Optimization of the Extraction Process, Structural Characterization and Antioxidant Activity of Ginseng Alcohol Soluble Proteins
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摘要: 为探讨人参中醇溶蛋白提取工艺，结构表征及体外抗氧化活性，本文以人参为研究对象，采用单因素实验和响应面试验探索人参醇溶蛋白的最佳提取工艺，以紫外吸收光谱法、红外分光光度分析法、氨基酸组成、微观结构观察等方法对人参醇溶蛋白进行结构表征，并对其在不同pH条件下的体外抗氧化活性开展一系列研究。通过测定DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、铁离子还原能力，评价人参醇溶蛋白的体外抗氧化活性。结果表明，人参中醇溶蛋白最佳提取工艺为：提取时间2 h、提取料液比1:10 g/mL、提取pH为7，此时人参醇溶蛋白得率为0.319%，蛋白含量为75%。通过紫外吸收光谱法、红外分光光度分析法、氨基酸组成成分分析试验结果表明，人参醇溶蛋白氨基酸总量为82.3 g/100 g，其中人体必需氨基酸含量为26.46 g/100 g，药用氨基酸含量为30.51 g/100 g，验证了该人参醇提物主要成分确为蛋白质，分子量约为3.3 kDa，SEM扫描电镜结果显示，该人参醇溶蛋白结构完整，表面稀疏且有不规则的脊形凸起以及少量孔隙，蛋白质颗粒呈现蜂窝聚集状态，具有稳定有序的网状结构。体外抗氧化试验结果表明，该蛋白在强酸性条件下具有较强的体外抗氧化活性，当pH=1时，人参醇溶蛋白对DPPH自由基的清除率为96%，对羟基自由基的清除率为79%，对铁离子的还原能力为0.86。Abstract: To explore the extraction process, structural characterization and in vitro antioxidant activity of alcohol soluble proteins from ginseng. This study used ginseng as the research object, explored the optimal extraction process of ginseng alcohol soluble protein by one-way test and response surface test, structurally characterized ginseng alcohol soluble protein by ultraviolet absorption spectrometry, infrared spectrophotometric analysis, amino acid composition, and microstructure observation, and carried out a series of studies on its antioxidant activity in vitro under different pH conditions. The in vitro antioxidant activity of ginseng alcohol soluble protein was evaluated by determining the DPPH radical scavenging capacity, ·OH scavenging capacity, and iron ion reduction capacity. The results showed that the optimal extraction process of ginseng alcohol soluble protein was 2 h, extraction material-liquid ratio of 1:10 g/mL, and extraction pH of 7, at which the yield of ginseng alcohol soluble protein was 0.319% and the protein content was 75%. The results of ultraviolet spectrophotometry, infrared spectrophotometry and amino acid composition analysis showed that the total amount of amino acids in ginseng alcohol soluble protein was 82.3 g/100 g, of which the content of essential amino acids was 26.46 g/100 g, and the content of medicinal amino acids was 30.51 g/100 g, which verified that the main component of ginseng alcohol extract was indeed protein, and the molecular weight was about 3.3 kDa. The SEM results showed that the ginseng alcoholic protein was structurally complete, the surface was sparse with irregular ridges and a small number of pores, and the protein particles showed honeycomb aggregation with a stable and orderly reticular structure. The results of in vitro antioxidant test showed that the protein had strong in vitro antioxidant activity under strong acidic conditions. When the pH was 1, the scavenging rate of ginseng alcohol soluble protein for DPPH radical was 96%, the scavenging rate for ·OH was 79%, and the reducing ability for iron ion was 0.86.
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人参（Panax ginseng C.A.Mey）为五加科植物人参的根及根茎，属于多年生宿根草本植物，是我国传统名贵中药材，被誉为“百草之王”。《神农本草经》记载其具有“补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目、开心益智、久服延年益寿”等功效[1−3]。人参具有多种活性成分，主要包括人参皂苷类、多糖类、蛋白质类物质，具有抗衰老、抗肿瘤、降血脂[4]、体外抗阿尔兹海默病[5−6]、缓解疲劳[7]、调节免疫功能[8]等多种药理作用，具有着重要的药用价值[9−10]。
人参蛋白是人参有效组分之一，现阶段对人参蛋白的研究主要集中于人参中水溶性蛋白，目前提取人参蛋白的方法主要有硫酸铵沉淀法、有机试剂沉淀法、膜过滤法[11]等，并且已被证明其具有抗氧化、增强免疫、神经保护等药理活性[12]。有研究表明包括木瓜，苦杏仁，白芸豆等中药材在内的多种植物醇溶蛋白目前均已进入较深层次研究，包括提取工艺、结构表征、相关活性等[13−15]，而人参醇溶蛋白却鲜有相关文献报道。
因此本文优化了人参醇溶蛋白的最佳提取工艺并对其进行结构表征，探讨了人参醇溶蛋白的体外抗氧化活性研究。为人参蛋白包括人参醇溶蛋白的进一步研究奠定理论基础，对中药材人参在食品、药物开发等方面都具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
人参药材 吉林省抚松县万良镇提供，长春中医药大学药学院王哲副教授鉴定为植物人参（Panax ginseng C.A.Mey）的干燥根茎；无水乙醇 分析纯，天津新通精细化工有限公司；氯化钠、硫酸亚铁 北京化工厂；水杨酸 天津市光复精细化工研究所；过氧化氢 天津新通精细化工有限公司；DPPH、羟基自由基试剂盒、Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；BeyoBlueTM考马斯亮蓝超快染色液 上海碧云天生物技术有限公司。
