Research Progress in Metabolic Engineering Strategies for Microbial Synthesis of 2′-Fucosyllactose and 3-Fucosyllactose
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摘要: 人乳寡糖（human milk oligosaccharide，HMOs）是母乳的关键成分，它对婴幼儿健康成长发挥着重要的作用。2′-岩藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2′-FL）和3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）是HMOs的主要组分，具有抑制病原体感染、调节肠道菌群和提高免疫力等功能，其合成方法成为近年内的研究热点。然而，利用化学法或酶法合成2′-FL和3-FL具有反应过程繁琐、成本高以及产物收率低等缺点，无法满足市场的需求，因此，高效的微生物法已被开发应用于2′-FL和3-FL的商业化生产。本文总结2′-FL和3-FL的制备方法，系统阐述微生物法合成2′-FL和3-FL的工程化策略，为后续2′-FL和3-FL的微生物生产提供一定的研究思路。Abstract: Human milk oligosaccharides (HMOs) are key components of breast milk, playing a vital role in fostering the healthy development of infants and young children. Among the main HMOs components, 2′-fucosyllactose (2′-FL) and 3-fucosyllactose (3-FL) exhibit considerable benefits in terms of inhibiting pathogenic infections, regulating gut microbiota, and enhancing immunity. In recent years, the synthesis of 2′-FL and 3-FL has emerged as a prominent area of research in the field. Despite the potential advantages of chemical or enzymatic synthesis of 2′-FL and 3-FL, these methods are hindered by their inherent limitations, including intricate reaction procedures, high costs, and poor yield, which are not conducive to meeting the demand of the market. Therefore, more efficient microbial methods have been developed and applied in the commercial production of 2′-FL and 3-FL. This article systematically outlines the methods for preparing both 2′-FL and 3-FL, thoroughly expounds upon the engineering strategies for microbial synthesis of 2′-FL and 3-FL, and provides a compelling framework for further microbial production exploration of 2′-FL and 3-FL.
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Keywords:
- 2′-fucosyllactose /
- 3-fucosyllactose /
- microbiological method /
- engineering strategy
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人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是一种复合低聚糖，在母乳中以游离形式存在，是母乳中第三大固体成分，具有显著的生物活性，能够有效地提升母乳的营养价值[1]。HMOs被证实具有独特的健康益处，如减少病原体黏附，调节上皮细胞和免疫反应，降低坏死性小肠结肠炎的风险，促进大脑发育和认知等功能[2]。在整个哺乳期，HMOs的浓度不同[3]。研究表明，HMOs在初乳中的浓度最高（平均9~22 g/L），其次是过渡乳（平均8~19 g/L），随着哺乳的进行，成熟乳中的HMOs浓度逐渐下降，从出生一个月内采集的母乳中的6~15 g/L下降到6个月后的4~6 g/L[4]。HMOs还可以保护母乳喂养的婴儿免受微生物感染，喂食配方奶粉（添加特定HMOs）的婴儿表现出一种与纯母乳喂养婴儿更接近的炎性细胞因子模式[5]。因此，在商业婴儿配方奶粉中的补充适量的HMOs对于模仿真正的母乳具有重要意义[6]。
