Whole Genome Sequencing and Biological Characterization of Bacillus cereus GW-01
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摘要: 目的：通过全基因组测序和生物信息学，研究前期筛选可降解高效氯氰菊酯（β-CY）蜡样芽孢杆菌GW-01的基因组序列信息和生物学特性，为其安全性评估提供参考。方法：利用HPLC验证了GW-01降解β-CY的能力。GW-01的整个基因组基于二代Illumina NovaSeq与三代PacBio Sequel测序平台相结合的测序技术，对菌株GW-01进行全基因组测序，并对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、碳水化合物活性酶预测、毒力因子和抗生素抗性分析，此外，还基于gyrA 基因序列对菌株GW-01构建系统发育树。结果：GW-01在第6 d可降解48.4%的β-CY；GW-01菌株全基因组大小为5244145 bp，基因组类型为环状，平均GC含量36.43%，共编码5314个基因，含有104个tRNA基因，313个ncRNA，GW-01菌株全基因组序列在GO、KEGG、COG、NR和 Swiss-Prot、CAZy、VFDB、CARD数据库分别注释到基因3536、4714、4434、5290、3854、135、263和96个，GW-01与其他四个近缘菌株相比显示出高GC含量，并且毒力因子和耐药基因较少。结论：GW-01与其近缘菌相比，显示出明显不同的进化途径和毒素编码基因，表明其安全性较高。Abstract: Objective: To analyze the genome sequence information and biological properties of the pre-screened high-performance cypermethrin (β-CY)-degrading Bacillus cereus strain GW-01 through whole genome sequencing and bioinformatics, and to provide valuable insights for its safety assessment. Methods: The degradation ability of GW-01 towards β-CY was verified using HPLC. The whole genome of strain GW-01 was sequenced using third-generation single-molecule sequencing technology based on the second-generation Illumina NovaSeq and third-generation PacBio Sequel sequencing platforms. The sequencing data underwent analyses for genome assembly, gene prediction, functional annotation, prediction of carbohydrate-activating enzymes, virulence factors, and antibiotic resistance. Additionally, a phylogenetic tree was constructed for strain GW-01 based on the gyrA gene sequence. Results: On day 6, GW-01 degraded 48.4% of β-CY. The whole genome size of GW-01 strain was 5244145 bp with a cyclic genome type and an average GC content of 36.43%. It encoded a total of 5314 genes, including 104 tRNA genes and 313 ncRNAs. The whole genome sequences of GW-01 were annotated in the GO, KEGG, COG, NR, Swiss-Prot, CAZy, VFDB, and CARD databases, yielding 3536, 4714, 4434, 5290, 3854, 135, 263 and 96 annotated genes, respectively. GW-01 exhibited higher GC content and fewer virulence factors and resistance genes compared to the other four closely related strains. Conclusion: GW-01 displayed a distinct evolutionary pathway and a lower number of toxin-encoding genes compared to common Bacillus cereus strains, suggesting its higher safety profile.
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Keywords:
- Bacillus cereus /
- whole genome sequencing /
- biological characteristics /
- safety
