Study on Preparation and Stability of Anthocyanin Micelles from Lonicera edulis Pomace
-
摘要: 为增强花色苷的稳定性，拓宽其在食品保健以及医药领域的应用，以羧甲基壳聚糖（CMCS）、L-组氨酸（L-His）和硬脂酸（SA）为载体材料，蓝靛果果渣花色苷为芯材，采用响应面法优化酸响应性蓝靛果果渣花色苷胶束的制备工艺，通过在光照、温度、pH等不同条件下蓝靛果果渣花色苷的稳定性以及其对肝癌细胞杀伤性进行评价。结果表明：经响应面优化的最佳制备工艺为水浴时间10 min，超声时间15 min，超声温度60 ℃，包封率为85.3%±0.31%。储存稳定性分析表明在各种温度、pH、光照、氧化剂、还原剂的条件下，载花色苷胶束中花色苷的保存率分别是花色苷的1.33、1.26、1.16、1.11、2.41倍；在体外肝癌细胞杀伤实验中，在24 h后，载花色苷胶束对肝癌细胞抑制率是花色苷的1.34倍。本研究合成了一种新型的两亲性羧甲基壳聚糖衍生物，可以显著提高花色苷稳定性，适宜作为花色苷以及其他食品活性成分的潜在纳米胶束载体。Abstract: In order to enhance the stability of anthocyanins and broaden its application in the fields of food health care and medicine, carboxymethyl chitosan (CMCS), L-histidine (L-His) and stearic acid (SA) were used as carrier materials, and Lonicera edulis pomace anthocyanins were used as core materials. The preparation process of acid-responsive Lonicera edulis pomace anthocyanins micelles was optimized by response surface method. The stability of Lonicera edulis pomace anthocyanins under different conditions such as light, temperature and pH and their cytotoxicity to liver cancer cells were evaluated. The results showed that the optimal preparation process was as follows: Water bath time 10 min, ultrasonic time 15 min, ultrasonic temperature 60 °C, and the encapsulation efficiency was 85.3%±0.31%. The storage stability analysis showed that under various conditions of temperature, pH, light, oxidant and reducing agent, the preservation rate of anthocyanins in the micelles were 1.33, 1.26, 1.16, 1.11 and 2.41 times that of anthocyanins, respectively. In the in vitro liver cancer cell killing experiment, after 24 h, the inhibition rate of anthocyanin-loaded micelles on liver cancer cells was 1.34 times that of anthocyanin. In this study, a novel amphiphilic carboxymethyl chitosan derivative was synthesized, which could significantly improve the stability of anthocyanins and was suitable as a potential nanomicelle carrier for anthocyanins and other food active ingredients.
-
Keywords:
- Lonicera edulis /
- anthocyanin /
- polymer micelle /
- stability /
- response surface optimization
-
蓝靛果（Lonicera caerulea L. var. edulis）又名蓝果忍冬、山茄子、黑瞎子果等，属忍冬科、忍冬属、忍冬亚属，被称为“新兴的第三代小浆果之王”[1]。蓝靛果具有多种生物活性物质，包括花色苷[2]、多酚类[3]、黄酮类[4]、维生素、氨基酸、矿物质[5]等。蓝靛果的营养价值[6−8]研究始于20世纪80年代，研究表明其果实中含有丰富的花色苷。
作为一种水溶性色素，花色苷还具有抗肿瘤[9−10]、抗氧化[11]、抑菌[12]等多种生理活性。但花色苷易受光照、温度、pH等因素的影响[13]，稳定性较差，限制了其在食品保健以及医药领域的应用[14]。纳米胶束作为药物的载体[15]，能够提高花色苷稳定性[16]，并通过EPR（Enhanced permeability and retention effect）效应提高抗肿瘤效果[17]。
壳聚糖是一种阳离子多糖，以它为药物递送载体的材料，易于被细胞内吞。同时，壳聚糖能通过活化免疫系统促进人体抗肿瘤作用[18]，可与抗肿瘤药发挥协同效果[19]。而将壳聚糖改造后的衍生物拥有着更好的溶解性、生物相容性和稳定性。羧甲基壳聚糖是一种重要的水溶性壳聚糖衍生物，具备良好的生物相容性和生物降解性，相较于壳聚糖而言，羧甲基壳聚糖还具有良好的抗菌性以及水溶性等诸多生理活性和功能特性[20]。Jiang等[21]研究设计了pH以及缺氧敏感性对硝基氯甲酸芐酯（NBCF）-羧甲基壳聚糖胶束，该胶束可以缓解肿瘤中HIF-1α和PD-L1的过表达，还可以与H2O2通过Feton反应释放活性氧，诱导肿瘤细胞毒性。Yan等[22]制备了一种负载阿霉素（DOX）和脱镁叶绿素A（PHA）的氧化还原反应胶束，通过甘草次酸和聚合物胶束的电荷转换特性延长其在肿瘤部位的停留时间，为图像引导的癌症治疗提供了新的思路。
