Preparation and Stability Analysis of Spirulina Polyphenol Composite Nanocapsules
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摘要: 为通过微胶囊化提高螺旋藻多酚的稳定性。利用玉米醇溶蛋白（Zein）和多孔淀粉（porous starch，PS）对螺旋藻多酚（polyphenol，Phe）进行包埋，制备了螺旋藻多酚-多孔淀粉（Phe-PS），螺旋藻多酚-多孔淀粉-玉米醇溶蛋白（Phe-PS-Zein）两种微胶囊，并对Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein进行了微观结构和稳定性、抗氧化性及体外模拟消化性质的比较。结果表明，Phe-PS微胶囊在芯壁比1:10、温度80 ℃、磁力搅拌时间120 min条件下，包埋率为60.29%；Phe-PS-Zein微胶囊在芯壁比1:10、壁材比1:1、搅拌时间90 min、温度60 ℃和pH7时包埋率最高，达86.93%。XRD和XPS图谱结果表明，添加Zein后，晶体衍射峰强度有所降低，主要与Zein的无定型结构有关。DSC分析结果表明，蛋白做壁材改善了微胶囊热稳定性。通过对抗氧化性、稳定性以及体外缓释效果的测定发现，与游离Phe和Phe-PS相比，Phe-PS-Zein对DPPH自由基清除力和Fe3+的还原力提高。综上，Phe-PS-Zein颗粒可以作为螺旋藻多酚的有效递送载体。本研究结果有望为Phe的高值化利用提供理论和实验基础。Abstract: To improve the stability of Spirulina polyphenols through microencapsulation. Two types of microcapsules, Phe-PS and Phe-PS-Zein were prepared by embedding zein and porous starch (PS) in spirulina polyphenols (Phe). The microstructure, stability, antioxidant activity, and in vitro simulated digestion properties of Phe, Phe-PS, and Phe-PS-Zein were compared. The results showed that under the conditions of core to wall ratio of 1:10, temperature of 80 ℃, and magnetic stirring time of 120 minutes, the embedding rate of Phe-PS microcapsules was 60.29%. The encapsulation efficiency of Phe-PS-Zein microcapsules was the highest at core to wall ratio of 1:10, wall to material ratio of 1:1, stirring time of 90 minutes, temperature of 60 ℃, and pH of 7, reached 86.93%. The XRD and XPS spectra indicated that the diffraction peak intensity of the crystal decreased after the addition of zein, which was mainly related to the amorphous structure of zein. DSC analysis showed that the addition of protein as wall material improved the thermal stability of microcapsules. Compared with free Phe and Phe-PS, Phe-PS-Zein showed an increased ability to scavenge DPPH radicals and reduce Fe3+ by measuring its antioxidant activity, stability, and in vitro sustained-release effect. In summary, the Phe-PS-Zein particles could serve as an effective delivery carrier for Spirulina polyphenols. The results of this study would be expected to provide a theoretical and experimental basis for the high-value utilization of Phe.