GS-05粉碎机 北京锟捷玉诚机械设备有限公司；Lynx 6000离心机 美国Thermo Fisher公司；S220-K-CN标准型pH计、AB135-S电子天平、ALC-2100-2电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；Alpha 3-4 Lscbasic冷冻干燥仪 美国Labconco公司；超低温冰箱（−80 ℃） SanyoThermo公司；涡旋混合震荡器 北京大龙仪器有限公司；Infinite 200 Pro多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；Micro Mhemi4.2凝胶成像仪 以色列DNR公司。
1.2 实验方法
1.2.1 人参醇溶蛋白提取、盐析工艺及溶剂的选择
分别称取25 g人参粉，选择无水乙醇，90%，80%，70%，60%，50%乙醇，回流2 h提取，7000 r/min，25 ℃离心10 min，采用宋丹等[16]的盐析法并修改，对人参醇溶性蛋白进行盐析，取上清按1:1料液比，与1% NaCl混合，4 ℃，盐析24 h，7000 r/min，25 ℃离心10 min，弃上清，沉淀冻干后备用。精密天平称取适量人参醇溶性蛋白冻干粉，用相应提取溶剂配制成1 mg/mL人参蛋白溶液，取等量2×蛋白上样Buffer，混匀后沸水5 min，使蛋白变性后按顺序于Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书配制好的凝胶中上样。按BeyoBlueTM考马斯亮蓝超快染色液说明书染色并脱色后于凝胶成像仪中成像。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 不同提取时间对人参醇溶蛋白得率的影响
在提取料液比1:10，提取溶剂为90%乙醇，pH=7条件下进行试验，研究提取时间0.5、1、1.5、2、2.5、3 h对人参醇溶蛋白得率的影响，待提取完成，按1.2.1方法盐析蛋白，冻干后计算得率。人参醇溶蛋白得率（%）=人参醇溶蛋冻干粉质量/提取该人参醇溶蛋白粉所用人参质量。
1.2.2.2 不同料液比对人参醇溶蛋白得率的影响
在提取时间为2 h，提取溶剂为90%乙醇，pH=7条件下进行试验，探讨不同提取料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g/mL对人参醇溶蛋白得率的影响，提取结束后，按1.2.1方法盐析蛋白，冻干后计算得率。
1.2.2.3 不同pH对人参醇溶蛋白得率的影响
在提取时间为2 h，提取溶剂为90%乙醇，料液比1:10（g/mL）的条件下进行试验，探讨当pH分别为1、3、5、7、9条件时对人参醇溶蛋白得率的影响。按1.2.1方法盐析蛋白，并在冻干后计算得率。
1.2.3 响应面设计试验
采用Design Expert10.0.3软件进行三因素三水平的Box-Behnken试验设计[17]，根据单因素实验的结果，以提取时间（A）、提取料液比（B）、提取pH（C）为自变量，对人参醇溶蛋白的提取进行工艺优化，表1为试验因素水平表。
表 1 响应面试验的因素与水平Table 1. Factors and levels of response surface experiment水平 因素 A
提取时间（h）B
提取料液比（g/mL）C
提取pH−1 1.5 1:5 5 0 2 1:10 7 1 2.5 1:15 9 1.2.4 紫外光谱扫描
取适量人参醇溶蛋白样品溶于pH7.0的90%乙醇中，使人参醇溶蛋白溶液的最终浓度为2 mg/mL。根据Qian等[18]的方法，使用UV-2550型紫外可见分光光度计进行扫描，扫描范围为200~600 nm，扫描速度为60 nm/min。
1.2.5 傅立叶变换红外吸收光谱（FTIR）检测
将人参醇溶蛋白冻干粉与干燥的溴化钾1:50研磨混匀后，在专门的压片机上压制薄片，用Vertex70型红外光谱仪在400~4000 cm−1范围内扫描[19]。
1.2.6 氨基酸组成成分分析
1.2.6.1 供试品处理
取一定量的人参醇溶蛋白样品，转移至水解管中，加入1 mL、6 mol/L的盐酸，充入氮气约5 min，密封后放置于Block Heater干式加热器模块中，110 ℃水解反应24 h。反应完毕后，将游离氨基酸溶液转移至1.5 mL EP管中，抽真空浓缩至干。
1.2.6.2 混合氨基酸标准品衍生化的处理
取25 µL混合氨基酸标准品溶液，加入12.5 µL 1 mol/L三乙胺涡旋混合震荡，之后加入12.5 µL、0.1 mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）涡旋混合震荡室温静置1 h，加入100 µL正己烷剧烈混合震荡后静置10 min，取下层溶液20 µL，加入180 µL流动相A溶液，混合后0.22 µm过滤处理待测试。
1.2.6.3 样品溶液衍生化处理
取适量流动相A液复溶已冻干样品游离氨基酸，取25 µL样品氨基酸溶液，加入12.5 µL 1 moL/L三乙胺涡旋混合震荡，加入12.5 µL 0.1 mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）涡旋混合震荡室温静置1 h，100 µL正己烷剧烈混合震荡后静置10 min，取下层溶液20 µL与180 µL流动相A溶液混合后0.22 µm过滤处理等待测试。
1.2.6.4 高效液相色谱条件
A液为0.05 mol/L乙酸钠水溶液，B液为甲醇-乙腈-水溶液（甲醇:乙腈:水）=20:60:20（V:V:V）。流速为：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；色谱柱为Aglient AdvanceBio columns洗脱条件见表2。
表 2 高效液相色谱洗脱条件Table 2. High performance liquid chromatography separation gradients保留时间（min） 流速（mL/min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0.01 1.0 95.0 5.0 39.00 1.0 52.0 48.0 40.00 1.0 0.0 100.0 45.00 1.0 0.0 100.0 46.00 1.0 95.0 5.0 60.00 1.0 95.0 5.0 1.2.7 扫描电子显微镜（SEM）
将冻干后人参醇溶蛋白样品均匀撒在贴有导电胶的硅片上，用洗耳球吹掉多余的样品，离子溅射仪进行90 s喷金处理处理，后放入扫描电子显微镜在5 kV加速电压下观察100、500、1000倍三个倍数下拍摄人参醇溶蛋白成像。
1.2.8 人参醇溶蛋白体外抗氧化试验
1.2.8.1 DPPH自由基清除能力
采用文献[20]方法并进行修改，设计不同pH条件下人参醇溶蛋白体外抗氧化活性。参考文献[21]报道，取适量人参醇溶蛋白冻干粉，90%乙醇溶解配成1 g/100 mL的人参醇溶蛋白溶液后调pH=1、3、5、7、9并取50 µL不同pH样品溶液与200 µL 0.004% DPPH溶液（无水甲醇溶解）混合反应，在37 ℃下避光反应1 h，12000 r/min离心5 min，于517 nm波长处测定吸光度A1；用无水甲醇代替DPPH溶液，测定吸光度A2；用蒸馏水代替样品溶液，测定吸光度A0，计算DPPH自由基清除率，公式为：清除率（%）=[1−(A1−A2)/A0]×100。
1.2.8.2 羟基自由基清除能力
参考文献[22−23]报道，将50 µL不同pH样品溶液与100 µL、9 mmol/L硫酸亚铁，100 µL、9 mmol/L水杨酸（无水乙醇溶解）混合，加入100 µL过氧化氢（8.8 mmol/L），在25 ℃下反应30 min，12000 r/min 离心5 min，于510 nm波长处测定吸光度A1；用蒸馏水代替过氧化氢，测定吸光度A2；用蒸馏水代替样品溶液，测定吸光度A0，计算羟基自由基清除率，公式为：清除率（%）=[1−(A1−A2)/A0]×100。
1.2.8.3 铁离子还原能力
参考文献[24]报道，将1.0 mL不同pH样品溶液与1.0 mL 1%铁氰化钾溶液混合，在50 ℃下反应20 min，冷却至室温后，加1.0 mL 10%三氯乙酸，5000 r/min离心15 min，取2.5 mL上清液与0.15 mL 0.1%氯化铁混合，于700 nm波长处测定吸光度。
1.3 数据处理
每个样品重复测定3次，取平均值，采用SPSS Statistics 17.0软件进行方差分析和显著性分析，P<0.05表示具有显著性差异，使用Graph Pad prism 8.0.2和Design-Expert 10.0.3进行数据处理和分析。
2. 结果与分析
2.1 人参醇溶蛋白提取溶剂的选择