本研究从蓝靛果果渣中提取、纯化花色苷并通过合成一种新型的组氨酸-硬脂酸-羧甲基壳聚糖（His-SA-CMCS）两亲性纳米胶束载体，以期提高花色苷稳定性及抗肿瘤效果，使果渣废物利用，为后续蓝靛果食药用价值以及纳米载体的研究提供了一定的基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
蓝靛果果渣 黑龙江省勃利县野生蓝靛果基地提供；肝癌细胞HepG2 上海中科院细胞库；硬脂酸（SA）、L-组氨酸（L-His）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、碳二亚胺盐酸盐（EDC）（上述药品均为国产分析纯）、羧甲基壳聚糖（CMCS）（分子量240 kDa，脱乙酰度>90%，取代度90%） 上海麦克林生化科技股份有限公司；DMEM培养基 美国Hyclone公司。
KQ-100DE型数控超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；BCM-1000型生物净化工作台 上海玻璃仪器厂；imark-1681130酶标仪 美国Biorad公司；DU530紫外-可见分光光度计 美国Beckman公司；Thermo-3111CO2培养箱 美国Thermo公司；DP10型倒置显微镜 日本Olympus公司；DDS-11A电导率仪 上海越平科学仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 蓝靛果果渣花色苷的提取、纯化
将冷冻的蓝靛果果渣解冻后，粉碎，称取匀浆80 g，参考张聪等[23]方法，进行一定调整，采用料液比1:10，乙醇浓度85%，超声时间40 min，进行超声辅助提取。重复浸提3次，合并抽滤后的提取液，为花色苷粗提液，随后用聚酰胺树脂进行纯化。
1.2.2 花色苷提取量的测定
采用pH示差法[24]，配制pH1.0和pH4.5的缓冲液，分别取1 mL经稀释后的花色苷提取液加入缓冲液中，室温黑暗条件下混匀静置20 min后，分别测定在510和700 nm处的吸光值，并按如下公式（1）计算含量：
花色苷含量(g/100g)=A×Mw×DF×Vε×L×m (1) 式中：A：pH1.0条件下510 nm与700 nm吸光度之差减去pH4.5条件下510 nm与700 nm吸光度之差；Mw：矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔质量，449.2 g/mol；DF：稀释倍数；V：提取液总体积，mL；ε：矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900 L·mol/cm；m：称取的蓝靛果质量，g；L：比色皿的光距长度，1 cm。
1.2.3 负载花色苷胶束的制备
1.2.3.1 His-CMCS的制备
将100 mg羧甲基壳聚糖溶于15 mL去离子水中，加入14.3 mg N-羟基琥珀酰亚胺和49.4 mg碳二亚胺盐酸盐，搅拌1 h后，再向其中加入14.3 mg L-His，30 ℃条件下，搅拌24 h，随后将样品装入透析袋（截留分子量大于3500 Da）用去离子水透析24 h，所得产物进行真空干燥[25]。
1.2.3.2 His-SA-CMCS的制备
将真空干燥后的His-CMCS样品100 mg溶于20 mL二甲基亚砜为溶液A，将284.5 mg的硬脂酸溶于5 mL二甲基亚砜中，随后加入206.3 mg的N,N'-二环己基碳二亚胺和146.6 mg 4-二甲氨基吡啶，搅拌2 h后所得溶液为溶液B。将溶液B加入到溶液A中，室温搅拌24 h，随后将样品装入透析袋（截留分子量3500 Da），用去离子水透析24 h。透析后的样品用乙酸乙酯萃取3次，然后用旋转蒸发仪除去多余的乙酸乙酯，所得产物进行真空干燥。
1.2.3.3 负载花色苷胶束的制备
将His-SA-CMCS溶解在甲醇/二氯甲烷（v/v 2:1）的混合溶液中，将混合物装入圆底烧瓶内，用旋转蒸发仪形成均匀的薄膜，然后放置在通风橱内干燥1 h，随后将用磷酸缓冲盐溶液（PBS）溶解的1 mg/mL的花色苷溶液加入到圆底烧瓶中，60 ℃水浴震荡水化、超声后，将样品过0.45和0.22 μm水系滤膜两次后，即可得到负载花色苷的胶束[26]。
1.2.3.4 花色苷标准曲线的绘制
精确称量纯化后的花色苷溶解在PBS中配制成1 mg/mL溶液，用PBS分别稀释成1 mg/mL、500、250、125、62.5 μg/mL的溶液，以PBS为对照，在520 nm处测定吸光值，得到回归方程：Y=0.001494X+0.05313，决定系数R2=0.9991，表明花色苷在62.5 μg/mL~1 mg/mL的浓度范围内，花色苷的浓度与吸光度具有良好的线性关系。
1.2.4 负载花色苷胶束制备的单因素实验
选取水浴时间（5、10、15、20、25 min），超声时间15 min，超声温度60 ℃；超声时间（5、10、15、20、25 min），水浴时间10 min，超声温度60 ℃；超声温度（50、55、60、65、70 ℃），水浴时间10 min，超声时间15 min；对负载花色苷胶束的包封率进行研究，包封率测定方法为紫外分光光度法[27]。具体计算公式如下：
包封率(%)=载药NPs中花色苷量花色苷投入量×100 (2) 1.2.5 响应面试验
在单因素实验结果的基础上，使用Box-Behnken软件设计响应面试验。将水浴时间（A）、超声时间（B）、超声温度（C）对胶束制备工艺的参数进行优化，每组试验重复3次，响应值为负载花色苷胶束包封率的平均值。响应面设计因素水平见表1。
表 1 Box-Behnkens设计因素水平表Table 1. Box-Behnkens design factor level table因素 编码 水平 水浴时间（min） A 5 10 15 超声时间（min） B 10 15 20 超声温度（℃） C 55 60 65 1.2.6 负载花色苷胶束的体外释放
称量两份制备好的载花色苷胶束1 mL，分别与1 mL pH5.0和1 mL pH7.4的PBS缓冲液混合后装入透析袋（3500 Da）内，然后在15 mL pH5.0和pH7.4的PBS缓冲液内透析并振荡，在预先设计的每个时间点内，吸取3 mL释放液测定其在520 nm处的吸光值，对照花色苷标准曲线，计算释放量，然后补入相同体积和pH的PBS缓冲液，绘制释放曲线[28]。