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蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，Bc）为兼性厌氧，产芽孢的革兰氏阳性菌杆菌，在土壤、空气及动物肠道中普遍存在[1]，该菌能形成热稳定性孢子，具有很强的环境适应性[2]。蜡样芽孢杆菌与炭疽芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、细胞毒性芽孢杆菌等细菌的16S rRNA相似度极高，难以区分[3]。蜡样芽孢杆菌是一种传统的食源性致病菌，通常认为食物中Bc含量超过105 CFU/g可引起动物和人类的食物中毒，出现腹泻和呕吐等症状[4]。由于蜡样芽孢杆菌次级代谢产物丰富，也是益生菌常用菌种之一[5]，常被用作人和畜禽的口服菌剂，具有促进肠道优势菌群的生长[6]、抑制病原菌增殖[7]、减轻术后炎症[8]、缓解肠道炎症反应[9]、增强肠道上皮屏障功能和先天免疫功能[8]。蜡样芽孢杆菌能大量表达蛋白酶与脂肪酶，Shahn等[10]利用益生菌蜡状芽孢杆菌DM423与植物乳杆菌共发酵香肠，促进了香肠风味物质的形成。蜡样芽孢杆菌还可分泌细菌素、抗菌肽或其他具有抑菌能力的物质来发挥抑菌功能，进而预防肠道微生物感染[11]。本团队前期从健康的雌性绵羊瘤胃中筛选到可降解高效氯氰菊酯（β-CY）的蜡样芽孢杆菌GW-01[12−13]，并发现其作为口服菌剂可有效降低小鼠体内β-CY的积累[14]。然而，其能否应用于人体需要更多的证据。
随着基因组测序技术、生物信息学的不断发展与进步，利用微生物全基因组对Bc的安全性分析成为可能。传统的实验和鉴定方法很难全面地分析GW-01生物学特性，也不能充分挖掘其功能基因，为了从基因层面深入了解该菌，本文采用二代Illumina Hiseq与三代Pacbio平台相结合的测序技术，对蜡样芽孢杆菌GW-01进行全基因组测序，利用NR、Swiss-Prot、COG、GO和KEGG数据库进行基因功能注释，并预测其毒力因子与抗性基因，为GW-01的安全性分析提供全基因组维度的证据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
蜡样芽孢杆菌GW-01 从5岁健康雌性绵羊（中国武威）的瘤胃食糜中分离得到，筛选时表现出对氯氰菊酯有一定的降解作用，现由四川师范大学生命科学学院微生物实验室保存；高效氯氰菊酯 国家标准物质中心；乙腈、甲醇 色谱纯，上海吉至生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；DNA Marker DL2000，宝日医生物技术（北京）有限公司；6×DNA Loading Buffer 北京兰杰柯科技有限公司；荧光染料（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit） 美国赛默飞公司。
Agilent 1200 HPLC高效液相色谱仪 安捷伦生物科技有限公司；NanoDrop 2000紫外分光光度计 美国赛默飞公司；ABI9700 PCR仪 美国应用生物系统公司；DYY-6C电泳仪 北京六一生物科技有限公司；Illumina HiSeq X Ten测序仪 Illumina公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株GW-01培养及对β-CY降解率的测定
将甘油保存的GW-01菌株划线于LB固体培养基中，培养条件37 ℃、24 h，然后用无菌生理盐水洗下并用紫外分光光度计将细胞浓度调节至OD600 nm约0.8制成种子液。
将GW-01种子液按5%的接种量接种于含100 μg/mL的β-CY的LB培养基中，分装于30 mL/瓶。同时接种5%无菌生理盐水作为空白对照，37 ℃、135 r/min条件下培养，测定不同培养时间条件下GW-01对β-CY的降解情况。
将30 mL培养液加入等量的乙腈，超声处理破碎30 min，取10 mL超声破碎后的培养液于6000 r/min离心10 min，并用0.45 μm的有机相滤膜过滤上清液以去除样品中的杂质，用液相色谱检测上清滤液中β-CY的含量。通过采用配有二极管阵列检测器（DAD）的Agilent1200高效液相色谱仪，以乙腈-水（85:15，v/v）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测时间为15 min，色谱柱为Eclipse plus C18，紫外检测器波长为220 nm。
式中：A0为高效氯氰菊酯初始浓度（μg/mL）；A为高效氯氰菊酯降解后浓度（μg/mL）。
1.2.2 菌株总DNA提取
依据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书对菌株GW-01进行总DNA提取。首先DNA的纯净度通过使用NanoDrop 2000进行检测，OD260/280=1.8~2.0，OD260/230=2.0~2.2；用荧光染料（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit）检测 DNA的浓度，浓度应大于50 ng/μL；最后用核酸电泳法检测DNA完整度，将5 μL的基因组样品与1 μL 6×DNA Loading Buffer吹打混匀后加入到1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，观察基因组DNA有无弥散，以此来检测DNA是否降解。
1.2.3 菌株GW-01基因组文库制备及测序
本次测序委托成都迈乐赛生物科技有限公司完成。样本质检合格后，利用Covaris打断DNA样品，使其呈现片段化，进行文库构建。采用第二代 Illumina NovaSeq平台与第三代PacBio平台相结合的测序技术进行测序。
1.2.4 基因组序列拼接及分析
使用HGAP[15]、CANU[16]软件将Pacbio获得的下机数据进行拼装以得到contig序列。使用pilon[17]软件将二代获得的高质量数据和三代contig序列进行校正，最终进行拼接以得到完整序列，并对拼接最终得到的完整序列进行拼装效果评价。
1.2.5 基因功能分析
通过BLAST软件（Basic Local Alignment Search Tool）与 Gene Ontology（GO）[18]、Cluster of Orthologous Groups of Proteins（COG）[19]，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）[20]通路分析工具、Non-Redundant Protein Database（NR）[21]非冗余蛋白数据库，Carbohydrate-Active EnZymes Database（CAZy）[22]碳水化合物活性酶、Swiss-Prot[23]蛋白质序列功能信息数据库、毒力因子数据库（VFDB）[24]和综合抗生素抗性基因数据库（CARD）[25]，进行对比分析，使用Diamond软件对致病系统进行比对分析，获得相应的注释结果。
