Optimization of Accelerated Solvent Extraction of Polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis Using Response Surface Methodology and Anti-inflammatory Activity
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摘要: 为了建立快速溶剂萃取技术（ASE）提取龙须菜多糖的新方法，本文以秦皇岛龙须菜为原料，利用ASE提取龙须菜粗多糖（GLP-K），以多糖得率为指标，采用单因素实验结合响应面试验法优化提取工艺条件。通过傅里叶红外光谱和高效液相色谱对多糖进行结构表征；探索GLP-K在脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎作用。结果表明，快速溶剂萃取法用于龙须菜多糖提取的最佳工艺参数为提取温度70 ℃，提取时间8.5 min，循环4次，在此条件下，多糖实验得率为9.58%±0.31%；红外光谱证实该多糖含有糖醛酸，重均分子量在4.4~747.1 kDa 之间；GLP-K在浓度1000 μg/mL及以下时对RAW264.7细胞增殖也无影响（P<0.001）；与模型组相比，GLP-K给药组（50、100、200、300、400、500 μg/mL）NO的释放量显著降低43.76%~69.47%（P<0.001）。本文丰富了快速溶剂萃取技术在多糖提取方面的研究，为龙须菜多糖的开发和利用提供实验依据。Abstract: The aim of this work was to apply response surface methodology (RSM) to model and optimize the accelerated solvent extraction (ASE) technique for extracting the crude polysaccharides (GLP-K) from Gracilaria lemaneiformis. In terms of the yield of polysaccharide, single factor tests and Box-Behnken design response surface method were developed. The structure of the prepared polysaccharides was characterized by Fourier transform infrared (FT-IR) and high performance liquid chromatography (HPLC). And the anti-inflammatory potential of GLP-K in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 macrophages was also explored. Briefly, the optimal extraction conditions for GLP-K were as follows: 70 °C of extraction temperature, 8.5 min of extraction time, and 4 extraction cycles. Under the condition, the experimental yield of polysaccharide was 9.58%±0.31%. FT-IR showed that the polysaccharide contained uronic acid, and the weight-average molecular weight ranged from 4.4 to 747.1 kDa. GLP-K had no significant cytotoxic effects at or below the concentrations of 1000 μg/mL (P<0.001). Compared with the model group, GLP-K administration group (50, 100, 200, 300, 400, 500 μg/mL) displayed remarkable inhibitory effects on the release level of NO (P<0.001), which decreased by 43.76%~69.47%. This paper enriched the research on the extraction of polysaccharides by accelerated solvent extraction technology, and provided experimental basis for the development and utilization of Gracilaria lemaneiformis polysaccharides.
