Scutellaria baicalensis Extract Inhibits the UVA-induced Photoaging in NIH3T3 Cells
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摘要: 目的：探究黄芩提取物对紫外线（UVA）诱导的成纤维细胞系（NIH3T3）光老化的保护作用。方法：通过UVA照射建立细胞光老化模型，采用CCK-8检测、β-半乳糖苷酶染色、DAPI染色、免疫荧光染色等技术，探讨黄芩提取物对光老化成纤维细胞的保护作用。结果：黄芩提取物能显著促进NIH3T3的细胞增殖与迁移（P<0.05），提高UVA照射后NIH3T3细胞存活率、降低UVA照射引起的细胞凋亡及衰老相关胞外β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的表达，并促进内源性I型、IV型胶原蛋白再生，逆转UVA照射引起的胶原蛋白流失，多方面共同作用抵御细胞光老化。结论：黄芩提取物能有效抑制因UVA照射引起的NIH3T3细胞光老化。Abstract: Objective: To investigate the protective effect of Scutellaria baicalensis extract on ultraviolet (UVA)-induced photoaging in a fibroblast cell line (NIH3T3). Methods: The cellular photoaging model was established by UVA irradiation, and the protective effects of Scutellaria baicalensis extract on photoaging fibroblasts were investigated using CCK-8 assay, β-galactosidase staining, DAPI staining, and immunofluorescence staining. Results: Scutellaria baicalensis extract significantly promoted cell proliferation and migration of NIH3T3 cells (P<0.05), increased the cell viability of NIH3T3 cells after UVA irradiation, reduced UVA-induced cell apoptosis, and the expression of senescence-associated marker β-galactosidase (SA-β-gal). It also promoted the regeneration of endogenous type I and type IV collagen, reversing collagen loss induced by UVA irradiation, collectively contributing to the defense against cellular photoaging. Conclusion: Scutellaria baicalensis extract effectively inhibits the photoaging of NIH3T3 cells induced by UVA irradiation.
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Keywords:
- Scutellaria baicalensis /
- anti-aging /
- photoaging /
- plant extract
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皮肤是人体最大的器官，除了在维持体内平衡起着至关重要的作用外，还是人体的主要环境屏障。皮肤老化是由内源性老化和外源性老化共同引起的[1]，一般来说，内源性老化是指皮肤的自然老化过程，而外源性老化是由于外部条件造成的衰老[2]。皮肤老化不仅对外观产生负面影响，还可能与各种皮肤病或皮肤肿瘤有关[3]。紫外线是阳光的重要组成部分，它通过与细胞内的发色体和光敏剂相互作用，产生过量的自由基，进而在皮肤细胞中发生严重的氧化应激反应。长期紫外辐照会造成皮肤老化，而皮肤老化主要表现在真皮结构的改变，成纤维细胞是皮肤真皮层中最主要的细胞，与成纤维细胞相关的生物学特性的改变是反应皮肤光损伤和光老化的重要指标[4]。成年后真皮层中成纤维细胞活性逐渐下降，胶原蛋白的总含量也逐年减少，一般婴儿及青年人皮肤中Ⅰ型胶原蛋白含量约占85%，而衰老皮肤中Ⅰ型胶原蛋白的表达量逐年减少，Ⅳ型胶原蛋白在皮肤肌底支撑力方面发挥着主要作用[5]。随着胶原蛋白的不断降解，真皮层厚度也不断降低，从而引起皱纹、松弛等一系列皮肤问题[6]。