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Keywords:
- Spirulina polyphenols /
- porous starch /
- zein /
- microcapsule /
- structure characterization /
- stability /
- antioxidant activity /
- in vitro digestion
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螺旋藻是目前科学研究发现的理想的人类食品，被一些学者誉为“营养冠军”[1]、未来食物[2]，其提取物已经在抗癌药物研发领域得到认可[3]。此外，螺旋藻还具有协助治疗疾病的功效，备受科研人员的推崇，是目前发现的营养最均衡全面的纯天然食品[4]。螺旋藻不仅可以应用于功能饮料中，还被用于乳制品、意大利面、油衍生物和营养补充剂的生产[5]。螺旋藻中含有多种生物活性物质，如藻蓝蛋白、酚类、多糖、多不饱和脂肪酸（PUFA）、类胡萝卜素、维生素和甾醇。这些化合物大多数对于治疗心血管疾病（CVD）、高胆固醇、高血糖、肥胖、高血压、肿瘤和炎症性疾病中起着重要作用，被认为是一种天然药物[6]。
多酚类物质分子中具有多个酚羟基，属植物的次生代谢产物，主要包括黄酮类、单宁类、酚酸以及花色苷等。许多研究表明，多酚类物质具有良好的抗氧化活性，对辅助治疗疾病有一定的帮助。多酚是天然抗氧化剂，可作为屏障，防止活性氧（ROS）引起的氧化应激。尽管多酚具有多种有益人体的好处，然而，由于多酚对热敏感且容易氧化[7]，它们的使用在很大程度上受到限制。多酚在食物制备、循环、胃肠道中的不稳定性或弱稳定性限制了它的作用和潜在的治疗优势[8]。因此，为了最大限度地发挥人类从加工食品中摄入多酚的有益效果，必须深入系统研究多酚在食品加工中的稳定性，以评估其真正的生物活性。目前大多数关于多酚稳定性的研究都集中在微胶囊上。
微胶囊技术是一种新型储存包装技术，将一些性质不稳定的物质通过壳类材料进行包裹，通过隔离达到保护作用。这些性质不稳定的物质可以是固体、液体，也可以是气体。壳类材料主要是安全性能较高的天然或者合成大分子聚合物，如植物胶类、碳水化合物类、纤维素类、蛋白质类以及脂类等，对内容物具有很强的保护作用[9]。其保护作用主要体现在以下三方面：防止强光、高温及强酸强碱对内部物质的辐射与腐蚀，提高其储存时间；类似于药物胶囊，能够使内部活性成分持续、缓慢、长久地释放生物活性，延长其发挥作用的时间；遮盖不良风味或令人不愉悦的感官特性。例如黄酮类化合物味苦，将其包被在胶囊中，可以有效改善其口感[10]。目前为了获得理想的包埋效果，一般采用多种材料组合为壳，以期做到相互补充。
针对这一问题，本文提出将多酚类化合物与多孔淀粉和玉米醇溶蛋白进行复合包埋，以提高其稳定性。制备负载螺旋藻多酚的螺旋藻多酚-多孔淀粉微胶囊（Phe-PS）和螺旋藻多酚-多孔淀粉-玉米醇溶蛋白微胶囊（Phe-PS-Zein），进行结构表征和稳定性分析，以保证螺旋藻多酚在食品生产过程中的有效应用。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
螺旋藻干粉 海南新大泽生物技术有限公司；胃蛋白酶（1:3000）、猪胰蛋白酶（1:250）、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH） 北京索莱宝科技有限公司；玉米醇溶蛋白（Zein）、乙醇、大孔树脂XDA-7、福林酚、蜡质玉米淀粉、乙酸钠、糖化酶（10万U/g） 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯 上海麦克林生化科技股份有限公司。
AB135-S型精密电子天平 瑞士梅特勒公司；DF-101S型磁力搅拌器 上海力辰仪器科技有限公司；N-1210BV-W型旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；Neofuge 1600R型台式冷冻离心机 上海Heal Force；Power Wave XS2型多功能酶标仪 美国Bio-Tek公司；TS-211GZ型恒温摇床 上海仪纯实业有限公司；DW-86L590D型超低温冰箱 上海科菱威生物科技有限公司；FJ-200-SH型高速均质机 上海沪析实业有限公司；BILON-2000FD型真空冷冻干燥机 上海新诺仪器集团有限公司；UV-6100型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；D8 ADVANCE型X射线衍射仪 德国布鲁克公司；Gemini300型场发射扫描电镜 德国蔡司集团；STA 449 F3/F5型差示扫描量热仪 德国耐驰公司；Nicolet IS10型红外光谱仪 美国尼高力仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 螺旋藻多酚的提取纯化
