR的溶解性，分析包合作用对其水溶性的影响。将等量CUR、HP-β-CD、CUR-HP-β-CD包合物制备水溶液（图4d），不同于CUR单体的橙黄色结晶粉末和HP-β-CD单体的白色粉末，通过冷冻干燥得到的包合物粉末外观为亮黄色粉。通过饱和溶液法比较包合前后CUR在水中的溶解度。游离CUR的水溶性为0.43 μg/mL，极不溶于水，而包合物在水中的溶解度远高于CUR，达到3.98×103 μg/mL，说明CUR经包合后溶解度明显提高，即HP-β-CD包合可以改善难溶物质的水溶性。
2.3 CUR-HP-β-CD介导PDI对沙门氏菌的杀灭作用
2.3.1 沙门氏菌对CUR-HP-β-CD光敏剂的敏感性
将鼠伤寒沙门氏菌单独用蓝光照射（L+P-）或单独添加CUR包合物（L-P+），孵育处理后平板上所得菌落数与空白对照组（L-P-）无统计学差异（图5a）。但当相同浓度菌液同时在光敏剂作用和蓝光照射处理（L+P+）后，其菌落数显著（P<0.05）减少。这表明光敏剂介导PDI对沙门氏菌的杀灭作用必须同时满足存在光敏剂以及蓝光照射这两个条件。
![]()
图 5 PDI处理条件的优化及杀菌特性的研究注：（a）ATCC14028对PDI处理的敏感性；（b）水溶性CUR浓度的确定；（c）光照时间的确定；（d）水溶性CUR介导PDI的杀菌特性研究；不同小写字母表述数据差异显著，P<0.05。Figure 5. Optimization of PDI treatment conditions and study of bactericidal characteristics2.3.2 CUR-HP-β-CD浓度对PDI作用的影响
CUR-HP-β-CD包合物介导的PDI对鼠伤寒沙门氏菌的杀灭效果受其浓度影响显著（P<0.05）（图5b）。随着包合物浓度的增加，PDI作用后沙门氏菌的菌落数明显减少，当其质量浓度为20 μg/mL（以CUR计） 、光照30 min时，菌落对数相较于空白组减少了2.65 lg（CFU/mL），杀菌效果最显著。而随着包合物浓度的继续增加，其介导的PDI对鼠伤寒沙门氏菌的杀灭效果略有下降，可能是因为蓝光照射发出的能量是一定的，当CUR浓度过高时，大量的光敏剂无法有效吸附在细菌表面，这一部分光敏剂会消耗掉部分光照能量，而吸附在菌体表面的光敏剂所吸收的能量就会降低，从而导致杀菌效率降低[1]。在研究CUR浓度对荧光假单胞菌的灭活作用时也发现，在CUR浓度为75 μmol/L时，对荧光假单胞菌的抑制效果最显著（P<0.05），当进一步增大CUR的浓度时，杀菌效果反而减弱[23]。综上，选择质量浓度为20 μg/mL的水溶性CUR进行后续PDI处理。
2.3.3 光照时间对PDI作用的影响
延长光照时间也可以加强光动力杀菌活性。图5c显示了光照时间对PDI杀灭鼠伤寒沙门氏菌的影响。当光照10 min时，PDI处理组（L+P+）的菌落数与空白对照组相比无显著差异；随着光照时间的延长，其杀菌效果逐渐显著，当光照时间达到40 min时，其杀菌效果达到最佳，菌落对数降低了3.16 lg（CFU/mL）（P<0.001）。继续延长蓝光照射时间（50、60 min）的杀菌效果与光照40 min无显著差异。蓝光照射是CUR介导PDT发挥杀菌活性的重要条件之一，在光敏剂CUR的存在下，蓝光照射可以激活光敏剂，使其发挥微生物毒作用；另一方面，随着光照时间的增加，菌液温度也会略有升高，菌落数量趋于稳定[24]。因此，在保证杀菌效果的同时，尽量缩短光照时间，后续PDI处理的光照时间选择40 min。
2.3.4 CUR-HP-β-CD介导PDI杀菌活性分析
在水溶性CUR质量浓度为20 µg/mL、蓝光照射40 min的条件下，固定待测细菌的初始菌落为106 CFU/mL，与空白对照组（L-P-）相比，可以完全杀灭大肠杆菌NCTC12900和金黄色葡萄球菌ATCC25923。通常情况下，革兰氏阴性菌（G−）对PDI具有较强的抵抗力，而革兰氏阳性菌（G+）对PDI更敏感，因为PDI攻击的主要目标是细菌的外部结构。革兰氏阴性菌的外膜是复杂的磷脂双分子层结构，在细胞和外界环境之间起到一定的阻碍作用，而大多数革兰氏阳性菌的外膜只有肽聚糖层，具有相对较高的可渗透性，致使光敏剂或PDI产生活性氧ROS可以很容易地穿透细胞从而杀死G+细菌[25]。在本研究中，对于不同血清型和耐药谱的沙门氏菌，PDI处理后其菌落数相较于空白对照组均有显著性降低，菌量减少2.5~4.5 lg（CFU/mL）（图5d）。光敏剂介导的PDI也是控制耐药菌污染的有效措施，以甲苯胺蓝为光敏剂介导的PDI对耐药菌也有一定的杀灭效果[26]，而且光敏剂被光激发照射后产生的ROS没有针对特定的靶标结构或代谢途径，也会降低细菌产生耐药性的风险[27]。综上所述，CUR包合物介导的PDI不仅对革兰氏阴/阳性菌具有杀菌效果，还能杀灭一定浓度的耐药沙门氏菌。
