Optimization of Microwave-assisted Deep Eutectic Solvent Extraction of Total Flavonoids from Paeonia rockii Seeds and Its Antioxidant Activity
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摘要: 目的：优化紫斑牡丹籽总黄酮的微波辅助深共熔溶剂提取方法，并探究其体外抗氧化活性。方法：以低共熔溶剂作为提取溶剂，采用微波辅助技术提取紫斑牡丹籽中的总黄酮。采用单因素实验以及响应面法进行提取工艺优化。从DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率进行总黄酮的体外抗氧化活性研究。结果：以氯化胆碱作为氢键受体，脲作为氢键供体的低共熔溶剂体系下，在摩尔比为1:3，含水量41.80%（V/V）的深共熔溶剂体系最优，料液比1:19 g/mL，微波功率为110 W，微波时间3.00 min，此时紫斑牡丹籽总黄酮得率为1.76 mg/g。当提取物总黄酮浓度在80 μg/mL时，对DPPH·、羟基自由基的清除率分别为82.00%、42.10%。结论：采用微波辅助深共熔溶剂提取紫斑牡丹籽总黄酮，含量高，均具有抗氧化活性，且对DPPH自由基清除率超80%。Abstract: Objective: To optimize the extraction method of total flavonoids from Peony purpurea seeds with microwave-assisted deep eutectic solvent, and to investigate its antioxidant activity in vitro. Methods: Microwave-assisted technology using deep eutectic solvent as extraction solvent was used to extract total flavonoids from Paeonia rockii seeds. Single factorial experiments and response surface methodology optimized the extraction process. The in vitro antioxidant activity of the total flavonoids was evaluated in terms of the rate of scavenging of DPPH radicals and the rate of scavenging of hydroxyl radicals. Results: Under the deep eutectic solvent system with chloride as hydrogen bond acceptor and urea as hydrogen bond donor, the deep eutectic solvent system with a molar ratio of 1:3 and a water content of 41.80% (V/V) was optimal. The ratio of material to liquid was 1:19 g/mL, the power of the microwave was 110 W and the time of the microwave was 3.00 min. The total flavonoid yield from Paeonia rockii seeds was 1.76 mg/g. When the total flavonoid concentration of the extract was 80 μg/mL, the scavenging rate of DPPH reached 82.00%. And the scavenging rate of hydroxyl radicals was 42.10% when the total flavonoid concentration of the extract was up to 80 μg/mL. Conclusion: Microwave-assisted deep eutectic solvent extraction of total flavonoids from Paeonia rockii seeds has high content, antioxidant activity and DPPH free radical scavenging rate of more than 80%.
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紫斑牡丹（Paeonia rockii）是我国独有的名贵观赏木本植物，香味独特，花色多种多样，主要分布在我国西北地区[1]。紫斑牡丹种油可供食用[2]，籽出油率高，油中富含不饱和脂肪酸[3]。有学者还从紫斑牡丹中分离到10种有抗氧化、消炎作用的芪类物质[4]。有报道紫斑牡丹籽还具有一定的药理功效，如消除炎症，镇痛、止痛，抗氧化等作用[5]。
