Process and Structural Characteristics Analysis of Solid-state Fermentation of Modified Dietary Fiber from Rosa roxburghii Pomace
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摘要: 为提高刺梨果渣利用率，减少资源浪费和环境污染。本研究以刺梨果渣为原料，采用固态发酵改性刺梨果渣膳食纤维（dietary fiber，DF），以可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）与不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）比值（SDF/IDF）为响应值，接种量、发酵温度和发酵时间为考察因素，利用响应面试验优化刺梨果渣最佳发酵工艺，并分析发酵前和发酵后膳食纤维结构特性与理化性质。结果表明，刺梨果渣最佳发酵工艺为：发酵时间为4 d，温度为40 ℃，接菌量为7.5%， SDF/IDF为14.21%±0.42%；理化性质分析表明，发酵后较发酵前持水力、持油力及膨胀力增大；超微结构分析发现，发酵后DF呈现片层状，表面粗糙，结构疏松；红外图谱分析表明，发酵后DF吸收峰强度增大，整体峰型及位置未发生改变，X-射线衍射图谱表明发酵后衍射峰强度减弱，结晶结构未发生变化。刺梨果渣经枯草芽孢杆菌发酵可改变DF结构，并改善其理化特性。Abstract: In order to improve the utilization rate of Rosa roxburghii pomace, reduce resource waste and environmental pollution, this study used Rosa roxburghii pomace as raw material and modified dietary fiber (DF) through solid-state fermentation. The ratio of soluble dietary fiber (SDF) to insoluble dietary fiber (IDF) (SDF/IDF) was used as the response value, inoculation amount, fermentation temperature, and fermentation time were used as factors to optimize the optimal fermentation process of Rosa roxburghii pomace using response surface methodology. The structural characteristics and physicochemical properties of dietary fiber before and after fermentation were analyzed. The results showed that the optimal fermentation process for Rosa roxburghii pomace was as follows: Fermentation time of 4 days, temperature of 40 ℃, inoculation amount of 7.5%, SDF/IDF of 14.21%±0.42%. The analysis of physical showed that the water holding capacity, oil holding capacity, and swelling capacity were increased after fermentation compared to before fermentation. The ultrastructural analysis revealed that DF after fermentation exhibited layered morphology, rough surface, and loose structure. The infrared spectrum analysis showed that the intensity of DF absorption peak increased after fermentation, and the overall peak shape and position remain unchanged. The X-ray diffraction spectrum showed that the intensity of diffraction peak weakens after fermentation, and the crystal structure did not changed. The fermentation of Rosa roxburghii pomace by Bacillus subtilis could alter the structure of DF and improve its physicochemical properties.