HMOs是由3~6个糖基组成的化合物，其中包括N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）、唾液酸（sialicacid，Sia）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、岩藻糖（fucose，Fuc）以及N-乙酰神经氨酸（CMP-N-acetylneuraminicacid，Neu5Ac）。这五种单糖通过多种结合方式相互组合，形成了超过200种不同的结构[7]。HMOs按照修饰基团的不同可分为 3 类，包括被岩藻糖基修饰的中性HMOs，如2′-岩藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2′-FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose, 3-FL）和二岩藻糖基乳糖（Difucosyllactose，DFL）等，占比35%~50%（图1）；酸性 HMOs，如3′-唾液酸乳糖（3′-Sialyllactose，3′-SL）和6′-唾液酸基乳糖（6′-Sialyllactose，6′-SL），占比12%~14%；以及非岩藻糖基化的中性HMOs，如乳糖-N-四糖（Lacto-N-tetraose，LNT）和乳糖-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose，LNnT），占比42%~55%[8−10]。
鉴于人们愈发认识到HMOs在婴幼儿健康与生长发育中的关键作用，全球范围内对合成人乳寡糖及其活性类似物作为婴幼儿配方奶粉添加剂的研究与商业关注日益浓厚。2′-FL和3-FL是HMOs中最丰富的岩藻糖基化寡糖，它们对婴幼儿的生长发育有益。近年来，通过微生物法、酶法和化学合成法生产2′-FL、3-FL已取得重大技术突破，这给婴儿营养食品行业带来了革命性的变化。美国食品药品管理局、欧盟委员会、澳大利亚和新西兰食品标准局等已经批准在婴儿配方食品中添加2′-FL。2021年12月，欧盟和美国已经分别批准了3-FL等六种母乳寡糖作为新食品原料。2022年4月15日，中国国家食品安全风险评估中心对2′-FL公开征求意见。相信，不久之后在中国2′-FL在食品中添加的法规会有新的进展。
本文总结2′-FL和3-FL的制备方法，系统阐述微生物法合成2′-FL和3-FL的工程化策略，为后续2′-FL和3-FL的微生物生产提供一定的研究思路。
1. 2′-FL和3-FL的合成方法
2′-FL是HMOs的重要组成部分，具有广泛的应用价值。而3-FL与2′-FL的合成方法相似，因此，它们的合成研究可以相互借鉴。研究者们用化学法、酶法和微生物细胞工厂法广泛地研究了2′-FL和3-FL的合成[11]，这几种方法的优缺点具体见表1。
表 1 2′-FL和3-FL的合成方法Table 1. Synthesis methods of 2′-FL and 3-FL1.1 化学法合成2′-FL和3-FL
化学合成法使用乳糖和L-岩藻糖作为原料，分别通过2、3步反应合成乳糖受体和岩藻糖基供体。然后，将这两种物质混合，通过3步反应得到2′-FL混合物。最后，通过脱盐、脱色和提纯等工艺，可以得到纯度更高的2′-FL[12]。
虽然化学合成法在生产效率和产品纯度上都表现出色，但是它的生产流程繁复，反应条件苛刻，产物收率偏低，L-岩藻糖价格不菲，并且经常需要使用有毒有害的试剂，这些都限制了它的广泛应用。
1.2 酶法合成2′-FL和3-FL
酶合成法2′-FL和3-FL是利用多种酶催化底物、供体以及辅助因子转化为目标化合物的特异性反应[13]。虽然酶合成法具有反应条件温和、反应成分相对简单以及易于纯化等优点，但酶法存在底物成本高以及产物的得率不高等问题，目前尚处于实验室规模。
1.2.1 岩藻糖基转移酶合成2′-FL和3-FL
岩藻糖基转移酶（EC2.4.1.-）是糖基转移酶家族，广泛用于复杂糖链表位的糖基化，参与多种生理过程，包括细胞识别、细胞黏附、免疫反应和癌症转移等。到目前为止，已经分离、鉴定了不同类型的岩藻糖基转移酶，并将其应用于制备高附加值的α-岩藻糖基化产物[15]。根据岩藻糖苷的区域特异性和受体类型，岩藻糖基转移酶可划分为五大类：α-1,2，α-1,3，α-1,4，α-1,6和O-岩藻糖基转移酶[16]。其中，α-1,2-岩藻糖基转移酶能够将GDP-L-岩藻糖从供体传递到受体乳糖端，从而产生2′-FL[17]。α-1,3-岩藻糖基转移酶能够以GDP-L-岩藻糖和乳糖为底物，生成3-FL。不同来源的岩藻糖基转移酶在酶学和理化性质等方面存在差异，常见的岩藻糖基转移酶如表2所示。从表2中可看到，目前岩藻糖基转移酶的生物来源较为广泛，其中幽门螺旋杆菌来源的最多。
表 2 岩藻糖基转移酶的各种形式Table 2. Various forms of fucosyltransferase岩藻糖基转移酶 生物来源 酶名称 数据库编号 参考文献 α-1,2-FT Helicobocton Pyloni NCTC364 FucT2 Not reported [15] Escherichia coli O126 WbgL UniProtKB no. A6M9C2 [14] Helicobocton Pyloni HP1 HpFucT GenBank no. WP_026938579.1 [18] Thermosynechococcus elongatus BP-1 TeFucT GenBank no. WP_011056838.1 [18] Helicobocton Pyloni 26695 FutC GenBank no. KY499613.1 [19] Helicobacter mustelae FutL GenBank no. WP_013023529.1 [19] Escherichia coli O126 WbsJ GenBank no. AAO37698.1 [19] Helicobocton Pyloni UA802 FucT2 GenBank no. AF076779.1 [20] Bacillus cereus VD107 FutBc GenBank no. EJR48924.1 [21] Helicobocton Pyloni 11S02629-2 BKHT GenBank no. PAF50342.1 [22] Azospirillum lipoferum SAMT GenBank