向5 g螺旋藻粉中添加100 mL溶剂（乙醇:水=3:1，V/V），并在避光条件下以1000 r/min的转速磁力搅拌90 min，提取液在5000×g下室温离心5 min，然后通过0.45 µm滤膜过滤，收集上清液，获得的提取液两过XDA-7大孔树脂吸附柱，除去色素及杂质，然后在40~50 ℃的温度范围内进行旋蒸浓缩，浓缩液冻干即为螺旋藻多酚（polyphenol，Phe），备用[11]。
1.2.2 负载螺旋藻多酚的螺旋藻多酚-多孔淀粉（Phe-PS）微胶囊的制备
1.2.2.1 多孔淀粉的制备
多孔淀粉（porous starch，PS）的制备参考张超[12]的方法，并略有修改。称取15 g蜡质玉米淀粉，添加乙酸钠缓冲液（50 mmol/L，pH4.5）300 mL配制成5%淀粉悬浮液。然后将悬浮液置于40 ℃水浴锅中预热，待温度恒定后，加入糖化酶（40 U/mL）3 mL，在250 r/min条件下搅拌反应2.5 h。然后添加1 mol/L NaOH溶液调节pH至9.0终止反应，反应液经室温离心（10000 r/min，20 min）后保留沉淀，并用去离子水对沉淀进行3次洗涤，最后进行冻干，得到PS。
称取1 g PS，将其溶于100 mL 80 ℃蒸馏水中，并将容器置于60 ℃水浴中磁力搅拌至完全溶解；称取100 mg Phe，将其溶于10 mL无水乙醇，缓慢滴入热淀粉浆中，用磁力搅拌器继续搅拌至芯材完全溶解，同时加热除去乙醇，8000 r/min的转速下室温均质1 min，倒入平板中，液面不超过5 mm，放入−80 ℃冰箱预冻24 h，真空冷冻干燥至恒重，研磨，得到负载Phe的Phe-PS微胶囊粉末，存放在4 ℃下进行进一步分析。
1.2.2.2 包埋率的测定
复合微胶囊颗粒包埋率检测参考Ahmad等[13]的方法，并略有修改。取3 mL新鲜制备的样品在4 ℃下10000×g离心30 min，获得上清液，在765 nm处测定上述溶液的吸光度。采用标准曲线（y=0.014+1.095x）计算Phe的含量，微胶囊的包埋率（EE）计算公式如下：
EE(%)=总多酚含量−上清液多酚含量总多酚含量×100 (1) 1.2.3 螺旋藻多酚-多孔淀粉-玉米醇溶蛋白（Phe-PS-Zein）复合微胶囊颗粒制备
PS储备液的制备：称取1.0 g多孔淀粉溶于100 mL超纯水中，在磁力搅拌（1000 r/min）下过夜，使PS充分水合，4 ℃下储存备用。
Phe-Zein溶液的制备：准确称取1.0 g Zein溶于50 mL 80%（v/v）的乙醇溶液中，振荡2 h，配制成浓度为20 mg/mL的Zein储备液。在Zein储备液中加入适当体积的多酚溶液（Zein:Phe=20:1，v/v），避光搅拌（800 r/min）1 h，离心（5000×g，10 min）除去不溶性杂质，现用现配[14]。
多酚微胶囊颗粒制备参考Meng等[14]的方法，并略有修改。用无菌注射器将Phe-Zein溶液缓慢滴加至含有PS的水溶液中（PS:Zein:Phe=1:1:20，v/v/v），在避光条件下800 r/min搅拌2 h，旋蒸除去多余的乙醇，添加适量的超纯水补偿乙醇的损失，得到Phe-PS-Zein微胶囊颗粒。
1.2.4 螺旋藻多酚微胶囊的结构表征
1.2.4.1 粒径和多分散性指数的表征
将样品（0.01%，w/v）悬浮在超纯水中，在超声波浴中以40 kHz的频率超声30 min，使聚合物完全分散。基于动态光散射技术[15]，利用激光粒度仪测定复合纳米颗粒的粒径和多分散性分布指数（PDI）。
1.2.4.2 红外光谱分析（FTIR）
利用FTIR表征微胶囊颗粒内的分子间相互作用[16]。采用溴化钾压片法制备样品，样品与溴化钾的质量比约为1:100。首先在玛瑙中将样品和溴化钾研成细粉，再用油压机压成片。为避免溴化钾吸潮，整个实验过程在红外灯下操作。红外参数如下：光谱波长范围为400~4000 cm−1，分辨率为2 cm−1，扫描64次。
1.2.4.3 X射线衍射（X-ray diffractometry，XRD）和X射线光子能谱分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）表征