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刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）学名缫丝花，又称送春归，为蔷薇科蔷薇属植物[1]，主要分布于我国贵州、云南，海拔500~2500 m的向阳山坡、沟谷、灌木丛的热带及亚热带地区[2]。刺梨为贵州省的优势资源，据2021年报道，全省人工种植面积约156万亩，年产鲜果50万吨，产值达100亿元[3]。目前，刺梨相关产品的开发主要以刺梨汁为原料，榨汁后可产生大量果渣副产物，保守估计贵州省每年产刺梨果渣超过2万吨[4]。刺梨果渣易发霉、腐烂，不易保存，会造成环境污染。
刺梨果渣中含有较多的功能性成分，如膳食纤维（dietary fiber，DF）、维生素C和黄酮类等，其中膳食纤维的含量高达70%以上[4]。膳食纤维是继糖类、脂类、蛋白质、矿物质、维生素和水之后的“第七大营养物质”，据其溶解度不同，分为不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）。IDF可减少排泄物在肠道的驻留时间，具有促进润肠排便的功效[5]；SDF具有降低血脂水平，降低血压，改善血糖控制，减轻体重，改善免疫功能和减少炎症等作用[6]。前人对刺梨果渣中膳食纤维提取工艺做过一些研究，但大多以SDF为评价指标，而刺梨果渣中IDF和SDF对人体均具有一定的有益功效，对植物材料中膳食纤维科学的评价指标应为SDF/IDF。郭京京等[7]和Zhang等[8]均以SDF/IDF为评价指标，分别对沙棘渣、银耳中膳食纤维做出科学评价。本课题组前期研究发现刺梨果渣中SDF含量较低，不利于其果渣资源的二次开发利用[3]。营养学家认为，提高SDF在DF中的比例，可增强膳食纤维的功效[9]。根据膳食纤维的功能和结构特点，采用化学法、酶解法、化学-酶结合法、微生物发酵法等方法可提高SDF含量。其中微生物发酵法具有反应条件温和、污染少、易处理等优点，其又可分为液态发酵与固态发酵，发酵刺梨果渣大多采用微生物液态发酵法，未见固态发酵[2]。微生物固态发酵相较于液态发酵具有水分活度低、易生长、酶活力高、发酵过程无需严格无菌、成本低、易操作、可产生特殊风味、提高营养价值等优点[10]。
本文以SDF/IDF为响应值，筛选刺梨果渣微生物固态发酵发酵优势菌种，采用响应面法对发酵工艺进行优化，以期获得最佳发酵工艺；通过持水性、持油性及膨胀力，分析发酵前后DF理化性质的改变；利用扫描电镜、傅里叶红外光谱及X-射线分析发酵前后DF结构变化。本文旨在提高刺梨果渣SDF/IDF，改善DF理化性质及结构特性，为今后开发刺梨果渣副产品，提高其资源的利用率，减少资源浪费提供技术资料。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜刺梨果渣 国药集团同济堂（贵州）制药有限公司提供；发酵菌种（枯草芽孢杆菌、绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、植物乳杆菌、嗜热链球菌、平菇、灵芝） 中国工业微生物菌种保藏管理中心；耐高温α-淀粉酶（酶活力≥4×104 U/g）、糖苷酶（酶活力≥1.0×105 U/g） 北京索莱宝科技有限公司；酸洗硅藻土 上海麦克林生化科技股份有限公司；其它试剂均为国产分析纯。
XS205型电子天平 瑞士梅特勒公司；L-600型离心机 湘仪离心机有限公司；UV2510PC型紫外分光光度 岛津企业管理（中国）有限公司；D8 Advance粉末X射线衍射仪 布鲁克（北京）科技有限公司；Nicolet iS50 FT-IR傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Fisher公司；日本高分辨冷场发射扫描电镜 日本日立公司。
1.2 实验方法
1.2.1 刺梨果渣固态发酵菌种筛选
1.2.1.1 培养基的配制
MRS培养基、PDA培养基、麦芽汁琼脂培养基、乳酸菌培养基、查氏琼脂培养基等均按照菌种说明书配制。
1.2.1.2 菌种的活化及扩大培养
将从中国工业菌种保藏管理中心购买的菌株枯草芽孢杆菌、绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、植物乳杆菌、嗜热链球菌、平菇、灵芝按照相关说明进行活化处理，然后将活化的菌种转接至2~3代恢复活力。