no. SMH41196.1 [23] α-1,3-FT Helicobocton Pyloni 26695 FutA GenBank no. AAD07447.1 [19] Helicobacter typhlonius FutH GenBank no. WP_052082154.1 [19] Helicobacter hepaticus FutJ GenBank no. WP_011114915.1 [19] Helicobacter hepaticus FutK GenBank no. AAP78373.1 [19] Bacteroides gallinaceum FutM2 GenBank no. WP_204430034.1 [24] Helicobocton Pyloni NCTC11637 FT1 GenBank no. WP_0004874201 [25] 1.2.2 α-L-岩藻糖苷酶合成2′-FL和3-FL
α-L-岩藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）是一类外切糖苷水解酶，能够选择性地水解或转移相应碳水化合物或糖结合物的非还原α-L-岩藻糖基残基[26]。采用α-L-岩藻糖苷酶合成2′-FL的技术[27]，通常以4-硝基苯基-α-L-岩藻糖苷为糖基供体，该酶具有高度的特异性，作用于岩藻糖基化合物的岩藻糖基团，水解得到的岩藻糖分子与乳糖经进一步反应获得2′-FL。
1.3 微生物法合成2′-FL和3-FL
微生物合成法FL有两种合成途径。一种是从头合成途径（De novo pathway），以甘油、葡萄糖或蔗糖作为合成起始底物，在磷酸甘露糖变位酶（ManB）、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶（ManC）、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd）和GDP-L-岩藻糖合成酶（WcaG）的参与下合成GDP-L-岩藻糖，GDP-L-岩藻糖和乳糖在岩藻糖基转移酶作用下生成2′-FL和3-FL[28]。另一种是补救途径（salvage pathway），以L-岩藻糖为起始底物，通过双功能酶L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶（fucosepyrophosphorylase，FKP）合成GDP-L-岩藻糖，再经过岩藻糖基转移酶的作用生成2′-FL和3-FL[29]。
相比于化学法和酶法，微生物具有更快的增殖速度，更容易扩大培养，而且能够使用低成本碳源。因此，微生物法已经成为2′-FL、3-FL及其他HMOs绿色合成的首选方式[30]。表3列出不同的微生物细胞工厂生产2′-FL和3-FL的研究进展。从表3中可看到，近几年，通过细胞工厂生产2′-FL和3-FL的产量得到大幅度提升，其中2′-FL的产量已经达到了112.56 g/L，具有良好的工业应用前景。
表 3 微生物法合成2′-FL和3-FL的研究进展Table 3. Research progress for microbial synthesis of 2′-fucosyllactose and 3-fucosyllactose微生物宿主和
合成途径代谢工程策略 过表达基因与
敲除基因产物 产量（g/L） 得率 年份 参考
文献大肠杆菌 BL21（DE3）
（从头合成途径）筛选α-1，2/3-岩藻糖基转移酶；通过RBS、融合肽和多拷贝基因来增强HpfutC和
HpM 32的活性敲除lacZ，wcaJ，nudD，pfkA和lon基因 2′-FL,3-FL 9.36，6.28（摇瓶发酵）；64.62，40.68
（补料分批发酵）0.65 mol/mol乳糖，
0.65 g/L/h；0.67 mol/mol乳糖，0.41 g/L/h2022 [28] 大肠杆菌 BL21（DE3）
（从头合成途径）通过单拷贝整合额外表达futC，用强组成型启动子（PJ23119）取代manC-manB和gmd-wcaG原启动子 过表达rcsA和rcsB；
敲除lacZ和wcaJ2′-FL 9.06 （摇瓶发酵）；79.23（补料分批发酵） 0.88 mol/mol乳糖，
1.45 g/L/h2022 [31] 大肠杆菌 MG1655
（从头合成途径）进行适应性实验室进化 过表达manA，lacY，glpX和 setA；敲除lacAZ，wcaJ和 nudD 2′-FL 61.06（摇瓶发酵） 1.70 g/L/h 2023 [32] 大肠杆菌 BL21（DE3）
（从头合成途径）从幽门螺旋杆菌sp. 11S02629-2筛选得到高活性的α-1,2-f岩藻糖基转移酶（BKHT） 过表达rcsA和 rcsB；
敲除lacZ和wcaJ2′-FL 11.13（摇瓶发酵）；
94.7（补料分批发酵）0.98 mol/mol乳糖，
1.14 g/L/h2023 [22] 大肠杆菌 BL21（DE3）
（从头合成途径）从脂质体固氮螺菌筛选得到高活性的α-1,2-f岩藻糖基
转移酶（SAMT）过表达rcsA和rcsB；
敲除lacZ和wcaJ2′-FL 8.03（摇瓶发酵）；112.56（补料分批发酵） 0.98 mol/mol乳糖，
1.10 g/L/h2023 [23] 酿酒酵母 W303-1a
（从头合成途径）建立自诱导基因表达系统 过表达Gal4p；敲除gal80 2′-FL,3-FL 3.37，2.36（摇瓶发酵）；32.05，20.91
（补料分批发酵）0.80 mol/mol乳糖，
0.67 g/L/h；0.64 mol/mol乳糖，0.42 g/L/h2022 [33] 枯草芽孢杆菌 168
（从头合成途径）增加辅因子的再生并增强前体的供应 过表达manA和ndk；
敲除yesZ和ganA2′-FL 18.27（摇瓶发酵），88.30（补料分批发酵） 0.61 mol/mol乳糖，
2.18 g/L/h2022 [34] 谷氨酸棒杆菌