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龙须菜 （Gracilaria lemaneiformis） 又名江蓠、海发菜，属江蓠科红藻界天然海洋植物，其藻体直立，线形分支。其广泛分布在中国沿海地区，利于维持海洋生态环境，作为琼脂的主要来源，具有很高经济价值[1]。龙须菜富含多糖、膳食纤维、蛋白质、氨基酸、矿物质、多酚等可供人体吸收和利用的营养物质，其中多糖含量超过干重的30%[2]。研究表明，龙须菜多糖具有免疫调节[3]、降血糖[4]、抗氧化[5]、抗肿瘤[6]等优异活性，在功能食品、化妆品、医用材料和生物肥料领域实现高值化应用。
目前，多糖提取[7]的传统方法有微波辅助提取法[8]、溶剂提取法[9]和酶提取法[10]等。此外，快速溶剂萃取技术[11]是一种新兴的高压自动萃取技术，通过改变温度和压力影响多糖的提取率。该方法具有工序简单、自动化提取、效率高、成本低等优点，在食品[12]、化工[13]和环境[14]领域有广泛的应用。王国明等[15]研究发现快速溶剂萃取法提取人参粗多糖得率高于传统水提法；金建华等[16]探究了快速溶剂萃取法提取唐古特白刺果实多糖的最佳工艺为温度102 ℃、时间10 min、压力10 MPa、循环提取2次；王宇晴等[17]探究了快速溶剂萃取法提取灵芝多糖的最佳工艺参数为提取温度110 ℃，提取压力90 Pa，提取时间20 min，循环2次。然而，快速溶剂萃取技术提取龙须菜多糖尚未报道。
本文将探究快速溶剂萃取法提取龙须菜多糖的提取工艺参数（提取温度、提取时间、循环次数），以获得龙须菜多糖的最高得率。系统分析提取工艺参数对龙须菜多糖得率的影响及其相互作用，并对其结构和抗炎活性进行实验，有望为龙须菜多糖提取方法和生物活性提供一定参考价值。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
龙须菜 2021年采自河北省秦皇岛海域，经除杂、清洗和晾晒后，得到的龙须菜在50 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重，粉碎过40目筛，得到龙须菜粉末并置于−20 ℃冰箱内储存备用；3500 Da透析袋 上海源叶有限公司；RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞） 武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM高糖培养基 上海富衡生物科技有限公司；胎牛血清 上海源培生物科技股份有限公司；CCK-8试剂盒 上海七纯生物科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；LPS（0111:B4） 美国Sigma公司；硫酸铵、叔丁醇、无水乙醇等 分析纯，天津欧博凯化工有限公司。
APLE-3000全自动加压溶剂萃取仪（配有100 mL萃取池） 北京吉天仪器有限公司；ALpha2-4L D plus冷冻干燥机 德国CHRIST公司；TENSOR27傅立叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司；HPLC1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司；1300Ⅱ级A2型生物安全柜、3111型CO2细胞培养箱、MultifugeX1R型高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；XSZ-D2普通倒置显微镜 德国ZEISS公司；SPECTRA MAX 190型酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 龙须菜多糖提取
参照何俊平等[18]的实验方法，并做修改。精确称取龙须菜粉末（5.0000±0.0003）g并与硅藻土（1:1，w/w）混合均匀，装入100 mL不锈钢萃取池中，用硅藻土填满萃取池剩余空间后放到加压溶剂萃取仪中，以水为溶剂，固定加载溶剂25 mL；固定10 MPa压力，在一定温度下静态萃取一定时间，循环一定次数，后将萃取液离心（5000 r/min，10 min），记录体积，加四倍体积无水乙醇4 ℃条件下醇沉过夜、离心取沉淀，将沉淀复溶；然后加入20% （w/v） 硫酸铵和1.5倍（v/v）叔丁醇，35 ℃反应30 min，过3500 Da透析膜，透析48 h，浓缩至四分之一，冷冻干燥得龙须菜粗多糖GLP-K。提取工艺流程见图1。