1.2.1.3 种子液的制备
将恢复活力后的菌株接种于液体摇瓶培养基中，按菌种说明书条件下培养，使其产生大量菌体，作为种子液。
1.2.1.4 刺梨果渣固态发酵菌种筛选
新鲜刺梨果渣：刺梨经国药集团同济堂（贵州）制药有限公司榨汁后得到的废弃物。
以新鲜刺梨果渣为培养基，选取食品发酵常用菌种枯草芽孢杆菌、绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、植物乳杆菌、嗜热链球菌、平菇、灵芝分别进行单菌发酵，对比发酵后SDF/IDF，选取最优发酵菌种。
1.2.1.5 膳食纤维得率测定
参照郑佳欣[11]的酶-重量法，根据公式（1）~（4）测定膳食纤维（DF）、不溶性膳食纤维（IDF）、可溶性膳食纤维（SDF）得率。取干燥至恒重刺梨果渣1 g（m0），加入0.05 mol/L MES-TRIS 缓冲液，磁力搅拌器使混合均匀。先后加入热稳定α-淀粉酶、蛋白酶及淀粉葡萄糖苷酶酶解，过滤，将沉淀先后经70 ℃热水、78 %乙醇、95 %乙醇和丙酮洗涤2次，烘干，即得m1（IDF）；上清液，加入4倍体积95 %乙醇溶液（提前预热至60 ℃），室温下静置12 h，离心，收集沉淀，烘干，即得m2（SDF）。
IDF得率(%)=m1/m0×100 (1) SDF得率(%)=m2/m0×100 (2) DF=IDF+SDF (3) SDF/IDF(%)=m2/m1×100 (4) 1.2.2 刺梨果渣固态发酵工艺优化
1.2.2.1 单因素实验
接菌量对SDF/IDF的影响：每个发酵瓶中加入刺梨果渣20 g，121℃灭菌30 min，发酵温度40 ℃，发酵时间4 d，考察发酵菌种接种量3%，6%，9%，12%，15%对SDF/IDF的影响。
发酵温度对SDF/IDF的影响：每个发酵瓶中加入刺梨果渣20 g，121 ℃灭菌30 min，发酵接菌量6%，发酵时间4 d，分别考察发酵温度25、30、35、40、45 ℃对SDF/IDF的影响。
发酵时间对SDF/IDF的影响：每个发酵瓶中加入刺梨果渣20 g，121 ℃灭菌30 min，发酵接菌量6%，发酵温度40 ℃，分别考察发酵时间2、3、4、5、6 d对SDF/IDF的影响。
1.2.2.2 响应面试验优化发酵工艺
在单因素实验基础上，利用软件Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken试验，设计三因素三水平试验，以发酵时间（A）、发酵温度（B）、接菌量（C）为自变量，SDF/IDF为响应值，优化发酵工艺，设计因素与水平见表1。
表 1 Box-Behnken 试验因素水平Table 1. Factor levels of Box-Behnken experimental
水平因素 A 发酵时间（d） B 发酵温度（℃） C 接菌量（%） −1 3 35 3 0 4 40 6 1 5 45 9 1.2.3 膳食纤维理化性质分析
1.2.3.1 持水力的测定
取0.2 g干燥DF，于15 mL离心管中，称其质量为m0，加入10 mL 蒸馏水，振荡摇匀，静置24 h，8000 r/min 离心10 min，弃掉上清液，称其质量为m1，根据下式计算持水力[12]：
持水力(g/g)=(m1−m0)/0.2 (5) 1.2.3.2 膨胀力的测定
取0.25 g干燥DF，于15 mL试管中，记录体积为V0，加入10 mL蒸馏水，振荡摇匀，静置24 h，记录其膨胀后体积V1，根据下式计算膨胀力[12]：
膨胀力(mL/g)=(V1−V0/0.25) (6) 1.2.3.3 持油力的测定
取0.2 g干燥DF，于离心管中，加入适量植物油，静置24 h，过滤，称湿质量（m1），根据下式计算持油力[12]：
持油力(g/g)=(m1−0.2)/0.2 (7) 1.2.4 膳食纤维的结构表征
1.2.4.1 电镜检测（SEM）
将发酵前和发酵后的DF干燥至质量恒定，取适量DF于扫描电镜下观察其超微结构[9]。
1.2.4.2 傅里叶红外光谱分析（FT-IR）
取适量DF于研钵中，加入溴化钾，充分研磨，装入模具，制成薄片，放入仪器，分析扫描，扫描次数：32次，分辨率：4 cm−1，扫描范围：500~4000 cm−1[13]。
1.2.4.3 X-射线衍射分析（XRD）
取适量DF于样品槽，用玻璃板压实样品，使表面平整，将载样板插入仪器测试底座，测试条件：加载电压40 kV，步宽0.02°，扫描速率4°/min，扫描角度10°~45°[14]。
1.3 数据处理
所有实验数据均平行测定3次，采用SPSS 26.0进行单因素方差分析，P<0.05表示具有统计学意义、Design Expert 8.0.6、Jade进行数据处理与分析，采用Origin 2021 b进行作图。
2. 结果与分析
2.1 固态发酵菌种对刺梨果渣SDF/IDF的影响