（从头合成途径）优化FutC密码子 过表达lacY和lacA 2′-FL 8.10（摇瓶发酵） 0.42 mol/mol乳糖，
0.07 g/L/h2018 [35] 2. 大肠杆菌生物合成2′-FL和3-FL的代谢工程化策略
随着代谢工程的不断发展，人们可以通过构建和调控微生物宿主中的代谢途径，从而产生更多高附加值的产品，为社会发展带来更多的价值。因此，可通过多种策略，如底盘宿主选择、代谢途径构建、途径酶的表达与优化、竞争代谢途径的敲除、辅因子的循环再生、碳源和养分的利用、代谢产物的转运等方式来提升目标产物产量[36−37]。
通过合成生物学和代谢工程技术，已经有五种底盘细胞被用于2′-FL和3-FL的生物合成，它们分别是大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌。其中酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌在微生物学中一般被认为是安全的（generally recognized as safe，GRAS）[38]。虽然GRAS微生物宿主具备生产安全性的优点，但它们的生产效率往往不及大肠杆菌，这是因为大肠杆菌的生长周期短、菌株构建简单、成本低廉，使得大肠杆菌生产效率更高。图2为大肠杆菌中合成2′-FL和3-FL的工程途径。
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图 2 在大肠杆菌中2′-FL和3-FL的生物合成途径Figure 2. Biosynthetic pathways of 2′-FL and 3-FL in E. coli2.1 模块化代谢工程策略
微生物代谢工厂合成目标化合物时，常常需要共同表达多个关键酶。由于中间产物的大量积聚，会给上游酶带来反馈性的抑制，从而加剧细胞的代谢负担，阻碍微生物的生长，进而影响最终产品的合成[39]。采用模块化代谢工程策略，将合成途径划分为多个模块，对每个模块进行精细的调控，可以有效地解决代谢流平衡问题[28]。
Li等[20]利用组合模块化策略，将2′-FL合成途径分为GDP-L-岩藻糖合成模块、乳糖岩藻糖基化模块，通过不同拷贝数的组合优化，在转录水平上微调基因表达水平，将代谢流合理引向2′-FL代谢途径，获得了14.1 g/L的2′-FL。Li等[40]将2′-FL分为GDP-L-岩藻糖合成模块、乳糖岩藻糖基化模块、辅因子再生模块，通过不同的质粒组合来平衡合成途径，获得了22.3 g/L的2′-FL。Chen等[24]将3-FL代谢通路的关键酶分为两个代谢模块，以质粒拷贝数的变化调节内源酶（ManB、ManC、Gmd和WcaG）和异源酶（FutM2）的基因表达强度，获得了20.3 g/L的3-FL。模块化代谢工程策略表明将代谢通路按照不同的功能、分支等因素分为不同的代谢模块，就代谢通路而言，每个模块又相互作用，从而实现代谢途径的调控，以此实现细胞内的代谢平衡，2′-FL和3-FL产量也会随之提高。
2.2 岩藻糖基转移酶筛选与优化策略
岩藻糖基转移酶能够以GDP-L-岩藻糖和乳糖为底物合成2′-FL和3-FL，是2′-FL和3-FL合成的关键限制因素之一。但是岩藻糖基转移酶存在异源表达量低、催化活性差等缺陷，阻碍了2′-FL和3-FL的合成。
2.2.1 异源表达量的筛选与优化
来源于微生物的α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶的活性仅为一般代谢酶活性的1%，且α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶的溶解性较差。因此，筛选高活性的α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶，提高α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶的溶解度，是合成2′-FL和3-FL过程中的重要手段。Huang等[19]针对酶源进行了挖掘与筛选分析，比较了各种外源α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶候选菌株，发现幽门螺杆菌来源的FutC和FutA产生的2′-FL和3-FL产量最高。据报道，大多数已鉴定的α-1,2-岩藻糖基转移酶很难在大肠杆菌中功能表达，导致形成包涵体。与某些标签融合表达可显著提高其可溶性表达，如SUMOstar[41]、TrxA[42]、pelB[28]等。此外，Lee等[43]发现降低启动子强度可能会提高α-1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌中的溶解度，用Trc启动子替换T7启动子后，α-1,2-岩藻糖基转移酶在菌株中的表达显著提高了2′-FL产量和产量。Li等[28]设计了多水平的组合策略（包括RBS、融合肽和多拷贝基因筛选）来改善岩藻糖基转移酶应用的技术瓶颈，其中中等表达强度的RBS（BBa_B0034）更适合α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶的翻译水平和蛋白表达，mRNA水平分别是对照组的3.48倍和4.54倍。这表明，可以通过筛选异源表达量高的岩藻糖基转移酶、探索更多的融合标签、筛选适当强度的表达元件等方式来提高宿主体内岩藻糖基转移酶的表达量。
2.2.2 催化活性的筛选与优化
大部分α-1,2-岩藻糖基转移酶会催化产生副产物DFL以及3-FL[44]。为获得其他高活力的α-1,2-岩藻糖基转移酶，Zhu等[22]从Helicobacter sp. 11S02629-2中筛选出一种新的具有活性的α-1,2岩藻糖基转移酶（BKHT），不产生副产物DFL和3-FL。获得了94.7 g/L的2′-FL，乳糖产量0.98 mol/mol，产糖量1.14 g/L/h。此外，Chen等[23]从Azospirillum lipoferum筛选出一种新的具有活性的α-1,2岩藻糖基转移酶（SAMT），将其插入到工程菌的染色体中，基于SAMT的菌株只产生2′-FL，没有其他副产物，获得112.56 g/L的2′-FL，乳糖产量0.98 mol/mol，产糖量1.10 g/L/h，具有较强的工业化生产潜力。这表明，通过筛选新的岩藻糖基转移酶，催化时减少或不产生副产物的生成，能够明显提高目的产物的产量。