2.3.5 CUR-HP-β-CD介导PDI对生菜中沙门氏菌的杀灭效果
以即食生菜为样品，通过人工接种污染的方法，研究CUR包合物介导的PDI在实际食品样品中对沙门氏菌的杀灭作用（图6）。选择不同浓度菌液污染的生菜（图6a），经PDI处理后杀菌效果显著（P<0.05），当初始污染浓度为103 CFU/mL时，其杀菌效率可达100%。当生菜污染浓度为106和108 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌时，PDI处理后菌浓度分别减少了3.74和3.34 lg（CFU/cm2）。由图6b所示被沙门氏菌污染的生菜经过光动力处理后，4 ℃条件下生菜储藏时间相较于空白组延长，表明PDI处理可在一定程度上减缓细菌生长、延长生菜的货架期。PDI处理组的生菜货架期延长的原因可能是细菌在遭受ROS亚致死环境的胁迫和低温条件的双重威胁后，进入了“存活但不可培养”的状态[28]。
![]()
图 6 PDI对生菜的抑菌作用注：（a）水溶性CUR在PDI条件下对生菜中不同沙门氏菌浓度的杀菌效果（***P<0.001）；（b） PDI对生菜储藏的影响。Figure 6. Antibacterial effects of PDI on lettuce2.4 PDI对沙门氏菌的杀菌机制
2.4.1 PDI处理后ROS浓度的变化
活性氧荧光探针DCFH-DA具有细胞渗透性和非荧光性，可以进入细胞被ROS氧化产生绿色荧光物质DCF（2',7'-二氯荧光素），这些物质稳定存在于细菌细胞中，通过测定绿色荧光强度来判断细胞中ROS含量的变化。如图7所示，与未光照未处理的样品（L-P-）相比，PDI处理组的绿色荧光强度随着时间的延长逐渐增大，表明了包合物CUR-HP-β-CD是一种有效的光敏剂，在其介导的PDI作用下，沙门氏菌体内产生了高浓度的ROS，且其浓度随着LED蓝光照射时间的延长而不断增加。由于细菌在代谢过程中内源性卟啉会产生ROS，因此阴性对照组（L-P-）中也检测到了微弱的ROS荧光信号。ROS对于细菌的死亡至关重要，在PDI处理过程中，ROS清除剂的存在会降低杀菌效果；而添加ROS稳定剂后，PDI介导的杀菌效果会增强[29]。综上所述，Cur-HP-β-CD包合物在蓝光照射下可以快速有效地产生ROS，这对其发挥光动力杀菌作用具有重要意义。
2.4.2 PDI处理后细菌显微形态的变化
为了从微观角度探索细菌在PDI处理后显微形态的变化，本研究通过扫描电镜观察沙门氏菌显微形态的变化（图8）。加入CUR-HP-β-CD包合物并在蓝光照射40 min（L+P+）处理后，沙门氏菌仍然呈现明显的特征杆状结构，部分细菌菌体无明显破损现象（图8a箭头），但是一部分沙门氏菌菌体却发生了明显的细胞变形和和表面坍塌现象，细胞膜变得粗糙、扭曲甚至破裂（图8b），从而影响了沙门氏菌正常的生长繁殖。研究表明，这种细菌损伤和细胞质物质的泄漏通常是不可逆的[30]。
![]()
图 8 光动力处理后沙门氏菌的扫描电镜图Figure 8. Scanning electron microscopy of Salmonella after photodynamic treatment2.4.3 PDI处理后细胞内容物的变化
由于细胞膜受损而释放细胞内物质，因此可以通过测定细胞内生物分子，作为判断细胞膜完整性的指标之一[31]。本研究通过测量PDI处理前后菌液在260 nm处和280 nm处的吸光度值，分析细胞内核酸和蛋白质等生物大分子的变化，进而表征其细胞膜的完整程度。结果显示，对照组（L-P-、L-P+、L+P-）的细菌滤液的吸光度值OD260 nm和OD280 nm均无显著差异；而PDI处理组（L+P+）细菌滤液在260和280 nm处吸光度值显著增加（图9），推测细菌在光敏剂的存在下，通过蓝光照射产生ROS，继而引发细胞内脂质氧化，使膜的流动性降低，通透性增加，甚至使细胞破裂，导致细胞内容物大量外流[32]。该结果也进一步表明CUR-HP-β-CD包合物在蓝光照射下可能通过破坏沙门氏菌的细胞膜结构，进而导致细胞死亡。