由图1可知，除黑曲霉外，其余菌种发酵刺梨果渣后均可使SDF/IDF的比值升高，其中经枯草芽孢杆菌、米曲霉发酵后，SDF/IDF显著增加（P<0.05或P<0.01），说明枯草芽孢杆菌、米曲霉对刺梨果渣膳食纤维有较好的改性作用，且枯草芽孢杆菌的作用效果最显著，因此本研究选取枯草芽孢杆菌为固态发酵菌种。枯草芽孢杆菌具有生长温度范围宽、发酵时间短、菌体自身可合成纤维素酶等优势。张智等[15]采用甘蔗渣制备膳食纤维时，也以枯草芽孢杆菌为发酵菌种，提高了可溶性膳食纤维的得率，同时改善了膳食纤维的结构及理化性质。
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图 1 不同菌种对刺梨果渣SDF/IDF的影响注：与自然发酵相比，*表示有显著性差异（P<0.05）；**表示有极显著性差异（P<0.01）。Figure 1. Effect of different bacterial strains on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace2.2 单因素实验结果
2.2.1 接菌量对SDF/IDF的影响
由图2可知，SDF/IDF随着接种量的增加呈先上升后下降趋势，下降后趋于平缓。当接菌量为6%时，SDF/IDF达到最高为14.71%。当接菌量低于6%时，可能由于菌种量较少导致发酵不彻底，不能将植物细胞壁的致密结构完全破坏，使得SDF的积累量较少；当接菌量高于6%时，SDF/IDF呈下降趋势，可能是因为接种量过大，使得菌种生长繁殖旺盛，导致底物营养物质供应不足，开始逐渐消耗积累的SDF，造成SDF/IDF下降[16−17]。
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图 2 接菌量对刺梨果渣SDF/IDF的影响Figure 2. Effect of bacterial inoculation on SDF/IDFof Rosa roxburghii pomace2.2.2 发酵温度对SDF/IDF的影响
由图3可知，随发酵温度的增加SDF/IDF呈先上升后下降趋势。发酵温度为40 °Ｃ时，SDF/IDF达14.58%。当发酵温度低于40 °Ｃ时，可能是因为环境温度达不到菌种适宜生长温度，生长代谢较慢，产生纤维素酶较少，导致SDF积累量少，使得SDF/IDF降低；当发酵温度超过40 ℃时，可能培养基中水分挥发较快，水分减少，影响菌种的生长，或者由于超过菌种适宜的生长温度，在一定程度上抑制菌种的生长以及纤维素酶的活性[18]，使得SDF/IDF降低，故最佳发酵温度为40 ℃。
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图 3 温度对刺梨果渣SDF/IDF的影响Figure 3. Effect of temperature on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace2.2.3 发酵时间对SDF/IDF的影响
由图4可知，随着发酵时间的延长，SDF/IDF先上升后下降。发酵时间为4 d时SDF/IDF达14.92%。当发酵时间小于4 d时，可能是因为发酵时间过短，菌种数量较少，发酵不完全，也可能是因为发酵时间过短不利于纤维素酶的合成；当发酵时间高于4 d时，可能是因为生成了一些不利于菌体生长的物质，致使菌种活性降低，产生酶减少，也可能是生长到一定阶段后，基质被消耗，培养基中的养分不足以维持其生长，生成的SDF被分解成糖类[19]，进而使其SDF/IDF降低，故最佳发酵时间选择为4 d。
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图 4 发酵时间对刺梨果渣SDF/IDF的影响Figure 4. Effect of fermentation time on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace2.3 响应面试验结果
2.3.1 响应面试验设计与结果
在单因素实验的基础上，运用Box-Behnken试验设计原理，以接种量、发酵温度、发酵时间为自变量，以SDF/IDF为响应值，进行三因素三水平试验，结果见表2。以Design Expert 8.0.6对数据进行分析，得到A、B、C与Y二次回归方程：Y=14.32+0.005A+0.46B+0.33C−0.31AB+0.66AC−0.81BC−1.25A2−1.37B2-0.41C2。由表3可知，P=0.0033<0.01，说明模型极显著。失拟项P=0.0767>0.05，失拟项不显著，表明该模型拟合度较好。模型的决定系数R2=0.9261，调整决定系数R2adj=0.8310，表明该模型试验值与预测值间相关性较高，有83.10%实际数据能用于模型解释；F值越大，反映因素对响应值的影响越大，由此可知各因素对刺梨果渣中SDF与IDF的比值影响大小次序为发酵温度（B）>接种量（C）>时间（A）；一次项B差异显著（P=0.0411<0.05），A（P=0.9791）和C（P=0.1181）差异不显著（P>0.05）；交互项AB（P=0.2773>0.05）差异不显著、AC（P=0.0399）、BC（P=0.0172）均差异显著（P<0.05）；二次项A2（P=0.0017）和B2（P=0.001）差异极显著（P<0.01），C2（P=0.1481>0.05）差异不显著。