1.2.7 临界胶束浓度（CMC）的测定
由于羧甲基壳聚糖在溶液中是带正电荷的多聚电解质，因此采用电导率法测定临界胶束浓度，配制不同浓度薄膜分散法制备的His-SA-CMCS空白胶束溶液，室温下用电导率仪测定其电导率并记录[29]。
1.2.8 花色苷稳定性的测定
1.2.8.1 光照对花色苷稳定性的影响
用薄膜分散法制备载花色苷胶束，将花色苷溶解于PBS中，浓度与负载花色苷胶束浓度相同，分别设置避光组和不避光组，每天采用公式（3）测定花色苷含量，共5 d。
花色苷保存率(%)=CtC0×100 (3) 式中：C0为样品起始花色苷含量，μg/mL；Ct为处理后t时花色苷含量，μg/mL。
1.2.8.2 温度对花色苷稳定性的影响
用薄膜分散法制备载花色苷胶束，将花色苷溶解于PBS中，浓度与负载花色苷胶束浓度相同，在黑暗条件下，将样品置于40、50、60、70、80 ℃下水浴4 h，每小时测定花色苷含量[30]。
1.2.8.3 pH对花色苷稳定性的影响
用薄膜分散法制备载花色苷胶束，将花色苷溶解于PBS中，浓度与负载花色苷胶束浓度相同，在黑暗条件下，用1 mol/L盐酸将样品pH分别调为2、4、6、8、10，在室温条件下，每小时测定花色苷含量。
1.2.8.4 氧化剂对花色苷稳定性的影响
用薄膜分散法制备载花色苷胶束，将花色苷溶解于PBS中，浓度与负载花色苷胶束浓度相同，分别向花色苷和载花色苷胶束中加入1% H2O2在黑暗条件下，每15 min测定花色苷含量[31]。
1.2.8.5 还原剂对花色苷稳定性的影响
用薄膜分散法制备载花色苷胶束，将花色苷溶解于PBS中，浓度与负载花色苷胶束浓度相同，分别向花色苷和载花色苷胶束中加入0.1% Na2SO3，每2 h测定花色苷含量。
1.2.9 负载花色苷胶束抗肺癌活性的研究
肝癌HepG2细胞用DMEM培养基培养到对数期后，用移液枪将细胞接种到96孔板内，每孔的细胞密度为104个/mL，然后放在培养箱内，37 ℃，5%的CO2条件下培养24 h后去掉上清液。将用薄膜分散法制备的载花色苷胶束、纯化后的花色苷和DOX用PBS配制成1 mg/mL的溶液过0.22 μm滤膜，然后分别用培养基稀释成50、100、200、400、800 μg/mL的溶液，空白组为只含培养基的肝癌HepG2细胞，药物对照组为10 μg/mL的DOX，每组各重复3次，在37 ℃，5%的CO2条件下培养24 h，每孔加入10 μL的刃天青钠盐，最后用酶标仪测定在570 nm处的吸光值。
细胞抑制率(%)=(1−OD样品−OD调零OD对照−OD调零)×100 (4) 式中：OD样品为样品组在570 nm处的吸光值；OD调零为不含细胞只含DMEM培养基在570 nm处的吸光值。
1.3 数据处理
所有试验均重复三次，实验数据均以平均值±标准差（means±SD）表示，利用t检验检测各组之间的差异显著性；当P<0.05时即认为数据之间有显著性差异，当P<0.01时即认为数据之间有极显著性差异，使用GraphPad Prism 8.3.0进行回归分析，使用GraphPad Prism 8.3.0及Origin 2022对数据分析和作图。
2. 结果与分析
2.1 蓝靛果果渣花色苷提取物中花色苷含量测定
按照公式（1），通过紫外分光光度计测量510 nm和700 nm处的吸光值，计算出花色苷粗提物中的含量为0.942±0.031 g/100 g，纯化后花色苷的含量为4.702±0.037 g/100 g。
2.2 负载花色苷胶束制备的单因素实验
由图1a可知，水浴时间10 min前，包封率呈上升趋势，在10 min后，包封率逐渐下降；由图1b可知，超声时间在5和25 min时包封率相对较低。由图1c可知，超声温度在50~60 ℃时，包封率随着温度的升高而升高，在60 ℃后，包封率逐渐降低；因此，最佳负载花色苷胶束的制备工艺为水浴时间5~15 min、超声时间10~20 min、超声温度55~65 ℃，并选取以上条件进行响应面优化试验。
2.3 响应面优化花色苷胶束制备工艺
为了确定花色苷胶束薄膜分散法制备的各因素的最佳工艺参数，通过Design Expert 10.0.7设计响应面优化试验，响应值为花色苷胶束包封率的平均值，共17组实验，结果见表2。
表 2 响应面分析试验方案及试验结果Table 2. Response surface analysis test scheme and test results实验号 A B C 包封率（%） 1 −1 −1 0 53.48 2 1 −1 0 55.78 3 −1 1 0 59.16 4 1 1 0 58.15 5 −1 0 −1 65.18 6 1 0 −1 66.18 7 −1 0 1 58.48 8 1 0 1 59.21 9 0 −1 −1 68.12 10 0 1 −1 61.35 11 0 −1 1 58.56 12 0 1 1 68.56 13 0 0 0 82.00 14 0 0 0 83.56 15 0 0 0 85.24 16 0 0 0 85.30 17 0 0 0 82.10 2.3.1 回归模型的建立及方差分析
通过Box-Behnken设计响应面优化试验，选择最优的花色苷胶束的制备工艺。使用Design Expert 10.0.7软件对试验结果进行回归拟合，花色苷胶束包封率对水浴时间（A）、超声时间（B）、超声温度（C）的回归模型方程为：
包封率(%)=83.64+0.3775A+1.41B−2C−0.8257AB−0.0675AC+4.19BC−14.44A2−12.56B2−6.94C2，R2= 0.9859，对其二次回归方程的分析及显著性结果见表3。
表 3 Box-Behnken试验设计及回归分析结果Table 3. Box-Behnken experiment design and regression analysis results方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P值 显著性 模型 2050.41 9 227.82 54.37 <0.0001 ** A 1.14 1 1.14 0.2721 0.618 B 15.9 1 15.9 3.8 0.092 C 32.08 1 32.08 7.66 0.027 * AB 2.74 1 2.74 0.6537 0.445 AC 0.0182 1 0.0182 0.0043 0.949 BC 70.31 1 70.31 16.78 0.004 ** A2 878.1 1 878.1 209.58 <0.0001 ** B2 663.83 1 663.83 158.44 <0.0001 ** C2 202.58 1 202.58 48.35 0.0002 ** 残差 29.33 7 4.19 失拟项 18.95 3 6.32 2.43 0.25 纯误差 10.38 4 2.6 总离差 2079.74 16 注：*表示差异显著（P<0.05）； **表示差异极显著（P<0.01）。 从表3可知，采用Design Expert 10.0.7软件所建立的数据模型结果的P<0.0001，说明所建立的模型显著性较好，从失拟项的P值为0.25>0.05，结果表明本响应面试验的数据模型拟合度较好，可用于负载蓝靛果果渣花色苷的制备。