如图1所示，人参醇溶蛋白在不同提取溶剂提取条件下，在SDS-PAGE电泳后呈现出不同分子量蛋白条带，50%、60%、70%、80%体积分数乙醇溶液提取结果猜测可能是因为提取溶剂水分的占比过大，将人参中即溶于水同时又溶于乙醇的两性蛋白提取出来，为了将提取的人参醇溶蛋白进行简单纯化并得到只溶于醇的蛋白，且90%体积分数乙醇溶液与无水乙醇提取所呈现蛋白条带相近，因此本试验选用90%乙醇作为人参醇溶蛋白的提取溶剂。
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图 1 不同提取溶剂提取人参醇溶蛋白的SDS-SPEAG电泳图注：1. 50%乙醇；2. 60%乙醇；3. 70%乙醇；4. 80%乙醇；5. 90%乙醇；6. 无水乙醇。Figure 1. SDS-SPEAG electrophoresis patterns of ginsenoside soluble proteins extracted with different extraction solvents2.2 单因素实验结果
2.2.1 提取时间对人参醇溶蛋白得率的影响
提取时间对人参醇溶蛋白得率的影响如图2所示，由图2可知，随提取时间的延长，人参醇溶蛋白的得率逐渐升高，当提取时间为2 h时，得率达到最高，可能是因为人参醇溶蛋白与提取液溶解不够充分所致。继续增加提取时间，人参醇溶蛋白的得率下降，这可能是因为随着提取时间的增加，蛋白变性所导致[25]。经过统计分析，发现提取时间对人参醇溶蛋白得率的影响存在显著性差异（P<0.05），因此选取提取时间1.5、2和2.5 h作为进一步响应面试验优化的条件。
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2.2.2 提取料液比对人参醇溶蛋白得率的影响
提取料液比对人参醇溶蛋白得率的影响如图3所示，由图3可知，提取料液比1:5~1:10（g/mL）时，人参醇溶蛋白的得率上升，当提取料液比为1:10（g/mL）时，人参醇溶蛋白的得率达到最高，因为随料液比的增加，更多蛋白与提取液充分接触，利于蛋白溶出，提高人参醇溶蛋白得率[26]。当料液比增加至1:25（g/mL）时，人参醇溶蛋白得率下降，可能是随着提取溶剂的增多，人参醇溶蛋白与蛋白水解酶充分接触，部分人参醇溶蛋白被蛋白水解酶水解所致。因为人参醇溶蛋白的得率在料液比1:10时提取效果最好，继续增加料液比也没有对人参醇溶蛋白得率有显著提高。经过统计分析，发现料液比的变化对人参醇溶蛋白得率有显著性影响（P<0.05），因此选取料液比1:5、1:10和1:15（g/mL）作为进一步响应面试验优化的条件。
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图 3 提取料液比对人参醇溶蛋白得率的影响Figure 3. Influence of extraction material-liquid ratio on the yield of ginseng alcohol-soluble protein2.2.3 提取pH对得率的影响
提取pH对人参醇溶蛋白得率的影响如图4所示，由图4可知，在pH7之前，蛋白质提取率随pH的增加而增加，人参醇溶蛋白的得率在pH7时升至最高，随后开始下降，这可能与人参醇溶蛋白的等电点相关。经统计分析，发现提取pH对人参醇溶蛋白得率有显著性影响（P<0.05），因此选取pH5、7、9作为进一步响应面试验优化的条件。
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图 4 提取pH对人参醇溶蛋白得率的影响Figure 4. Effect of extraction pH on the yield of ginseng alcohol-soluble protein2.3 响应面试验结果
2.3.1 响应面试验设计与结果
在Box-Behnken试验设计原理基础上，设计了三因素三水平的响应面分析试验。根据设计出的试验方案中的不同试验条件进行试验，每组平行做三次，得到的设计方案及结果如表3所示。
表 3 响应面试验BBD设计与结果Table 3. Response surface test BBD design and results实验号 提取时间 提取料液比 提取pH 人参醇溶蛋白得率（%） 1 −1 0 1 0.131±0.008 2 0 0 0 0.285±0.002 3 −1 1 0 0.142±0.004 4 1 1 0 0.256±0.001 5 −1 −1 0 0.125±0.002 6 −1 0 −1 0.140±0.007 7 0 0 0 0.311±0.011 8 0 1 1 0.246±0.002 9 1 0 1 0.277±0.0006 10 0 0 0 0.311±0.002 11 1 −1 0 0.225±0.001 12 0 −1 1 0.172±0..002 13 0 0 0 0.289±0.0006 14 1 0 −1 0.102±0.005 15 0 −1 −1 0.124±0.001 16 0 0 0 0.305±0.006 17 0 1 −1 0.109±0.004 2.3.2 回归模型的建立及分析
运用Design-Expert 10.0.3软件，对表3进行拟合，以人参醇溶蛋白得率作为响应值，得到的二次多项回归方程为：Y=0.30+0.04A+0.013B+0.044C+0.0035AB+0.046AC+0.022BC−0.057A2−0.056B2−0.081C2。响应面分析结果见表4。
表 4 响应面试验方差分析Table 4. Response surface experimental ANOVA方差分析项 平方和 自由度 均方 F P 模型 0.10 9 0.011 37.82 <0.0001** A提取时间 0.013 1 0.013 43.67 0.0003* B提取料液比 1.431×10−3 1 1.431×10−3 4.82 0.0641 C提取pH 0.015 1 0.015 51.89 0.0002* AB 4.900×10−3 1 4.900×10−3 0.17 0.6966 AC 8.464×10−3 1 8.464×10−3 28.52 0.0011* BC 1.980×10−3 1 1.980×10−3 6.67 0.0363* A2 0.014 1 0.014 45.65 0.0003* B2 0.013 1 0.013 45.25 0.0003* C2 0.028 1 0.028 93.02 <0.0001** 残差 2.078×10−3 7 2.968×10−3 失拟项 1.465×10−3 3 4.883×10−3 3.19 0.1461 纯误差 6.128×10−3 4 1.532×10−3 总和 0.10 16 注：**P<0.0001，差异极显著：*表示P<0.05，差异显著。 从表5可以看出，二次项C2对人参醇溶蛋白得率影响极显著，一次项A、C，交互项AC、BC，二次项A2、B2对人参醇溶蛋白得率影响显著，一次项B，交互项AB对人参醇溶蛋白得率影响不显著，得影响人参醇溶蛋白得率的顺序为提取pH（C）>提取时间（A）>提取料液比（B）。建立的回归模型中P<0.0001，表明回归模型的达到了极显著水平（P<0.01）；而失拟项的P为0.1461>0.05，其模型差异不显著，说明模型具有较好的试验稳定性，表明该方程可靠。本研究拟合度为0.9798，反映了本研究的正确性和准确性；R2Adj=0.9539，表示本研究所设计的试验模型可以用来说明95.39%的试验数据，变异系数CV=8.25%，变异系数比较低，表示该模型具有较高的可信度和精确度；此次试验信噪比为14.395>4，表明在精密度试验中该模型精密度良好。综上所述，该模型能较好地反映响应值的变化。
表 5 回归模型方差分析Table 5. Regression model analysis of variance标准值 均值 变异
系数预测
平方和拟合度 矫正
拟合度预测
拟合度信噪比 0.017 0.21 8.25 0.024 0.9798 0.9539 0.7634 14.395 2.3.3 各因素间的交互作用
根据回归方程分析结果，利用DesignExpert 8.0.6软件进行拟合，做响应面曲面图，进一步直观地确认三因素两两交互作用对蛋白得率的影响[27−28]。
对提取时间（A）、提取料液比（B）、提取pH（C）进行两两交互分析，做不同因素间响应面图见图5~图7。曲面越陡，等高线越密集，则影响越显著，等高线越接近椭圆，两个因素的交互作用越强。
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图 5 提取时间和提取料液比对人参醇溶蛋白得率的交互影响Figure 5. Interaction effect of extraction time and extraction stock ratio on the yield of ginseng alcohol-soluble protein![]()