表 2 Box-Behnken试验与响应值结果Table 2. Results of Box-Behnken test and response values实验号 发酵时间（d） 发酵温度（℃） 接菌量（%） SDF/IDF（%） 1 3 35 6 10.45±1.28 2 5 35 6 11.21±1.36 3 3 45 6 12.81±2.14 4 5 45 6 12.34±1.38 5 3 40 3 13.17±0.98 6 5 40 3 11.73±1.09 7 3 40 9 12.27±0.62 8 5 40 9 13.46±1.29 9 4 35 3 11.23±0.62 10 4 45 3 12.95±1.11 11 4 35 9 13.75±1.48 12 4 45 9 12.23±1.33 13 4 40 6 13.89±1.20 14 4 40 6 14.31±0.83 15 4 40 6 14.78±1.78 16 4 40 6 14.27±1.01 17 4 40 6 14.36±0.91 表 3 方差分析表Table 3. Analysis of variance方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 23.9 9 2.66 9.74 0.0033 ** A-发酵时间 2×10−3 1 2×10−3 0.7338×10−3 0.9791 B-发酵温度 1.7 1 1.7 6.25 0.0411 * C-接菌量 0.86 1 0.86 3.17 0.1181 AB 0.38 1 0.38 1.39 0.2773 AC 1.73 1 1.73 6.34 0.0399 * BC 2.62 1 2.62 9.63 0.0172 * A2 6.59 1 6.59 24.18 0.0017 ** B2 7.89 1 7.89 28.93 0.001 ** C2 0.72 1 0.72 2.64 0.1481 残差 1.91 7 0.27 失拟项 1.51 3 0.5 5.02 0.0767 不显著 纯误差 0.4 4 0.1 总离度 25.81 16 R2=0.9261 R2adj=0.8310 注：*表示有显著性（P<0.05）；**表示有极显著性（P<0.01）。 2.3.2 响应曲面分析
表3显示，FAB<FAC<FBC，根据F值可知发酵时间与温度的交互作用对刺梨果渣SDF/IDF的干扰最小，而接菌量与温度的交互作用对刺梨果渣SDF/IDF的干扰最大。在响应面图中，等高线的形状为圆形时表示各因素之间的交互作用不显著，若为椭圆形则表示交互作用显著[20]。图5是各因素之间交互作用的三维响应面图和等高线图，AB等高线形状为圆形，应曲面坡度不大，说明两因素间交互作用对刺梨果渣中SDF/IDF的影响显著性不大；从AC等高线图得知，等高线为椭圆形，表明两者的交互作用显著，沿发酵时间轴向等高线的变化密集，沿接菌量轴向等高线的变化稀疏，说明时间比接菌量更能影响刺梨果渣SDF/IDF；BC等高线图近似椭圆形表明两者的交互作用显著，从等高线图得知，沿接菌量轴向等高线的变化密集，沿发酵温度轴向等高线的变化稀疏，说明接菌量比发酵温度更能影响SDF/IDF。
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图 5 各因素交互作用对刺梨果渣 SDF/IDF影响的响应面图注：A：接菌量与发酵温度等高线图；B：接菌量与发酵温度响应面图；C：接菌量与发酵时间等高线图；D：接菌量与发酵时间交互作用响应面图；E：发酵温度与发酵时间等高线图；F：发酵温度与发酵时间交互作用响应面图。Figure 5. Response surface graph of the interaction of various factors on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace2.4 最佳提取条件的预测和验证
经Design-Expert 8.0.6 软件分析，最佳发酵工艺为：发酵时间4.13 d，发酵温度40.03 ℃，接菌量7.48%。从实际操作角度考虑，对最佳发酵条件调整为：发酵时间4 d，发酵温度40 ℃，接菌量7.5%。验证试验测得刺梨果渣SDF/IDF为14.21%±0.42%；说明此响应面法优化得到的刺梨果渣发酵工艺准确可靠。