黄酮类化合物作为植物中最丰富的次级代谢产物，广泛存在于植物各部位中，并已被研究证实具有多种生理活性作用[6−7]。植物总黄酮常用传统有机溶剂作为提取剂，但传统有机溶剂存在易挥发、安全性差、对人体有一定毒性等问题。深共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent，DES）是近年来开发的一种绿色高效的提取溶剂，DES通过氢键受体（如季铵盐）和氢键供体（如酰胺、羧酸、醇等）以一定摩尔比组合，通过分子间氢键作用，熔融成低温共熔混合物，其凝固点低于任一组分纯物质的熔点[8]，因具有无毒、储存方便、不易挥发[9−10]、良好的可设计性和可调控性[11]等优点受到人们的广泛关注，并且其合成成本低，易于处理且不需要纯化，可大规模生产作为黄酮的提取剂，也被普遍用来提取植物中的黄酮[12−15]。
目前对紫斑牡丹籽的研究多以籽产量及籽油品质[16]和酚类中白藜芦醇[17]的研究为主，对紫斑牡丹籽中总黄酮的提取研究未见文献报道。本研究采用深共熔溶剂微波辅助法提取紫斑牡丹籽中的总黄酮，同时通过体外抗氧化试验，以VC作为对照，测定紫斑牡丹籽总黄酮对DPPH·和·OH的清除率。通过本文的创新提取模式，解决紫斑牡丹籽产量大却利用率低，作为农田废弃物的既存问题，同时通过实验为后期开发一系列具有药用价值和护理价值的高附加值产品提供一定的参考价值。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫斑牡丹籽 山东菏泽志恒牡丹芍药；无水乙醇 天津市永大化学试剂有限公司；芦丁对照品 上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠 杭州萧山化学试剂厂；氯化胆碱 上海阿拉丁试剂有限公司；DPPH试剂 上海麦克林生化科技有限公司；水杨酸 上海化学试剂采购供应五联化工厂；硫酸亚铁 衢州巨化试剂有限公司；抗坏血酸 上海易恩化学技术有限公司；乳酸、蔗糖、过氧化氢、亚硝酸钠、硝酸铝、葡萄糖、脲 国药集团化学试剂有限公司；所有试剂均为分析纯；水 超纯水。
FW80高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；SW-80A涡旋混合器 宁波新芝生物科技股份有限公司；L6S紫外可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；EXCEL微波化学反应系统 上海屹尧仪器科技发展有限公司；GL-20G-Ⅱ台式高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；ME204E电子分析天平 梅特勒托利多仪器有限公司；Milli-Q纯水系统 美国密理博公司。
1.2 实验方法
1.2.1 原料预处理
紫斑牡丹籽洗净后置于烘箱中40 ℃干燥至恒重，冷却至室温后放入高速粉碎机中，粉碎过200目筛。放入广口棕色玻璃瓶置于干燥器中存储。
1.2.2 深共熔溶剂的制备
以氯化胆碱为氢键受体，分别加入脲、蔗糖、乙二醇、柠檬酸为氢键供体并按照一定的摩尔比进行混合[18−21]，加入体系体积分数50%的水，在水浴锅中进行加热至70 ℃搅拌直至混合均匀形成透明的无色液体。同理以乳酸为氢健供体，葡萄糖为氢键供体，制取乳酸-葡萄糖体系深共熔溶剂，具体见表1。
表 1 深共熔溶剂的组成Table 1. Composition of the DES序号 氢键受体 氢键供体 摩尔比 1 氯化胆碱 脲 1:2 2 氯化胆碱 蔗糖 1:1 3 氯化胆碱 乙二醇 1:3 4 氯化胆碱 柠檬酸 1:1 5 乳酸 葡萄糖 3:1 1.2.3 紫斑牡丹籽总黄酮的提取
称取一定量粉碎后混合均匀的紫斑牡丹籽粉末，将其与深共熔溶剂混合均匀，利用微波辅助提取，再放入离心机中，以7000 r/min进行离心10 min，再用0.22 μm孔径的滤膜过滤提取上清液，得到紫斑牡丹籽黄酮提取液[21]。
1.2.4 芦丁标准曲线的绘制及总黄酮得率的测定
称取10 mg的芦丁标准品，用50%乙醇水溶液定容至50 mL，摇匀，得到浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准贮备液。参考文献[13,22]方法进行线性范围、回归方程和相关系数的考察，具体过程如下：采用硝酸铝显色法，以芦丁为对照品，在510 nm波长下测定各浓度吸光度A，以芦丁的浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得到线性方程为：y=0.014c+0.029（R2=0.9987），线性范围0~100 μg/mL。
将“1.2.3”提取得到的总黄酮提取液，采用硝酸铝显色法[21−22]进行测定，过程如下：量取紫斑牡丹提取液适量，于10.00 mL比色管中，先用50%乙醇水溶液稀释至5.00 mL，分别加入5% NaNO2试液0.50 mL，摇匀，静置6 min。加5% Al（NO）3试液0.50 mL，摇匀，静置6 min。再加4% NaOH试液4.00 mL，最后用50%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置12 min。于510 nm处测其吸光度。用芦丁测定的标准曲线计算总黄酮得率[13]。计算公式为：
式中，C：样品溶液对应标线上的浓度，mg/mL；V0：样品溶液显色并定容后的总体积，mL；V1：配制溶液的样品液的体积，mL；V2：定容后待测样品溶液体积，mL；m：紫斑牡丹籽质量，g；W：总黄酮得率，mg/g。
1.2.5 单因素实验
1.2.5.1 不同种类的氢键供体对紫斑牡丹籽总黄酮得率的影响
氯化胆碱作为基础的氢键受体，分别将蔗糖、柠檬酸、脲、乙二醇为氢键供体配制深共熔溶剂，额外配制乳酸-葡萄糖体系的深共熔溶剂，各深共熔溶剂摩尔比见表1。体系含水量为50%，紫斑牡丹粉末与深共熔溶剂的料液比1:20 g/mL，在功率为100 W的条件下微波辅助提取3 min，并计算紫斑牡丹籽总黄酮的得率。
1.2.5.2 不同摩尔比对紫斑牡丹籽总黄酮得率的影响