图 7 提取料液比和提取pH对人参醇溶蛋白得率的交互影响Figure 7. Interactive effects of extraction stock ratio and extraction pH on the yield of ginseng alcohol-soluble protein由图5所示，响应面坡度平缓，等高线稀疏，说明提取时间提取料液比的交互作用对人参醇溶蛋白得率的影响较小。
由图6所示，在固定提取料液比、提取时间的情况下，人参醇溶蛋白得率随着提取pH的增加先上升后降低；在固定提取料液比、提取pH的情况下，人参醇溶蛋白得率随着提取时间的增加先上升后降低。响应面坡度陡峭，等高线接近于椭圆形，说明提取时间和提取 pH的交互作用对人参醇溶蛋白得率的影响显著。
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图 6 提取时间和提取pH对人参醇溶蛋白得率的交互影响Figure 6. Interactive effects of extraction time and extraction pH on the yield of ginseng alcohol-soluble protein由图7所示，在固定提取时间、提取pH的情况下，随着提取料液比的增加，人参醇溶蛋白得率呈现升高后降低变化趋势；在固定提取时间、提取料液比的情况下，随着提取时间的增加，人参醇溶蛋白得率呈现升高后降低变化趋势。响应面坡度陡峭，等高线密集，说明提取pH和提取料液比的交互作用对人参醇溶蛋白得率影响显著。
2.3.4 最佳工艺验证性试验
通过Design Expert10.0.3软件预测得到人参醇溶蛋白最佳提取工艺条件为提取时间为2.30 h，提取料液比为1:11.45 g/mL，提取pH7.78是最优的工艺参数。该方法可以使蛋白得率达到0.322%。结合实际操作条件，将人参醇溶蛋白提取工艺调整为提取时间2 h、提取料液比1:10 g/mL、提取pH7。在此试验的基础上，进行三次工艺验证试验，得到人参醇溶蛋白的提取率为0.319%±0.001%，与预期的预测的0.322%相近，表明该数学模型的优化范围达到了预期目的，且具有可靠性和和重现性。通过该试验模型可以有效的获得更多的人参醇溶蛋白[29]。
2.4 人参醇溶蛋白紫外分析
如图8所示，经过紫外最大波长扫描，发现人参醇溶蛋白最大紫外吸收波长为224 nm。在280 nm附近也有微弱的吸收峰，说明人参醇溶蛋白含有一定量的酪氨酸[30]。
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图 8 人参醇溶蛋白紫外全波长扫描Figure 8. UV full wavelength scan of ginseng alcohol soluble protein2.5 傅立叶变换红外吸收光谱（FTIR）检测结果
如图9所示，人参醇溶蛋白在4000~400 cm−1有很多吸收峰，波数3347 cm−1处出现的宽峰是H-O键伸缩振动引起的典型吸收峰，2923 cm−1出现的峰是由-CH2-反对称伸缩振产生的，1652 cm−1处的吸收峰是由蛋白质酰胺I带特征基团R-CO-NH2中-C=O-伸缩振动产生的，1516 cm−1处吸收峰是蛋白质伯胺基团中的-NH面内弯曲振动产生的，1378 cm−1处的吸收峰由蛋白质中游离的COO-对称伸缩振动产生的，1238 cm−1处的吸收峰可能由-C（CH3）3中的C-C反对称伸缩振动产生的，后面出现的721、575、523 cm−1可能是由-OH的存在而引起的[31−33]。
2.6 氨基酸组成成分分析
2.6.1 氨基酸组成混合标准品及样品液相分析
氨基酸混合标准品经PITC衍生化处理后，经高效液相色谱分析，得到的原始数据经过Empower积分标峰，所得的标峰图谱和数据处理积分列表见图10。
供试品水解后的游离氨基酸样品经PITC衍生化处理后，经高效液相色谱分析，得到的原始数据经过Empower积分标峰，所得的标峰图谱和数据处理积分列表见图11。
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图 11 醇溶蛋白氨基酸组成液相色谱图Figure 11. Liquid chromatogram of amino acid composition of alcohol-soluble protein人参醇溶蛋白的氨基酸的组成成分如表6所示，其中人参醇溶蛋白氨基酸总量占82.3%，人体必需氨基酸含量占26.46%，药用氨基酸含量占30.51%。人参醇溶蛋白中同时属于人体必需氨基酸和药用氨基酸的LYS、ILE以及PHE在促进人体生长发育，增强机体免疫力以及抗病毒等方面有较强功效[34]。这些结果表明，人参醇溶蛋白中所含人体必需氨基酸以及药用氨基酸占比较高，在生物医学以及食品工业方面有较强的开发价值。
表 6 人参醇溶蛋白的氨基酸的组成成分Table 6. Composition of amino acids of ginseng alcohol-soluble proteins必需氨基酸种类 所占样品比例 非必需氨基酸种类 所占样品比例 苏氨酸（Thr） 4.37% 天冬氨酸（Asp）* 8.51% 赖氨酸（Lys）* 2.29% 丝氨酸（Ser） 13.07% 缬氨酸（Val） 4.59% 精氨酸（Arg）* 11.27% 异亮氨酸（Ile）* 3.61% 酪氨酸（Tyr） 1.78% 异白氨酸（Leu） 6.77% 谷氨酸（Glu） 9.26% 苯丙氨酸（Phe）* 4.83% 丙氨酸（Ala） 7.61% 脯氨酸（Pro） 4.70% 药用氨基酸含量 30.51% 必需氨基酸含量 26.46% 非必需氨基酸含量 56.20% 注：“*”角标表示即为人体必需氨基酸同时又为药用氨基酸。 2.7 人参醇溶蛋白的扫描电镜分析
如图12所示，不同倍数扫描电镜下人参醇溶性蛋白结构完整，表面稀疏，具有少数孔隙，蛋白质颗粒呈蜂窝聚集状态，具有稳定有序的网状结构，表面有不规则的脊形凸起，该电镜结果与疏水性蛋白结构一致[35]。
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图 12 人参醇溶蛋白1000、500、100倍数下扫描电镜图Figure 12. Scanning electron microscope images of ginseng gliadin at 1000, 500 and 100 times2.8 人参醇溶蛋白不同pH下体外抗氧化活性能力
2.8.1 不同pH人参醇溶蛋白对DPPH自由基的清除能力
图13显示，在人参醇溶蛋白pH为1~7范围内，人参醇溶蛋白对DPPH基自由基的清除率先下降后上升，当pH=1时DPPH基自由基的清除率高达96%，时当pH=5时清除率最低为21%，而后随着pH的升高，人参醇溶蛋白对DPPH自由基的清除率又逐渐升高。与弱碱性条件（pH=9）相比，在较强酸性条件下（pH=1），高静电荷引起的分子内电荷排斥力导致蛋白质分子的肿胀与展开，暴露其疏水基团，从而促进其抗氧化活性[36]。
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图 13 不同pH人参醇溶蛋白对DPPH自由基的清除能力Figure 13. Scavenging ability of DPPH free radicals by ginseng alcohol-soluble protein at different pH2.8.2 羟基自由基清除能力
图14可以看出，在人参醇溶蛋白pH为1~7范围内，人参醇溶蛋白对羟基自由基的清除率逐渐下降，当pH大于5时，清除率又逐渐缓慢上升，但变化不显著。当pH=1时人参醇溶蛋白对羟基自由基的清除率最大，达到79%。这可能是因为随着pH的增加，人参醇溶蛋白的空间构像发生了改变，产生了不同的抗氧化活性。
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图 14 不同pH人参醇溶蛋白对OH自由基的清除能力Figure 14. Scavenging ability of OH radicals by ginseng alcohol-soluble protein at different pH2.8.3 不同pH人参醇溶蛋白对铁离子的还原能力
图15显示，在人参醇溶蛋白pH为1~7范围内，人参醇溶蛋白铁离子的还原能力先迅速下降后逐步上升，当pH为1时还原作用最强，高达0.86，当pH大于5时，换还原力逐渐增加，这可能是碱性pH使疏水性氨基酸残基增多，提高了人参醇溶蛋白对铁离子的还原力[37]。
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图 15 不同pH人参醇溶蛋白对铁离子的还原能力Figure 15. Reduction ability of ginseng alcohol-soluble protein to iron ions at different pH3. 结论