2.5 刺梨果渣发酵前后膳食纤维理化性质分析
由表4可知，发酵后刺梨果渣的膳食纤维持水力、持油力及膨胀力均高于未发酵组，表明发酵后刺梨果渣膳食纤维的理化性质发生了改变，在持水、持油及膨胀性方面都有所提升。此结果与Wang等[13]的报道相似，这可能与膳食纤维结构改善有关，发酵后膳食纤维结构变得疏松，比表面积增大，使得纤维素与半纤维素中暴露出更多的亲水基团，产生SDF比例增多，持水性增强，同时改善其膨胀性[21−22]。
表 4 发酵前后刺梨果渣DF理化分析Table 4. DF physicochemical analysis of Rosa roxburghii pomace before and after fermentation组别 持水力 膨胀力 持油力 发酵前膳食纤维（UF-DF） 4.06±0.06a 3.13±0.25a 1.16±0.09a 发酵后膳食纤维（F-DF） 5.4±0.27b 6.40±0.17b 1.39±0.04b 注：同列不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。 2.6 刺梨果渣发酵前后膳食纤维结构表征
2.6.1 扫描电子显微镜分析
如图6所示，在相同倍率下对比刺梨果渣发酵前后显微图，UF-DF表面光滑，有少量褶皱，呈现致密、规则结构；F-DF表面出现裂纹，比表面积增大，有颗粒物附着且结构较疏松，呈片状可能是由于发酵产生了纤维素酶并对纤维素进行了降解，改善了微观结构，疏松的结构有利于膳食纤维样品的水化和提高其吸附性能，因此，推测F-DF结构的改变，是导致其持水力、持油力和膨胀力增加的主要原因[23−26]。
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图 6 刺梨果渣膳食纤维扫描电子显微镜图注：A~C为发酵前膳食纤维（UF-DF）；D~F为发酵后膳食纤维（F-DF）。Figure 6. Scanning electron microscopy images of dietary fiber from Rosa roxburghii pomace2.6.2 傅立叶红外光谱分析
由图7可知，发酵前后DF在吸收峰上没有明显变化，仅在吸收强度上存在微小差异，3423 cm−1处出现的吸收峰，可能是由于半纤维素和纤维素-OH基团的振动引起，氢键在分子间形成，F-DF在此处吸收强度比UF-DF强，说明经过发酵处理DF 糖苷键断裂，合成氢键的羟基增多，导致内部缔合的氢键较多[6]。2922 cm−1出现较弱吸收峰，表明-CH和-CH2基团存在，是纤维素的典型结构[27]。1739 cm−1处出现的峰可能是醛或酯中C=O的特征峰，半纤维素的乙酰基和糖醛酸酯基的伸展。1603 cm−1 处出现的峰可能是羰基吸收峰，由C=O键伸缩振动引起，表明其中可能存在糖醛酸[28]。1246~1427 cm−1处的峰与C-H的变角振动有关，说明样品中可能含有木质素，发酵后DF吸收强度减小，这表明可能发酵后DF中木质素含量减少[29]。1035 cm−1的峰是C-O的伸缩振动，通常报道为阿拉伯糖和木聚糖[13]。综上，F-DF的红外谱图相较于UF-DF都有特征吸收峰，仅有部分波长对应吸收强度的差异，表明官能团基本相似，并未产生新的官能团，它们的亲水性基团和其他活性基团在发酵过程中没有发生变化。
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图 7 发酵前（UF-DF）和发酵后（F-DF）刺梨果渣膳食纤维傅里叶红外光谱图Figure 7. Fourier transform infrared spectroscopy of dietary fiber before fermentation (UF-DF) and after fermentation (F-DF) of Rosa roxburghii pomace2.6.3 X射线衍射分析
纤维素晶体结构分为纤维素I- V 5种结晶构型[30]。图8为刺梨果渣 DF发酵前后的XRD图，可以看出2θ在15.34°和22.09°时有明显的结晶衍射峰，且在34.65°处有一个较弱的衍射峰，是纤维素I的典型晶体构型[31]，发酵前后膳食纤维衍射峰的位置没有改变，只有衍射强度差异，这表明发酵并未使膳食纤维的结晶构型发生显著性改变。经Jade 7.0 软件拟合后发现，F-DF相对结晶度为28.25%，UF-DF相对结晶度为36.83%，相对结晶度降低了8.58%，说明发酵处理使纤维素和半纤维素发生降解，破坏了晶体结构，导致结晶度减小[32]；聚合力降低，使这些结构组分溶出或转化为水溶性成分溶出，导致刺梨果渣DF的功能特性的变化[16]。