1.2.6 菌株GW-01 的进化和比较基因组学分析
根据菌株GW-01全基因组注释信息，选择gyrA基因序列及NCBI数据库比对分析结果，利用MEGA 11.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。
1.3 数据处理
GW-01菌株对β-CY降解率测定用Origin 2021软件进行数据分析，所得数据为均值±标准差（±SD）。
2. 结果与分析
2.1 菌株GW-01对β-CY降解率的测定
由图1所示，蜡样芽孢杆菌GW-01能降解100 μg/mL的β-CY，并且随着培养时间的增加，菌株GW-01对β-CY的降解率逐渐增加，在第6 d达到最大降解率48.4%。
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图 1 GW-01在不同时间内对β-CY的降解率Figure 1. Degradation rate of β-CY by GW-01 at different times2.2 菌株GW-01全基因组概况
采用第二代Illumina NovaSeq测序平台与第三代PacBio测序平台相结合，对菌株GW-01进行全基因组测序。如图2所示，GW-01菌株全基因组大小为5244145 bp，基因组类型为环状，GC的平均含量为36.43%，编码的基因为5314个，含有104个tRNA基因，313个ncRNA。
2.3 菌株GW-01的进化和比较基因组学分析
芽孢杆菌属内的种间亲缘关系较近，不能采用16S rRNA基因来分析芽孢杆菌属物种间的进化关系，因此保守蛋白编码基因在系统发育分析时具有更高的分辨率[26]，其中gyrA是常用于芽孢杆菌鉴定的保守蛋白编码基因，可以用于区分杆菌种间的差异[27−28]。将菌株GW-01与五株蜡样芽孢杆菌来源的gyrA蛋白序列构建进化树如图3所示，菌株GW-01与CC-1和M3聚在一起，表明GW-01与这两株菌在进化时尚存在密切的关系。推测GW-01可能出现在CC-1之前，M3之后。
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图 3 基于GW-01及近缘种gyrA 蛋白氨基酸序列构建进化树Figure 3. Phylogenetic tree reconstructed based on gyrA protein sequence of GW-01 and its related bacterial species选取与菌株GW-01亲缘关系非常相近的四株蜡样芽孢杆菌CC-1、M3、G1-1、M13进行分析，并从NCBI上下载这四株Bc的基因组概况如表1所示，GW-01与CC-1基因组大小和tRNA数最为接近，GW-01的GC含量比例高于其他菌株，编码蛋白数与M3最为接近。蜡样芽孢杆菌GW-01与其他四株菌独有基因和共有基因如图4所示，共有的基因有630个，GW-01、CC-1、M3、M13和G1-1独有的基因分别为554、627、954、409和598。
表 1 蜡样芽孢杆菌GW-01全基因组特征及其与其他近缘芽孢杆菌比较Table 1. Genome characteristics of Bacillus cereus GW-01 and comparison with other Bacillus relatives项目 Bacillus cereus GW-01 Bacillus cereus CC-1 Bacillus cereus M3 Bacillus cereus G1-1 Bacillus cereus M13 全基因组大小（Mb） 5.24 5.30 5.44 5.54 5.5 GC含量（%） 36.43 35.49 35.52 35.3 35.28 蛋白数量 5314 5163 5268 5727 5411 tRNA数量 104 104 106 106 106 NCBI编号 − NZ_CP023183.1 NZ_CP016316.1 NZ_CP042929.1 NZ_CP016360.1 ![]()
图 4 五株蜡样芽孢杆菌菌株独有基因和共有基因的韦恩图Figure 4. Venn diagram of unique and shared genes of five kinds of Bacillus cereus strains2.4 基因组的功能注释
将预测基因的蛋白序列与GO、KEGG、NR、CAZy、CARD、VFDB和Swiss-Prot各功能数据库进行比对分析（Evalue≤1e-5），选取蛋白质序列匹配程度高即Score最高的比对结果（默认Identity≥40%，Coverage≥40%）进行注释。最终发现菌株GW-01基因组共有5314个基因比对成功得到注释，其中在GO、KEGG、NR、COG和Swiss-Prot中得到功能注释的基因较多，分别为3536、4714、5290、4434和3854个，占基因总数的66.60%、38.72%、99.62%、83.50%、72.58%
2.4.1 GO注释结果
将菌株GW-01蛋白序列与GO（Gene Ontology）数据库进行比对，统计分析发现，被注释的基因共有3536。如表2所示，GO数据库按照生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）对蛋白进行注释，共计80条目，每组分别包括42、13和25个。在BP中注释的基因数为9320，涉及最多基因的条目包括生物过程（Biological_process）、细胞氮化合物代谢过程（Cellular nitrogen compound metabolic process）和生物合成过程（Biosynthetic process），分别有3321、1103和1060个；CC中，注释基因数为3930，其中与细胞（Cell）、细胞组分（Cellular_component）、细胞内部分（Intracellular）、细胞质（Cytoplasm）相关的基因表现出最高相关性，各有1067、1023、698、491个；MF大类中注释的基因数为7116，其中涉及最多基因的条目为分子功能（Molecular_function）、离子结合（Ion binding）、DNA结合（DNA binding）和氧化还原酶活性（Oxidoreductase activity），其数量分别为3166、1007、474和455。
