Analysis of the Components of Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim. Alcohol Extract and Exploration of Its Mechanism of Promoting Skin Wound Healing Based on Network Pharmacology
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摘要: 为了深入挖掘兴安升麻生理功能，本研究采用醇提法提取活性成分，通过HPLC-MS分析兴安升麻的化学成分并基于网络药理学探讨其对皮肤伤口的促愈机制。结果表明，兴安升麻中鉴定出125种化学成分，其中萜类、苯丙素类及酮类化合物含量较多，主要包括隐绿原酸、绿原酸、白术内脂III等活性成分，可作用于一个或多个靶点， EGFR、KDR、F2可能为促愈过程中发挥作用的重要靶点，且橘皮素、山姜素、5-去甲川陈皮素等活性成分可能在此过程中发挥重要作用，说明兴安升麻具有多成分、多靶点作用于促进皮肤伤口愈合的特性；兴安升麻可能通过VEGF、EGFR和TNF信号通路调控相关因子和蛋白的表达，发挥对皮肤伤口的促愈作用。本研究探明了兴安升麻醇提物的主要活性成分，并基于网络药理学预测了促进皮肤伤口愈合的作用机制，为后续兴安升麻的开发利用提供试验及理论基础。Abstract: In order to further explore the physiological functions of Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim., the study extracted the active compounds by alcohol extraction method, analyzed the chemical compositions by HPLC-MS, and explored its healing mechanism on skin wounds based on network pharmacology. The results showed that 125 chemical components were identified from Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim., and the contents of terpenoids, phenylpropanoids and ketones were higher, including cryptochlorogenic acid, chlorogenic acid, atractylenolide III and others. The active compounds of Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim. could regulate one or more targets. The EGFR, KDR, F2 genes might be important targets in the process of promoting healing, and tangeretin, alpinetin, and 5-O-demethylnobiletin and other active compounds might also play important roles in this process. It was proved that Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim. had a characteristic of multi-component and multi-target action to promote skin wound healing. After the action of Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim., the expression of related factors and proteins might be regulated through VEGF, EGFR, and TNF signaling pathways, exerting a promoting effect on skin wound healing. Through the above research, the main active ingredients of Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim. alcohol extract were identified, and the mechanism of promoting skin wound healing was predicted based on network pharmacology, which would provide the experimental and theoretical basis for the subsequent development and utilization of Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim..
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升麻属植物为毛茛科多年生草本植物，约有10余种主产于我国各地[1]。升麻在我国是一种常用中药，也是药食同源目录中的一种食物，为大三叶升麻、兴安升麻和升麻的干燥根茎。由于其具备成本较低、毒副作用较小、不易产生耐药性等优点，三个升麻品种均被收录于2015年版《中国药典》[2]。其中，兴安升麻又名为苦老芽、窟窿牙，在我国广泛分布于内蒙古、山西、河北、辽宁和黑龙江等地[3]。作为一种药用植物，兴安升麻具有清热解毒、发表透疹等功效，常被用于治疗咽喉肿痛、风热头痛、子宫脱垂等病症[2]。它又是一种纯天然的山野菜，将刚生长出的嫩芽制作后食用，入口微苦、先苦后甜，有良好清热败火、抗菌消炎功效，食疗效果较好[4−7]，具有较高研究价值。