![]()
图 9 PDI处理后沙门氏菌蛋白质和核酸浓度Figure 9. Concentration of protein and nucleic acid of Salmonella after PDI treatment3. 结论
本研究以HP-β-CD为主体通过主客体作用包合姜黄素制备了包合物CUR-HP-β-CD，其水溶性相较CUR单体显著（P<0.05）提高，将其作为光敏剂，在LED蓝光照射下，探究了其对鼠伤寒沙门氏菌的杀灭作用，并初步探究了其对鼠伤寒沙门氏菌的作用机理。研究表明，在光敏剂CUR-HP-β-CD浓度为20 μg/mL（以CUR计）时，其介导的PDI在光照40 min后可以显著（P<0.05） 降低沙门氏菌的菌落数，并对不同血清型的耐药沙门氏菌也显示出良好的杀菌活性。同时，该条件下的PDI可以应用于即食生菜样品的保鲜，延长其货架期。通过测定PDI作用前后沙门氏菌ROS强度、细菌显微形态以及胞内容物浓度的变化，揭示了CUR-HP-β-CD介导PDI对沙门氏菌的杀菌机理。即光敏剂CUR-HP-β-CD在蓝光照射下诱导沙门氏菌产生了较高浓度的ROS，破坏了细胞的完整结构，特别是细胞膜的结构，使沙门氏菌蛋白质、核酸等内容物释放，从而达到杀菌的目的。本研究为控制食品中沙门氏菌等食源性致病菌的污染提供了一种有效的研究方法，也为光敏剂介导的光动力杀菌技术应用于食品工业提供了坚实的理论基础。
-
![]()
图 2 不同CUR-CD包合物的扫描波长
Figure 2. Scanning wavelengths of different CUR-CD inclusion complexes
![]()
图 3 CUR-HP-β-CD包合条件的优化
注：（a）乙醇浓度；（b）包合时间；（c）包合温度；（d）投料摩尔比。
Figure 3. Optimization of CUR-HP-β-CD inclusion conditions
![]()
图 4 CUR-HP-β-CD包合物的表征和水溶性分析
注：（a）最大吸收波长；（b）粒径变化；（c）FT-IR红外光谱（1. CYR；2. HP-β-CD；3. 物理混合物；4. 包合物）；（d）包合物（左）、HP-β-CD（中）、CUR（右）固体粉末及其水溶液。
Figure 4. Characterization and water solubility analysis of CUR-HP-β-CD inclusion complexes
![]()
图 5 PDI处理条件的优化及杀菌特性的研究
注：（a）ATCC14028对PDI处理的敏感性；（b）水溶性CUR浓度的确定；（c）光照时间的确定；（d）水溶性CUR介导PDI的杀菌特性研究；不同小写字母表述数据差异显著，P<0.05。
Figure 5. Optimization of PDI treatment conditions and study of bactericidal characteristics
![]()
图 6 PDI对生菜的抑菌作用
注：（a）水溶性CUR在PDI条件下对生菜中不同沙门氏菌浓度的杀菌效果（***P<0.001）；（b） PDI对生菜储藏的影响。
Figure 6. Antibacterial effects of PDI on lettuce
![]()
图 8 光动力处理后沙门氏菌的扫描电镜图
Figure 8. Scanning electron microscopy of Salmonella after photodynamic treatment
-