成纤维细胞是真皮层中重要的功能细胞，皮肤状态主要受其状态和功能变化的影响，它的老化能直接或间接造成皮肤的老化，因此，研究成纤维细胞的功能在探讨皮肤老化过程中具有重要意义。NIH3T3细胞是由美国国立卫生研究院建立的一株具有成纤维细胞形态和特征的小鼠胚胎成纤维细胞系，目前国内外有许多与皮肤相关的研究均选取了该细胞系[7]，因此，本研究以NIH3T3细胞为研究对象来探讨皮肤细胞衰老的具体表现。
近年来植物提取物以其天然绿色健康的抗衰理念逐渐得到广大消费者的青睐，一些研究表明天然的化学组分也能起到一定的抗氧化作用,例如葡萄种子提取物、盐肤木提取物、枸杞多糖、雪莲多糖等[8]。黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根。其根茎可用于食疗，提取物也具有多种生物活性[9]。黄芩提取物在美白、抗过敏及祛痘抑菌上有明显作用，但在抗皮肤老化方面还尚未有深入研究[10]。黄芩提取物的主要成分有黄芩苷元、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩苷和黄芩新素等，已有研究证实，黄芩苷和汉黄芩素具有较强的吸收紫外线能力[11]，可以清除自由基并抑制黑色素的生成，并保护皮肤细胞不受氧自由基过度氧化[12]。但关于黄芩提取物对UVA照射导致细胞光老化修复作用的研究仍然较缺乏。
为了更全面深入研究黄芩提取物预防光老化的作用，本研究以UVA辐射体外培养的NIH3T3细胞，研究黄芩提取物对UVA诱导NIH3T3细胞光老化的作用，以期为黄芩提取物作为化妆品活性原料在抗衰老的功效上提供一定的理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
NIH3T3细胞 上海中科院；胎牛血清、DMEM培养基、0.25% 胰酶溶液、DMSO、CCK-8试剂盒、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒、DAPI染色液 碧云天生物技术有限公司；唇形科植物中药黄芩根 采收自山西；Col Ⅰ一抗、Col Ⅳ一抗、Alexa Fluor® 594荧光二抗、Alexa Fluor® 488荧光二抗 Abcam公司。
Galaxy S系列二氧化碳培养箱 华粤行仪器有限公司；SW-CT超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；TDZ5-WS台式低速离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；Synergy酶标仪 Thermo；BT25S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Observe5荧光倒置显微镜 Zessis公司；LSM 900激光共聚焦显微镜 卡尔蔡司光学有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黄芩提取物制备
参照文献[13]，粉碎中药材黄芩，过20目筛，加入药材10倍量的60%乙醇回流提取两次，每次2 h，过滤提取液，合并，挥发干净乙醇并浓缩，浓缩液冷冻干燥得到黄芩提取物。以DMEM培养基调至终浓度，黄芩提取物终浓度为10 μg/mL。
1.2.2 黄芩提取物对NIH3T3细胞增殖率的影响
参照文献[14]的实验方法，采用CCK-8法检测黄芩提取物对NIH3T3细胞增殖率的影响。将处于对数生长期的NIH3T3细胞接种于96孔板中，于CO2培养箱中培养24 h，加入不同浓度的黄芩提取物，培养24 h后加入DMEM配制的10% CCK-8试剂，培养箱孵育2 h，在酶标仪450 nm处读取吸光度（OD）值。细胞增殖率计算公式如下：
细胞增殖率(%)=(OD实验组−OD空白组)/OD空白组×100 (1) 1.2.3 细胞划痕实验
参照文献[15]的实验方法，采用细胞划痕实验检测黄芩提取物对NIH3T3细胞迁移能力的影响。将细胞以5×107个/mL接种于六孔板内，细胞长满后用200 μL枪头划线，每孔3个划痕，弃去旧培养基，用PBS清洗三次，实验组加入含黄芩提取物的1%胎牛血清的培养基，空白组加入含1%胎牛血清的培养基，分别在0、6、12、24 h拿到显微镜下拍照，收集图像，使用Image J处理收集到的细胞图像，计算各个时间段细胞的迁移率。细胞迁移率计算公式如下：
细胞迁移率(%)=(A−B)/A×100 (2) 式中：A：初始划痕宽度；B：分别为6、12、24 h后的划痕宽度。
1.2.4 NIH3T3细胞UVA光老化模型的建立
参照文献[14]的实验方法，建立NIH3T3光老化模型。NIH3T3细胞培养于含1%双抗和10%胎牛血清的DMEM培养基中，当细胞生长至对数生长期时，按2×104 个/mL分别接种于35 mm2培养皿和六孔板内，37 ℃，5%CO2培养24 h后照射不同剂量的UVA，使用铝箔纸将UVA紫外线辐照计及细胞均包裹其中，（照射剂量=照射强度×照射时间；照射强度为0.25 J/cm2）对照组不进行照射，照射后用生理盐水清洗一次，加入含1%胎牛血清的DMEM培养，24 h后避光加入10% CCK-8试剂测定细胞存活率。选择细胞存活率为未经UVA照射细胞50%左右的UVA照射剂量进行后续实验。