研究发现，升麻属植物中富含多种活性成分，具有重要的药理活性功能，如抗病毒、抗炎、抗骨质疏松、治疗妇女更年期综合症等[8−10]，在维护人体健康及防治相关疾病方面具有较高的研究价值。升麻属植物中酚酸类、萜类等化合物是较好的抗炎活性成分，如阿魏酸、异阿魏酸等。我国每年约有超过1000万人遭受皮肤创伤，当皮肤受损后，皮肤的完整性及功能性会受到破坏，迫使血管破裂、引发炎症反应、造成机体的感染，甚至危及生命[11−12]。因此，作为连接机体与外界环境的第一关，快速修复皮肤创伤至关重要[13]。但是伤口愈合的速度及愈合质量会受到诸多因素的影响，其中，伤口炎症、细菌感染是影响伤口愈合的重要因素之一。前期研究发现，具有良好抗菌消炎作用的兴安升麻能够有效促进伤口愈合，严格防止细菌感染[14]，但是由于其成分复杂，对于发挥药效活性成分群及作用机制尚不清晰。
网络药理学是一门多学科技术和内容相结合的交叉学科，通过分析生物网络解释药物成分与疾病靶点之间的复杂关系，并揭示其作用机制[15−16]。Deng等[15]探索了桔梗治疗肺癌的潜在作用机制，表明桔梗可能是通过MAPK和P13K-AKT等潜在信号通路来治疗肺癌。基于网络药理学研究发现桃红四物汤主要通过抑菌作用及改善血液流变学等途径，治疗关节置换后假体周围感染[17]。因此，基于网络药理学方法分析药物与机体之间的关系已经受到研究者的广泛关注，逐渐成为研究热点，但尚未见与基于网络药理学预测兴安升麻作用机制的相关研究。
由于兴安升麻发挥促进皮肤伤口愈合功效的活性成分及作用机制尚不明确，本研究以兴安升麻为原料，采用醇提法提取生物活性物质，并通过HPLC-MS技术分析鉴定兴安升麻醇提物的活性化学成分。通过网络药理学进一步分析预测其促愈作用机制，以期为兴安升麻的开发与应用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
兴安升麻（Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.） 购于河北省张家口市，多年生草本植物；无水乙醇 纯度≥95.0%，天津市富宇精细化工有限公司；乙腈 纯度≥99.9%，上海拜力生物科技有限公司；甲酸 色谱纯，梯希爱化成工业发展有限公司；甲酸铵 纯度≥99.9%，西格玛奥德里奇贸易有限公司。
RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 保定高新区阳光科教仪器厂；FD5-2.5型真空冷冻干燥机 SIM仪器有限公司；H1850-R型冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；U3000型液相色谱仪、QE Focus高分辨质谱仪 赛默飞世尔科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 兴安升麻活性物质的提取
将兴安升麻冻干，粉碎，过60目筛。称取5 g粉末，加入60 mL 78%乙醇混合均匀，在室温条件下醇提3次，每次静置提取12 h。将醇提液合并、过滤，8000 r/min离心5 min，收集上清液于37 ℃下旋蒸除去乙醇，再经冷冻干燥，最终获得醇提物干粉。
1.2.2 化学成分的鉴定
通过HPLC-MS检测，根据精确分子量及数据库筛选分析兴安升麻醇提物的化学成分，并应用面积归一法进行定量[18]。
1.2.2.1 色谱条件
采用ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 µm）色谱柱，自动进样器温度设为8 ℃，以0.25 mL/min的流速，40 ℃的柱温，进样2 µL进行梯度洗脱，流动相为正离子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；负离子5 mmol/L甲酸铵水（A）-乙腈（B）。
1.2.2.2 质谱条件
仪器使用电喷雾离子源（ESI），正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV，鞘气30 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率70000进行全扫描，扫描范围81~1000 aum。
1.2.3 靶点的筛选及预测
利用Pubchem数据库获取兴安升麻化学成分的结构，将其导入SwissADME数据库，以“胃肠道吸收为高且类药性满足两个条件”为标准，并结合文献筛选出有效成分，并根据靶点可能性通过SwissTargetPrediction数据库筛选及预测有效成分的潜在靶点，再利用UniProt蛋白数据库筛选出具有相应基因的有效靶点。以“皮肤伤口（skin wound）”为关键词，通过GeneCards、OMIM及DrugBank数据库搜索与此相关的疾病靶点。将其与兴安升麻的有效靶点进行匹配，得到兴安升麻促进皮肤伤口愈合的相关靶点。
1.2.4 “药物-成分-疾病-靶点”网络图的构建
采用Cytoscape3.9.0软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络，并进行可视化分析。其中，节点分别代表药物、有效成分、皮肤伤口及靶点，边代表节点之间的相互关系。
1.2.5 蛋白互相作用网络的构建
将交集靶点导入String数据库，进行蛋白互相作用分析，以得分≥0.7为标准筛选相互作用关系，并根据degree值筛选出前20个靶点作为核心靶点；将其导入Cytoscape软件，构建蛋白相互作用网络图。
1.2.6 生物功能的分析
利用DAVID数据库对核心靶点进行GO和KEGG富集分析，得到兴安升麻促进皮肤伤口愈合的主要作用通路；并将结果导入微生信平台构建富集分析结果图。
1.3 数据处理
对高分辨质谱数据进行分析，通过Proteowizard软件将获得的原始数据转换成mzXML格式，利用XCMS程序包进行峰识别、峰过滤、峰对齐。根据精确分子量（分子量误差为≤30 ppm）、保留时间等进行物质鉴定，后续根据MS/MS碎片模式对HMDB、METLIN、Massbank、LipidMaps、mzClound、以及帕诺米克自建标准品数据库确认注释获得活性物质，并采用面积归一化法测定各成分的相对含量。通过数据库筛选并预测成分、疾病靶点相关信息，利用Cytoscape3.9.0软件、微生信平台分析筛选结果并绘图。SwissTargetPrediction数据库（http://swisstargetprediction.ch/）；SwissADME数据库（http://www.swissadme.ch/）；PubChem数据库（http://pubmed.cn/）；UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）；GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）；OMIM数据库（https://www.omim.org/）；DrugBank数据库（https://go.drugbank.com/）；String数据库（https://www.omim.org/）；DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape3.9.0软件；微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/en）。