表 2 菌株Bacillus cereus GW-01 GO功能分类Table 2. GO functional classification of Bacillus cereus GW-01Ontology 分组 基因数 Ontology 分组 基因数 biological_process biological_process 3321 cellular_component cell 1067 cellular nitrogen compound metabolic process 1103 cellular_component 1023 biosynthetic process 1060 intracellular 698 small molecule metabolic process 827 cytoplasm 491 transport 647 plasma membrane 351 catabolic process 436 organelle 112 carbohydrate metabolic process 189 protein complex 76 protein maturation 187 external encapsulating structure 48 cellular protein modification process 153 extracellular region 29 cofactor metabolic process 150 proteinaceous extracellular matrix 13 signal transduction 148 cytosol 9 translation 126 thylakoid 9 lipid metabolic process 124 extracellular space 4 response to stress 121 molecular_function molecular_function 3166 cell wall organization or biogenesis 82 ion binding 1007 generation of precursor metabolites and energy 77 DNA binding 474 sulfur compound metabolic process 71 oxidoreductase activity 455 anatomical structure development 66 lyase activity 254 cell division 59 kinase activity 220 cell cycle 43 nucleic acid binding transcription factor activity 213 cell morphogenesis 36 transferase activity, transferring acyl groups 195 homeostatic process 32 isomerase activity 162 locomotion 31 RNA binding 131 anatomical structure formation involved in morphogenesis 30 ligase activity 127 cell differentiation 30 methyltransferase activity 118 ribosome biogenesis 30 hydrolase activity, acting on carbon-nitrogen
（but not peptide） bonds98 cellular component assembly 26 nucleotidyltransferase activity 84 cell motility 18 transferase activity, transferring glycosyl groups 83 protein folding 15 structural molecule activity 70 reproduction 15 hydrolase activity, acting on glycosyl bonds 59 photosynthesis 13 phosphatase activity 46 chromosome segregation 10 helicase activity 41 cell adhesion 9 enzyme binding 38 chromosome organization 7 protein binding transcription factor activity 33 transposition 6 transferase activity, transferring alkyl or aryl
（other than methyl） groups31 cell death 5 enzyme regulator activity 7 membrane organization 5 lipid binding 2 secondary metabolic process 5 transcription factor binding 2 nitrogen cycle metabolic process 4 cytoskeleton organization 1 mRNA processing 1 neurological system process 1 2.4.2 COG注释结果
对菌株GW-01基因组中编码功能性蛋白的基因进行COG注释，发现被注释到具有生物学活性的蛋白编码基因共4434个。如图5所示，基因功能注释信息分为25类，分别有0、0、213、35、342、112、246、123、104、196、368、176、253、30、110、273、62、0、1448、185、32、116、10、0、0个基因注释分类到A~Z。较丰富的几个类别依次是转录（Transcription）共368个基因，占注释基因总数的6.93%；氨基酸代谢及转运（Amino Acid Transport and Metabolism）共342个基因，占注释基因总数的6.44%；而关于无机离子转运与代谢（273个基因，5.14%）、碳水化合物运输和代谢（246个基因，4.63%）、蛋白质翻译、核糖体结构和生物合成（196个基因，3.69%）的基因也得到较多的注释。此外，还有1448个基因（27.25%）尚未确定功能，这些基因可能赋予菌株某些特殊的生物学功能，有待今后进一步的研究。