1.2.5 β-半乳糖苷酶染色
参照文献[16]的实验方法，采用β-半乳糖苷酶染色检测UVA引起NIH3T3细胞衰老的变化情况。将细胞以2×104个/mL接种于六孔板内，对细胞进行UVA照射及黄芩提取物干预后，取出六孔板，用PBS洗涤1次，加入1 mL染色固定液室温固定15 min，吸除固定液，PBS洗涤3次，每次3 min，加入1 mL染色工作液，用保鲜膜封住六孔板，37 ℃孵育过夜后拿至普通光学显微镜下观察并拍照。
1.2.6 DAPI染色
参照文献[17]的实验方法，采用DAPI染色检测UVA及黄芩提取物干预后对NIH3T3细胞凋亡的影响。将细胞接种于12孔板内，经UVA照射及黄芩提取物干预后，4%多聚甲醛固定30 min，弃去固定液，PBS洗一遍，每孔加入DAPI 染色液250 μL，覆盖住细胞样品即可，室温染色5 min后吸弃染色液，再用PBS清洗3次细胞即可避光拿到荧光显微镜下拍照。
1.2.7 免疫荧光染色
参照文献[18]的实验方法，采用免疫荧光染色检测经UVA及黄芩提取物干预后对NIH3T3细胞Col Ⅰ、Col Ⅳ含量的影响。将细胞以2×104个/mL在六孔板内制作细胞爬片，经UVA照射及黄芩提取物干预后取出细胞爬片，弃去原培养基，免疫组化笔画圈，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗5 min，加入1% BSA封闭30 min后加入1% BSA稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，第2 d取出细胞爬片回收一抗，PBS清洗3次，加入对应1% BSA稀释的二抗，37 ℃放置1 h，回收二抗，PBS清洗2次，每次5 min，DAPI染色5 min后用抗荧光淬灭封片剂封片，避光拿到共聚焦显微镜下拍照。
1.3 数据处理
采用Graphpad Prism6进行数据统计分析。组间差异通过t检验进行评估，P<0.05认为具有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 黄芩提取物对NIH3T3细胞增殖的影响
在皮肤中，成纤维细胞可合成胶原蛋白[19]、弹性纤维及补充透明质酸，能填充肌肤老化缝隙，改善皱纹，使皮肤全面年轻化。在衰老进程中，细胞增殖会变得缓慢，衰老细胞也会不断累积进而发生凋亡[20]。因此，首先采用CCK-8法检测黄芩提取物对NIH3T3细胞增殖率的影响。如图1，与Ctrl组相比，不同浓度（1、5、10、20、30 μg/mL）的黄芩提取物作用24 h后，能显著促进NIH3T3细胞增殖（P<0.05），且在10 μg/mL浓度下促进NIH3T3细胞增殖最为明显，因此选取黄芩提取物浓度为10 μg/mL来进行后续各项细胞学研究。
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图 1 CCK-8法检测NIH3T3细胞的细胞增殖率注：*表示与Ctrl组相比，P<0.05。Figure 1. Detection of cell proliferation rate of NIH3T3 cells by CCK-8 assay2.2 黄芩提取物对NIH3T3细胞迁移率的影响
皱纹是皮肤老化过程中的主要表现。细胞向皮肤老化处迁移并分泌皮肤所需的生长因子，增加胶原的形成，能有效减少因皮肤老化而产生的皱纹[21]。如图2所示，细胞划痕实验结果显示，与Ctrl组相比，黄芩提取物作用能促进NIH3T3细胞迁移，且在作用24 h后能显著促进细胞的迁移（P<0.05）。黄芩提取物处理能促进细胞迁移，这有利于细胞往老化皮肤处迁移，并分泌细胞因子刺激胶原形成，减少皱纹以使皮肤恢复年轻化。
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图 2 细胞划痕实验检测黄芩提取物对NIH3T3细胞迁移率的影响注：（A）不同时间细胞迁移图像；（B~D）6、12、24 h的细胞迁移率标尺为100 μm；*表示与Ctrl组相比，P<0.05。Figure 2. Effects of Scutellaria baicalensis extract on the migration rate of NIH3T3 cells detected by cell scratching assay2.3 黄芩提取物对UVA损伤NIH3T3细胞存活率的影响
研究表明，紫外线（UV）辐照是引起皮肤光老化损伤的主要原因，长波紫外线（UVA）和中波紫外线（UVB）可以分别穿透皮肤的真皮层和表皮层，对皮肤结构产生不同程度的损伤[22]。表皮位于皮肤的最外层，受到UVB的照射，皮肤屏障被破坏，易出现红斑、灼热、晒伤、水疱、脱皮等症状[23]。UVA比UVB更具穿透性，能到达真皮层，使皮肤中的胶原蛋白发生变性，减弱皮肤弹性，加速皱纹的形成[24]。在光老化过程中，皮肤真皮层中成纤维细胞是受到紫外线主要影响的细胞，它也是产生衰老表征的主要效应细胞[25]，所以在本实验采用UVA照射成纤维细胞的体外模型来模拟在自然状态下皮肤光老化在细胞水平上的变化。