本研究确定人参中醇溶蛋白最佳提取工艺为，提取时间2 h、料液比1:10 g/mL、提取pH7，此工艺下蛋白得率为0.319%。该蛋白分子量约为3.3 kDa，与疏水性蛋白的表面结构特征一致，氨基酸总量为82.3%。当pH=1时，其对DPPH自由基的清除率为96%，对羟基自由基的清除率为79%，对铁离子的还原能力为0.86，本文可为人参醇溶蛋白的开发利用提供数据支持与科学依据，但其发挥抗氧化活性的具体机制尚不明确，需通过体内实验进行深入研究。
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图 1 不同提取溶剂提取人参醇溶蛋白的SDS-SPEAG电泳图
注：1. 50%乙醇；2. 60%乙醇；3. 70%乙醇；4. 80%乙醇；5. 90%乙醇；6. 无水乙醇。
Figure 1. SDS-SPEAG electrophoresis patterns of ginsenoside soluble proteins extracted with different extraction solvents
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图 3 提取料液比对人参醇溶蛋白得率的影响
Figure 3. Influence of extraction material-liquid ratio on the yield of ginseng alcohol-soluble protein
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图 4 提取pH对人参醇溶蛋白得率的影响
Figure 4. Effect of extraction pH on the yield of ginseng alcohol-soluble protein
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图 5 提取时间和提取料液比对人参醇溶蛋白得率的交互影响
Figure 5. Interaction effect of extraction time and extraction stock ratio on the yield of ginseng alcohol-soluble protein
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图 7 提取料液比和提取pH对人参醇溶蛋白得率的交互影响
Figure 7. Interactive effects of extraction stock ratio and extraction pH on the yield of ginseng alcohol-soluble protein
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图 6 提取时间和提取pH对人参醇溶蛋白得率的交互影响
Figure 6. Interactive effects of extraction time and extraction pH on the yield of ginseng alcohol-soluble protein
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图 8 人参醇溶蛋白紫外全波长扫描
Figure 8. UV full wavelength scan of ginseng alcohol soluble protein
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图 11 醇溶蛋白氨基酸组成液相色谱图
Figure 11. Liquid chromatogram of amino acid composition of alcohol-soluble protein
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图 12 人参醇溶蛋白1000、500、100倍数下扫描电镜图
Figure 12. Scanning electron microscope images of ginseng gliadin at 1000, 500 and 100 times
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图 13 不同pH人参醇溶蛋白对DPPH自由基的清除能力
Figure 13. Scavenging ability of DPPH free radicals by ginseng alcohol-soluble protein at different pH
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图 14 不同pH人参醇溶蛋白对OH自由基的清除能力
Figure 14. Scavenging ability of OH radicals by ginseng alcohol-soluble protein at different pH
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图 15 不同pH人参醇溶蛋白对铁离子的还原能力
Figure 15. Reduction ability of ginseng alcohol-soluble protein to iron ions at different pH
表 1 响应面试验的因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiment
水平 因素 A
提取时间（h）B
提取料液比（g/mL）C
提取pH−1 1.5 1:5 5 0 2 1:10 7 1 2.5 1:15 9 
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表 2 高效液相色谱洗脱条件
Table 2 High performance liquid chromatography separation gradients
保留时间（min） 流速（mL/min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0.01 1.0 95.0 5.0 39.00 1.0 52.0 48.0 40.00 1.0 0.0 100.0 45.00 1.0 0.0 100.0 46.00 1.0 95.0 5.0 60.00 1.0 95.0 5.0
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表 3 响应面试验BBD设计与结果
Table 3 Response surface test BBD design and results
实验号 提取时间 提取料液比 提取pH 人参醇溶蛋白得率（%） 1 −1 0 1 0.131±0.008 2 0 0 0 0.285±0.002 3 −1 1 0 0.142±0.004 4 1 1 0 0.256±0.001 5 −1 −1 0 0.125±0.002 6 −1 0 −1 0.140±0.007 7 0 0 0 0.311±0.011 8 0 1 1 0.246±0.002 9 1 0 1 0.277±0.0006 10 0 0 0 0.311±0.002 11 1 −1 0 0.225±0.001 12 0 −1 1 0.172±0..002 13 0 0 0 0.289±0.0006 14 1 0 −1 0.102±0.005 15 0 −1 −1 0.124±0.001 16 0 0 0 0.305±0.006 17 0 1 −1 0.109±0.004
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表 4 响应面试验方差分析
Table 4 Response surface experimental ANOVA
方差分析项 平方和 自由度 均方 F P 模型 0.10 9 0.011 37.82 <0.0001** A提取时间 0.013 1 0.013 43.67 0.0003* B提取料液比 1.431×10−3 1 1.431×10−3 4.82 0.0641 C提取pH 0.015 1 0.015 51.89 0.0002* AB 4.900×10−3 1 4.900×10−3 0.17 0.6966 AC 8.464×10−3 1 8.464×10−3 28.52 0.0011* BC 1.980×10−3 1 1.980×10−3 6.67 0.0363* A2 0.014 1 0.014 45.65 0.0003* B2 0.013 1 0.013 45.25 0.0003* C2 0.028 1 0.028 93.02 <0.0001** 残差 2.078×10−3 7 2.968×10−3 失拟项 1.465×10−3 3 4.883×10−3 3.19 0.1461 纯误差 6.128×10−3 4 1.532×10−3 总和 0.10 16 注：**P<0.0001，差异极显著：*表示P<0.05，差异显著。