2.3.2 响应曲面分析及优化
图2说明水浴时间、超声时间和超声温度与响应值蓝靛果花色苷包封率之间的关系。使用Design Expert 10.0.7软件绘制响应面三维曲面图，从图中可以看出每个因素的最佳制备参数及每个参数之间的相互关系，各因素对花色苷胶束的包封率影响程度为：超声温度（C）>超声时间（B）>水浴时间（A）。
![]()
图 2 因素A和B，A和C，B和C响应面分析和等高线图Figure 2. Factors A and B, A and C, B and C response surface analysis and contour map2.3.3 Box-Behnken回归模型验证
在使用Box-Behnken响应面设计和Design Expert 10.0.7软件数据分析后，得出负载蓝靛果果渣花色苷胶束制备的最佳工艺参数：水浴时间为10.061 min，超声时间15.165 min，超声温度59.329 ℃，在此条件下，通过薄膜分散法制备的胶束的包封率为83.8%。实际工艺条件为：水浴时间10 min，超声时间15 min，超声温度60 ℃，在此工艺条件下，制备的花色苷胶束的包封率为85.3%±0.31%，与响应面模型的预测值相吻合。
2.4 His-SA-CMCS空白胶束和负载花色苷胶束的表征
2.4.1 临界胶束浓度（CMC）的测定
通过电导率仪对不同浓度的His-SA-CMCS胶束溶液的电导率进行测定，以电导率σ和浓度C作图，拟合得到两个回归方程σ=0.01210C+10.87和σ=0.002333C+11.55（图3），交点所对应的浓度69.62 μg·mL−1为临界胶束浓度，易形成胶束。
2.4.2 载花色苷胶束的不同pH条件下的体外释放率
如图4所示，在pH5.0条件下24 h后，载花色苷胶束的释放液中花色苷释放率达到80.53 %，但在pH7.4条件下，载花色苷胶束的释放率较低，释放速度较为缓慢。由此可见本研究制备的胶束缓释作用较好，持续释放时间长。
![]()
图 4 不同pH条件下载花色苷胶束的体外释药动力曲线Figure 4. In vitro release kinetics of anthocyanin micelles at different pH2.4.3 花色苷和载花色苷胶束稳定性研究
如图5所示，图5a~图5e为花色苷和载花色苷胶束在不同温度下1、2、3、4、5 h花色苷的保存率，随着温度和时间的变化，花色苷保存率不断降低，在70 ℃加热5 h后，胶束中花色苷保存率比花色苷保存率高25.6%，花色苷胶束较花色苷的保存率为极显著（P<0.01）；如图6~图7所示，在pH、光照、氧化剂和还原剂条件下的实验结果表明，花色苷保存率随着时间的变化逐渐降低；如图7a所示，在室温光照条件下，5 d后，载花色苷胶束比花色苷保存率高9.29%，花色苷胶束较花色苷的保存率为极显著（P<0.01）；如图7c所示，在室温条件经氧化剂处理45 min后，花色苷保存率差值最大，载花色苷胶束比花色苷保存率高12.31%，花色苷胶束较花色苷的保存率存在显著性差异（P<0.05）；如图7d所示，在室温条件经还原剂处理9 h后，保存率差值最大，载花色苷胶束比花色苷保存率高38.45%，花色苷胶束较花色苷的保存率为极显著（P<0.01）。以上结果说明载花色苷胶束因其特殊的“核-壳”结构，能够使花色苷稳定性显著增加。
![]()
![]()
图 6 载花色苷胶束和花色苷在pH2~10条件下1 h（a）、2 h（b）、3 h（c）、4 h（d）的花色苷保存率Figure 6. Anthocyanin-loaded micelles and anthocyanin preservation rate of 1 h (a), 2 h (b), 3 h (c), 4 h (d) under pH2~10 conditions![]()
图 7 载花色苷胶束和花色苷在光照（a）、黑暗（b）、1% H2O2（c）和0.1% Na2SO2（d）处理下花色苷保存率Figure 7. Preservation rate of anthocyanin loaded micelles and anthocyanin under light (a), dark (b), 1% H2O2 (c)and 0.1% Na2SO3 (d)2.5 负载花色苷胶束对肝癌HepG2细胞的杀伤效果
在上药24 h后，负载花色苷胶束和花色苷对肝癌细胞的杀伤效果如图8所示，负载花色苷胶束在800 μg/mL浓度时对肝癌细胞抑制率为55.98%±1.46%，IC50为696.5 μg/mL；同浓度花色苷对肝癌细胞的抑制率为50.76%±0.67%，IC50为1078 μg/mL。相对于花色苷而言，负载花色苷胶束对肝癌细胞有着更好的杀伤效果，并且随着浓度的增加杀伤效果也随之增加。
![]()
图 8 载花色苷胶束和花色苷对肝癌HepG2细胞杀伤Figure 8. Killing effect of anthocyanin loaded micelles and anthocyanins on HepG2 cells3. 结论
本研究采用超声辅助提取法和聚酰胺树脂层析法对蓝靛果果渣中的花色苷进行提取和纯化，纯化后花色苷含量为4.702±0.037 g/100 g。在薄膜分散法制备载花色苷胶束单因素实验的基础上，使用响应面优化确定水浴时间为10 min，超声时间15 min，超声温度60 ℃为负载花色苷胶束的最优制备工艺，在此工艺下制备的载花色苷胶束包封率为85.3%±0.31%。本研究得到的花色苷纯度较高，制备的负载花色苷胶束具有较高的包封率，从药物释放率结果中可以得出，该聚合物胶束在酸性环境下释放率比中性环境下释放的更快，具有pH响应性，因此可以靶向肿瘤微环境，并在肿瘤微环境下释放更多的花色苷。从在不同条件下对花色苷和载花色苷胶束稳定性的研究结果中可以得出蓝靛果花色苷共聚物胶束的保存率更好，具有更高的稳定性。并且，载花色苷胶束相较于花色苷而言，具有更好的抗肝癌效果，对蓝靛果的药用价值发掘及研究具有重要意义。