2. 结果与分析
2.1 醇提物化学成分结果分析
本研究从兴安升麻中共鉴定出125种化学成分（表1），其中萜类（24.05%）、苯丙素类（23.23%）和酮类（20.61%）化合物占比较高，另外还鉴定到酚类（6.69%）、生物碱类（5.16%）、糖类（3.03%）、醌类（1.98%）、香豆素类（1.60%）和木脂素类（1.01%）等化合物。共有21种化学成分相对含量大于1%，主要包括隐绿原酸（10.52%）、绿原酸（10.27%）、白术内脂III（8.46%）、莪术二酮（5.10%）、5-羟甲基糠醛（4.77%）、高车前素（4.73%）等，其中隐绿原酸、绿原酸为苯丙素类化合物，白术内脂III与莪术二酮为萜类化合物；升麻属植物主要生物活性成分为苯丙素类化合物、三萜皂苷或其苷元，以及色酮类、生物碱类、糖类、含氮化合物等[19−21]。多酚类、酮类、生物碱类等部分化合物具有显著的抗炎功效，能够在伤口愈合过程中发挥作用[22−23]。
表 1 兴安升麻醇提物化学成分Table 1. Chemical compositions of alcohol extracts from Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.编号 中文名称 英文名称 保留时间（min） 分类 相对含量（%） 1 隐绿原酸 Cryptochlorogenic acid 6.09 苯丙素类 10.50 2 绿原酸 Chlorogenic acid 5.63 苯丙素类 10.27 3 白术内脂III Atractylenolide III 13.40 萜类 8.46 4 莪术二酮 Curdione 12.41 萜类 5.10 5 5-羟甲基糠醛 5-Hydroxymethylfurfural 7.19 NULL 4.77 6 高车前素 Hispidulin 11.43 酮类 4.73 7 巴西苏木素 Brazilin 7.80 酮类 4.23 8 原苏木素 B Protosappanin B 7.58 酚类 4.15 9 辛弗林 Synephrine 5.39 NULL 3.04 10 木香内酯 Micheliolide 13.73 生物碱类 2.73 11 当归甙 Sweroside 7.67 萜类 2.65 12 姜黄烯醇 Curcumenol 11.10 萜类 2.15 13 甜橙黄酮 Sinensetin 12.59 酮类 1.89 14 苍术素 Atractylodin 11.79 NULL 1.59 15 橘皮苷 Hesperidin 9.46 酮类 1.49 16 木犀草素7-葡萄糖苷酸 Luteolin 7-glucuronide 8.52 酮类 1.49 17 普尔马汀 Pulmatin 10.67 醌类 1.32 18 棉子糖 Raffinose 1.68 糖类 1.24 19 5-去甲川陈皮素 5-O-Demethylnobiletin 13.77 酮类 1.17 20 人参皂苷 Ginsenoside 12.57 萜类 1.14 21 有机酸 Loganic acid 5.49 萜类 1.01 22 益母草碱 Leonurine 7.99 生物碱类 0.89 23 耐斯糖 Nystose 2.90 糖类 0.88 24 断氧化马钱苷 Secoxyloganin 7.67 萜类 0.79 25 松脂醇 Pinoresinol 8.88 木脂素类 0.74 26 白蜡树精 Fraxinol 9.25 香豆素类 0.67 27 高丽槐素 Maackiain 8.98 NULL 0.67 28 沉香四醇 Agarotetrol 8.90 酚类 0.66 29 木兰花碱 Magnoflorine 7.72 生物碱类 0.62 30 丁香醛 Syringaldehyde 9.05 酚类 0.59 31 香风草甙 Didymin 10.18 酮类 0.57 32 洋蓟素 Cynarine 7.54 苯丙素类 0.54 33 臭椿酮 Ailanthone 8.72 萜类 0.54 34 蔗糖 Sucrose 2.66 糖类 0.54 35 尼泊金乙酯 Ethylparaben 13.91 酚类 0.50 36 木蝴蝶苷A Oroxin A 8.53 酮类 0.50 37 异麦角甾苷 Isoacteoside 8.66 苯丙素类 0.46 38 美迪紫檀素 Medicarpin 11.01 NULL 0.45 39 黄芪甲苷II Astragaloside II 13.03 萜类 0.43 40 紫花前胡醇 Decursinol 10.49 香豆素类 0.43 41 4-甲氧基水杨酸 4-Methoxysalicylic acid 6.86 酚类 0.39 42 穿心莲内酯 （-）-Parthenolide 10.42 萜类 0.38 43 麦芽五糖 Amylopentaose 1.70 糖类 0.38 44 乙酮 Ethanone 10.48 醌类 0.36 45 阿魏酸 Ferulic acid 7.33 苯丙素类 0.35 46 美迪紫檀苷 Methylnissolin-3-O-glucoside 10.22 酮类 0.35 47 洋川芎内酯 Senkyunolide 13.48 NULL 0.34 48 金腰乙素 Chrysosplenetin 12.94 酮类 0.34 49 阿格拉宾 Arglabin 11.52 生物碱类 0.34 50 维采宁-2 Vicenin 2 7.24 酮类 0.33 51 丁基酞内酯 Butylphthalide 13.85 NULL 0.31 52 瓶子草素 Sarracenin 10.85 萜类 0.31 53 大黄素-甲醚 Physcion 8.39 醌类 0.30 54 异泽兰黄素 Eupatilin 12.67 酮类 0.30 55 异鼠李素-3-O-新橙皮苷 Isorhamnetin-3-O-neohespeidoside 8.93 酮类 0.29 56 去氢毛钩藤碱 Hirsuteine 10.89 生物碱类 0.29 57 对香豆酸甲酯 Methyl 4-hydroxycinnamate 11.31 NULL 0.28 