2.2.3 其他方面的筛选与优化
在对岩藻糖基转移酶的分子改造报道中，通过系统的截断和延伸，α-1,3-岩藻糖基转移酶的C端工程导致3-FL合成增加了10~20倍[25]。Liu等[45]为了提高α-1,2-岩藻糖基转移酶的底物选择性和底物耐受性，采用了计算机辅助设计和筛选与生化实验相结合的半理性操作，突变体的催化效率比野生型提高了100倍。Park等[46]通过对保守氨基酸序列的家族多序列分析和蛋白质-配体底物对接分析，找到4个突变位点（F40S/Q150H/C151R/Q239S），这些突变位点可以提高FutC的溶解性和活性，并且四个组合突变使2′-FL产量提高了2.4倍。
2.3 中间体GDP-L-岩藻糖的积累策略
GDP-L-岩藻糖是代谢工程生产2′-FL和3-FL的岩藻糖基供体。GDP-L-岩藻糖的从头合成和补救合成已分别或联合用于2′-FL和3-FL的生产。
在从头合成途径中，可以调控合成GDP-L-岩藻糖的相关基因表达来增加FL的产量，如manB、manC、gmd、wcaG、 rcsA 以及 rcsB[19]。另外一种是敲除参与 GDP-L-岩藻糖代谢的相关基因，如参与克拉酸合成的基因wcaJ，抑制 GDP-L-岩藻糖进一步合成克拉酸[20]。RcsA和RcsB作为调节因子，对温度变化非常敏感，它的降解受到ATP的影响，因此，当ATP的浓度下降时，RcsA和RcsB的活性会受到影响，从而导致GDP-L-岩藻糖的供应量减少[19]。此外，还需要考虑前体GDP-甘露糖代谢竞争途径的相关酶GDP-甘露糖甘露醇水解酶（NudD）和GDP-甘露糖水解酶（NudK）。在Ni等[47]的研究中，与对照菌株相比，缺失nudD可以提高工程菌中2′-FL的产量；然而，nudK的缺失并没有表现出积极的效果，甚至减少了2′-FL的产量。而在Li等[28]的研究中，nudD和nudK的缺失都能够提高工程菌中2′-FL的产量。
在补救合成途径中，Wan等[48]敲除以L-岩藻糖为直接底物的两种酶—L-岩藻糖异构酶（FucK）和L-岩藻糖激酶（FucI）的酶基因，以提高2′-FL生物合成前体的利用率，最终菌株的补料分批发酵产胞外2′-FL为30.5 g/L，产糖量为0.661 mol/mol岩藻糖，产率为0.48 g/L/h。此外，L-鼠李糖异构酶（RhaA）和D-阿拉伯糖异构酶（AraA）参与催化L-岩藻糖的异构化，工程菌中araA和rhaA基因的双敲除使2′-FL的产糖量由0.36 mol/mol岩藻糖提高到0.52 mol/mol岩藻糖，从而使2′-FL的浓度由23.1 g/L达到47.0 g/L[49]。因此敲除araA、rhaA也是提高GDP-L-岩藻糖产量的有效策略。
2.4 底物乳糖的摄取与利用策略
乳糖作为生产2′-FL和3-FL的岩藻糖受体底物，需确保细胞内具备充足数量以满足2′-FL和3-FL的合成需求。相关研究表明，乳糖可以在β-半乳糖苷酶（LacZ）的作用下被水解成葡萄糖和半乳糖。由于乳糖的2′-FL和3-FL产量（分别为0.026 mol/mol和0.046 mol/mol）明显低于理论产量（1 mol/mol），大部分乳糖显然被用于细胞生长，而不是2′-FL和3-FL的生产[19]。
Chin等[50]通过敲除底盘细胞中编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ，发现细胞生长受到的影响几乎可以忽略不计，而且这种方法可以有效地提高乳糖在目标产物合成中的利用率，从而将代谢流引向目标代谢产物，进而提升2′-FL和3-FL的产量。此外，β-半乳糖苷透性酶（LacY）是一种跨膜蛋白，负责乳糖的跨细胞膜运输[28]。可以通过过表达或增加基因拷贝数等方式来增强LacY的表达，提高乳糖在细胞内的利用率，从而促进2′-FL和3-FL的生物合成[20]。乳糖抑制因子（LacI）的缺失能够解除LacY的抑制。因此，敲除LacI后，LacY将更多的乳糖运输到细胞内，用于2′-FL的合成[42]。
2.5 辅因子循环体系构建策略
在微生物细胞生产2′-FL和3-FL中，存在两种关键辅因子，一种是鸟苷-5′-三磷酸（GTP），作为生物合成GDP-L-岩藻糖的关键辅因子，它既是GDP的供体，也是能源物质；另一种是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），它可以参与多种代谢反应，包括磷酸戊糖途径（PPP途径）、三羧酸循环途径（TCA循环）以及脱氢酶系统，为生物体提供氢原子，促进生物体的生长发育。
两种从头合成途径的酶（ManC、WcaG）都需要GTP和NADPH的参与，而补救途径的酶（FKP）也需要GTP的参与才能正常催化。Huang等[19]选择8个NADPH再生的相关基因进行优化，构建了22株单基因或联合表达这些基因的菌株。结果显示大多数工程菌对FL的产量都有促进作用，其中分别导入编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（zwf）和嘧啶核苷酸转氢酶（pntAB）的效果最好。在另一项研究中，Li等[40]选择了9个与GTP和NADPH再生相关的基因进行表达，其中共表达zwf和肌苷鸟苷激酶（gsK）的工程菌对2′-FL的产量有最大的促进作用。
2.6 自组装途径酶的空间组织策略