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图 5 菌株 Bacillus cereus GW-01基因组COG功能分类Figure 5. COG functional classification of Bacillus cereus GW-012.4.3 KEGG注释结果
将菌株GW-01所获得的基因组信息与KEGG数据库进行比对并分析，如图6所示，4714个基因对应到KEGG通路，富集在48条代谢通路中。KEGG富集分析显示，信号和细胞过程（Signaling and cellular processes）、遗传信息处理（Genetic information processing）、碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）是最主要的3 种代谢通路，分别有668、616和433个基因注释结果；此外，氨基酸代谢（Amino acid metabolism）、代谢（Metabolism）、能量代谢（Energy metabolism）、辅助因子和维生素的代谢（Metabolism of cofactors and vitamins）、信号转导（Signal transduction）通路与GW-01菌株基因组相比，具有较高相关度。
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图 6 菌株 Bacillus cereus GW-01基因组KEGG功能分类Figure 6. KEGG functional classification of Bacillus cereus GW-012.4.4 CAZy功能分析
CAZy（Carbohydrate-Active enZYmes Database）即专门用于研究和分类碳水化合物活性酶的数据库。该数据库提供了广泛的酶家族和分类，包含了与糖苷键降解、修饰及生成等相关的酶类家族。主要包含5大分类：糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs）、糖基转移酶（Glycosyl Transferases，GTs）、多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases，PLs）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs）、辅助活性酶（Auxiliary Activities，AAs）。在碳水化合物的降解、合成修饰过程中发挥重要的作用。此外，CAZy还包含了与碳水化合物结合相关的酶（Carbohydrate-Binding Modules，CBMs）。
将菌株GW-01基因组序列通过CAZy数据库进行比对功能注释，如图7所示，发现其蛋白质结构域属于CAZy家族的编码基因共有135个，包括糖苷水解酶（GHs）家族的蛋白34个、碳水化合物酯酶（CEs）38个、11类糖苷转移酶家族的蛋白（GTs）43个、多糖裂解酶（PLs）0个、辅助酶8个、3类碳水化合物结合组件（CBMs）12个。
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图 7 菌株Bacillus cereus GW-01基因组CAZy注释Figure 7. CAZy annotation of Bacillus cereus GW-012.5 毒力因子分析
毒力因子是指微生物（如细菌、病毒、真菌等）能够在特定物种的宿主内建立自身并增强其引起毒性或致病性潜力的基因产物，在致病机制中发挥关键作用，使微生物能够侵入宿主、定位到特定组织或细胞，并导致病原性或毒性反应。毒力因素包括细菌毒素、帮助细菌附着宿主的细胞表面蛋白、细胞表面碳水化合物和参与宿主侵入免疫逃逸的蛋白、以及可能有助于细菌在致病机制中发挥关键作用的的水解酶[29−30]。
在蜡样芽胞杆菌中，导致机体发生食物中毒的原因主要是该菌会产生肠毒素，包括引起腹泻症状的溶血型肠毒素Hbl（hemolysin BL）、非溶血型肠毒素Nhe（nonhemolytic enterotoxin）、细胞毒素CytK（cytotoxin）、肠毒素FM（entFM）及一些特殊蛋白酶，引起呕吐的呕吐毒素ces（cereulide）[31−32]，其中，毒力最强的是引起呕吐的毒素基因ces。对于不同肠致病性蜡样芽孢杆菌，其携带的毒力基因数目、毒力基因表达情况各不相同，因此各菌株对宿主的致病性也不尽相同[33]。
将菌株 GW-01 和四株近缘菌株的基因组与 VFDB 数据库进行比对分析，毒力因子相关基因数预测如表 3、表4 所示，与其他四株菌相比，菌株 GW-01 毒力因子相关基因数占整体基因比率最低，仅占 0.49%，在典型肠毒素基因鉴定中菌株 GW-01 中只检出了 Nhe（A、B 和 C）。研究表明肠毒素基因或某种毒素基因谱的存在并不一定证实蜡样芽孢杆菌菌株具有毒性活性[34] 。
表 3 蜡样芽孢杆菌GW-01及其与其他近缘芽孢杆菌毒力因子Table 3. Bacillus cereus GW-01 and other closely related Bacillus virulence factors项目 Bacillus cereus
GW-01Bacillus cereus
CC-1Bacillus cereus
M3Bacillus cereus
G1-1Bacillus cereus
M13所有基因数 5314 5163 5268 5725 5411 VFDB基因数 263 278 274 295 287 占比（%） 0.49 0.53 0.52 0.51 0.53 表 4 蜡样芽孢杆菌GW-01及其与其他近缘芽孢杆菌毒力基因型Table 4. Bacillus cereus GW-01 and other closely related Bacillus virulence genotypesBacillus cereus
GW-01Bacillus cereus
CC-1Bacillus cereus
M3Bacillus cereus
G1-1Bacillus cereus