将氯化胆碱和脲分别按摩尔比1:1、1:2、1:3、1:4、1:5配制深共熔溶剂，体系含水量为50%，紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶剂的料液比为1:20 g/mL，在功率为100 W的条件下微波辅助提取3 min，计算紫斑牡丹籽黄酮的得率。
1.2.5.3 深共熔溶剂体系的含水量对紫斑牡丹籽总黄酮得率的影响
将氯化胆碱和脲按摩尔比1:3配制深共熔溶剂，设置体系含水量分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%，在紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶剂的料液比为1:20 g/mL，微波功率为100 W的条件下微波提取3 min，计算紫斑牡丹籽黄酮的得率。
1.2.5.4 料液比对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
将氯化胆碱和脲按摩尔比1:3配制深共熔溶剂，体系含水量为40%，紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶剂的料液比分别为1:5、1:10、1:20、1:30、1:40 g/mL，在微波功率为100 W的条件下微波提取3 min，计算紫斑牡丹籽总黄酮的得率。
1.2.5.5 微波功率对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
将氯化胆碱和脲按摩尔比1:3配制深共熔溶剂，体系含水量为40%，紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶剂的料液比为1:20 g/mL，将微波功率分别设为25、50、100、150、200 W，提取3 min，计算紫斑牡丹籽黄酮的得率。
1.2.5.6 微波时间对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
在氯化胆碱和脲按摩尔比1:3配制深共熔溶剂，体系含水量为40%，紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶剂的料液比为1:20 g/mL的条件下，微波功率为100 W的情况下，分别设定提取时间为1、2、3、5、7 min，计算紫斑牡丹籽黄酮的得率。
1.2.6 响应面试验优化试验设计
由单因素实验所得的结果，选取四个因素：含水量、料液比、微波功率和微波时间设计Box-Behnken响应面试验[23]，并利用软件Design-Expert 11来设计4因素3水平的优化试验，见表2。
表 2 Box-Behnken试验设计因素及水平Table 2. Design factors and level of Box-Behnken test水平 因素 A：含水量
（%）B：料液比
（g/mL）C：微波功率
（W）D：微波时间
（min）−1 30 1:10 50 1.0 0 40 1:20 100 3.0 1 50 1:30 150 5.0 采用4因素3水平的Box-Behnken结合响应面对单因素实验参数进行优化，考察含水量（%）、料液比（g/mL）、微波功率（W）和微波时间（min）4个因素在不同水平组合下对紫斑牡丹籽总黄酮得率的影响。
1.2.7 紫斑牡丹黄酮抗氧化性研究
1.2.7.1 DPPH·清除率测定
将紫斑牡丹籽总黄酮提取液配制不同浓度溶液（10、20、30、40、60和80 μg/mL）1.00 mL和2.00 mL的0.10 mmol/L的DPPH[17]工作液，均匀混合在避光处反应30 min，随后在波长517 nm检测样品吸光度，平行测定三组并取平均值，以等浓度的抗坏血酸（VC）作为阳性对照组。DPPH·清除率[24]计算公式如下：
式中：A1为加入提取物的吸光值；A2为本底吸收的吸光值；A3为空白溶液的吸光值。
1.2.7.2 羟基自由基清除率测定
为探究·OH的清除率[25]，首先分别将紫斑牡丹籽总黄酮提取液配制等浓度梯度的样品溶液（10、20、30、40、60、80 μg/mL），再向试管中依次加入1 mL 5.0 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL 5.0 mmol/L的H2O2溶液，混合均匀后静置10 min，再加入1 mL 2.5 mmol/L的水杨酸醇溶液，将其放置于37 ℃水浴锅中进行避光反应30 min。以蒸馏水代替样品溶液配制空白溶液在510 nm处测定吸光度，同浓度样品平行测定三次。以同浓度的VC溶液作阳性对照。·OH清除率计算公式如下：
式中：A1为加入提取物的吸光值；A2为本底吸收的吸光值；A3为空白溶液的吸光值。
1.3 数据处理
采用Design-Expert 8.0.6软件作图，对结果进行相应的响应面分析，并用Origin 2019b进行数据处理和分析，所得的所有实验都重复三次并取平均值。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 不同种类的氢键供体对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
由图1可得，以氯化胆碱作为氢键受体，脲作为氢键供体时，黄酮得率最高。氯化胆碱-乙二醇、乳酸-葡萄糖、氯化胆碱-柠檬酸三者的黄酮提取效果接近且次之。深共熔溶剂制备时氯化胆碱和脲中的乙酰胺之间形成氢键，溶质分子和深共熔溶剂之间的静电键和氢键的相互作用被pH影响，从而对黄酮的提取起到重要作用[19]。而黄酮类化合物多含酚羟基呈酸性，酸碱的中和，所以总黄酮得率最高的氢键供体是酰胺类。综上所述，应选择氯化胆碱和脲来制备深共熔溶剂。