如图3A所示，经不同剂量UVA（2.5、5、7.5、10、12.5 J/cm²）辐射后，NIH3T3细胞存活率明显降低，与Ctrl组相比具有显著性差异（P<0.05），表明体外NIH3T3细胞光老化模型建立成功。当UVA照射剂量为7.5 J/cm2时，与Ctrl组相比，细胞存活率接近其一半（P<0.01），故选用该照射剂量用于后续实验研究。UVA损伤后，经黄芩提取物作用24 h，细胞存活率明显提高（图3B），且具有统计学意义（P<0.01）。说明黄芩提取物能提高UVA照射后NIH3T3细胞的存活率，对UVA照射引起细胞光老化具有明显的保护作用。
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图 3 黄芩提取物对UVA损伤NIH3T3细胞存活率的影响注：（A）CCK-8法检测UVA对NIH3T3存活率的影响；（B）CCK-8法检测黄芩提取物对UVA引起NIH3T3光老化存活率的影响；*表示与Ctrl组相比，P<0.05；#与UVA组相比，P<0.01。Figure 3. Effects of Scutellaria baicalensis extract on the survival rate of NIH3T3 cells damaged by UVA2.4 黄芩提取物对UVA引起的NIH3T3细胞衰老的影响
衰老细胞内具有高活性的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），经过原位染色，以X-Gal为底物，经β-半乳糖苷酶催化可生成深蓝色产物，即SA-β-gal阳性细胞。采用β-半乳糖苷酶染色检测SA-β-gal阳性细胞，阳性细胞数量增多则说明细胞发生衰老。如图4所示，经UVA照射后，被染成蓝色的SA-β-gal阳性细胞明显增多，而黄芩提取物处理后，衰老细胞数明显减少，说明黄芩提取物能保护NIH3T3细胞免受UVA照射引起的衰老。
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图 4 β-半乳糖苷酶染色检测黄芩提取物对UVA诱导细胞光老化的影响注：标尺为100 μm。Figure 4. Effects of Scutellaria baicalensis extract on UVA-induced cell photoaging detected by β-galactosidase staining2.5 黄芩提取物对UVA诱导NIH3T3细胞凋亡的影响
细胞凋亡是细胞老化过程中常见的生物学现象[26]，为检测老化细胞凋亡的情况，采用DAPI染色液对细胞核进行染色并检测其细胞凋亡率[27]。如图5所示，与Ctrl组相比，UVA照射能明显引起NIH3T3细胞凋亡（P<0.001）,经黄芩提取物处理后，NIH3T3细胞凋亡率明显降低，且具有统计学意义（P<0.01），说明黄芩提取物能保护UVA照射引起的细胞老化及凋亡。
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图 5 DAPI染色检测黄芩提取物对UVA引起细胞凋亡的影响注：红色箭头指示细胞凋亡小体；*表示与Ctrl组相比，P<0.001；#与UVA组相比，P<0.01；标尺为20 μm。Figure 5. Effects of Scutellaria baicalensis extract on UVA-induced apoptosis by DAPI staining2.6 黄芩提取物对UVA引起NIH3T3细胞Ⅰ型胶原蛋白流失的影响
成纤维细胞是皮肤真皮的主要结构成员，可以合成并分泌胶原纤维、弹性纤维及网状纤维，在修复及保持皮肤弹性、合成胶原蛋白方面具有重要的作用[28]。在皮肤老化过程中，皱纹的形成与胶原蛋白的流失密不可分，补充胶原蛋白也是当下抗衰的手段之一[29]，但胶原蛋白的透皮吸收依然是一个难题，通过刺激内源性的胶原合成以逆转皮肤老化成为本研究重点。
Ⅰ型胶原蛋白是皮肤中最主要的胶原蛋白，可使皮肤饱满、紧致和富有弹性[5]。在衰老过程中，成纤维细胞中Ⅰ型胶原蛋白流失严重[30]，采用免疫细胞荧光染色检测细胞中Ⅰ型胶原蛋白的变化。如图6所示，经UVA照射后，细胞Ⅰ型胶原蛋白荧光强度（绿色荧光）明显减弱，经黄芩提取物处理后，细胞Ⅰ型胶原蛋白荧光强度明显增强，说明黄芩提取物能逆转UVA照射引起的胶原蛋白流失的情况。
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图 6 黄芩提取物对UVA引起NIH3T3细胞 Ⅰ 型胶原蛋白流失的影响注：标尺为20 μm。Figure 6. Effects of Scutellaria baicalensis extract on UVA-induced type I collagen loss in NIH3T3 cells2.7 黄芩提取物对UVA引起NIH3T3细胞Ⅳ型胶原蛋白流失的影响