自组装途径酶的空间组织策略作为一种有效的合成生物学和蛋白质工程策略，通过构建具有明确结构的多酶复合体，可以建立底物通道，促进活性残基之间的中间转移，控制代谢流量，减少中间扩散，从而提高产物产率[51]。Wan等[48]将一对来自cAMP 依赖蛋白激酶（PKA）的RIDD和来自A激酶锚定蛋白（AKAPs）的RIAD多肽引入2′-FL补救合成途径中的两个关键酶FutC和FKP，构建了一个控制代谢通量的自组装复合体，在工程大肠杆菌中实现了体内高效的2′-FL生物合成。此外，该课题组将短肽相互作用对Riad-RIDD引入2′-FL从头合成途径自组装成酶复合体，并引入另一个正交的蛋白质相互作用基序（Spycatcher-SpyTag或PDZ-PDZlig）进一步聚集成多酶组件。胞内多酶组合显著增加了通向2′-FL生物合成的通量，与表达自由漂浮酶和未组装酶的菌株相比，2′-FL产量增加了2.1倍[52]。这表明，通过构建多酶复合体，能够控制代谢流量，增加了通向2′-FL和3-FL生物合成的通量。
2.7 敲除竞争代谢途径策略
根据代谢通量分析，关键中间体果糖-6-磷酸（Fru-6-P）、GDP-D-甘露糖、GDP-L-岩藻糖以及乳糖的分枝代谢可能阻碍2′-FL和3-FL的生物合成和积累。为了最大限度地增加流向FL合成途径的碳流，Li等[28]通过CRISPR/Cas9系统分别敲除由ATP依赖的磷酸果糖激酶（由pfkA和pfkB编码）的Fru-6-P到Fru-1,6-P分支途径、由果糖-6-磷酸缩醛酶（由fsaA和fsaB编码）的Fru-6-P到甘油醛-3-P分支途径以及由甘露醇-1-磷酸脱氢酶（由mtlD编码）的Fru-6-P转化为甘露醇-1-P，与未敲除的菌株相比，2′-FL和3-FL的产量得到了明显提升。
大肠杆菌在发酵过程中会产生乙酸酯以及糖酵解副产物，这不仅对细胞生长有毒性，而且与2′-FL合成竞争碳源，降低2′-FL的产量，同时也不利于后续的分离纯化。Liao等[53]通过敲除arcA（厌氧氧化还原控制因子）和iclR（编码乙醛酸操纵子阻遏蛋白）来调节乙酸代谢，arcA突变体显著减少了乙酸的积累。然而，iclR的敲除和双敲除突变体对2′-FL的生物合成毫无益处。一方面，iclR突变体的最大DCW增加了6.2%，这可能影响了细胞的生理和代谢；另一方面，iclR的缺失可能会促进细胞的生长，而不是促进2′-FL的生物合成，但其分子机制尚不完全清楚。另有一项研究表明，糖酵解副产物的积累不仅对细胞生长有害，而且与乳糖和GDP-L岩藻糖的合成竞争碳源[54]。在这项研究中，通过敲除调节参与副产物途径的四种基因，包括用于将乙酰辅酶A转化为乙酸酯的泛醌依赖的丙酮酸脱氢酶（PoxB）和乙酸激酶-磷酸乙酰转移酶（ackA-pta）、用于将丙酮酸转化为甲酸盐的丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）以及用于将丙酮酸转化为乳酸的D-乳酸脱氢酶（LdhA），进一步实现了工程大肠杆菌中2′-FL和3-FL的高效生产。
2.8 菌种改良的组合策略
迄今为止，多数研究中所述的大肠杆菌中合成FL的生物合成途径，主要是通过在质粒上过度表达相关基因来实现的[55]。然而，基于质粒的细胞工厂在发酵过程中存在质粒丢失的问题，并且需要添加抗生素和诱导剂。因此，不含抗生素和诱导剂的生物合成途径更具有工业应用价值。
Parschat等[56]在大肠杆菌构建了一条蔗糖利用途径，筛选出一个能够将UDP-半乳糖和葡萄糖高效转化为乳糖的β-1,4-半乳糖基转移酶（GalTpm1141）。然后，将途径酶基因、蔗糖利用基因簇（cscABKR）、GalTpm1141和UDP-半乳糖强化基因（pgi、pgm和galE）通过染色体整合到大肠杆菌中，实现了从廉价碳源蔗糖合成2′-FL的新途径，2′-FL产量达到64 g/L。另外，Li等[54]在大肠杆菌BL21（DE3）的染色体上引入了2′-FL和3-FL的从头合成途径，引入乳糖合成途径，并对关键酶启动子的替换，在无抗生素的补料分批发酵中产生40.44 g/L的2′-FL和30.42 g/L的3-FL。
表达载体质粒与染色体组合的方式也是一种提高FL产量的可行策略。Liu等[31]首先通过质粒表达系统构建2′-FL的从头合成途径，随后将额外的α-1,2-岩藻糖基转移酶（WbgL）表达盒通过染色体整合到recA基因座上，以加强岩藻糖化反应，并使用一个强的组成型启动子（PJ23119）来取代manC-manB和gmd-wcaG的原始启动子，在摇瓶发酵和补料分批发酵培养中，2′-FL产量分别达到9.06 g/L和79.23 g/L。这表明不含抗生素和诱导剂的染色体整合策略可作为构建代谢工程菌的外源基因表达的一种绿色、安全和商业可行的生产策略。
2.9 适应性实验室进化策略
通过非理性适应性实验室进化，有助于构建高水平的2′-FL和3-FL生产工厂。Sun等[32]对2′-FL工程菌进行了适应性实验室进化，首先通过紫外诱变获得3个突变体文库，然后转移到24深孔板中富集有益突变体，随机挑取大的菌落对其生长状况和2′-FL产量进行测试，并通过基因组测序进行分析，获得了一个rpoC基因突变，可提高细胞耐受性和2′-FL的产量，最高可达61.06±1.93 g/L，生产强度为1.7 g/L/h。因此，通过非理性适应性实验室进化，筛选有益突变体也是很重要的。
3. 其他宿主合成2′-FL和3-FL的工程化策略
目前，2′-FL和3-FL的生物合成主要以大肠杆菌作为底盘宿主，但是由于大肠杆菌细胞含内毒素[57]，且易被噬菌体感染[58]，所以其作为食品的生产菌株存在一定的风险。因此食品级微生物宿主具有更大的发展前景。
3.1 工程酵母菌株生物合成2′-FL和3-FL
近年来，一些酵母菌已被广泛认为是生产化学品的成熟和优越的生物生产平台，其中包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。在酿酒酵母和解脂耶氏酵母的细胞质中存在相对丰富的GDP-甘露糖[59]，这是从头合成途径中合成GDP-L-岩藻糖的必要前体，而且酿酒酵母和解脂耶氏酵母无法分解乳糖，这减少了FL合成途径中的乳糖损耗。Hollands等[41]在酿酒酵母和解脂耶氏酵母中构建了2′-FL的从头合成途径，通过安装乳糖转运体Lac12（来源Kluyveromyces lactis）和将GDP-甘露糖转化为GDP-岩藻糖的酶（Gmd和WcaG），最后引入FucT2以及分泌2′-FL的转运体CDT2（来源于Neurospora crassa），工程酿酒酵母和解脂酵母分别通过补料分批培养产生15和24 g/L的2′-FL。