通过XRD测定样品的晶体结构，根据刘夫国[16]的方法并稍作修改，将粉末样品在含有饱和NaCl溶液的干燥器中平衡一周。扫描速度为2°/min时角为5°~35°。将冻干后的样品采用X射线光电子能谱仪分析粒子的表面元素。测试条件：管电流40 mA，管电压40 kV，Cu靶（1.5406 eV），Co靶（1.79026 eV），在0~1000 eV内进行全扫描。
1.2.4.4 热重分析（DSC）
根据Rawel等[17]的方法并稍作修改，用于分析微胶囊颗粒的热稳定性。准确称量15.0 mg的样品放入标准铝盘中，保证良好的传热接触。采用铟来校正仪器，并用空铝盘做基线校准。使用氮气作为保护气，温度扫描范围为25~600 ℃，加热速率为10 ℃/min，测试完成后采用液氮进行物理降温。
1.2.5 螺旋藻多酚微胶囊的稳定性分析
1.2.5.1 螺旋藻多酚微胶囊的储存稳定性
将新制备的螺旋藻多酚微胶囊颗粒和游离的螺旋藻多酚，在4 ℃条件下保存21 d，每隔3 d测定一次Phe含量，按下述公式计算储存过程中螺旋藻多酚的保留率。
保留率(%)=MtM0×100 (2) 式中：Mt表示t min后微胶囊或提取物中多酚含量，mg；M0表示0 min微胶囊或提取物中多酚含量，mg。
1.2.5.2 O2对螺旋藻多酚微胶囊稳定性的影响
为探究O2对螺旋藻多酚微胶囊的影响，本实验参照安小琦[18]的方法略有改动。取5份0.1 g螺旋藻多酚提取物和5份0.2 g螺旋藻多酚微胶囊，放置于暗室中，每隔5 d测量其多酚含量，计算其多酚保留率，每个样品进行三次重复试验，考察O2对螺旋藻多酚微胶囊稳定性的影响。
1.2.5.3 还原剂（NaHSO3）对螺旋藻多酚微胶囊稳定性的影响
参照侯顺超[19]的方法测定还原剂（NaHSO3）对螺旋藻多酚微胶囊稳定性的影响，配制浓度分别为0.25、0.5、0.75、1、1.25和1.5 mg/mL的NaHSO3溶液，加入一定量的螺旋藻多酚和螺旋藻多酚微胶囊制品，充分溶解后，将其置于室温条件下避光保存1 h，测量其多酚含量，并以1.2.5.1所述公式计算多酚保留率，每个样品进行三次重复试验，考察还原剂对螺旋藻多酚微胶囊稳定性的影响。
1.2.6 螺旋藻多酚微胶囊的抗氧化性分析
1.2.6.1 DPPH自由基清除能力分析
参照Ahmad等[20]的方法并略作修改，将4 mL样品加入4 mLDPPH乙醇溶液中并充分混合，将混合物溶液置于黑暗中30 min。在517 nm处测量上述溶液的吸光度（At），并使用以下公式计算样品的自由基清除活性（%）：
DPPH自由基清除率(%)=(1−At−AbAc)×100 (3) 式中：Ab表示4 mL样品溶液与4 mL无水乙醇的吸光度；Ac表示4 mL去离子水和4 mL DPPH乙醇混合溶液的吸光度；At表示4 mL样品溶液与4 mL DPPH乙醇溶液的吸光度。
1.2.6.2 铁离子还原法分析抗氧化能力
参考杨少辉等[21]的研究方法，并略有修改。将0.3 mol/L pH3.6的乙酸缓冲溶液，与20 mmol/L FeCl3（H2O）6，10 mmol/L TPTZ按照10:1:1（v/v/v）制备成FRAP储备液。将其混匀后于37 ℃条件下孵育60 min，现用现配。取1 mL的待测样品与15 mL FRAP储备液混合，反应4 min后，在593 nm处测其吸光值。
1.2.7 体外模拟消化特性测定
体外模拟消化参考Minekus等[22]的方法，并略有修改。本研究制备的螺旋藻多酚微胶囊在口腔中停留的时间短暂，因此本研究中不考虑口腔消化情况。将3 g微胶囊颗粒加入15 mL无胃蛋白酶模拟胃液（SGF）中，并置于37 ℃水浴中。将2000 U/mL胃蛋白酶加入15 mL SGF溶液中，并用5 mol/L HCl将pH调节至2.0。随后取15 mL的胃糜与等体积的人工肠液（SIF）混合，立即用1 mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至7.0，加入终浓度为100 U/mL猪胰蛋白酶，6.25 mg/mL胆汁提取物。混合溶液在37 ℃，150 r/min的水浴条件下反应2 h。各相反应结束后，取10 mL样品在4 ℃，10000×g离心30 min，收集上清中的Phe，上清液经0.45 μm滤膜过滤后，参考Karakashov等[23]的方法测定多酚含量。多酚的生物利用度按照公式计算：
生物利用度(%)=上清液中多酚含量总多酚含量×100 (4) 1.3 数据处理