58 斑蝥素 Cantharidin 7.69 NULL 0.27 59 樟脑 Camphor 9.11 萜类 0.27 60 野黄芩苷 Scutellarin 7.72 酮类 0.24 61 脱落酸 (+)-Abscisic acid 9.20 NULL 0.23 62 马鞭草苷 Verbenalin 6.20 萜类 0.22 63 木犀草素B Calceolarioside B 8.56 苯丙素类 0.21 64 供应连翘酯苷 Forsythiaside 8.38 苯丙素类 0.21 65 异樱花苷 Isosakuranin 10.18 酮类 0.21 66 橘皮素 Tangeretin 12.09 酮类 0.19 67 千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 Oroxyloside 10.64 酮类 0.19 68 异鼠李素 Isorhamnetin 11.81 酮类 0.19 69 七叶内酯 Esculetin 7.74 香豆素类 0.19 70 黄豆黄素 Glycitein 11.33 酮类 0.19 71 连翘酯苷E Forsythoside E 8.13 苯丙素类 0.19 72 杜鹃素 Farrerol 11.50 酮类 0.18 73 艾黄素 Artemetin 13.12 酮类 0.18 74 7-甲氧基-4-甲基香豆素 7-Methoxy-4-methylcoumarin 13.84 NULL 0.18 75 6''-O-乙酰黄豆黄苷 6-O-Acetylglycitin 9.63 酮类 0.18 76 桃叶珊瑚苷 Aucubin 5.61 萜类 0.18 77 钩藤碱 Mitrinermine 9.82 生物碱类 0.17 78 松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷 Pinoresinol 4-O-beta-D-glucopyranoside 8.88 木脂素类 0.17 79 圣草次苷 Eriocitrin 8.22 酮类 0.16 80 内华达素 Nevadensin 12.68 酮类 0.16 81 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷 Miquelianin 7.96 酮类 0.15 82 异嗪皮啶 Isofraxidin 9.23 香豆素类 0.15 83 花椒素 Xanthoxylin 9.56 酚类 0.14 84 柴胡皂苷D Saikosaponin D 12.32 萜类 0.14 85 对甲氧基苯乙酸 4-Methoxyphenylacetic acid 7.74 NULL 0.13 86 奎尼酸 Quinic acid 6.10 NULL 0.13 87 紫花前胡苷 Nodakenin 10.49 香豆素类 0.13 88 5-羟基-1-四氢萘酮 5-Hydroxy-1-tetralone 7.30 NULL 0.12 89 橄榄苦苷 Oleuropein 7.31 萜类 0.12 90 毛钩藤碱 Hirsutine 11.17 生物碱类 0.12 91 3,5-二咖啡酰奎宁酸 3,5-Dicaffeoylquinic acid 6.96 苯丙素类 0.11 92 丹皮酚 Paeonol 11.26 酚类 0.11 93 8-O-乙酰哈巴苷 8-O-Acetylharpagide 6.97 萜类 0.11 94 亚麻木酚素 Seco-isolariciresinol diglucoside 6.72 木脂素类 0.11 95 芸香柚皮苷 Narirutin 7.46 酮类 0.10 96 咖啡酸乙酯 Ethyl caffeate 11.19 苯丙素类 0.10 97 异樱花素 Isosakuranetin 12.90 酮类 0.09 98 甘草查尔酮B Licochalcone B 11.68 酮类 0.09 99 芥子酸 Sinapic acid 10.66 苯丙素类 0.08 100 忍冬苷 Lonicerin 8.26 酮类 0.08 101 二氢白藜芦醇 Dihydroresveratrol 8.39 酚类 0.08 102 柳穿鱼素 Pectolinarigenin 12.50 酮类 0.08 103 灯盏花乙素甲酯 Scutellarin methylester 9.35 酮类 0.08 104 2-丙烯 2-Propenal 9.94 苯丙素类 0.07 105 丹皮酚原苷 Paeonolide 4.54 酚类 0.06 106 异绿原酸B Isochlorogenic acid b 5.85 苯丙素类 0.06 107 蔓荆子黄素 Casticin 12.11 酮类 0.06 108 山姜素 Alpinetin 8.51 酮类 0.05 109 紫胶桐酸 alpha-Aleuritic acid 11.11 NULL 0.05 110 柠檬酸 Citric acid 3.94 NULL 0.04 111 洛塞琳 Rosarin 5.20 苯丙素类 0.03 112 水合氧化前胡素 Oxypeucedanin hydrate 10.77 香豆素类 0.03 113 罗汉果黄素 Grosvenorin 8.35 酮类 0.03 114 椭圆玫瑰树碱 Ellipticine 11.16 NULL 0.03 115 车叶草苷酸 Asperulosidic acid 6.73 萜类 0.03 116 麦角甾苷 Verbascoside 8.93 苯丙素类 0.02 117 芹菜素-7-O-（2G-鼠李糖）龙胆糖苷 Apigenin 7-O-(2G-Rhamnosyl) Gentiobioside 7.92 酮类 0.02 118 苦玄参苷IB Picfeltarraenin IB 13.95 萜类 0.02 119 苔黑酚龙胆二糖苷 Orcinol gentiobioside 3.41 酚类 0.02 120 异黄芪皂苷I Isoastragaloside I 13.37 萜类 0.02 121 草夹竹桃苷 Androsin 5.31 NULL 0.01 122 野鸢尾黄素 Irigenin 11.37 酮类 0.01 123 柯诺辛B Corynoxine B 6.14 生物碱类 0.01 124 党参炔苷 Lobetyolin 5.82 NULL 0.00 125 黄芪异黄烷苷 Isomucronulatol 7-O-glucoside 9.43 酮类 0.00 注：“NULL”代表其他类型化合物。 2.2 靶点筛选结果分析