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图 1 龙须菜多糖快速溶剂提取工艺流程图Figure 1. Accelerated solvent extraction process flow chart of GLP-K1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 提取温度对多糖得率的影响
以水为溶剂，固定投料量为5 g，提取压力为10 Mpa，提取时间2 min，循环次数1次，探究提取温度（40、50、60、70、80 ℃）对龙须菜多糖得率的影响。每个实验平行重复三次。
1.2.2.2 提取时间对多糖得率的影响
以水为溶剂，固定投料量为5 g，提取压力为10 Mpa，提取温度60 ℃，循环次数1次，探究提取时间（2、4、6、8、10 min）对龙须菜多糖得率的影响。每个实验平行重复三次。
1.2.2.3 循环次数对多糖得率的影响
以水为溶剂，固定投料量为5 g，提取压力为10 Mpa，提取温度60 ℃，提取时间2 min，探究循环次数（1、2、3、4、5次）对龙须菜多糖得率的影响。每个实验平行重复三次。
1.2.3 响应面试验优化龙须菜多糖提取工艺
基于Box-Benhnken试验设计原理，综合单因素实验结果，固定提取投料量为5 g，提取压力为10 MPa，以多糖得率为响应值，选择提取温度（A）、提取时间（B）和循环次数（C）为自变量，设计三因素三水平响应面优化试验，响应面试验设计表见下表1。
表 1 响应面试验设计因素与水平Table 1. The design factors and levels of response surface test水平 A提取温度（℃） B提取时间（min） C循环次数（次） −1 60 6 3 0 70 8 4 1 80 10 5 1.2.4 龙须菜多糖得率的测定
参考任鑫等[19]的方法，按公式（1）计算龙须菜多糖得率：
Y(\%)=M1M2×100 (1) 式中：Y为龙须菜多糖得率，%；M1为龙须菜粗多糖质量，g；M2为龙须菜粉的质量，g。
选用苯酚硫酸法测定多糖含量。标准曲线：先配制0.1 mg/mL葡萄糖标准液母液，再配成一系列浓度（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 μg/mL）的标准溶液，各取1 mL于试管中，加1 mL 6%苯酚和5 mL浓硫酸，静置20 min，在490 nm处测定吸光度值，作图得标准曲线。配制1 mg/mL的GLP-K溶液，按上述步骤加苯酚和浓硫酸，静置20 min，在490 nm处测吸光度值。
1.2.5 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
将干燥多糖样品与干燥KBr于研钵中顺时针充分研磨至混匀，置于专用模具内手动压成透明薄片后测试。扣除KBr的空白背景，扫描范围：500~4000 cm−1，扫描间隔2 cm−1。
1.2.6 分子量分布
采用高效液相色谱法[20]（HPLC）对龙须菜多糖进行测定。将样品溶解在蒸馏水中，过0.22 μm的微孔滤膜后上机检测。色谱条件：Agilent PL aquagel-OH MIXED-H凝胶色谱柱（300×7.5 mm，8 μm），流动相为蒸馏水，流速为0.8 mL/min，柱温为35 ℃；配制2 mg/mL 葡聚糖标准品及样品，测样体积为20 μL。实验平行重复三次。
1.2.7 体外RAW264.7 细胞实验
1.2.7.1 细胞培养
将RAW 264.7细胞株采用生长培养液（含89% DMEM培养基、10%胎牛血清和1%的青霉素、链霉素双抗混悬液）于37 ℃含5% CO2的培养箱中常规培养。将培养皿放在普通倒置显微镜下，放大不同倍数观察细胞密度和生长情况。
1.2.7.2 对RAW 264.7细胞活力的影响
取生长状态良好的RAW 264.7制备细胞悬液，将细胞按1×104/孔接种到96孔板中，每孔100 μL培养基，贴壁培养24 h后弃培养基，空白组（无细胞）和对照组分别加入100 μL培养基，实验组加入100 μL含有不同浓度（7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000 μg/mL）龙须菜多糖的培养基干预24 h后，弃培养基，再将100 μL含有10% CCK-8试剂的细胞培养基加入空白组、对照组和实验组中，37 ℃避光孵育1 h。用酶标仪在450 nm处测量每个孔的吸光度（A450），计算细胞存活率。每组设三个复孔。存活率计算见公式（2）。
存活率(\%)=As−AbAc−Ab×100 (2) 式中：As为实验组吸光度；Ac为对照组吸光度；Ab为空白组吸光度。
1.2.7.3 细胞中NO含量检测
取生长状态良好的RAW 264.7制备细胞悬液，将细胞按2×105/孔接种到48孔板中，每孔200 mL培养基，贴壁培养24 h后弃培养基，实验组加入200 μL含有不同浓度（50、100、200、300、400、500 μg/mL）龙须菜多糖的培养基，LPS组和对照组加200 μL新鲜培养基，预处理2 h后，LPS组和实验组加入22.2 μL含10 μg/mL LPS的培养基，对照组加入22.2 μL新鲜培养基，刺激22 h后，根据NO试剂盒说明书步骤检测培养基上清中NO含量。