每组实验重复3次，以平均值±标准差表示，用Origin 8.1软件进行数据作图，用SPSS 22.0进行显著性分析（P<0.05）。
2. 结果与分析
2.1 结构和形貌表征
2.1.1 粒径和多分散性指数
如图1所示，相较于Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein的粒径明显减小，这是因为Phe在溶液中是以聚集状态存在的，这种聚集导致Phe的粒径较大，而PS和（或）Zein的加入打破了这种聚集状态，对Phe进行了包埋；另一方面，相较于Phe-PS，Phe-PS-Zein的PDI降低，表明Phe-PS-Zein的分子量分布更均匀[24]。
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图 1 Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein的粒径分布与多分散性指数Figure 1. Particle size distribution and polydispersity index of Phe, Phe-PS and Phe-PS-Zein2.1.2 FTIR表征
Phe，PS和Phe-PS的FTIR光谱如图2所示。在多孔淀粉中，波长3428 cm−1左右的宽峰代表OH的拉伸振动，927和1159 cm−1之间的区域通常与C=C，C=O和C=H的拉伸或弯曲振动有关[25]。光谱在3428 cm−1（苯酚OH基团的拉伸振动）、2928 cm−1（脂肪族C-H基团的拉伸振动）、1631 cm−1（芳香族C=C基团的拉伸振动）、1327、1167、1040 cm−1（C=O基团的对称拉伸振动）处显示宽吸收峰[26]；829和738 cm−1处的吸收峰归因于芳香环上C-H基团的弯曲振动[27]。
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图 2 Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein的FTIR表征Figure 2. FTIR spectra of Phe, Phe-PS and Phe-PS-ZeinPhe-PS微胶囊颗粒中也有类似的峰，且峰的范围很广，说明螺旋藻多酚被包裹在多孔颗粒中，没有明显的相互作用。此前有研究报道指出，氢键是酚类化合物与淀粉基壁材之间的主要相互作用[28]。在本研究中，多酚和淀粉分子中的-OH基团可能在氢键的形成中发挥了重要作用，氢键的形成导致了多酚包封后淀粉光谱的变化。此外，在螺旋藻多酚颗粒中还观察到苯环的存在，其波数为848 cm−1。此外，高峰期为1692 cm−1对应于多酚芳香环的C=C拉伸，在1631 cm−1处的峰显示在Phe-PS复合物图谱中。该结果表明，由于多酚的一个或两个芳香环进入多孔淀粉的螺旋腔，是因为相互作用而发生的变化。在姜黄素-β-环糊精包涵体复合物中也报告了类似的现象[29]。在Phe-PS颗粒中发现了更宽且不那么尖锐的条带，再次证实了螺旋藻多酚被包裹在淀粉纳米颗粒中。至于三种物质的FTIR光谱差异，可以归因于多酚和多孔淀粉的聚合程度。
2.1.3 XPS表征结果
为了进一步研究各制备样品的化学状态以及键能情况[13]，对不同负载量样品进行了高分辨率XPS光谱分析。图3为O轨道高分辨谱图，可以看到对于不同单质及复合物样品，结合能位于532.20 eV的特征峰归因于样品中的C-O，位于533.28 eV峰值主要是材料中羟基（-OH）所引起的衍射峰[30]。而在534.01 eV的特征峰主要是由于样品O-C=O键或者表面吸附水所致。Phe，PS和Zein中Zein的C-O键结合能最低，含量也最高，这与FTIR结果一致。Phe负载了PS后结合能以及含量变化较小，而复合Zein后C-O含量明显增加，结合能也降低，表明Zein与Phe-PS成功复合。该结果与梁宏闪[31]的研究结论一致。
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图 3 Phe，Phe-PS，Phe-PS-Zein，PS和Zein的XPS谱图（O轨道高分辨谱图）Figure 3. XPS survey spectra of Phe, Phe-PS and Phe-PS-Zein(O Orbital high-resolution spectra)2.1.4 XRD表征结果