[1] 曾巧辉, 余杏同, 区灿盛, 等. 姜黄素光动力杀灭即食鸡肉中沙门氏菌的研究[J]. 佛山科学技术学院学报(自然科学版),2022,40(1):19−25. [ZENG Q H, YU X T, OU C S, et al. Study on curcumin-mediated photodynamic inactivation of Salmonellaon ready-to-eat chicken[J]. Journal of FoShan university natual science edition,2022,40(1):19−25.] doi: 10.3969/j.issn.1008-0171.2022.1.fskxjsxyxb202201003 ZENG Q H, YU X T, OU C S, et al. Study on curcumin-mediated photodynamic inactivation of Salmonellaon ready-to-eat chicken[J]. Journal of FoShan university natual science edition, 2022, 40（1）: 19−25. doi: 10.3969/j.issn.1008-0171.2022.1.fskxjsxyxb202201003
[2] World Health Organization. Joint FAO/WHO Expert Meeting on the pre- and post-harvest control of Campylobacter spp. in poultry meat[R]. Italy:FAO Headquarters, 2023.
[3] CAPITA R, ALONSO-CALLEJA C. Antibiotic-resistant bacteria:a challenge for the food industry[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 2013, 53(1):11-48.
[4] WANG Q J, LI Y F, SUN D W, et al. Enhancing food processing by pulsed and high voltage electric fields:principles and applications[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2018,58(13):2285−2298. doi: 10.1080/10408398.2018.1434609
[5] 熊中平, 李爱媚. 新食品加工技术对食品品质的影响[J]. 中国食品工业,2023(9):94−96. [XIONG Z P, LI A M. The impact of new food processing technologies on food quality[J]. China Food Industry,2023(9):94−96.] XIONG Z P, LI A M. The impact of new food processing technologies on food quality[J]. China Food Industry, 2023（9）: 94−96.
[6] 华蕊, 吴科榜, 管庆丰, 等. 猪源抗菌肽PR-39对畜禽常见病原菌的抑菌活性及与抗生素协同杀菌效应研究[J]. 饲料工业,2019,40(22):29−33. [HUA R, WU K B, GUAN Q F, et al. Antibacterial activity of porcine antibacterial peptide PR-39 against common pathogens in livestock and poultry and its synergistic bactericidal effect with antibiotics[J]. Feed Industry Magazine,2019,40(22):29−33.] HUA R, WU K B, GUAN Q F, et al. Antibacterial activity of porcine antibacterial peptide PR-39 against common pathogens in livestock and poultry and its synergistic bactericidal effect with antibiotics[J]. Feed Industry Magazine, 2019, 40（22）: 29−33.