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表 5 回归模型方差分析
Table 5 Regression model analysis of variance
标准值 均值 变异
系数预测
平方和拟合度 矫正
拟合度预测
拟合度信噪比 0.017 0.21 8.25 0.024 0.9798 0.9539 0.7634 14.395
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表 6 人参醇溶蛋白的氨基酸的组成成分
Table 6 Composition of amino acids of ginseng alcohol-soluble proteins
必需氨基酸种类 所占样品比例 非必需氨基酸种类 所占样品比例 苏氨酸（Thr） 4.37% 天冬氨酸（Asp）* 8.51% 赖氨酸（Lys）* 2.29% 丝氨酸（Ser） 13.07% 缬氨酸（Val） 4.59% 精氨酸（Arg）* 11.27% 异亮氨酸（Ile）* 3.61% 酪氨酸（Tyr） 1.78% 异白氨酸（Leu） 6.77% 谷氨酸（Glu） 9.26% 苯丙氨酸（Phe）* 4.83% 丙氨酸（Ala） 7.61% 脯氨酸（Pro） 4.70% 药用氨基酸含量 30.51% 必需氨基酸含量 26.46% 非必需氨基酸含量 56.20% 注：“*”角标表示即为人体必需氨基酸同时又为药用氨基酸。
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[1] PATEL S, RAUF A. Adaptogenic herb ginseng (Panax) as medical food:Status quo and future prospects[J]. Biomed Pharmacother,2017,85:120−127. doi: 10.1016/j.biopha.2016.11.112
[2] HUANG J M, LIU D, WANG Y W, et al. Ginseng polysaccharides alter the gut microbiota and kynurenine/tryptophan ratio, potentiating the antitumour effect of antiprogrammed cell death 1/programmed cell death ligand 1 (anti-PD-1/PD-L1) immunotherapy[J]. Gut,2022,71(4):734−745. doi: 10.1136/gutjnl-2020-321031
[3] CAO M, YAN H J, HAN X, et al. Ginseng-derived nanoparticles alter macrophage polarization to inhibit melanoma growth[J]. J Immunother Cancer,2019,7(1):326. doi: 10.1186/s40425-019-0817-4
[4] 谢伟, 刘晓芳, 周鹏, 等. 人参“开心”意涵之探析与新解[J]. 中医药导报,2021,27(5):215−217. [XIE Wei, LIU Xiaofang, ZHOU Peng, et al. Analysis and new interpretation of Renshen (Ginseng) "Kai Xin" meaning[J]. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,2021,27(5):215−217.] XIE Wei, LIU Xiaofang, ZHOU Peng, et al. Analysis and new interpretation of Renshen （Ginseng） "Kai Xin" meaning[J]. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2021, 27（5）: 215−217.
[5] 王瑞, 王键. 新安医家吴楚运用人参特色探析[J]. 中华中医药杂志, 2020, 35(2):833−835. [WANG Rui, WANG Jian. Analysis on the experience of Xin’an doctor Wuchu in applying Ginseng[J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2020, 35(2):833−835.] WANG Rui, WANG Jian. Analysis on the experience of Xin’an doctor Wuchu in applying Ginseng[J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2020, 35（2）: 833−835.
[6] 徐云凤, 赵雨, 幺宝金, 等. 人参蛋白对高脂血症模型大鼠的降血脂作用[J]. 中药新药与临床药理,2011,22(2):138−141. [XU Yunfeng, ZHAO Yu, YAO Baojin, et al. Effect of ginseng protein on decreasing blood lipid in rat models with hyperlipidemia[J]. Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology,2011,22(2):138−141.] XU Yunfeng, ZHAO Yu, YAO Baojin, et al. Effect of ginseng protein on decreasing blood lipid in rat models with hyperlipidemia[J]. Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology, 2011, 22（2）: 138−141.
[7] LI H Y, SONG J, ZHANG J H, et al. Ginseng protein reverses amyloid beta peptide and H2O2 cytotoxicity in neurons, and ameliorates cognitive impairment in AD rats induced by a combination of D-galactose and AlCl3[J]. Phytother Res,2017,31(2):284−295. doi: 10.1002/ptr.5747
[8] LI H Y, KANG T G, QI B, et al. Neuroprotective effects of ginseng protein on PI3K/Akt signaling pathway in the hippocampus of D-galactose/AlCl3 inducing rats model of Alzheimer’s disease[J]. J Ethnopharmacol,2016,179:162−169. doi: 10.1016/j.jep.2015.12.020
[9] 徐云凤, 赵雨, 邢楠楠, 等. 人参蛋白对小鼠抗疲劳作用的研究[J]. 食品工业科技,2011,32(11):406−407,436. [XU Yunfeng, ZHAO Yu, XING Nannan, et al. Study on anti-fatigue effects of ginseng protein on mice[J]. Science and Technology of Food Industry,2011,32(11):406−407,436.] XU Yunfeng, ZHAO Yu, XING Nannan, et al. Study on anti-fatigue effects of ginseng protein on mice[J]. Science and Technology of Food Industry, 2011, 32（11）: 406−407,436.