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图 1 不同种类的氢键供体对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响Figure 1. Effects of different hydrogen bond donors on the yield of flavonoids in Paeonia rockii seeds2.1.2 深共熔溶剂体系的摩尔比对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
在同一体系的深共熔溶剂条件下，实验中随着氢供体的增加（1:1~1:3）得率逐渐升高，且在1:3达到最高，随着氢供体继续增加，摩尔比达到1:4~1:5后得率下降（图2）。主要是氢供体过多导致深共熔溶剂与总黄酮的结合力下降所致。当脲作为氢键供体，氯化胆碱作为氢键受体时，以摩尔比1:3构建的深共熔溶剂体系中紫斑牡丹籽黄酮得率最高。
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图 2 不同摩尔比对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响Figure 2. Effects of different molar ratio on yield of flavonoids in Paeonia rockii2.1.3 深共熔溶剂体系的含水量对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
由图3可知，随着含水量增加，紫斑牡丹籽黄酮类化合物得率呈现出先上升后下降的趋势。当深共熔溶剂体系的含水量达到40%时，紫斑牡丹籽的黄酮得率达到最大。这是因为适当的加入水能降低提取剂的粘度[20]，调节了提取剂的极性，增大了接触面积，从而使氯化胆碱-脲的深共熔溶剂体系与样品充分混合，提高提取效率；当深共熔溶剂的含水量过多，则会在结合集团饱和之后导致深共熔溶剂浓度下降，过量的水降低了溶剂和黄酮类化合物之间的相互作用力，使得黄酮得率降低。故选定深共熔溶剂体系的含水率为40%。
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图 3 深共熔溶剂体系的含水量对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响Figure 3. Effects of water content in deep eutectic solvent system on yield of flavonoid of Paeonia rockii seeds2.1.4 料液比对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
料液比在1:20 g/mL之前，随着料液比增加，紫斑牡丹籽的黄酮得率增大，并在料液比1:20 g/mL时达到最大，之后黄酮得率随着料液比的增加而降低且趋势逐渐趋于平缓，见图4。可能是因为前期由于提取溶剂适量的增加从而增大了紫斑牡丹籽粉末和溶剂的接触面积，故黄酮得率呈现上升趋势，而料液比1:20 g/mL之后，料液比的增加也使得提取时的含水量增加，体系发生稀释，所以降低了得率。因此，选择料液比为1:20进行后续实验。
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图 4 料液比对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响Figure 4. Effects of the ratio of material to liquid on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds2.1.5 微波功率对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
由图5可以看出，紫斑牡丹籽的黄酮得率随着微波功率上升到50 W时有着明显的升高，再平缓的上升至100 W时达到最大，后黄酮得率逐渐降低。这可能是因为微波功率增大后，温度升高，深共熔溶剂的粘度降低，使得其和紫斑牡丹种子粉末混合的更加均匀充分，提高了黄酮的提取率，之后随着微波功率的增大，其他杂质析出，从而降低了黄酮得率。综合考虑，选取微波功率为100 W进行后续实验。
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图 5 微波功率对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响Figure 5. Effects of microwave power on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds2.1.6 微波时间对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
微波时间对紫斑牡丹籽总黄酮的提取影响见图6，随着微波提取时间的增长，紫斑牡丹籽粉末的黄酮得率逐渐增加。当微波时间到达3 min时，此时黄酮提取率达到最大。随着时间的延长又逐渐降低。其原因可能是前期因为提取时间不够故黄酮类化合物析出不充分，提取不彻底，后因时间过长[26]导致除黄酮类化合物外还有其他杂质析出。对比各微波时间下的黄酮得率，故选取了微波时间在3 min时，进行实验操作。
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图 6 微波时间对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响Figure 6. Effects of microwave time on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds2.2 响应面试验结果