对兴安升麻活性成分的定性定量分析并不能确切证明其疗效，也难以确定发挥治疗功效的有效成分及作用机制，因此基于网络药理学进行靶点筛选及预测，进而分析其促愈作用机制。
2.2.1 化学成分靶点筛选及预测结果
对兴安升麻的125种化学成分进行类药性筛选，并查阅文献[24−25]，保留可能与“促进皮肤伤口愈合”相关性较高的化学成分，最终筛选共得到99种有效成分，并筛选及预测到860个目标靶点。
2.2.2 疾病靶点筛选及预测结果
以“skin wound”为关键词，利用GeneCards、OMIM和DrugBank数据库分别筛选出622、215和44个疾病靶点，经整理去重后获得804个相关靶点。
2.2.3 成分-疾病交集靶点筛选结果
由图1可知，兴安升麻有效成分靶点与皮肤伤口靶点取交集后共得到159个交集靶点，其为兴安升麻促进皮肤伤口愈合的相关靶点。
2.3 “药物-成分-疾病-靶点”网络图构建结果分析
对兴安升麻有效成分进行编码（表2），将药物、成分、疾病及靶点关系导入Cytoscape3.9.0构建网络图。如图2所示，去除相互作用较弱的游离点，图中共有256个节点，粉色箭头状节点代表兴安升麻，紫色圆形节点代表95种有效成分，绿色箭头状节点代表皮肤伤口，蓝色圆形节点代表159个靶点；1049条边代表节点之间的相互关系。分析发现，兴安升麻中不同的有效成分可作用于一个或多个靶点，说明兴安升麻的多成分、多靶点作用于促进皮肤伤口愈合的特性。以Degree值为判断标准（Degree值≥25），前20种与靶点相关性较强的兴安升麻茎叶有效成分包括：橘皮素、山姜素、5-去甲川陈皮素、高车前素、甘草查尔酮B、内华达素、甜橙黄酮、艾黄素、金腰乙素、异泽兰黄素、异鼠李素、柳穿鱼素、大黄素-甲醚、芥子酸、蔓荆子黄素、美迪紫檀素、紫胶桐酸、二氢白藜芦醇、木兰花碱、木香内酯，这些物质大多数为酮类化合物，还有少量的苯丙素类、生物碱类及酚类化合物。以Degree值为判断标准（Degree值≥18），前20个与兴安升麻茎叶有效成分相关性较强的靶点包括：CYP19A1、EGFR、MMP13、MMP2、ABCB1、MMP12、PTGS2、MMP9、TYR、MET、ALOX5、CYP1B1、ESR1、MMP1、TERT、KDR、SRC、MMP8、F2、AR。其中，EGFR、KDR、F2靶点可能在此过程中发挥重要作用。
表 2 兴安升麻茎叶有效成分编码表Table 2. Coding table of active ingredients of the stems and leaves of Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.有效成分 编码 有效成分 编码 脱落酸 XASM1 黄豆黄素 XASM49 高丽槐素 XASM2 罗汉果黄素 XASM50 阿格拉宾 XASM3 橘皮苷 XASM51 穿心莲内酯 XASM4 毛钩藤碱 XASM52 圣草次苷 XASM5 高车前素 XASM53 杜鹃素 XASM6 野鸢尾黄素 XASM54 山姜素 XASM7 异麦角甾苷 XASM55 千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 XASM8 异嗪皮啶 XASM56 3,5-二咖啡酰奎宁酸 XASM9 异鼠李素 XASM57 对甲氧基苯乙酸 XASM10 异鼠李素-3-O-新橙皮苷 XASM58 4-甲氧基水杨酸 XASM11 异樱花素 XASM59 5-羟基-1-四氢萘酮 XASM12 异樱花苷 XASM60 5-羟甲基糠醛 XASM13 益母草碱 XASM61 5-去甲川陈皮素 XASM14 甘草查尔酮B XASM62 7-甲氧基-4-甲基香豆素 XASM15 有机酸 XASM63 8-O-乙酰哈巴苷 XASM16 忍冬苷 XASM64 紫胶桐酸 XASM17 木兰花碱 XASM65 草夹竹桃苷 XASM18 美迪紫檀素 XASM66 艾黄素 XASM19 橄榄苦苷 XASM67 车叶草苷酸 XASM20 去氢毛钩藤碱 XASM68 白术内脂III XASM21 对香豆酸甲酯 XASM69 桃叶珊瑚苷 XASM22 美迪紫檀苷 XASM70 丁基酞内酯 XASM23 木香内酯 XASM71 木犀草素B XASM24 钩藤碱 XASM72 樟脑 XASM25 芸香柚皮苷 XASM73 斑蝥素 XASM26 内华达素 XASM74 蔓荆子黄素 XASM27 木蝴蝶苷A XASM75 绿原酸 XASM28 丹皮酚 XASM76 金腰乙素 XASM29 丹皮酚原苷 XASM77 松脂醇 XASM30 柳穿鱼素 XASM78 异绿原酸B XASM31 大黄素-甲醚 XASM79 柯诺辛B XASM32 普尔马汀 XASM80 隐绿原酸 XASM33 奎尼酸 XASM81 姜黄烯醇 XASM34 棉子糖 XASM82 莪术二酮 XASM35 洛塞琳 XASM83 洋蓟素 XASM36 柴胡皂苷D XASM84 香风草甙 XASM37 野黄芩苷 XASM85 二氢白藜芦醇 XASM38 洋川芎内酯 XASM86 椭圆玫瑰树碱 XASM39 芥子酸 XASM87 七叶内酯 XASM40 甜橙黄酮 XASM88 咖啡酸乙酯 XASM41 当归甙 XASM89 尼泊金乙酯 XASM42 辛弗林 XASM90 异泽兰黄素 XASM43 丁香醛 XASM91 阿魏酸 XASM44 橘皮素 XASM92 供应连翘酯苷 XASM45 麦角甾苷 XASM93 连翘酯苷E XASM46 马鞭草苷 XASM94 白蜡树精 XASM47 花椒素 XASM95 人参皂苷 XASM48 2.4 蛋白相互作用网络构建结果分析
根据兴安升麻促进皮肤伤口愈合的作用靶点，结合他们之间的蛋白相互作用，利用Cytoscape3.9.0构建交集靶点的蛋白互作网络图。如图3a所示，图中共有150个节点代表不同靶点，1300条边代表靶点间的相互关系，图中节点由大到小、颜色由紫到黄代表节点degree值逐渐减小。如图3b所示，排名前20的PPI核心靶点依次为：SRC、STAT3、EGFR、HRAS、TP53、AKT1、MAPK3、CTNNB1、PIK3R1、VEGFA、TNF、PIK3CA、MAPK1、JUN、IL1B、NRAS、MAPK8、RELA、MMP9、PTK2，这些靶点可能在兴安升麻促进皮肤伤口愈合靶标网络中发挥重要作用。
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图 3 “成分-疾病”PPI分析网络图（a）和核心靶点网络图（b）Figure 3. Network diagram (a) and core target network diagram (b) of the PPI analysis of ''component-disease''2.5 GO和KEGG富集结果分析