[7] 郑宝东, 林少玲, 曾绍校, 等. 光动力技术研究进展及其在食品工业中的应用前景[J]. 食品与生物技术学报,2020,39(5):6−15. [ZHENG B D, LIN S L, ZENG S X, et al. Photodynamic technology and its application in food industry[J]. Journal of Food Science and Biotechnology,2020,39(5):6−15.] doi: 10.3969/j.issn.1673-1689.2020.05.002 ZHENG B D, LIN S L, ZENG S X, et al. Photodynamic technology and its application in food industry[J]. Journal of Food Science and Biotechnology, 2020, 39（5）: 6−15. doi: 10.3969/j.issn.1673-1689.2020.05.002
[8] 孟媛媛, 刘海泉, 潘迎捷, 等. 光动力杀菌机制及在食品应用中的优势与不足[J]. 食品工业科技,2022,43(22):414−421. [MENG Y Y, LIU H Q, PAN Y J, et al. Mechanism of photodynamic inactivation and its advantages and disadvantages in food applications[J]. Science and Technology of Food Industry,2022,43(22):414−421.] MENG Y Y, LIU H Q, PAN Y J, et al. Mechanism of photodynamic inactivation and its advantages and disadvantages in food applications[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43（22）: 414−421.
[9] ZHANG C Y, ZHANG L, YU H X, et al. Curcumin inhibits invasion and metastasis in K1 papillary thyroid cancer cells[J]. Food Chemistry,2013,139(1):1021−1028.
[10] CHAI Z Y, ZHANG F, LIU B J, et al. Antibacterial mechanism and preservation effect of curcumin-based photodynamic extends the shelf life of fresh-cut pears[J]. LWT-Food Science and Technology 2021, 142:110941.
[11] HU J M, ZHOU F, LIN Y, et al. The effects of photodynamically activated curcumin on the preservation of low alum treated ready-to-eat jellyfish[J]. LWT-Food Science and Technology,2019,115:108443. doi: 10.1016/j.lwt.2019.108443
[12] SZENTE L, SZEJTLI J. Highly soluble cyclodextrin derivatives:chemistry, properties, and trends in development[J]. Advanced Drug Delivery Reviews,1999,36(1):17−28. doi: 10.1016/S0169-409X(98)00092-1
[13] KABIROV D, SILVESTRI T, NICCOLI M, et al. Phase solubility and thermoanalytical studies of the inclusion complex formation between curcumin and hydroxypropyl-β-cyclodextrin in hydroalcoholic solutions[J]. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry,2020,147(1):347−353.