-
![]()
图 2 因素A和B，A和C，B和C响应面分析和等高线图
Figure 2. Factors A and B, A and C, B and C response surface analysis and contour map
![]()
图 4 不同pH条件下载花色苷胶束的体外释药动力曲线
Figure 4. In vitro release kinetics of anthocyanin micelles at different pH
![]()
![]()
图 6 载花色苷胶束和花色苷在pH2~10条件下1 h（a）、2 h（b）、3 h（c）、4 h（d）的花色苷保存率
Figure 6. Anthocyanin-loaded micelles and anthocyanin preservation rate of 1 h (a), 2 h (b), 3 h (c), 4 h (d) under pH2~10 conditions
![]()
图 7 载花色苷胶束和花色苷在光照（a）、黑暗（b）、1% H2O2（c）和0.1% Na2SO2（d）处理下花色苷保存率
Figure 7. Preservation rate of anthocyanin loaded micelles and anthocyanin under light (a), dark (b), 1% H2O2 (c)and 0.1% Na2SO3 (d)
![]()
图 8 载花色苷胶束和花色苷对肝癌HepG2细胞杀伤
Figure 8. Killing effect of anthocyanin loaded micelles and anthocyanins on HepG2 cells
表 1 Box-Behnkens设计因素水平表
Table 1 Box-Behnkens design factor level table
因素 编码 水平 水浴时间（min） A 5 10 15 超声时间（min） B 10 15 20 超声温度（℃） C 55 60 65 
下载: 导出CSV
表 2 响应面分析试验方案及试验结果
Table 2 Response surface analysis test scheme and test results
实验号 A B C 包封率（%） 1 −1 −1 0 53.48 2 1 −1 0 55.78 3 −1 1 0 59.16 4 1 1 0 58.15 5 −1 0 −1 65.18 6 1 0 −1 66.18 7 −1 0 1 58.48 8 1 0 1 59.21 9 0 −1 −1 68.12 10 0 1 −1 61.35 11 0 −1 1 58.56 12 0 1 1 68.56 13 0 0 0 82.00 14 0 0 0 83.56 15 0 0 0 85.24 16 0 0 0 85.30 17 0 0 0 82.10
下载: 导出CSV
表 3 Box-Behnken试验设计及回归分析结果
Table 3 Box-Behnken experiment design and regression analysis results
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P值 显著性 模型 2050.41 9 227.82 54.37 <0.0001 ** A 1.14 1 1.14 0.2721 0.618 B 15.9 1 15.9 3.8 0.092 C 32.08 1 32.08 7.66 0.027 * AB 2.74 1 2.74 0.6537 0.445 AC 0.0182 1 0.0182 0.0043 0.949 BC 70.31 1 70.31 16.78 0.004 ** A2 878.1 1 878.1 209.58 <0.0001 ** B2 663.83 1 663.83 158.44 <0.0001 ** C2 202.58 1 202.58 48.35 0.0002 ** 残差 29.33 7 4.19 失拟项 18.95 3 6.32 2.43 0.25 纯误差 10.38 4 2.6 总离差 2079.74 16 注：*表示差异显著（P<0.05）； **表示差异极显著（P<0.01）。
下载: 导出CSV
-
[1] XIA T Z, SU S, GUO K L, et al. Characterization of key aroma-active compounds in blue honeysuckle ( Lonicera caerulea L.) berries by sensory-directed analysis[J]. Food Chemistry,2023,429:136821. doi: 10.1016/j.foodchem.2023.136821
[2] 刘英, 秦程玉, 吴嘉仪, 等. 三种形态蓝靛果花色苷的提取工艺及其抗氧化活性研[J/OL]. 食品与发酵工业:1−9[2023-03-31]. [LIU Y, QIN C Y, WU J Y, et al. Study on the extraction process and antioxidant activity of anthocyanins from three forms of Lonicera edulis[J/OL]. Food and Fermentation Industry:1−9[2023-03-31]. LIU Y, QIN C Y, WU J Y, et al. Study on the extraction process and antioxidant activity of anthocyanins from three forms of Lonicera edulis[J/OL]. Food and Fermentation Industry: 1−9[2023-03-31].