如图4所示，对核心靶点进行GO富集分析，选取显著性较强的前15条相关联术语做可视化分析，从左到右P值逐渐增大、显著性逐渐减弱；柱状图的长度越长，富集的差异基因数量越多。
结果表明，在生物过程方面，共有221条相关联术语，主要参与蛋白质磷酸化的正调控（positive regulation of protein phosphorylation）、ERBB2信号通路（ERBB2 signaling pathway）、Fc-ε受体信号通路（Fc-epsilon receptor signaling pathway）、凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）、表皮生长因子受体信号通路（epidermal growth factor receptor signaling pathway）等过程；在细胞组件方面，共有29条相关联术语，主要存在于胞浆（cytosol）、细胞核（nucleus）、粘着斑（focal adhesion）、蛋白质复合物（protein complex）、细胞膜（caveola）等组件中；在分子功能方面，共有44条相关联术语，主要涉及相同的蛋白质结合（identical protein binding）、激酶活性（kinase activity）、转录因子结合（transcription factor binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、酶结合（enzyme binding）等分子功能。
将核心靶点进行KEGG通路富集分析，共富集到106条相关联通路，如图5所示，选取显著性较强的前20条通路做可视化分析，颜色由粉到蓝代表P值逐渐增大、显著性逐渐减弱；圆形图越大，富集的差异基因个数越多。结果显示，富集到的相关信号通路主要包括癌症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、乙型肝炎（Hepatitis B）、癌症的途径（Pathways in cancer）、ErbB信号通路（ErbB signaling pathway）、丙型肝炎（Hepatitis C）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、催乳素信号通路（Prolactin signaling pathway）、子宫内膜癌（Endometrial cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、VEGF信号通路（VEGF signaling pathway）、粘着斑（Focal adhesion）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）等。认为经兴安升麻介导后，VEGF、EGFR和TNF信号通路可能通过调控相关因子和蛋白的表达，在促进皮肤伤口愈合方面发挥重要作用。
3. 讨论与结论
兴安升麻在我国资源丰富，种植广泛，作为一种药食同源植物在河北地区深受人们喜爱。前期研究发现，兴安升麻能够有效促进皮肤伤口愈合[14]。皮肤创伤修复是一项复杂而精密的动态过程，利用信号网络进行精准的执行和调控；而网络药理学是一个基于信息检索、数据分析及网络构建的领域。因此本研究基于网络药理学进一步分析了兴安升麻对皮肤伤口的促愈机制，发现兴安升麻的多成分、多靶点作用于促进皮肤伤口愈合的特性；其中橘皮素、山姜素、5-去甲川陈皮素等成分可能在促进皮肤伤口愈合过程中发挥重要作用。已有研究证实以橘皮素为主要多酚物质的小花山奈具有抗氧化和抗炎活性，能够抗皮肤炎症[26]；山姜素能够有效减轻溃疡性结肠炎小鼠肠道炎症，并改善小鼠肠上皮屏障功能[27]；5-去甲川陈皮素也具有抗炎活性，能够抑制小鼠耳部炎症的形成及损伤[28]。“药物-成分-疾病-靶点”分析发现EGFR、KDR、F2靶点也在此过程中发挥重要作用。EGFR基因提供了制造表皮生长因子受体的受体蛋白的指令，能够促进细胞的生长繁殖[29]；KDR基因所编码的蛋白VEGFR-2，是血管生长因子重要信号转导的重要受体，具有调控血管内皮细胞增生、趋化内皮细胞和增加血管通透性等功能[30]；F2基因提供了制造凝血酶原的蛋白质的指令，对细胞生长和分裂、组织修复和新血管形成、血液凝固具有重要作用[31]。通过靶点与疾病的相关分析，认为VEGF、EGFR和TNF信号通路可能通过调控相关因子和蛋白的表达，在促进皮肤伤口愈合方面发挥重要作用。VEGF信号通路是调控心血管生成的重要信号通路，调控与新血管生成相关的下游基因，促进血管内皮细胞的增殖、迁移、存活，控制心血管的生成，促进皮肤伤口愈合[32−33]。EGFR信号通路可以促进表皮细胞、成纤维细胞的增殖和其他生长因子的合成，进而加速皮肤伤口表皮的愈合与再生[34−35]。TNF信号通路通过调控炎症因子和相关蛋白的表达，进而实现伤口清创及愈合[36]。
本研究通过HPLC-MS检测兴安升麻醇提物的化学成分，从中共鉴定出125种化学成分，其中包括大量萜类、苯丙素类、酮类、酚类化合物，以及生物碱类、糖类、醌类、香豆素类和木脂素类等化合物，且隐绿原酸、绿原酸、白术内脂III为含量最高的三种活性成分。进一步基于网络药理学预测其促愈保护作用，结果表明兴安升麻中的活性成分可作用于一个或多个靶点，EGFR、KDR、F2等重要靶点及橘皮素、山姜素、5-去甲川陈皮素等活性成分可能在此过程中发挥重要作用，说明兴安升麻多成分、多靶点作用于促进皮肤伤口愈合的特性；经兴安升麻介导后，VEGF、EGFR和TNF信号通路可能通过调控相关因子和蛋白的表达，发挥对皮肤伤口的促愈作用。本研究结果明确了兴安升麻的活性成分，并基于网络药理学分析了其对皮肤伤口的促愈作用机制，为后续对兴安升麻的开发与应用提供理论支撑。
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图 3 “成分-疾病”PPI分析网络图（a）和核心靶点网络图（b）
Figure 3. Network diagram (a) and core target network diagram (b) of the PPI analysis of ''component-disease''
表 1 兴安升麻醇提物化学成分
Table 1 Chemical compositions of alcohol extracts from Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.