[14] 罗见春, 郭绮, 张敏, 等. 单向灌流法研究姜黄素羟丙基-β-环糊精包合物的大鼠在体肠吸收[J]. 中国组织工程研究,2019,23(6):957−962. [LUO J C, GUO Q, ZHANG M, et al. Intestinal absorption characteristics of curcumin hydroxypropyl-beta-cyclodextrin in rats:an analysis using one-way perfusion method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research,2019,23(6):957−962.] doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1539 LUO J C, GUO Q, ZHANG M, et al. Intestinal absorption characteristics of curcumin hydroxypropyl-beta-cyclodextrin in rats: an analysis using one-way perfusion method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23（6）: 957−962. doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1539
[15] LAI D N, ZHOU A R, TAN B K, et al. Preparation and photodynamic bactericidal effects of curcumin-β-cyclodextrin complex[J]. Food Chemistry,2021,361:130117. doi: 10.1016/j.foodchem.2021.130117
[16] ZHANG L L, MAN S L, QIU H N A, et al. Curcumin-cyclodextrin complexes enhanced the anti-cancer effects of curcumin[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology,2016,48:31−38. doi: 10.1016/j.etap.2016.09.021
[17] 赵芳, 赵雪秋, 常清, 等. 虫草素与羟丙基-β-环糊精的包合行为及性能研究[J]. 分析化学,2017,45(10):1547−1555. [ZHAO F, ZHAO X Q, CHANG Q, et al. Study on inclusion behavior and properties of cordycepin with hydroxypropyl-β-cyclodextrin[J]. Analytical Chemistry,2017,45(10):1547−1555.] doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.170269 ZHAO F, ZHAO X Q, CHANG Q, et al. Study on inclusion behavior and properties of cordycepin with hydroxypropyl-β-cyclodextrin[J]. Analytical Chemistry, 2017, 45（10）: 1547−1555. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.170269
[18] GANGULY D, CHANDRA SANTRA R, MAZUMDAR S, et al. Radioprotection of thymine and calf thymus DNA by an azo compound:mechanism of action followed by DPPH radical quenching & ROS depletion in WI 38 lung fibroblast cells[J]. Heliyon,2020,6(5):e04036. doi: 10.1016/j.heliyon.2020.e04036
[19] LIANG Z X, LIU X L, QIN Z R, et al. Photodynamic inactivation of Shigella flexneri by curcumin[J]. LWT-Food Science and Technology,2022,153:112491. doi: 10.1016/j.lwt.2021.112491
[20] KHATUN B, RATHER M A, ROHILLA S, et al. Curcumin–hydroxypropyl-β-cyclodextrin complex preparation methods:a comparative study[J]. Chemical Papers,2023,77(8):4409−4424. doi: 10.1007/s11696-023-02791-7
[21] RAO S Q, SUN M L, HU Y, et al. ε-Polylysine-coated liposomes loaded with a β-CD inclusion complex loaded with carvacrol:Preparation, characterization, and antibacterial activities[J]. LWT-Food Science and Technology 2021, 146:111422.
[22] 李宁. 姜黄素-羟丙基-β-环糊精包合物的制备及药代动力学研究[D]. 合肥:安徽医科大学, 2018. [LI N. Preparation of curcumin-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex and investigation on its oral bioavailability[D]. Hefei:Anhui Medical University, 2018.] LI N. Preparation of curcumin-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex and investigation on its oral bioavailability[D]. Hefei: Anhui Medical University, 2018.
[23] 王洋, 赵瑜玲, 陈孟涵, 等. 姜黄素联合乙二胺四乙酸对荧光假单胞菌的光动力灭活作用[J]. 食品科学,2022,43(21):8−15. [WANG Y, ZHAO Y L, CHEN M H, et al. Photodynamic inactivation effect of curcumin combined with ethylene diamine tetraacetic acid on Pseudomonas fluorescens[J]. Food Science,2022,43(21):8−15.] doi: 10.7506/spkx1002-6630-20211127-335 WANG Y, ZHAO Y L, CHEN M H, et al. Photodynamic inactivation effect of curcumin combined with ethylene diamine tetraacetic acid on Pseudomonas fluorescens[J]. Food Science, 2022, 43（21）: 8−15. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20211127-335
[24] 严金华, 杨晨, 李泽林, 等. 光强和光照时间对大肠杆菌光动力灭菌效果的影响[J]. 浙江工业大学学报,2017,45(1):60−63. [YAN J H, YANG C, LI Z L, et al. The efficiency of Escherichia coli photodynamic disinfection effected by light intensity and illumination time[J]. Journal of Zhejiang University of Technology,2017,45(1):60−63.] doi: 10.3969/j.issn.1006-4303.2017.01.013 YAN J H, YANG C, LI Z L, et al. The efficiency of Escherichia coli photodynamic disinfection effected by light intensity and illumination time[J]. Journal of Zhejiang University of Technology, 2017, 45（1）: 60−63. doi: 10.3969/j.issn.1006-4303.2017.01.013
[25] NAGATA J Y, HIOKA N, KIMURA E, et al. Antibacterial photodynamic therapy for dental caries:Evaluation of the photosensitizers used and light source properties[J]. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy,2012,9(2):122−131. doi: 10.1016/j.pdpdt.2011.11.006
[26] 彭莹莹, 季晓春, 王广芬, 等. 光动力抗菌化学疗法对多药耐药菌及菌膜杀菌效果的研究[J]. 中华医院感染学杂志,2018,28(12):1761−1767. [PENG Y Y, JI X C, WANG G F, et al. Bactericidal effects of photodynamic antimicrobial chemotherapy on multidrug-resistant pathogens and biofilm[J]. Chinese Journal of Nosocomiology,2018,28(12):1761−1767.] PENG Y Y, JI X C, WANG G F, et al. Bactericidal effects of photodynamic antimicrobial chemotherapy on multidrug-resistant pathogens and biofilm[J]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2018, 28（12）: 1761−1767.