Ⅳ型胶原蛋白是基底膜致密层中含量最丰富的胶原蛋白，在维持皮肤致密性和稳定性上发挥了极大功能，它也是保护衰老皮肤不出现皱纹的主要“功臣”之一[16]。采用免疫细胞荧光实验检测细胞中Ⅳ型胶原蛋白的变化。如图7所示，经UVA照射后，细胞Ⅳ型胶原蛋白荧光强度（红色荧光）明显减弱，经黄芩提取物处理后，Ⅳ型胶原蛋白荧光强度有所回升，说明黄芩提取物能逆转经UVA照射引起的Ⅳ型胶原蛋白流失的情况。
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图 7 黄芩提取物对UVA引起NIH3T3细胞Ⅳ型胶原蛋白流失的影响注：标尺为20 μm。Figure 7. Effects of Scutellaria baicalensis extract on UVA-induced type IV collagen loss in NIH3T3 cells3. 结论
本研究发现黄芩提取物对NIH3T3细胞的增殖和迁移能力有显著促进作用，能减少因UVA辐照造成的细胞凋亡并提高细胞存活率，逆转因UVA引起的细胞老化，刺激细胞内源性胶原蛋白生成。综合来看，黄芩提取物具有保护皮肤、减少紫外光老化损伤的作用，这为后续进一步探索黄芩提取物在抗光老化的机制研究上奠定了基础。
天然植物提取物因其天然来源和毒副作用小的特点，逐渐成为全球化妆品研究领域的关注热点。本研究验证了黄芩提取物具备抵御光老化损伤的能力，这也为黄芩提取物作为主要活性原料来开发抗衰化妆品提供了有力支撑。
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图 1 CCK-8法检测NIH3T3细胞的细胞增殖率
注：*表示与Ctrl组相比，P<0.05。
Figure 1. Detection of cell proliferation rate of NIH3T3 cells by CCK-8 assay
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图 2 细胞划痕实验检测黄芩提取物对NIH3T3细胞迁移率的影响
注：（A）不同时间细胞迁移图像；（B~D）6、12、24 h的细胞迁移率标尺为100 μm；*表示与Ctrl组相比，P<0.05。
Figure 2. Effects of Scutellaria baicalensis extract on the migration rate of NIH3T3 cells detected by cell scratching assay
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图 3 黄芩提取物对UVA损伤NIH3T3细胞存活率的影响
注：（A）CCK-8法检测UVA对NIH3T3存活率的影响；（B）CCK-8法检测黄芩提取物对UVA引起NIH3T3光老化存活率的影响；*表示与Ctrl组相比，P<0.05；#与UVA组相比，P<0.01。
Figure 3. Effects of Scutellaria baicalensis extract on the survival rate of NIH3T3 cells damaged by UVA
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图 4 β-半乳糖苷酶染色检测黄芩提取物对UVA诱导细胞光老化的影响
注：标尺为100 μm。
Figure 4. Effects of Scutellaria baicalensis extract on UVA-induced cell photoaging detected by β-galactosidase staining
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图 5 DAPI染色检测黄芩提取物对UVA引起细胞凋亡的影响
注：红色箭头指示细胞凋亡小体；*表示与Ctrl组相比，P<0.001；#与UVA组相比，P<0.01；标尺为20 μm。
Figure 5. Effects of Scutellaria baicalensis extract on UVA-induced apoptosis by DAPI staining
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图 6 黄芩提取物对UVA引起NIH3T3细胞 Ⅰ 型胶原蛋白流失的影响
注：标尺为20 μm。
Figure 6. Effects of Scutellaria baicalensis extract on UVA-induced type I collagen loss in NIH3T3 cells
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