[3] 朱力国, 郭阳, 唐思媛, 等. 不同品种蓝靛果化学成分及抗氧化活性比较[J]. 中国酿造,2018,37(10):153−157. [ZHU L G, GUO Y, TANG S Y, et al. Comparison of chemical constituents and antioxidant activities of different varieties of Lonicera edulis[J]. China Brewing,2018,37(10):153−157. doi: 10.11882/j.issn.0254-5071.2018.10.030 ZHU L G, GUO Y, TANG S Y, et al . Comparison of chemical constituents and antioxidant activities of different varieties of Lonicera edulis[J]. China Brewing,2018 ,37 （10 ）:153 −157 . doi: 10.11882/j.issn.0254-5071.2018.10.030[4] 张龄予, 侯苏芯, 张文尉, 等. 蓝靛果的化学成分及其提取分离研究进展[J]. 应用化学,2022,39(11):1−13. [ZHANG L Y, HOU S X, ZHANG W W, et al. Research progress on chemical constituents and extraction and separation of Lonicera edulis[J]. Application Chemistry,2022,39(11):1−13. ZHANG L Y, HOU S X, ZHANG W W, et al . Research progress on chemical constituents and extraction and separation of Lonicera edulis[J]. Application Chemistry,2022 ,39 （11 ）:1 −13 .[5] MARTA G, ANNA SOKÓŁ-ŁĘTOWSKA, ALICJA Z, et al. Health properties and composition of honeysuckle berry Lonicera caerulea L. an update on recent studies[J]. Molecules,2020,25(3):749. doi: 10.3390/molecules25030749
[6] XUE H K, TAN J Q, Li Q, et al. Ultrasound-assisted deep eutectic solvent extraction of anthocyanins from blueberry wine residues:Optimization, identification, and HepG2 antitumor activity[J]. Molecules,2020,25(22):5456. doi: 10.3390/molecules25225456
[7] TAN J Q, LI Q, XUE H K, et al. Ultrasound-assisted enzymatic extraction of anthocyanins from grape skins:Optimization, identification, and antitumor activity[J]. Journal of Food Science,2020,85(11):3731−3744. doi: 10.1111/1750-3841.15497
[8] 张蕾, 周杰, 骆俊, 等. 桑葚花色苷诱导人胃癌SGC-7901细胞自噬凋亡的研究[J]. 中药材,2016,39(5):1134−1138. [ZHANG L, ZHOU J, LUO J, et al. Study on the autophagy and apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells induced by mulberry anthocyanins[J]. Chinese Herbal Medicine,2016,39(5):1134−1138. doi: 10.13863/j.issn1001-4454.2016.05.046 ZHANG L, ZHOU J, LUO J, et al . Study on the autophagy and apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells induced by mulberry anthocyanins[J]. Chinese Herbal Medicine,2016 ,39 （5 ）:1134 −1138 . doi: 10.13863/j.issn1001-4454.2016.05.046[9] 李文星, 包怡红, 王振宇. 蓝靛果花色苷诱导人结肠癌细胞HT29凋亡的实验研究[J]. 营养学报,2011,33(6):575−579. [LI W X, BAO Y H, WANG Z Y. Experimental study on apoptosis of human colon cancer cell HT29 induced by anthocyanins from Loni cera edulis[J]. Acta Nutrimenta Sinica,2011,33(6):575−579. doi: 10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2011.06.026 LI W X, BAO Y H, WANG Z Y . Experimental study on apoptosis of human colon cancer cell HT29 induced by anthocyanins from Lonicera edulis[J]. Acta Nutrimenta Sinica,2011 ,33 （6 ）:575 −579 . doi: 10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2011.06.026[10] ZHOU L P, WANG H, YI J J, et al. Anti-tumor properties of anthocyanins from Lonicera caerulea ‘Beilei’ fruit on human hepatocellular carcinoma: In vitro and in vivo study[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy,2018,104(8):520−529.