当酿酒酵母以葡萄糖作为碳源时，会表现出葡萄糖效应，其特征是抑制呼吸和促进乙醇的产生。因此，当葡萄糖被用作生产2′-FL的底物时，葡萄糖的过度代谢而产生的副产物（乙醇）的积累会阻碍2′-FL的高效生产。Lee等[60]构建了一个利用木糖生产2′-FL的工程酵母菌株，将编码2′-FL生物合成酶的异源基因整合到工程酵母染色体中，以实现基因的稳定表达，并对工程酵母中整合的外源基因的拷贝数进行了优化，得到2′-FL产量为25.5 g/L，生产率为0.35 g/L∙h。
Xu等[21]在酿酒酵母中构建了一个生产2′-FL的微生物细胞工厂，通过促进GDP-L-岩藻糖的从头合成，并筛选多个α-1,2-岩藻糖基转移酶，发现表达来源于蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的α-1,2-岩藻糖基转移酶的FutBc所提升的2′-FL最显著，是常用的幽门螺杆菌α-1,2-岩藻糖基转移酶（FutC）的1.8倍。此外，在GDP-甘露糖转移到GDP-L-岩藻糖的生产预计会干扰酿酒酵母正常的细胞功能，包括细胞壁的生物合成，从而影响细胞生长。为了提高酿酒酵母中FL的产量，细胞生长和高效的GDP-L-岩藻糖生物合成之间的平衡应该得到最好的保证。该课题组通过重新连接酿酒酵母信息素反应途径开发了一个自动诱导的基因表达系统。在交配型“a”酵母中表达了低亲和力的乳酸克鲁维酵母的α信息素（Kα）代替天然的酿酒酵母的α信息素（Sα）。在信息素响应型α启动子（Pfus1）的控制下，转录激活子Gal4p进一步增强了Kα诱导的途径基因的表达，增加了GDP-L-岩藻糖的积累，进一步分批补料发酵，2′-FL和3-FL的产量达到32.05 g/L和20.91 g/L[33]。同时，这也是3-FL在食品级微生物宿主的首次报道。
3.2 工程枯草芽孢杆菌生物合成2′-FL
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种具有GRAS性质的革兰氏阳性菌，其生长、繁殖速度较快，且具有较高的分泌和生产重组蛋白的能力，在代谢工程和合成生物学中具有重要的工业应用价值。
Ji等[61]在枯草芽孢杆菌中构建了2′-FL的从头合成途径，通过在枯草杆菌164T7P的基因组中构建了一条从头途径，从而获得了低产量的2′-FL（120 mg/L），随后引入外源乳糖透性酶（LacY）和阻断乳糖降解来提高底物供应大大提高了生产效率，2′-FL的累积产量达到31.2 g/L。Zhang等[34]通过在枯草杆菌引入了2′-FL的从头合成途径，使2′-FL的产量达到1.12 g/L，然后通过减少竞争乳糖消耗、增加GTP的再生和增加前体甘露糖-6-磷酸（M6P）的供应，获得了2.57 g/L的2′-FL产量。随后，通过优化碳源比例，添加20 g/L的乳糖和80 g/L的蔗糖时摇瓶发酵产量达到了14.29 g/L。最后用启动子P7取代内源manA基因的天然启动子，摇瓶中2′-FL产量可达18.27 g/L。最终工程菌在3-L生物反应器中不添加抗生素和化学诱导剂，2′-FL产量为88.3 g/L。
动态调控是微生物细胞工厂基因表达控制的有效策略。Yu等[62]开发了一个途径无关的可编程系统，使枯草杆菌代谢的多模块有序控制成为可能。首先，制造了一系列温度传感器，并对其进行了设计，以扩大它们的阈值。在此基础上，设计了基于不同过渡点温度传感器的单输入多输出顺序控制电路。同时，结合基于CRISPRi的非门电路，构建了抑制电路。作为概念验证，将这些遗传电路应用2-FL生物合成，并将其分为3个模块：2′-FL合成模块、GTP供给模块、竞争途径模块，以此实现多模块的有序控制，在摇瓶中的产量为1.84 g/L，是亲本菌株的5.16倍。在5-L生物反应器中，2-FL产量达到28.2 g/L。
3.3 工程谷氨酸棒状杆菌生物合成2′-FL
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种革兰氏阳性菌，有着优良的氨基酸生物合成和分泌能力。Seo等[35]首次报道了在谷氨酸棒杆菌中通过从头合成途径生产2′-FL，随后在此基础引入乳糖透过酶基因lacY，并进一步对fucT2进行密码子优化后，再以葡萄糖为碳源分批补料培养120 h后，发酵产物2′-FL产量为8.1 g/L，乳糖得率为0.42 mol/mol。
4. 结论与展望
在微生物法合成方面，目前研究主要集中在应用代谢工程策略合成。尽管合成生物学和代谢工程的发展促进了建造细胞工厂和进一步高效地生产2′-FL和3-FL的各种策略，但2′-FL和3-FL的生物合成还需要更系统的策略。为了构建高效生产2′-FL和3-FL的工程菌株，应加强供体的GDP-L-岩藻糖的供应，提高乳糖转运和可利用性，筛选并提高岩藻糖基转移酶的功能表达以及促进2′-FL和3-FL外排等。
此外，基于代谢工程的微生物法生产2′-FL和3-FL可能由于前体底物和辅因子的供应不平衡或细胞生长与2′-FL和3-FL合成之间的不平衡而产生不平衡的细胞代谢网络。动态调控是微生物细胞工厂基因表达控制的一种策略，也是代谢工程优化的最有效策略之一。因此，通过动态调控设计的基因编码代谢控制系统，能够促进宿主根据内部和外部代谢状态自主平衡代谢通量，以最大限度地提高宿主生产力和产量。
未来，更多的生物工程技术，包括蛋白质工程、代谢工程、发酵工程将被应用到2′-FL和3-FL合成的研究中，不仅可以进一步提高生产率，降低生产成本，而且可以建立一些通用的策略，指导其他HMOs的大规模生产。
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图 2 在大肠杆菌中2′-FL和3-FL的生物合成途径
Figure 2. Biosynthetic pathways of 2′-FL and 3-FL in E. coli