编号 中文名称 英文名称 保留时间（min） 分类 相对含量（%） 1 隐绿原酸 Cryptochlorogenic acid 6.09 苯丙素类 10.50 2 绿原酸 Chlorogenic acid 5.63 苯丙素类 10.27 3 白术内脂III Atractylenolide III 13.40 萜类 8.46 4 莪术二酮 Curdione 12.41 萜类 5.10 5 5-羟甲基糠醛 5-Hydroxymethylfurfural 7.19 NULL 4.77 6 高车前素 Hispidulin 11.43 酮类 4.73 7 巴西苏木素 Brazilin 7.80 酮类 4.23 8 原苏木素 B Protosappanin B 7.58 酚类 4.15 9 辛弗林 Synephrine 5.39 NULL 3.04 10 木香内酯 Micheliolide 13.73 生物碱类 2.73 11 当归甙 Sweroside 7.67 萜类 2.65 12 姜黄烯醇 Curcumenol 11.10 萜类 2.15 13 甜橙黄酮 Sinensetin 12.59 酮类 1.89 14 苍术素 Atractylodin 11.79 NULL 1.59 15 橘皮苷 Hesperidin 9.46 酮类 1.49 16 木犀草素7-葡萄糖苷酸 Luteolin 7-glucuronide 8.52 酮类 1.49 17 普尔马汀 Pulmatin 10.67 醌类 1.32 18 棉子糖 Raffinose 1.68 糖类 1.24 19 5-去甲川陈皮素 5-O-Demethylnobiletin 13.77 酮类 1.17 20 人参皂苷 Ginsenoside 12.57 萜类 1.14 21 有机酸 Loganic acid 5.49 萜类 1.01 22 益母草碱 Leonurine 7.99 生物碱类 0.89 23 耐斯糖 Nystose 2.90 糖类 0.88 24 断氧化马钱苷 Secoxyloganin 7.67 萜类 0.79 25 松脂醇 Pinoresinol 8.88 木脂素类 0.74 26 白蜡树精 Fraxinol 9.25 香豆素类 0.67 27 高丽槐素 Maackiain 8.98 NULL 0.67 28 沉香四醇 Agarotetrol 8.90 酚类 0.66 29 木兰花碱 Magnoflorine 7.72 生物碱类 0.62 30 丁香醛 Syringaldehyde 9.05 酚类 0.59 31 香风草甙 Didymin 10.18 酮类 0.57 32 洋蓟素 Cynarine 7.54 苯丙素类 0.54 33 臭椿酮 Ailanthone 8.72 萜类 0.54 34 蔗糖 Sucrose 2.66 糖类 0.54 35 尼泊金乙酯 Ethylparaben 13.91 酚类 0.50 36 木蝴蝶苷A Oroxin A 8.53 酮类 0.50 37 异麦角甾苷 Isoacteoside 8.66 苯丙素类 0.46 38 美迪紫檀素 Medicarpin 11.01 NULL 0.45 39 黄芪甲苷II Astragaloside II 13.03 萜类 0.43 40 紫花前胡醇 Decursinol 10.49 香豆素类 0.43 41 4-甲氧基水杨酸 4-Methoxysalicylic acid 6.86 酚类 0.39 42 穿心莲内酯 （-）-Parthenolide 10.42 萜类 0.38 43 麦芽五糖 Amylopentaose 1.70 糖类 0.38 44 乙酮 Ethanone 10.48 醌类 0.36 45 阿魏酸 Ferulic acid 7.33 苯丙素类 0.35 46 美迪紫檀苷 Methylnissolin-3-O-glucoside 10.22 酮类 0.35 47 洋川芎内酯 Senkyunolide 13.48 NULL 0.34 48 金腰乙素 Chrysosplenetin 12.94 酮类 0.34 49 阿格拉宾 Arglabin 11.52 生物碱类 0.34 50 维采宁-2 Vicenin 2 7.24 酮类 0.33 51 丁基酞内酯 Butylphthalide 13.85 NULL 0.31 52 瓶子草素 Sarracenin 10.85 萜类 0.31 53 大黄素-甲醚 Physcion 8.39 醌类 0.30 54 异泽兰黄素 Eupatilin 12.67 酮类 0.30 55 异鼠李素-3-O-新橙皮苷 Isorhamnetin-3-O-neohespeidoside 8.93 酮类 0.29 56 去氢毛钩藤碱 Hirsuteine 10.89 生物碱类 0.29 57 对香豆酸甲酯 Methyl 4-hydroxycinnamate 11.31 NULL 0.28 58 斑蝥素 Cantharidin 7.69 NULL 0.27 59 樟脑 Camphor 9.11 萜类 0.27 60 野黄芩苷 Scutellarin 7.72 酮类 0.24 61 脱落酸 (+)-Abscisic acid 9.20 NULL 0.23 62 马鞭草苷 Verbenalin 6.20 萜类 0.22 63 木犀草素B Calceolarioside B 8.56 苯丙素类 0.21 64 供应连翘酯苷 Forsythiaside 8.38 苯丙素类 0.21 65 异樱花苷 Isosakuranin 10.18 酮类 0.21 66 橘皮素 Tangeretin 12.09 酮类 0.19 67 千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 Oroxyloside 10.64 酮类 0.19 68 异鼠李素 Isorhamnetin 11.81 酮类 0.19 69 七叶内酯 Esculetin 7.74 香豆素类 0.19 70 黄豆黄素 Glycitein 11.33 酮类 0.19 71 连翘酯苷E Forsythoside E 8.13 苯丙素类 0.19 72 杜鹃素 Farrerol 11.50 酮类 0.18 73 艾黄素 Artemetin 13.12 酮类 0.18 74 7-甲氧基-4-甲基香豆素 7-Methoxy-4-methylcoumarin 13.84 NULL 0.18 75 6''-O-乙酰黄豆黄苷 6-O-Acetylglycitin 9.63 酮类 0.18 76 桃叶珊瑚苷 Aucubin 5.61 萜类 0.18 77 钩藤碱 Mitrinermine 9.82 生物碱类 0.17 78 松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷 Pinoresinol 4-O-beta-D-glucopyranoside 8.88 木脂素类 0.17 79 圣草次苷 Eriocitrin 8.22 酮类 0.16 80 内华达素 Nevadensin 12.68 酮类 0.16 81 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷 Miquelianin 7.96 酮类 0.15 82 异嗪皮啶 Isofraxidin 9.23 香豆素类 0.15 83 花椒素 Xanthoxylin 9.56 酚类 0.14 84 柴胡皂苷D Saikosaponin