[10] 李红艳, 赵雨, 孙晓迪, 等. 人参蛋白对小鼠免疫功能影响的研究[J]. 亚太传统医药,2010,60(1):14−16. [LI Hongyan, ZHAO Yu, SUN Xiaodi, et al. Effect of ginseng protein on immune function in mice[J]. Asia-Pacific Traditional Medicine,2010,60(1):14−16.] LI Hongyan, ZHAO Yu, SUN Xiaodi, et al. Effect of ginseng protein on immune function in mice[J]. Asia-Pacific Traditional Medicine, 2010, 60（1）: 14−16.
[11] 任雨贺, 刘淑莹. 人参蛋白质不同提取方法及含量的比较[J]. 安徽农业科学,2018,46(11):1−3,9. [REN Yuhe, LIU Shuying. Comparision on different extraction methods and contents of Panax ginseng protein[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences,2018,46(11):1−3,9.] REN Yuhe, LIU Shuying. Comparision on different extraction methods and contents of Panax ginseng protein[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2018, 46（11）: 1−3,9.
[12] 李红艳, 张江华. 人参总蛋白的酶解及氨基酸含量测定[J]. 中国现代中药,2016,18(1):72−75,81. [LI Hongyan, ZHANG Jianghua. Enzymolysis of ginseng total proteins and determination of amino acid content[J]. Modern Chinese Medicine,2016,18(1):72−75,81.] LI Hongyan, ZHANG Jianghua. Enzymolysis of ginseng total proteins and determination of amino acid content[J]. Modern Chinese Medicine, 2016, 18（1）: 72−75,81.
[13] 董世荣, 玄丽琪, 郭珊珊. 介质极性对柔性玉米醇溶蛋白乳化性的影响[J]. 食品工业科技,2022,43(17):72−77. [DONG Shirong, XUAN Liqi, GUO Shanshan. Effect of solvent polarity on the emulsifying properties of the Flexible Zein[J]. Science and Technology of Food Industry,2022,43(17):72−77.] DONG Shirong, XUAN Liqi, GUO Shanshan. Effect of solvent polarity on the emulsifying properties of the Flexible Zein[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43（17）: 72−77.
[14] 武安琪. 基于苦杏仁醇溶蛋白的降血糖肽饮料制备工艺研究[D]. 乌鲁木齐:新疆农业大学, 2021. [WU Anqi. Preparation of a bitter almond kernel prolamin based hypoglycemic peptide drink[D]. Urumqi:Xinjiang Agricultural University, 2020.] WU Anqi. Preparation of a bitter almond kernel prolamin based hypoglycemic peptide drink[D]. Urumqi: Xinjiang Agricultural University, 2020.
[15] 封杏岚, 黄程青, 徐瀹澄, 等. 白芸豆醇溶蛋白的提取工艺研究[J]. 农产品加工,2019,487(17):30−34. [FENG Xinglan, HUANG Chengqing, XU Yuecheng, et al. Study on the extraction process of prolamin in white kidney bean[J]. Farm Products Processing,2019,487(17):30−34.] FENG Xinglan, HUANG Chengqing, XU Yuecheng, et al. Study on the extraction process of prolamin in white kidney bean[J]. Farm Products Processing, 2019, 487（17）: 30−34.
[16] 宋丹, 马兰, 杨丹. 用盐析法分离蛋白质的影响因素及应用实例[J]. 畜牧兽医科技信息,2013,439(7):33−34. [SONG Dan, MA Lan, YANG Dan. Influencing factors and application examples of protein separation by salting-out method[J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,2013,439(7):33−34.] SONG Dan, MA Lan, YANG Dan. Influencing factors and application examples of protein separation by salting-out method[J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2013, 439（7）: 33−34.
[17] 赵丽明, 郭煦遥, 毛英民, 等. 响应面法优化西洋参果多糖的提取工艺及其体外抗氧化活性[J]. 食品工业科技,2023,44(13):160−166. [ZHAO Liming, GUO Xuyao, MAO Yingmin, et al. Optimization of extraction process and antioxidant activity of polysaccharide from panax quinque folium fruit by response surface methodology[J]. Science and Technology of Food Industry,2023,44(13):160−166.] ZHAO Liming, GUO Xuyao, MAO Yingmin, et al. Optimization of extraction process and antioxidant activity of polysaccharide from panax quinque folium fruit by response surface methodology[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44（13）: 160−166.
[18] QIAN J Y, MA L J, WANG L J, et al. Effect of pulsed electric field on structural properties of protein in solid state[J]. LWT,2016,74:331−337. doi: 10.1016/j.lwt.2016.07.068
[19] 刘兴丽, 沈力, 张艳艳, 等. 紫甘薯花色苷对面筋蛋白结构特性及饺子皮品质的影响[J]. 食品科学,2021,31(23):1−13. [LIU Xingli, SHEN Li, ZHANG Yanyan, et al. Effects of anthocyanins from purple sweet potato on structural properties of wheat gluten proteins and quality of dumpling wrappers[J]. Food Science,2021,31(23):1−13.] doi: 10.7506/spkx1002-6630-20210729-347 LIU Xingli, SHEN Li, ZHANG Yanyan, et al. Effects of anthocyanins from purple sweet potato on structural properties of wheat gluten proteins and quality of dumpling wrappers[J]. Food Science, 2021, 31（23）: 1−13. doi: 10.7506/spkx1002-6630-20210729-347
[20] 朱振宝, 王艳斐, 易建华. 影响蛋白质抗氧化活性的因素[J]. 食品与机械,2016,32(6):1−4,8. [ZHU Zhenbao, WANG Yangfei, YI Jianhua. Factors affecting antioxidant activivites of proteins[J]. Food & Machinery,2016,32(6):1−4,8.] ZHU Zhenbao, WANG Yangfei, YI Jianhua. Factors affecting antioxidant activivites of proteins[J]. Food & Machinery, 2016, 32（6）: 1−4,8.
[21] YAN J M, ZHU L, QU Y H, et al. Analyses of active antioxidant polysaccharides from four edible mushrooms[J]. Int J Biol Macromol,2019,123:945−956. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.11.079
[22] YANG X L, WANG R F, ZHANG S P, et al. Polysaccharides from Panax japonicus C. A. Meyer and their antioxidant activities[J]. Carbohydr Polym,2014,101:386−391. doi: 10.1016/j.carbpol.2013.09.038
[23] NING X, LIU Y, JIA M D, et al. Pectic polysaccharides from Sophorae tonkinensis exhibit significant antioxidant effects[J]. Carbohydr Polym,2021,262:117925. doi: 10.1016/j.carbpol.2021.117925
[24] LIU Y, DU Y Q, WANG J H, et al. Structural analysis and antioxidant activities of polysaccharide isolated from Jinqian mushroom[J]. Int J Biol Macromol,2014,64:63−68. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2013.11.029
[25] 李雪枫, 王坚, 罗瑛, 等. 柱花草叶蛋白提取工艺研究[J]. 安 徽 农 业 科 学,2008(26):11282−11284. [LI Xuefeng, WANG Jian, LUO Ying, et al. Study on extraction technology of protein from sty-losanthes guianensis leaves[J]. Anhui Agricultural Sciences,2008(26):11282−11284.] LI Xuefeng, WANG Jian, LUO Ying, et al. Study on extraction technology of protein from sty-losanthes guianensis leaves[J]. Anhui Agricultural Sciences, 2008（26）: 11282−11284.