图4为Phe，Phe-PS，Phe-PS-Zein，PS和Zein纳米颗粒的XRD谱图。通过Jade软件对测得的XRD数据进行分析处理，经过寻峰对准处理可以发现，上述五种物质在15°~30°之间存在明显的衍射峰。对于Phe而言，在22.9°存在明显的晶体衍射峰，但与PS复合后，衍射峰明显左移，在20.4°观察到宽化的衍射峰。根据Debye-Scherrer公式[32]，衍射峰宽化表明颗粒尺寸有所降低。添加Zein后，晶体衍射峰强度有所降低，主要与Zein的无定型结构有关。此外，从衍射峰尖锐程度来看，添加PS和Zein后，复合物的结晶度有所降低。通常而言，内部结晶区晶粒尺寸可通过X-射线衍射峰强度良好展现，若存在越小的晶粒尺寸，则会形成越低的衍射峰强度[33]。此现象实质上是多糖与蛋白质发生作用而再次排列组合，更大颗粒由此形成。
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图 4 Phe，Phe-PS，Phe-PS-Zein，PS和Zein的XRD谱图Figure 4. XRD patterns of Phe, Phe-PS, Phe-PS-Zein and Zein2.2 稳定性表征
2.2.1 DSC表征
利用DSC曲线研究了Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein的热稳定性，从图5中可以看出，Phe的吸热峰在Phe-PS和Phe-PS-Zein中未出现，表明Phe被很好地包裹在复合微胶囊颗粒中[34]。此外，双层壁材包埋微胶囊颗粒的变性温度升高，这是由于Zein和（或）PS与Phe之间相互作用，使得复合微胶囊颗粒的热稳定性增强。之前的研究表明，加入蛋白质做壁材后的微胶囊的热稳定性明显提高，这是由于蛋白质增加了生物聚合物颗粒之间的空间位阻[35]。
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图 5 Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein的DSC曲线Figure 5. Differential scanning calorimetry of Phe, Phe-PS and Phe-PS-Zein2.2.2 螺旋藻多酚微胶囊的储存稳定性
如图6所示，4 ℃下储存21 d后，Phe-PS-Zein和Phe-PS中螺旋藻多酚的保留率分别为80.97%和67.64%，比对照组的Phe保留率（47.03%）分别高了33.94%和20.61%。这是因为PS对Phe的包埋起到了保护Phe的作用，而Phe-PS-Zein内部的分子间相互作用更强，形成的结构更紧密，此外，玉米醇溶蛋白由于其分子内疏水作用而更易于聚集，多孔淀粉与其相互作用能够减弱玉米醇溶蛋白的疏水性，并增强微胶囊颗粒之间的静电和空间排斥，且加入玉米醇溶蛋白增加了分散体系的粘度，使其具有更好的物理稳定性，对Phe的保护效果也更好。
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图 6 复合微胶囊在4 ℃条件下储存21 d后螺旋藻多酚的保留率Figure 6. Effects of the retention rate of polyphenols from Spirulina stored at 4 °C for 21 days2.2.3 O2对螺旋藻多酚微胶囊稳定性的影响
将Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein一同放在接触空气的暗室中，每隔5 d测定其Phe含量并计算其保留率，结果如图7所示。对照组的Phe保留率在避光且与空气接触30 d后下降到47.03%，同等条件下，Phe-PS和Phe-PS-Zein保留率分别下降到77.64%和80.97%，证明将Phe微胶囊化，可以有效减少O2对其降解的影响，且Phe-PS-Zein提高Phe稳定性的效果更好。另一方面，随着时间的延长，对照组Phe在空气中的保留率下降趋势越来越大，而复合壁材包埋的Phe保留率一直平稳下降，说明微胶囊化说明复合微胶囊化对Phe有着较好的保护作用。
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图 7 O2对复合微胶囊中螺旋藻多酚保留率的影响Figure 7. Effects of O2 on the retention rate of polyphenols from Spirulina2.2.4 还原剂（NaHSO3）对螺旋藻多酚微胶囊稳定性的影响
将Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein溶解于不同浓度的NaHSO3溶液中，如图8所示，还原剂对Phe-PS-Zein的影响最小，随着NaHSO3浓度的增加，微胶囊多酚保留率下降趋势不明显，维持在90%以上。而Phe-PS中螺旋藻多酚保留率随着NaHSO3浓度的增加下降至80%以下，当NaHSO3浓度为150 mg/mL时Phe的保留率为73.45%，因此，复合壁材胶囊化后的螺旋藻多酚更加稳定，且Phe-PS-Zein比Phe-PS对Phe的保护效果更好。
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图 8 NaHSO3对复合微胶囊中螺旋藻多酚保留率的影响Figure 8. Effects of NaHSO3 on the retention rate of polyphenols from Spirulina2.3 抗氧化性测定
天然多酚具有一定的抗氧化能力[36]，可抑制单线态氧与自由基的活性，从而保护人体细胞和组织免受氧化损伤[37]。如图9所示，对DPPH实验结果进行统计学分析，结果表明三者对自由基的清除率具有显著性差异（P<0.05），Phe-PS和Phe-PS-Zein清除自由基的活性高于Phe，且Phe-PS-Zein对DPPH自由基的清除能力高于Phe-PS。FRAP实验也表现出相同的趋势且差异显著（P<0.05），这是因为Zein中富含芳香族氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，它们能够螯合过渡金属Fe3+，从而起到有效的抗氧化作用，使得Phe-PS-Zein对Fe3+表现出优异的抗氧化保护能力[38]。
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图 9 Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein对DPPH自由基清除力和对Fe3+的还原力Figure 9. DPPH scavenging activity and Ferric-reducing ability of Phe, Phe-PS和Phe-PS-Zein2.4 体外模拟消化测定
Phe的体外生物利用率取决于溶解在胃肠道中的Phe浓度[39]。如图10所示，消化系统的水基环境限制了多酚的吸收与利用，SGF期后，对照组的Phe释放量为28.97%±1.89%，而Phe-PS和Phe-PS-Zein复合微胶囊颗粒中多酚的生物利用率分别为20.64%±1.09%和19.43%±0.77%，均低于游离多酚在SGF期的生物利用率。实验结果表明，复合微胶囊颗粒能够控制SGF阶段多酚的释放，尤其是Phe-PS-Zein，可能是Phe-PS-Zein微胶囊颗粒表面Zein和PS的相互作用能够有效阻止微胶囊在胃环境中的降解，进而提高Phe在SIF期的生物利用率[40]。SIF期后，Phe-PS和Phe-PS-Zein复合微胶囊颗粒中Phe的生物利用率明显提高，分别为67.89%±1.89%和73.19%±2.04%，这是由于复合微胶囊颗粒在肠液中的解离和水解作用，促进了Phe的释放。该结果也与之前关于体外消化过程中多酚生物可及性的研究一致[41]。综上所述，Phe-PS-Zein在SGF期降解程度较低，在SIF期的生物利用度较高。
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图 10 Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein微胶囊颗粒的体外释放效果Figure 10. In vitro release profile of Phe, Phe-PS and Phe-PS-Zein3. 结论
本文制备了基于淀粉相的负载螺旋藻多酚的Phe-PS微胶囊颗粒，并对其进行表征和稳定性分析。为了探究更稳定的螺旋藻多酚递送体系，利用反溶剂沉淀法制备了负载多酚的Phe-PS-Zein微胶囊，通过DLS、FTIR、XRD、XPS、DSC等技术对其结构进行了表征，并进行了稳定性和体外缓释作用的探究，比较了Phe-PS-Zein与Phe-PS两种复合微胶囊颗粒的稳定性、生物利用率等性能。主要结论如下：设计单因素实验对负载螺旋藻多酚的Phe-PS-Zein微胶囊进行工艺优化，在芯壁比1:10，壁材比1:1，搅拌时间90 min，温度60 ℃和pH7时有最高包埋率，达86.93%。比多孔淀粉单层壁材负载螺旋藻多酚得到的Phe-PS微胶囊（芯材比1:10，温度80 ℃，磁力搅拌时间120 min，达到最佳包埋率60.29%）包埋效果更好。通过DLS、FTIR、XRD和XPS等技术对微胶囊结构进行了表征，并与游离的螺旋藻多酚进行比较。通过荧光光谱的分析，结果表明玉米醇溶蛋白-多酚复合体是在非共价作用力作用下形成的。XRD和XPS的图谱表明，添加Zein后晶体衍射峰强度有所降低，主要与Zein的无定型结构有关。通过对DSC分析和对抗氧化性、稳定性以及体外缓释效果的研究，比较了Phe-PS-Zein与Phe-PS两种微胶囊颗粒对螺旋藻多酚的保护效果，结果表明，Phe-PS-Zein颗粒可以作为螺旋藻多酚的有效递送载体。