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图 8 发酵前（UF-DF）和发酵后（F-DF）刺梨果渣膳食纤维X-射线衍射光谱Figure 8. X-ray diffraction spectra of dietary fiber before fermentation (UF-DF) and after fermentation (F-DF) of Rosa roxburghii pomace3. 结论
本研究以刺梨果渣为原料，以枯草芽孢杆菌为菌种进行固态发酵改性膳食纤维，设计单因素实验与响应面法优化发酵工艺，研究发酵时间、温度及接菌量对SDF与IDF的比值影响，得出刺梨果渣最佳发酵工艺为：发酵时间4 d，发酵温度40 ℃，接菌量为7.5%，该条件下SDF与IDF的比值为14.21%±0.42%；分析发酵前后膳食纤维理化性质，发现刺梨果渣发酵后膳食纤维持水力、持油力及膨胀力有所提高；对发酵前后膳食纤维进行扫描电镜、红外光谱及X-射线衍射分析，电子扫描电镜结果显示，发酵后DF结构疏松，表面有颗粒附着，比表面积增大，呈片状，表明发酵处理使刺梨果渣膳食纤维结构发生改变；在发酵前后FT-IR谱图中没有出现新的峰，也没有出现明显峰的位置与数目变化，这表明并未产生新的化学基团，谱图中只存在强度的微小差异，说明是分子内基团数目有所变化，其中1427 cm−1处吸收强度减弱，因此，推测发酵使得刺梨果渣中木质素减少；XRD测定发现，发酵并未改变刺梨果渣I型纤维素的晶体特征，但相比发酵前相对结晶度减弱，这可能是原料中纤维素发生降解，纤维的结晶区和非结晶区被破坏所导致。因此，刺梨果渣经枯草芽孢杆菌固态发酵后，可使SDF/IDF升高，且改善了膳食纤维的理化性质及结构特性。
发酵后刺梨果渣膳食纤维持水力、持油力、膨胀力增强，饱腹感增加；结构疏松，入口更加柔软，促进肠道蠕动，使其成为优质膳食纤维的制备原料，可提高刺梨果渣的利用率，为刺梨果渣的有效利用提供了依据，减少了资源浪费。本研究用单一菌种枯草芽孢杆菌发酵刺梨果渣来改性膳食纤维，但并未研究多菌种混合发酵，有待进一步研究混合菌种发酵对SDF/IDF的影响；除研究刺梨果渣发酵后膳食纤维变化情况外，今后还应对维生素C、黄酮、SOD等成分的变化进行分析，以期对发酵后的刺梨果渣资源进行科学评价。
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图 1 不同菌种对刺梨果渣SDF/IDF的影响
注：与自然发酵相比，*表示有显著性差异（P<0.05）；**表示有极显著性差异（P<0.01）。
Figure 1. Effect of different bacterial strains on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace
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图 2 接菌量对刺梨果渣SDF/IDF的影响
Figure 2. Effect of bacterial inoculation on SDF/IDFof Rosa roxburghii pomace
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图 3 温度对刺梨果渣SDF/IDF的影响
Figure 3. Effect of temperature on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace
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图 4 发酵时间对刺梨果渣SDF/IDF的影响
Figure 4. Effect of fermentation time on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace
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图 5 各因素交互作用对刺梨果渣 SDF/IDF影响的响应面图
注：A：接菌量与发酵温度等高线图；B：接菌量与发酵温度响应面图；C：接菌量与发酵时间等高线图；D：接菌量与发酵时间交互作用响应面图；E：发酵温度与发酵时间等高线图；F：发酵温度与发酵时间交互作用响应面图。
Figure 5. Response surface graph of the interaction of various factors on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace
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图 6 刺梨果渣膳食纤维扫描电子显微镜图
注：A~C为发酵前膳食纤维（UF-DF）；D~F为发酵后膳食纤维（F-DF）。
Figure 6. Scanning electron microscopy images of dietary fiber from Rosa roxburghii pomace