M13ccpA − + + + + codY − + + + + cytK − − − + − flhA − + + + + flhB − + + + + flhF − + + + + glpT − + + + + HblA − − + + − HblC − − + + − HblD − − + + − NheA + + + + + NheB + + + + + NheC + + + + + pta − + + + + Spo0A + + + + + yabA − + + + + panC + − − − − rpoN + − − − − plcR + − − − − Hsp + + + + + papR − + − − + 注：是否携带相应毒素基因，+为阳性，−为阴性。 2.6 抗性基因分析
在遗传、环境等选择压力的情况下蜡样芽胞杆菌会发生基因突变。滥用抗生素或长时间暴露于抗生素下，蜡样芽胞杆菌对药物的敏感性会逐渐降低，从而加速细菌耐药性的发展使菌株产生耐药性[35]。
将菌株GW-01和其他四株菌通过CARD数据库进行注释，结果如表5所示，与其他四株近缘菌相比，菌株GW-01与耐药相关的基因最少共96个，仅占0.18%。可能的耐受药物有林可霉素、利福平、达托霉素、止夫西地酸、磷霉素、青霉素、磺胺、氟喹诺酮、四环素、杆菌肽、大环内酯、链霉素共12种。目前认为，靶基因突变在细菌对抗生素耐药中起重要作用，通过对靶基因的调控表达可能改变菌株抗性，在菌株GW-01中有24个抗生素靶基因，可能成为改变菌株抗生素抗性的突破点。
表 5 蜡样芽孢杆菌GW-01及其与其他近缘芽孢杆菌抗生素抗性分析Table 5. Antibiotic resistance analysis of Bacillus cereus GW-01 and other closely related Bacillus项目 Bacillus cereus
GW-01Bacillus cereus
CC-1Bacillus cereus
M3Bacillus cereus
G1-1Bacillus cereus
M13总基因数 5314 5163 5268 5725 5411 CARD基因 96 103 103 108 102 占比（%） 0.18 0.19 0.19 0.18 0.18 抗生素靶基因 24 21 21 20 20 3. 讨论
食源性微生物的安全问题引起越来越多关注。Bc是常见的食源性致病菌，广泛存在于发酵食品、土壤、空气、水、植物和畜禽瘤胃肠道[3,36−37]。食品尤其是高淀粉食品在生产、运输、销售和储存等环节均会被该菌污染。作为食源性致病菌，Bc引发食物中毒占全球食物中毒的1.4%~12%[38]；在中国，2003年至2017年期间发生的13307起食源性疾病中，由Bc引起的占3.0%[39]。以Bc为主体的微生态制剂如“口服蜡样芽孢杆菌活菌片”、“蜡样芽胞杆菌片”等益生菌产品在医疗保健、农业和养殖业等各行各业有着极其广阔的应用[3,36−37] 。目前，Bc口服菌剂在市场上大量销售，用于治疗肠炎、腹泻和肠功能紊乱，作为人类和牲畜益生菌使用[40]。然而，几乎所有Bc菌株都含有毒素编码基因，约85%~100%含有Nhe，约40%~70%分别含有Hbl和cytK[34]，因此，很难解释Bc具有益生性的原因。
近年来，许多科学家致力于Bc致病或益生性的研究。Bc安全性分析主要集中于动物实验和基因组分析。动物实验方面，多采用小鼠[14,36]、刺参[41]、彭泽鲫[42]和银鲫[43]等动物研究Bc的益生特性。本课题组前期从健康雌性绵羊瘤胃中筛选到可降解β-CY的蜡样芽孢杆菌GW-01，从宿主来源看该菌株无致病性，并通过实验表明口服Bc菌株GW-01能有效降低小鼠体内β-CY的积累并促进小鼠体重增加[13]。为了深入研究该菌，本研究利用全基因组测序和生物信息学分析技术得到了菌株GW-01的基因组序列，确定菌株基因组大小为5244145 bp，共编码5314个基因，同时将基因组数据与GO、COG、KEGG、NR等数据库进行比对分析，完成菌株GW-01基因组功能注释及数据统计工作，并基于gyrA基因构建系统发育进化树，确定了GW-01菌株与蜡样芽孢杆菌CC-1、蜡样芽孢杆菌M3、蜡样芽孢杆菌G1-1、蜡样芽孢杆菌M13的近缘关系。
CAZy家族主要参与糖苷键降解、修饰及生成的酶类，在宿主微生物的适应性和致病性方面发挥重要作用[44−45]。对于具有致病性的菌株，其体内糖苷水解酶可对宿主细胞的多糖进行水解，从而获得自身所需营养或影响糖类在宿主中发挥作用[46−47]。细菌的CAZy协同作用可将复杂的碳水化合物降解为简单糖类，供给宿主动物吸收利用[48]。在菌株GW-01基因组中共获得CAZy家族的编码基因135个，糖苷水解酶34个、碳水化合物酯酶38个、类糖苷转移酶家族的蛋白43个、辅助酶8个、碳水化合物结合组件12个，推测这些酶类家族与菌株GW-01的益生性相关。
根据蜡样芽孢杆菌引起食物中毒的症状可分为致呕吐型肠毒素和致腹泻型肠毒素，主要毒素包括ces、Hbl和Nhe以及CytK。ces在淀粉和乳制品中检出率较高，常用的食品加工方法很难使ces失活，人体摄后宿主会出现恶心和呕吐等症状。Nhe和Hbl是引起腹泻的重要毒素，具有高度的同源性，主要通过溶解结合部位的细胞膜形成孔洞，导致K+外流，进而直接刺激NLRP3炎症小体，导致宿主的死亡，该毒力因子主要受PlcR、CCPA、ResD和FNR等毒力调节因子的影响[49]。CytK的毒性作用与Hbl和Nhe相类似，具有细胞毒性和溶血活性，可使皮肤发生坏死。毒素因子需要不同基因之间相互调控如AbrB、Spo0A、 PlcR和CodY调控系统对ces基因簇的转录进行调控[50]，CodY的功能是传输和调节ces基因簇所在质粒与细菌染色体间的信号，控制岗体进行营养和能量的代谢，进而影响毒素的合成[51−52]。
大量的研究显示几乎所有的Bc都能分泌一种或多种毒素，益生性Bc中毒素的存在情况仍不清楚。采用VFDB数据库对菌株GW-01的毒力因子进行预测，菌株GW-01大部分潜在的毒力因子仅编码菌株正常生长所需的蛋白功能，还有一些可以增强细菌粘附和侵袭的能力，如Hsp60，可提高细菌对宿主细胞的粘附能力。相比于其他四株近缘菌株，在GW-01中，只检测到与致病性芽孢杆菌相关的毒素基因Nhe，且Nhe存在于约80%~100%的蜡样芽孢杆菌中[34]。蜡样芽孢杆菌毒性基因在表达上沉默或只有在特定情况下才能表达，Cui等[53]认为蜡样芽孢杆菌益生菌菌株的毒性基因在转录上是沉默，不会产生活性毒素，Tsilia等[54]利用蜡状芽孢杆菌NVH 0500/00在胃肠道模拟过程中，发现其可以粘附黏蛋白，但不能产生肠毒素。plcR是芽孢杆菌细胞外毒力因子的多效性调节因子，同时调控HBL和Nhe的转录，plcR基因的转录发生在稳定期，而在孢子形成期可被孢子形成因子Spo0A抑制[9]。GW-01菌株的Nhe基因由于菌株的调控系统影响其毒素基因的表达，推测菌株GW-01较其他蜡样芽孢杆菌安全性较高。