[11] 李凤凤, 张秀玲, 柳晓晨, 等. 响应面优化微波辅助提取蓝靛果花色苷工艺及其抗氧化活性[J]. 食品工业科技,2019,40(2):195−200,214. [LI F F, ZHANG X L, LIU X C, et al. Response surface optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from Lonicera edulis and its antioxidant activity[J]. Food Industry Science and Technology,2019,40(2):195−200,214. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2019.02.034 LI F F, ZHANG X L, LIU X C, et al . Response surface optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from Lonicera edulis and its antioxidant activity[J]. Food Industry Science and Technology,2019 ,40 （2 ）:195 −200,214 . doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2019.02.034[12] MOHAMED A, DKHIL, RAFAT Z, et al. Anthelmintic and antimicrobial activity of Indigofera oblongifolia leaf extracts[J]. Saudi Journal of Biological Sciences,2020,27(2):594−498. doi: 10.1016/j.sjbs.2019.11.033
[13] 唐敬思, 王红梅, 佟锰, 等. 蓝靛果忍冬花色苷的研究进展[J]. 食品研究与开发,2020,41(16):220−224. [TANG J S, WANG H M, TONG M, et al. Research progress of anthocyanins from Lonicera caerulea[J]. Food Research and Development,2020,41(16):220−224. doi: 10.12161/j.issn.1005-6521.2020.16.037 TANG J S, WANG H M, TONG M, et al . Research progress of anthocyanins from Lonicera caerulea[J]. Food Research and Development,2020 ,41 （16 ）:220 −224 . doi: 10.12161/j.issn.1005-6521.2020.16.037[14] DUHYEONG H, JACOB D. RAMSEY, et al. Polymeric micelles for the delivery of poorly soluble drugs:From nanoformulation to clinical approval[J]. Advanced Drug Delivery Reviews,2020,156:180−118.
[15] 刘聪, 梁广, 周韵秋, 等. 白藜芦醇聚合物胶束制备工艺的Box-Behnken设计-响应面法优化[J]. 时珍国医国药,2020,31(4):856−859. [LIU C, LIANG G, ZHOU Y Q, et al. Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the preparation process of resveratrol polymeric micelles[J]. Shizhen Traditional Chinese Medicine,2020,31(4):856−859. doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2020.04.024 LIU C, LIANG G, ZHOU Y Q, et al . Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the preparation process of resveratrol polymeric micelles[J]. Shizhen Traditional Chinese Medicine,2020 ,31 （4 ）:856 −859 . doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2020.04.024[16] TONG Y Q, DENG H T, KONG Y W, et al. Stability and structural characteristics of amylopectin nanoparticle-binding anthocyanins in Aronia melanocarpa[J]. Food Chemistry, 2020, 311(C).
[17] 赵昌顺, 温苏晨, 万雨晴, 等. 纳米胶束药物介导基于化疗的肿瘤联合治疗研究进展[J]. 药学进展,2022,46(7):502−511. [ZHAO C S, WEN S C, WAN Y Q, et al. Research progress of nanomicelle drug-mediated chemotherapy-based combination therapy for tumors[J]. Pharmaceutical Progress,2022,46(7):502−511. ZHAO C S, WEN S C, WAN Y Q, et al . Research progress of nanomicelle drug-mediated chemotherapy-based combination therapy for tumors[J]. Pharmaceutical Progress,2022 ,46 （7 ）:502 −511 .[18] LI X M, XING R, XU C J, et al. Immunostimulatory effect of chitosan and quaternary chitosan:A review of potential vaccine adjuvants[J]. Carbohydrate Polymers,2021,264(15):118050.
[19] JANA S, MAJI N, NAYAK A K, et al. Development of chitosan-based nanoparticles through inter-polymeric complexation for oral drug delivery[J]. Carbohyd Polym,2013,98(1):870−876. doi: 10.1016/j.carbpol.2013.06.064
[20] LUO Y C, TENG Z, WANG Q. Development of zein nanoparticles coated with carboxymethyl chitosan for encapsulation and controlled release of vitamin D3[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry,2012,60(3):836−843. doi: 10.1021/jf204194z
[21] JIANG L Q, ZHANG M, BAI Y T, et al. O-carboxymethyl chitosan based pH/hypoxia-responsive micelles relieve hypoxia and induce ROS in tumor microenvironment[J]. Carbohydrate Polymers,2022,275:11861.
[22] YAN T S, HUI W X, ZHU S Y, et al. Carboxymethyl chitosan based redox-responsivemicelle for near-infrared fluorescence image-guided photo-chemotherapy of liver cancer[J]. Carbohydrate Polymers, 2021, 253117284.