[26] 魏雅静, 杨宇, 祝开阳. 平欧榛子分离蛋白提取条件优化[J]. 食品安全导刊,2022(11):70−72. [WEI Y J, YANG Y, ZHU K Y. Optimization of extraction conditions of hazelnut protein isolate in Pingou[J]. Journal of Food Safety,2022(11):70−72.] WEI Y J, YANG Y, ZHU K Y. Optimization of extraction conditions of hazelnut protein isolate in Pingou[J]. Journal of Food Safety, 2022（11）: 70−72.
[27] 谢海荣, 孙永, 李红艳, 等. 响应面法优化提取三叶青叶中总黄酮的两种工艺比较[J]. 中国食品学报,2015,15(11):105−112. [XIE Hairong, SUN Yong, LI Hongyan, et al. Comparison of two kinds of extraction technologies for total flavonoids from tetrastigma hemsleyanum leaves by response surface method[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2015,15(11):105−112.] XIE Hairong, SUN Yong, LI Hongyan, et al. Comparison of two kinds of extraction technologies for total flavonoids from tetrastigma hemsleyanum leaves by response surface method[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2015, 15（11）: 105−112.
[28] 万丹娜, 饶倩如, 俞梦莹, 等. Box-Behnken 设计-响应面法优化山楂的醇沉工艺[J]. 中国药房,2018,29(15):2078−2081. [WAN Danna, RAO Qianru, YU Mengying, et al. Optimization of ethanol precipitation technology of Crataegus pinnatifida by using Box-Behnken design response surface methodology[J]. China Pharmacy,2018,29(15):2078−2081.] WAN Danna, RAO Qianru, YU Mengying, et al. Optimization of ethanol precipitation technology of Crataegus pinnatifida by using Box-Behnken design response surface methodology[J]. China Pharmacy, 2018, 29（15）: 2078−2081.
[29] 张婉迎, 杨俊杰, 杨松, 等. 响应面法优化桑葚水溶性蛋白提取工艺[J]. 食品工业,2018,39(8):128−133. [ZHANG Wanying, YANG Junjie, YANG Song, et al. Optimize the extraction process of mulberry water soluble protein by response surface method[J]. The Food Industry,2018,39(8):128−133.] ZHANG Wanying, YANG Junjie, YANG Song, et al. Optimize the extraction process of mulberry water soluble protein by response surface method[J]. The Food Industry, 2018, 39（8）: 128−133.
[30] 宋乐. 驼掌胶原蛋白的提取及其理化性质研究[D]. 呼和浩特:内蒙古农业大学, 2020. [SONG Le. Study on extraction and physicochemical properties of camel palm collagen[D]. Hohhot:Inner Mongolia Agricultural University, 2020.] SONG Le. Study on extraction and physicochemical properties of camel palm collagen[D]. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2020.
[31] 刘婷婷, 刘阳, 张晶, 等, 分蘖葱头蛋白提取工艺优化及其基础特性[J]. 食品科学, 2018, 39(2):267−272. [LIU Tingting, LIU Yang, ZHANG Jing, et al. Optimization of extraction and characterization of protein from Allium cepa L. var. Agrogatum Don[J]. Food Science, 2018, 39(2):267−272.] LIU Tingting, LIU Yang, ZHANG Jing, et al. Optimization of extraction and characterization of protein from Allium cepa L. var. Agrogatum Don[J]. Food Science, 2018, 39（2）: 267−272.
[32] 王悦. 葛根水溶性总蛋白提取工艺优化、物理化学性质以及其美白机制研究[D]. 长春:长春中医药大学, 2021. [WANG Yue. Study on extraction process optimization, physicochemical properties and whitening mechanism of pueraria water-soluble total protein[D]. Changchun:Changchun University of Chinese Medicine, 2021.] WANG Yue. Study on extraction process optimization, physicochemical properties and whitening mechanism of pueraria water-soluble total protein[D]. Changchun: Changchun University of Chinese Medicine, 2021.
[33] 许彦腾. 黑水虻幼虫蛋白质提取与抗氧化活性及理化特性研究[D]. 咸阳:西北农林科技大学, 2015. [XU Yanteng. Research on exteraction, antioxidat activity and physicochemical property of black soldier fly larva proteins[D]. Xianyang:Northwest A&F University, 2015.] XU Yanteng. Research on exteraction, antioxidat activity and physicochemical property of black soldier fly larva proteins[D]. Xianyang: Northwest A&F University, 2015.
[34] BONGIOANNI A, SOLEDAD B M, ALEJANDRA M B, et al. Amino acids and its pharmaceutical applications:A mini review[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2022:613.
[35] 齐奇. 红松仁中多酚脱除对各组分蛋白结构和性质影响[D]. 哈尔滨:东北林业大学, 2022. [QI Qi. Polyphenol removal from Pinus koraiensis kernel effect on structure and properties of protein components[D]. Harbin:Northeast Forestry University, 2022.] QI Qi. Polyphenol removal from Pinus koraiensis kernel effect on structure and properties of protein components[D]. Harbin: Northeast Forestry University, 2022.
[36] 王璋, 许时婴, 江波, 等. 食品化学[M]. 北京:中国轻工业出版社, 2003. [WANG Zhang, XU Shiying, JIANG Bo, et al. Food chemistry[M]. Beijing:China Light Industry Press, 2003.] WANG Zhang, XU Shiying, JIANG Bo, et al. Food chemistry[M]. Beijing: China Light Industry Press, 2003.
[37] 许英一, 徐艳霞, 王宇, 等. 不同处理条件对燕麦蛋白肽抗氧化活性的影响[J]. 食品工业,2019,40(3):46−49. [XU Yingyi, XU Yanxia, WANG Yu, et al. Effects of different treatment conditions on antioxidant activity of oat protein peptide[J]. The Food Industry,2019,40(3):46−49.] XU Yingyi, XU Yanxia, WANG Yu, et al. Effects of different treatment conditions on antioxidant activity of oat protein peptide[J]. The Food Industry, 2019, 40（3）: 46−49.
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1. 宋露露，李云飞，刘鑫源，徐睿绮，郑郭芳，秦楠. 阿胶中驴血清白蛋白的提取纯化、功能特性及抗氧化活性分析. 食品工业科技. 2024(23): 179-188 . 
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2. 刘贵涛，权煜，饶欢，赵丹丹，赵霞，郝建雄，刘学强. 亚麻籽粕蛋白多肽的制备及其抗氧化性. 食品研究与开发. 2024(24): 84-91 . 百度学术
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