4. 结论
本文采用第二代 Illumina与第三代 PacBio平台相结合的测序技术，对菌株GW-01进行全基因组测序，得到了基因组序列信息，并确定为蜡样芽孢杆菌。通过COG、GO、KEGG等数据库完成了功能注释与比对分析，了解了菌株GW-01的生物学特性。通过与CAZy数据库的比对共获得了CAZy家族编码基因135个，其糖苷水解酶、糖苷转移酶等的协同作用可能与菌株GW-01的益生性相关。采用VFDB数据库对菌株GW-01的毒力因子进行预测，与其他Bc相比，GW-01潜在的毒力因子占比率最少，且大部分仅编码菌株正常生长所需的蛋白，因此GW-01虽具有毒力因子但其致病性有限，在开发成为益生菌方面具有很大的应用潜力。
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图 1 GW-01在不同时间内对β-CY的降解率
Figure 1. Degradation rate of β-CY by GW-01 at different times
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图 3 基于GW-01及近缘种gyrA 蛋白氨基酸序列构建进化树
Figure 3. Phylogenetic tree reconstructed based on gyrA protein sequence of GW-01 and its related bacterial species
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图 4 五株蜡样芽孢杆菌菌株独有基因和共有基因的韦恩图
Figure 4. Venn diagram of unique and shared genes of five kinds of Bacillus cereus strains
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图 5 菌株 Bacillus cereus GW-01基因组COG功能分类
Figure 5. COG functional classification of Bacillus cereus GW-01
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图 6 菌株 Bacillus cereus GW-01基因组KEGG功能分类
Figure 6. KEGG functional classification of Bacillus cereus GW-01
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图 7 菌株Bacillus cereus GW-01基因组CAZy注释
Figure 7. CAZy annotation of Bacillus cereus GW-01
表 1 蜡样芽孢杆菌GW-01全基因组特征及其与其他近缘芽孢杆菌比较
Table 1 Genome characteristics of Bacillus cereus GW-01 and comparison with other Bacillus relatives
项目 Bacillus cereus GW-01 Bacillus cereus CC-1 Bacillus cereus M3 Bacillus cereus G1-1 Bacillus cereus M13 全基因组大小（Mb） 5.24 5.30 5.44 5.54 5.5 GC含量（%） 36.43 35.49 35.52 35.3 35.28 蛋白数量 5314 5163 5268 5727 5411 tRNA数量 104 104 106 106 106 NCBI编号 − NZ_CP023183.1 NZ_CP016316.1 NZ_CP042929.1 NZ_CP016360.1 
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表 2 菌株Bacillus cereus GW-01 GO功能分类
Table 2 GO functional classification of Bacillus cereus GW-01
Ontology 分组 基因数 Ontology 分组 基因数 biological_process biological_process 3321 cellular_component cell 1067 cellular nitrogen compound metabolic process 1103 cellular_component 1023 biosynthetic process 1060 intracellular 698 small molecule metabolic process 827 cytoplasm 491 transport 647 plasma membrane 351 catabolic process 436 organelle 112 carbohydrate metabolic process 189 protein complex 76 protein maturation 187 external encapsulating structure 48 cellular protein modification process 153 extracellular region 29 cofactor metabolic process 150 proteinaceous extracellular matrix 13 signal transduction 148 cytosol 9 translation 126 thylakoid 9 lipid metabolic process 124 extracellular space 4 response to stress 121 molecular_function molecular_function 3166 cell wall organization or biogenesis 82 ion binding 1007 generation of precursor metabolites and energy 77 DNA binding 474 sulfur