表 2 岩藻糖基转移酶的各种形式
Table 2 Various forms of fucosyltransferase
岩藻糖基转移酶 生物来源 酶名称 数据库编号 参考文献 α-1,2-FT Helicobocton Pyloni NCTC364 FucT2 Not reported [15] Escherichia coli O126 WbgL UniProtKB no. A6M9C2 [14] Helicobocton Pyloni HP1 HpFucT GenBank no. WP_026938579.1 [18] Thermosynechococcus elongatus BP-1 TeFucT GenBank no. WP_011056838.1 [18] Helicobocton Pyloni 26695 FutC GenBank no. KY499613.1 [19] Helicobacter mustelae FutL GenBank no. WP_013023529.1 [19] Escherichia coli O126 WbsJ GenBank no. AAO37698.1 [19] Helicobocton Pyloni UA802 FucT2 GenBank no. AF076779.1 [20] Bacillus cereus VD107 FutBc GenBank no. EJR48924.1 [21] Helicobocton Pyloni 11S02629-2 BKHT GenBank no. PAF50342.1 [22] Azospirillum lipoferum SAMT GenBank no. SMH41196.1 [23] α-1,3-FT Helicobocton Pyloni 26695 FutA GenBank no. AAD07447.1 [19] Helicobacter typhlonius FutH GenBank no. WP_052082154.1 [19] Helicobacter hepaticus FutJ GenBank no. WP_011114915.1 [19] Helicobacter hepaticus FutK GenBank no. AAP78373.1 [19] Bacteroides gallinaceum FutM2 GenBank no. WP_204430034.1 [24] Helicobocton Pyloni NCTC11637 FT1 GenBank no. WP_0004874201 [25] 
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表 3 微生物法合成2′-FL和3-FL的研究进展
Table 3 Research progress for microbial synthesis of 2′-fucosyllactose and 3-fucosyllactose
微生物宿主和
合成途径代谢工程策略 过表达基因与
敲除基因产物 产量（g/L） 得率 年份 参考
文献大肠杆菌 BL21（DE3）
（从头合成途径）筛选α-1，2/3-岩藻糖基转移酶；通过RBS、融合肽和多拷贝基因来增强HpfutC和
HpM 32的活性敲除lacZ，wcaJ，nudD，pfkA和lon基因 2′-FL,3-FL 9.36，6.28（摇瓶发酵）；64.62，40.68
（补料分批发酵）0.65 mol/mol乳糖，
0.65 g/L/h；0.67 mol/mol乳糖，0.41 g/L/h2022 [28] 大肠杆菌 BL21（DE3）
（从头合成途径）通过单拷贝整合额外表达futC，用强组成型启动子（PJ23119）取代manC-manB和gmd-wcaG原启动子 过表达rcsA和rcsB；
敲除lacZ和wcaJ2′-FL 9.06 （摇瓶发酵）；79.23（补料分批发酵） 0.88 mol/mol乳糖，
1.45 g/L/h2022 [31] 大肠杆菌 MG1655
（从头合成途径）进行适应性实验室进化 过表达manA，lacY，glpX和 setA；敲除lacAZ，wcaJ和 nudD 2′-FL 61.06（摇瓶发酵） 1.70 g/L/h 2023 [32] 大肠杆菌 BL21（DE3）
（从头合成途径）从幽门螺旋杆菌sp. 11S02629-2筛选得到高活性的α-1,2-f岩藻糖基转移酶（BKHT） 过表达rcsA和 rcsB；
敲除lacZ和wcaJ2′-FL 11.13（摇瓶发酵）；
94.7（补料分批发酵）0.98 mol/mol乳糖，
1.14 g/L/h2023 [22] 大肠杆菌 BL21（DE3）
（从头合成途径）从脂质体固氮螺菌筛选得到高活性的α-1,2-f岩藻糖基
转移酶（SAMT）过表达rcsA和rcsB；
敲除lacZ和wcaJ2′-FL 8.03（摇瓶发酵）；112.56（补料分批发酵） 0.98 mol/mol乳糖，
1.10 g/L/h2023 [23] 酿酒酵母 W303-1a
（从头合成途径）建立自诱导基因表达系统 过表达Gal4p；敲除gal80 2′-FL,3-FL 3.37，2.36（摇瓶发酵）；32.05，20.91
（补料分批发酵）0.80 mol/mol乳糖，
0.67 g/L/h；0.64 mol/mol乳糖，0.42 g/L/h2022 [33] 枯草芽孢杆菌 168
（从头合成途径）增加辅因子的再生并增强前体的供应 过表达manA和ndk；
敲除yesZ和ganA2′-FL 18.27（摇瓶发酵），88.30（补料分批发酵） 0.61 mol/mol乳糖，
2.18 g/L/h2022 [34] 谷氨酸棒杆菌
（从头合成途径）优化FutC密码子 过表达lacY和lacA 2′-FL 8.10（摇瓶发酵） 0.42 mol/mol乳糖，
0.07 g/L/h2018 [35]
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