在上述单因素实验中，本文进行了摩尔比、含水量、料液比、微波功率和微波时间对紫斑牡丹籽总黄酮得率的影响摸索，黄酮得率变化范围大小的排序是微波功率>含水量>料液比=摩尔比>微波时间。考虑到合成出来的氯化胆碱-脲体系深共熔溶剂在摩尔比（1:3~1:4）的黏度都比较大，实验过程中过0.22 µm滤膜较难，故不将摩尔比纳入接下来的响应面试验参数中。
2.2.1 响应面试验设计方案及结果分析
利用Box-Behnken实验设计得到的结果见表3。采用Design-Expert 8.0.6软件对其中的各项条件进行响应面分析，通过数据分析，进行多元回归拟合的方程模型为：R=1.73+0.050A−0.027B+0.018C−0.0014D−0.0053AB+0.0048AC+0.013AD−0.057BC−0.0045BD+0.002CD−0.14A2−0.24B2−0.062C2−0.11D2。
表 3 响应面试验结果Table 3. Results of response surface experiment试验号 A B C D 黄酮得率（mg/g） 1 0 −1 0 1 1.410 2 1 0 0 −1 1.520 3 −1 0 0 −1 1.418 4 1 0 0 1 1.540 5 0 −1 0 −1 1.40 6 0 0 −1 1 1.580 7 0 0 0 0 1.732 8 −1 0 1 0 1.500 9 0 0 0 0 1.738 10 0 1 0 1 1.324 11 0 0 −1 −1 1.588 12 1 1 0 0 1.443 13 0 0 0 0 1.747 14 0 1 1 0 1.333 15 −1 0 0 1 1.387 16 1 −1 0 0 1.430 17 0 0 0 0 1.721 18 −1 1 0 0 1.342 19 −1 0 −1 0 1.470 20 0 −1 1 0 1.557 21 0 0 0 0 1.713 22 0 1 0 −1 1.332 23 0 1 −1 0 1.386 24 0 −1 −1 0 1.380 25 −1 −1 0 0 1.308 26 1 0 1 0 1.568 27 0 0 1 −1 1.590 28 1 0 −1 0 1.519 29 0 0 1 1 1.590 由表4可得，模型的F值19.62，显示模型的建立是有效的；同时模型的P<0.0001，说明本实验中该模型极显著；一次项A影响极显著（P<0.01）；交互项BC显著（P<0.05），AB、AC、AD、BD、CD影响均不显著（P>0.05）；A2、B2、C2、D2影响极显著（P<0.01）。决定系数R2=0.9515，由此可得该模型拟合的情况良好，能较好地反映含水量、料液比、微波功率、微波时间之间的关系，可以用来预测紫斑牡丹籽黄酮的提取率，且根据F值可判断各响变量对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响大小为：含水量>料液比>微波功率>微波时间。
表 4 响应面二次模型方差法Table 4. Response surface quadratic model variance method方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型项 0.53 14 0.038 19.62 <0.0001 ** A 0.030 1 0.030 15.34 0.0015 ** B 0.0088 1 0.0088 4.58 0.0505 C 0.0039 1 0.0039 2.00 0.1788 D 0.000024 1 0.000024 0.013 0.9125 AB 0.00011 1 0.0001 0.057 0.8142 AC 0.00009 1 0.00009 0.047 0.8316 AD 0.00065 1 0.00065 0.34 0.5701 BC 0.013 1 0.013 6.88 0.0201 * BD 0.00008 1 0.00008 0.042 0.8403 CD 0.00002 1 0.00002 0.009 0.9286 A2 0.14 1 0.14 70.30 <0.0001 ** B2 0.39 1 0.39 201.43 <0.0001 ** C2 0.029 1 0.029 15.31 0.0016 ** D2 0.086 1 0.086 44.70 <0.0001 ** 残差 0.027 14 0.0019 失拟项 0.024 10 0.0024 3.2 0.1368 纯误差 0.003 4 0.0007 总误差 0.56 28 决定系数R2 0.9515 2.2.2 各个因素相互作用的响应曲面图
图7为含水量、料液比、微波功率和微波时间4个因素的交互作用对紫斑牡丹籽黄酮得率影响的响应曲面图和等高线图[27]。响应面的曲面越陡，表示两因素的交互作用越显著。趋向于椭圆的等高线可以表示两因素交互作用显著性越强，趋向圆形的等高线相反。由图可得含水量（A）、料液比（B）、微波功率（C）和微波时间（D）与总黄酮得率具有抛物线关系。BC等高线图趋于椭圆形，且趋势线连接的较为紧密，因此BC交互作用显著；而AB、CD则呈圆形趋势，且趋势线连接的并不紧密，无明显交互作用。
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图 7 各因素交互作用对牡丹籽黄酮得率影响的响应面图Figure 7. Response surface plots of the effcets of interaction among factors on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds2.2.3 验证实验