compound metabolic process 71 oxidoreductase activity 455 anatomical structure development 66 lyase activity 254 cell division 59 kinase activity 220 cell cycle 43 nucleic acid binding transcription factor activity 213 cell morphogenesis 36 transferase activity, transferring acyl groups 195 homeostatic process 32 isomerase activity 162 locomotion 31 RNA binding 131 anatomical structure formation involved in morphogenesis 30 ligase activity 127 cell differentiation 30 methyltransferase activity 118 ribosome biogenesis 30 hydrolase activity, acting on carbon-nitrogen
（but not peptide） bonds98 cellular component assembly 26 nucleotidyltransferase activity 84 cell motility 18 transferase activity, transferring glycosyl groups 83 protein folding 15 structural molecule activity 70 reproduction 15 hydrolase activity, acting on glycosyl bonds 59 photosynthesis 13 phosphatase activity 46 chromosome segregation 10 helicase activity 41 cell adhesion 9 enzyme binding 38 chromosome organization 7 protein binding transcription factor activity 33 transposition 6 transferase activity, transferring alkyl or aryl
（other than methyl） groups31 cell death 5 enzyme regulator activity 7 membrane organization 5 lipid binding 2 secondary metabolic process 5 transcription factor binding 2 nitrogen cycle metabolic process 4 cytoskeleton organization 1 mRNA processing 1 neurological system process 1
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表 3 蜡样芽孢杆菌GW-01及其与其他近缘芽孢杆菌毒力因子
Table 3 Bacillus cereus GW-01 and other closely related Bacillus virulence factors
项目 Bacillus cereus
GW-01Bacillus cereus
CC-1Bacillus cereus
M3Bacillus cereus
G1-1Bacillus cereus
M13所有基因数 5314 5163 5268 5725 5411 VFDB基因数 263 278 274 295 287 占比（%） 0.49 0.53 0.52 0.51 0.53
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表 4 蜡样芽孢杆菌GW-01及其与其他近缘芽孢杆菌毒力基因型
Table 4 Bacillus cereus GW-01 and other closely related Bacillus virulence genotypes
Bacillus cereus
GW-01Bacillus cereus
CC-1Bacillus cereus
M3Bacillus cereus
G1-1Bacillus cereus
M13ccpA − + + + + codY − + + + + cytK − − − + − flhA − + + + + flhB − + + + + flhF − + + + + glpT − + + + + HblA − − + + − HblC − − + + − HblD − − + + − NheA + + + + + NheB + + + + + NheC + + + + + pta − + + + + Spo0A + + + + + yabA − + + + + panC + − − − − rpoN + − − − − plcR + − − − − Hsp + + + + + papR − + − − + 注：是否携带相应毒素基因，+为阳性，−为阴性。
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表 5 蜡样芽孢杆菌GW-01及其与其他近缘芽孢杆菌抗生素抗性分析
Table 5 Antibiotic resistance analysis of Bacillus cereus GW-01 and other closely related Bacillus
项目 Bacillus cereus
GW-01Bacillus cereus
CC-1Bacillus cereus
M3Bacillus cereus
G1-1Bacillus cereus
M13总基因数 5314 5163 5268 5725 5411 CARD基因 96 103 103 108 102 占比（%） 0.18 0.19 0.19 0.18 0.18 抗生素靶基因 24 21 21 20 20
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