D 12.32 萜类 0.14 85 对甲氧基苯乙酸 4-Methoxyphenylacetic acid 7.74 NULL 0.13 86 奎尼酸 Quinic acid 6.10 NULL 0.13 87 紫花前胡苷 Nodakenin 10.49 香豆素类 0.13 88 5-羟基-1-四氢萘酮 5-Hydroxy-1-tetralone 7.30 NULL 0.12 89 橄榄苦苷 Oleuropein 7.31 萜类 0.12 90 毛钩藤碱 Hirsutine 11.17 生物碱类 0.12 91 3,5-二咖啡酰奎宁酸 3,5-Dicaffeoylquinic acid 6.96 苯丙素类 0.11 92 丹皮酚 Paeonol 11.26 酚类 0.11 93 8-O-乙酰哈巴苷 8-O-Acetylharpagide 6.97 萜类 0.11 94 亚麻木酚素 Seco-isolariciresinol diglucoside 6.72 木脂素类 0.11 95 芸香柚皮苷 Narirutin 7.46 酮类 0.10 96 咖啡酸乙酯 Ethyl caffeate 11.19 苯丙素类 0.10 97 异樱花素 Isosakuranetin 12.90 酮类 0.09 98 甘草查尔酮B Licochalcone B 11.68 酮类 0.09 99 芥子酸 Sinapic acid 10.66 苯丙素类 0.08 100 忍冬苷 Lonicerin 8.26 酮类 0.08 101 二氢白藜芦醇 Dihydroresveratrol 8.39 酚类 0.08 102 柳穿鱼素 Pectolinarigenin 12.50 酮类 0.08 103 灯盏花乙素甲酯 Scutellarin methylester 9.35 酮类 0.08 104 2-丙烯 2-Propenal 9.94 苯丙素类 0.07 105 丹皮酚原苷 Paeonolide 4.54 酚类 0.06 106 异绿原酸B Isochlorogenic acid b 5.85 苯丙素类 0.06 107 蔓荆子黄素 Casticin 12.11 酮类 0.06 108 山姜素 Alpinetin 8.51 酮类 0.05 109 紫胶桐酸 alpha-Aleuritic acid 11.11 NULL 0.05 110 柠檬酸 Citric acid 3.94 NULL 0.04 111 洛塞琳 Rosarin 5.20 苯丙素类 0.03 112 水合氧化前胡素 Oxypeucedanin hydrate 10.77 香豆素类 0.03 113 罗汉果黄素 Grosvenorin 8.35 酮类 0.03 114 椭圆玫瑰树碱 Ellipticine 11.16 NULL 0.03 115 车叶草苷酸 Asperulosidic acid 6.73 萜类 0.03 116 麦角甾苷 Verbascoside 8.93 苯丙素类 0.02 117 芹菜素-7-O-（2G-鼠李糖）龙胆糖苷 Apigenin 7-O-(2G-Rhamnosyl) Gentiobioside 7.92 酮类 0.02 118 苦玄参苷IB Picfeltarraenin IB 13.95 萜类 0.02 119 苔黑酚龙胆二糖苷 Orcinol gentiobioside 3.41 酚类 0.02 120 异黄芪皂苷I Isoastragaloside I 13.37 萜类 0.02 121 草夹竹桃苷 Androsin 5.31 NULL 0.01 122 野鸢尾黄素 Irigenin 11.37 酮类 0.01 123 柯诺辛B Corynoxine B 6.14 生物碱类 0.01 124 党参炔苷 Lobetyolin 5.82 NULL 0.00 125 黄芪异黄烷苷 Isomucronulatol 7-O-glucoside 9.43 酮类 0.00 注：“NULL”代表其他类型化合物。 
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表 2 兴安升麻茎叶有效成分编码表
Table 2 Coding table of active ingredients of the stems and leaves of Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.
有效成分 编码 有效成分 编码 脱落酸 XASM1 黄豆黄素 XASM49 高丽槐素 XASM2 罗汉果黄素 XASM50 阿格拉宾 XASM3 橘皮苷 XASM51 穿心莲内酯 XASM4 毛钩藤碱 XASM52 圣草次苷 XASM5 高车前素 XASM53 杜鹃素 XASM6 野鸢尾黄素 XASM54 山姜素 XASM7 异麦角甾苷 XASM55 千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 XASM8 异嗪皮啶 XASM56 3,5-二咖啡酰奎宁酸 XASM9 异鼠李素 XASM57 对甲氧基苯乙酸 XASM10 异鼠李素-3-O-新橙皮苷 XASM58 4-甲氧基水杨酸 XASM11 异樱花素 XASM59 5-羟基-1-四氢萘酮 XASM12 异樱花苷 XASM60 5-羟甲基糠醛 XASM13 益母草碱 XASM61 5-去甲川陈皮素 XASM14 甘草查尔酮B XASM62 7-甲氧基-4-甲基香豆素 XASM15 有机酸 XASM63 8-O-乙酰哈巴苷 XASM16 忍冬苷 XASM64 紫胶桐酸 XASM17 木兰花碱 XASM65 草夹竹桃苷 XASM18 美迪紫檀素 XASM66 艾黄素 XASM19 橄榄苦苷 XASM67 车叶草苷酸 XASM20 去氢毛钩藤碱 XASM68 白术内脂III XASM21 对香豆酸甲酯 XASM69 桃叶珊瑚苷 XASM22 美迪紫檀苷 XASM70 丁基酞内酯 XASM23 木香内酯 XASM71 木犀草素B XASM24 钩藤碱 XASM72 樟脑 XASM25 芸香柚皮苷 XASM73 斑蝥素 XASM26 内华达素 XASM74 蔓荆子黄素 XASM27 木蝴蝶苷A XASM75 绿原酸 XASM28 丹皮酚 XASM76 金腰乙素 XASM29 丹皮酚原苷 XASM77 松脂醇 XASM30 柳穿鱼素 XASM78 异绿原酸B XASM31 大黄素-甲醚 XASM79 柯诺辛B XASM32 普尔马汀 XASM80 隐绿原酸 XASM33 奎尼酸 XASM81 姜黄烯醇 XASM34 棉子糖 XASM82 莪术二酮 XASM35 洛塞琳 XASM83 洋蓟素 XASM36 柴胡皂苷D XASM84 香风草甙 XASM37 野黄芩苷 XASM85 二氢白藜芦醇 XASM38 洋川芎内酯 XASM86 椭圆玫瑰树碱 XASM39 芥子酸 XASM87 七叶内酯 XASM40 甜橙黄酮 XASM88 咖啡酸乙酯 XASM41 当归甙 XASM89 尼泊金乙酯 XASM42 辛弗林 XASM90 异泽兰黄素 XASM43 丁香醛 XASM91 阿魏酸 XASM44 橘皮素 XASM92 供应连翘酯苷 XASM45 麦角甾苷 XASM93 连翘酯苷E XASM46 马鞭草苷 XASM94 白蜡树精 XASM47 花椒素 XASM95 人参皂苷 XASM48
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