根据Box-Behnken试验得到的结果和回归方程，预测试验范围内紫斑牡丹籽总黄酮的提取最佳工艺条件为：含水量41.83%，料液比1:19.19 g/mL，微波功率109.47 W，微波时间3.02 min，在此条件下的黄酮得率为1.74 mg/g。考虑到仪器参数的限制、实验的可操作性等问题，将最优的工艺条件修正为含水量41.80%，料液比1:19 g/mL，微波功率110 W，微波时间3.00 min，在此条件下进行验证实验，重复试验3次，得到的紫斑牡丹籽总黄酮得率为1.76 mg/g，与理论值接近，说明本研究优化得到的紫斑牡丹籽总黄酮的提取工艺参数是可靠的，可以拟合实际提取。
2.3 紫斑牡丹籽总黄酮的抗氧化性
2.3.1 清除DPPH·能力
由图8可知，无论是样品溶液还是VC对照溶液的DPPH·清除能力都随着溶液浓度的增大清除率变强，样品溶液在0~40 μg/mL浓度范围内呈现出良好的线性关系[28−29]。且样品溶液浓度在40 μg/mL时清除率达到稳定状态，再继续加大溶液浓度，清除率变化不大。虽然低于VC溶液，但其在80 μg/mL清除率也达到了近82.00%。
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图 8 紫斑牡丹籽总黄酮对DPPH·清除能力Figure 8. DPPH· scavenging ability of flavonoids in Paeonia rockii seeds2.3.2 羟自由基清除率测定
紫斑牡丹籽总黄酮类化合物清除·OH的清除率见图9，在10~40 μg/mL之间浓度时样品溶液的羟基自由基清除率呈现一个比较快的上升趋势[30]。溶液浓度到40 μg/mL时的羟基自由基清除率为38%，此后，再继续加大溶液浓度，清除率变化不明显，在80 μg/mL浓度时的羟基自由基清除率为42.10%，仅上升了4%。总体看样品溶液对羟基自由基的清除率随着样品溶液浓度的增加呈增大趋势[31]。
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图 9 紫斑牡丹籽总黄酮对·OH清除能力Figure 9. ·OH scavenging ability of flavonoids in Paeonia rockii seeds3. 结论
本研究以产自山东菏泽的紫斑牡丹籽为研究对象，用微波辅助深共熔溶剂来提取紫斑牡丹籽中的黄酮类物质，在单因素实验基础上采用响应面优化了提取工艺，最佳提取条件为：深共熔溶剂体系为氯化胆碱-脲（摩尔比1:3），含水量41.80%，料液比1:19 g/mL，微波功率110 W，微波时间3.00 min，在此条件下的黄酮得率为1.76 mg/g。在抗氧化实验发现紫斑牡丹籽总黄酮类物质对DPPH·、·OH都具有一定的清除作用，清除能力均随着溶液浓度的升高而变强。本研究通过对紫斑牡丹籽总黄酮提取工艺和体外抗氧化能力的研究，增加了紫斑牡丹籽的利用率，为紫斑牡丹籽深加工和紫斑牡丹籽黄酮开发提供理论依据和数据支持。
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图 1 不同种类的氢键供体对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
Figure 1. Effects of different hydrogen bond donors on the yield of flavonoids in Paeonia rockii seeds
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图 2 不同摩尔比对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
Figure 2. Effects of different molar ratio on yield of flavonoids in Paeonia rockii
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图 3 深共熔溶剂体系的含水量对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
Figure 3. Effects of water content in deep eutectic solvent system on yield of flavonoid of Paeonia rockii seeds
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图 4 料液比对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
Figure 4. Effects of the ratio of material to liquid on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds
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图 5 微波功率对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
Figure 5. Effects of microwave power on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds
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图 6 微波时间对紫斑牡丹籽黄酮得率的影响
Figure 6. Effects of microwave time on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds
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图 7 各因素交互作用对牡丹籽黄酮得率影响的响应面图
Figure 7. Response surface plots of the effcets of interaction among factors on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds
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图 8 紫斑牡丹籽总黄酮对DPPH·清除能力
Figure 8. DPPH· scavenging ability of flavonoids in Paeonia rockii seeds
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图 9 紫斑牡丹籽总黄酮对·OH清除能力
Figure 9. ·OH scavenging ability of flavonoids in Paeonia rockii seeds
表 1 深共熔溶剂的组成
Table 1 Composition of the DES
序号 氢键受体 氢键供体 摩尔比 1 氯化胆碱 脲 1:2 2 氯化胆碱 蔗糖 1:1 3 氯化胆碱 乙二醇 1:3 4 氯化胆碱 柠檬酸 1:1 5 乳酸 葡萄糖 3:1 
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表 2 Box-Behnken试验设计因素及水平
Table 2 Design factors and level of Box-Behnken test
水平 因素 A：含水量
（%）B：料液比
（g/mL）C：微波功率
（W）D：微波时间
（min）−1 30 1:10 50 1.0 0 40 1:20 100 3.0 1 50 1:30 150 5.0
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表 3 响应面试验结果
Table 3 Results of response surface experiment
试验号 A B C D 黄酮得率（mg/g） 1 0 −1 0 1 1.410 2 1 0 0 −1 1.520 3 −1 0 0 −1 1.418 4 1 0 0 1 1.540 5 0 −1 0 −1 1.40 6 0 0 −1 1 1.580 7 0 0 0 0 1.732 8 −1 0 1 0 1.500 9 0 0 0 0 1.738 10 0 1 0 1 1.324 11 0 0 −1 −1 1.588 12 1 1 0 0 1.443 13 0 0 0 0 1.747 14 0 1 1 0 1.333 15 −1 0 0 1 1.387 16 1 −1 0 0 1.430 17 0 0 0 0 1.721 18 −1 1 0 0 1.342 19 −1 0 −1 0 1.470 20 0 −1 1 0 1.557 21 0 0 0 0 1.713 22 0 1 0 −1 1.332 23 0 1 −1 0 1.386 24 0 −1 −1 0 1.380 25 −1 −1 0 0 1.308 26 1 0 1 0 1.568 27 0 0 1 −1 1.590 28 1 0 −1 0 1.519 29 0 0 1 1 1.590
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表 4 响应面二次模型方差法
Table 4 Response surface quadratic model variance method
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型项 0.53 14 0.038 19.62 <0.0001 ** A 0.030 1 0.030 15.34 0.0015 ** B 0.0088 1 0.0088 4.58 0.0505 C 0.0039 1 0.0039 2.00 0.1788 D 0.000024 1 0.000024 0.013 0.9125 AB 0.00011 1 0.0001 0.057 0.8142 AC 0.00009 1 0.00009 0.047 0.8316 AD 0.00065 1 0.00065 0.34 0.5701 BC 0.013 1 0.013 6.88 0.0201 * BD 0.00008 1 0.00008 0.042 0.8403 CD 0.00002 1 0.00002 0.009 0.9286 A2 0.14 1 0.14 70.30 <0.0001 ** B2 0.39 1 0.39 201.43 <0.0001 ** C2 0.029 1 0.029 15.31 0.0016 ** D2 0.086 1 0.086 44.70 <0.0001 ** 残差 0.027 14 0.0019 失拟项 0.024 10 0.0024 3.2 0.1368 纯误差 0.003 4 0.0007 总误差 0.56 28 决定系数R2 0.9515
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