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图 7 发酵前（UF-DF）和发酵后（F-DF）刺梨果渣膳食纤维傅里叶红外光谱图
Figure 7. Fourier transform infrared spectroscopy of dietary fiber before fermentation (UF-DF) and after fermentation (F-DF) of Rosa roxburghii pomace
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图 8 发酵前（UF-DF）和发酵后（F-DF）刺梨果渣膳食纤维X-射线衍射光谱
Figure 8. X-ray diffraction spectra of dietary fiber before fermentation (UF-DF) and after fermentation (F-DF) of Rosa roxburghii pomace
表 1 Box-Behnken 试验因素水平
Table 1 Factor levels of Box-Behnken experimental
水平因素 A 发酵时间（d） B 发酵温度（℃） C 接菌量（%） −1 3 35 3 0 4 40 6 1 5 45 9 
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表 2 Box-Behnken试验与响应值结果
Table 2 Results of Box-Behnken test and response values
实验号 发酵时间（d） 发酵温度（℃） 接菌量（%） SDF/IDF（%） 1 3 35 6 10.45±1.28 2 5 35 6 11.21±1.36 3 3 45 6 12.81±2.14 4 5 45 6 12.34±1.38 5 3 40 3 13.17±0.98 6 5 40 3 11.73±1.09 7 3 40 9 12.27±0.62 8 5 40 9 13.46±1.29 9 4 35 3 11.23±0.62 10 4 45 3 12.95±1.11 11 4 35 9 13.75±1.48 12 4 45 9 12.23±1.33 13 4 40 6 13.89±1.20 14 4 40 6 14.31±0.83 15 4 40 6 14.78±1.78 16 4 40 6 14.27±1.01 17 4 40 6 14.36±0.91
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表 3 方差分析表
Table 3 Analysis of variance
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 23.9 9 2.66 9.74 0.0033 ** A-发酵时间 2×10−3 1 2×10−3 0.7338×10−3 0.9791 B-发酵温度 1.7 1 1.7 6.25 0.0411 * C-接菌量 0.86 1 0.86 3.17 0.1181 AB 0.38 1 0.38 1.39 0.2773 AC 1.73 1 1.73 6.34 0.0399 * BC 2.62 1 2.62 9.63 0.0172 * A2 6.59 1 6.59 24.18 0.0017 ** B2 7.89 1 7.89 28.93 0.001 ** C2 0.72 1 0.72 2.64 0.1481 残差 1.91 7 0.27 失拟项 1.51 3 0.5 5.02 0.0767 不显著 纯误差 0.4 4 0.1 总离度 25.81 16 R2=0.9261 R2adj=0.8310 注：*表示有显著性（P<0.05）；**表示有极显著性（P<0.01）。
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表 4 发酵前后刺梨果渣DF理化分析
Table 4 DF physicochemical analysis of Rosa roxburghii pomace before and after fermentation
组别 持水力 膨胀力 持油力 发酵前膳食纤维（UF-DF） 4.06±0.06a 3.13±0.25a 1.16±0.09a 发酵后膳食纤维（F-DF） 5.4±0.27b 6.40±0.17b 1.39±0.04b 注：同列不同小写字母表示数据差异显著（P<0.05）。
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