[27] JIA Q Y, SONG Q, LI P, et al. Rejuvenated photodynamic therapy for bacterial infections[J]. Advanced Healthcare Materials,2019,8(14):1900608. doi: 10.1002/adhm.201900608
[28] LI Y M, HUANG T Y, BAI C Y, et al. Reduction, prevention, and control of Salmonella enterica viable but non-culturable cells in flour food[J]. Frontiers in Microbiology,2020,11:1859. doi: 10.3389/fmicb.2020.01859
[29] 董冬丽, 林少玲, 孙崇臻, 等. 姜黄素光动力技术对水产食品霍利斯格里蒙特菌和溶藻弧菌的灭活作用[J]. 中国食品学报,2022,22(2):40−48. [DONG D L, LIN S L, SUN C Z, et al. Inactivation of curcumin photodynamic technology on grimontia hollisae and vibrio alginolyticus in aquatic food[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2022,22(2):40−48.] DONG D L, LIN S L, SUN C Z, et al. Inactivation of curcumin photodynamic technology on grimontia hollisae and vibrio alginolyticus in aquatic food[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2022, 22（2）: 40−48.
[30] HU J M, LIN S L, TAN B K, et al. Photodynamic inactivation of Burkholderia cepacia by curcumin in combination with EDTA[J]. Food Research International,2018,111:265−271. doi: 10.1016/j.foodres.2018.05.042
[31] LIU B K, XUE Y F, ZHANG J T, et al. Visible-light-driven TiO2/Ag3PO4 heterostructures with enhanced antifungal activity against agricultural pathogenic fungi Fusarium graminearum and mechanism insight[J]. Environmental Science:Nano,2017,4(1):255−264. doi: 10.1039/C6EN00415F
[32] YOSHIMITSU H. Occurrence, biosynthesis, biodegradation, and industrial and medical applications of a naturally occurring ε-poly-l-lysine[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry,2011,75(7):1226−1233. doi: 10.1271/bbb.110201
-
期刊类型引用(3)
1. 姜浩，张沐棠，吴柳清，陈颖，陈椰娜，温锦培，齐鹤鸣，白卫东. 姜黄素药食特性及应用综述. 食品与发酵工业. 2025(04): 363-373 . 
百度学术
2. 陈榕，颜烨，何梓炫，黄小红，林昭妍. 提升姜黄素疗效的策略及技术研究进展. 中草药. 2024(15): 5315-5330 . 百度学术
3. 陈佳敏，赵前程，栾倩，沈俊，林邦楚，刘鹰，干淼钰，李剑，蔡路昀. 烟熏三文鱼加工工艺及微生物质量控制研究进展. 肉类研究. 2024(07): 71-77 . 百度学术
其他类型引用(1)
下载:
下载:
计量
- 文章访问数: 123
- HTML全文浏览量: 78
- PDF下载量: 23
- 被引次数: 4