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图 1 Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein的粒径分布与多分散性指数
Figure 1. Particle size distribution and polydispersity index of Phe, Phe-PS and Phe-PS-Zein
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图 2 Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein的FTIR表征
Figure 2. FTIR spectra of Phe, Phe-PS and Phe-PS-Zein
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图 3 Phe，Phe-PS，Phe-PS-Zein，PS和Zein的XPS谱图（O轨道高分辨谱图）
Figure 3. XPS survey spectra of Phe, Phe-PS and Phe-PS-Zein(O Orbital high-resolution spectra)
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图 4 Phe，Phe-PS，Phe-PS-Zein，PS和Zein的XRD谱图
Figure 4. XRD patterns of Phe, Phe-PS, Phe-PS-Zein and Zein
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图 5 Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein的DSC曲线
Figure 5. Differential scanning calorimetry of Phe, Phe-PS and Phe-PS-Zein
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图 6 复合微胶囊在4 ℃条件下储存21 d后螺旋藻多酚的保留率
Figure 6. Effects of the retention rate of polyphenols from Spirulina stored at 4 °C for 21 days
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图 7 O2对复合微胶囊中螺旋藻多酚保留率的影响
Figure 7. Effects of O2 on the retention rate of polyphenols from Spirulina
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图 8 NaHSO3对复合微胶囊中螺旋藻多酚保留率的影响
Figure 8. Effects of NaHSO3 on the retention rate of polyphenols from Spirulina
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图 9 Phe，Phe-PS和Phe-PS-Zein对DPPH自由基清除力和对Fe3+的还原力
Figure 9. DPPH scavenging activity and Ferric-reducing ability of Phe, Phe-PS和Phe-PS-Zein
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