[23] 张聪, 张彦龙, 白龙林, 等. 响应面优化超声波辅助提取蓝靛果花色苷及抗炎活性研究[J]. 生物技术,2020,30(5):473−480,443. [ZHANG C, ZHANG Y L, BAI L L, et al. Response surface optimization of ultrasonic-assisted extraction of anthocyanins from Lonicera edulis and its anti-inflammatory activity[J]. Biotechnology,2020,30(5):473−480,443. doi: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2020.05.0075 ZHANG C, ZHANG Y L, BAI L L, et al . Response surface optimization of ultrasonic-assisted extraction of anthocyanins from Lonicera edulis and its anti-inflammatory activity[J]. Biotechnology,2020 ,30 （5 ）:473 −480,443 . doi: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2020.05.0075[24] 齐会娟, 刘德文, 李中宾, 等. 野生和栽培蓝靛果中花色苷含量的测定及分析[J]. 特种经济动植物,2019,22(8):42−46. [QI H J, LIU D W, LI Z B, et al. Determination and analysis of anthocyanin content in wild and cultivated Lonicera edulis[J]. Special Economic Animals and Plants,2019,22(8):42−46. doi: 10.3969/j.issn.1001-4713.2019.08.025 QI H J, LIU D W, LI Z B, et al . Determination and analysis of anthocyanin content in wild and cultivated Lonicera edulis[J]. Special Economic Animals and Plants,2019 ,22 （8 ）:42 −46 . doi: 10.3969/j.issn.1001-4713.2019.08.025[25] 黄志军, 李桃, 郭晓娟, 等. 薄膜水化法制备长春西汀胶束的工艺研究[J]. 中药材,2012,35(11):1850−1854. [HUANG Z J, LI T, GUO X J, et al. Study on the preparation of vinpocetine micelles by thin film hydration method[J]. Chinese Medicinal Materials,2012,35(11):1850−1854. doi: 10.13863/j.issn1001-4454.2012.11.002 HUANG Z J, LI T, GUO X J, et al . Study on the preparation of vinpocetine micelles by thin film hydration method[J]. Chinese Medicinal Materials,2012 ,35 （11 ）:1850 −1854 . doi: 10.13863/j.issn1001-4454.2012.11.002[26] ZHU J X, GUO X X, GUO T T, et al. Novel pH-responsive and self-assembled nanoparticles based on Bletilla striata polysaccharide:Preparation and characterization[J]. RSC Advances,2018,8(70):40308−40320. doi: 10.1039/C8RA07202G
[27] 刘露, 黄国俊, 白宏震, 等. 叶酸修饰壳聚糖纳米载药胶束的制备及其体外抗肿瘤效果研究[J]. 浙江大学学报(医学版),2020,49(3):364−374. [LIU L, HUANG G J, BAI H Z, et al. Preparation of folate-modified chitosan nano-drug-loaded micelles and their in vitro anti-tumor effect[J]. Journal of Zhejiang University (Medical Edition),2020,49(3):364−374. doi: 10.3785/j.issn.1008-9292.2020.06.03 LIU L, HUANG G J, BAI H Z, et al . Preparation of folate-modified chitosan nano-drug-loaded micelles and their in vitro anti-tumor effect[J]. Journal of Zhejiang University （Medical Edition）,2020 ,49 （3 ）:364 −374 . doi: 10.3785/j.issn.1008-9292.2020.06.03[28] WANG X Y, GUO Y L, QIU L Z, et al. Preparation and evaluation of carboxymethyl chitosan-rhein polymeric micelles with synergistic antitumor effect for oral delivery of paclitaxel[J]. Carbohydrate Polymers,2019,206:121−131. doi: 10.1016/j.carbpol.2018.10.096
[29] 杨宇涵, 林世源, 陈卉, 等. 亚麻酸-壳聚糖载多柔比星口服胶束的制备和表征及大鼠在体肠吸收[J]. 药学学报,2022,57(9):2857−2863. [YANG Y H, LIN S Y, CHEN H, et al. Preparation and characterization of linolenic acid-chitosan loaded doxorubicin oral micelles and intestinal absorption in rats[J]. Journal of Pharmacy,2022,57(9):2857−2863. YANG Y H, LIN S Y, CHEN H, et al . Preparation and characterization of linolenic acid-chitosan loaded doxorubicin oral micelles and intestinal absorption in rats[J]. Journal of Pharmacy,2022 ,57 （9 ）:2857 −2863 .[30] 张梅, 张燕杰, 陈为健, 等. 锦绣杜鹃花色苷微胶囊的制备及其稳定性研究[J]. 林产化学与工业,2023,43(2):19−26. [ZHANG M, ZHANG Y J, CHEN W J, et al. Preparation and stability of anthocyanin microcapsules from Rhododendron pulchrum[J]. Forest Chemistry and Industry,2023,43(2):19−26. doi: 10.3969/j.issn.0253-2417.2023.02.003 ZHANG M, ZHANG Y J, CHEN W J, et al . Preparation and stability of anthocyanin microcapsules from Rhododendron pulchrum[J]. Forest Chemistry and Industry,2023 ,43 （2 ）:19 −26 . doi: 10.3969/j.issn.0253-2417.2023.02.003[31] XUE B, WANG Y H, TIAN J L, et al. Effects of chitooligosaccharide-functionalized graphene oxide on stability, simulated digestion, and antioxidant activity of blueberry anthocyanins[J]. Food Chemistry,2022,368(30):130838.
下载:
计量
- 文章访问数: 111
- HTML全文浏览量: 15
- PDF下载量: 31