1.3 数据处理
通过Excel软件处理三次平行实验的实验结果作平均值和标准差分析，响应面试验数据采用Design-Expert8.0.6.1软件进行分析。采用Origin 9软件进行结构作图，GraphPad prism8.0.1软件进行活性作图分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P<0.001表示差异高度显著。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 提取温度对多糖得率的影响
如图2所示，随着反应温度的升高，多糖的得率随之提高，当温度达到70 ℃时，多糖得率达到最大，继续升高温度时，得率略有下降，可能是温度的上升有利于溶剂与细胞壁的相互作用，使胞内物质溶出，但在10 MPa的压力加持下，高温导致多糖发生了热降解。因此后继试验中提取温度取值范围为60~80 ℃。
2.1.2 提取时间对多糖得率的影响
如图3 所示，在2~8 min内，龙须菜多糖的得率随反应时间增加而提高，提取时间为8 min 时得率达到最大值，为5.59%；继续延长时间后，得率下降，分析可能是在较短时间范围内，随着提取时间的延长，细胞组织遭到持续性破坏，多糖溶出，得率增加；多糖在长时间[21−22]的高压作用下发生水解或氧化。因此后继试验中提取时间取值范围为6~10 min。
2.1.3 循环次数对多糖得率的影响
如图4所示，多糖得率随着循环次数的增加而提高，当循环次数为4时得率最高，继续增加循环次数，得率没有增加，分析是多糖在水中溶解度是一定的，达到平衡后不再溶出，更换新溶剂后多糖会继续溶出至再次达到平衡，但随着提取次数的增加，其他水溶性杂质会占据多糖的位置，因此后继试验中循环次数取值范围为3~5次。循环次数对多糖得率的影响结果与Du等[21]在青稞中β-葡聚糖的快速溶剂萃取试验结果一致。
2.2 响应面试验优化分析
2.2.1 响应面多元回归方程的建立
以龙须菜多糖的得率为响应值，采用三因素三水平的响应面试验设计得到最佳提取工艺参数，实验结果见表2，方差分析结果见表3，龙须菜多糖得率在7.38%~9.75%之间，对表2中的响应面试验数据结果进行多元回归方程拟合，并获得以龙须菜多糖为响应值的多元回归方程：
表 2 龙须菜多糖提取工艺条件响应面优化方案及结果Table 2. Response surface optimization scheme and results of extraction process conditions of GLP-K实验号 A提取温度 B提取时间 C循环次数 Y龙须菜多糖得率（%） 1 −1 −1 0 7.38 2 1 −1 0 8.36 3 −1 1 0 7.79 4 1 1 0 8.20 5 −1 0 −1 7.38 6 1 0 −1 7.83 7 −1 0 1 8.42 8 1 0 1 9.16 9 0 −1 −1 8.15 10 0 1 −1 8.35 11 0 −1 1 8.99 12 0 1 1 9.13 13 0 0 0 9.68 14 0 0 0 9.73 15 0 0 0 9.75 16 0 0 0 9.69 17 0 0 0 9.59 表 3 响应面回归方程模型方差分析Table 3. Analysis of variance of response surface regression equation model来源 偏差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 11.24 9 1.25 99.36 <0.0001 ** A 0.83 1 0.83 66.13 <0.0001 ** B 0.044 1 0.044 3.53 0.1022 C 1.99 1 1.99 158.61 <0.0001 ** AB 0.081 1 0.081 6.45 0.0387 * AC 0.022 1 0.022 1.73 0.2298 BC 0.001 1 0.001 0.070 0.7989 A2 5.18 1 5.18 411.70 <0.0001 ** B2 1.77 1 1.77 140.97 <0.0001 ** C2 0.62 1 0.62 49.36 0.0002 ** 残差 0.088 7 0.013 失拟项 0.073 3 0.024 6.47 0.0515 不显著 纯误差 0.015 4 0.001 总和 11.33 16 注：R2=0.9922，R2adj=0.9822；*表示有显著性差异（P<0.05）；**表示有极显著性差异（P<0.01）。 Y=9.69+0.32A+0.075B+0.50C−0.14AB+0.074AC−0.015BC−1.11A2−0.65B2−0.38C2
结合表3可知，F值越高，P值越低，显著性则越高[23]。回归模型P<0.01，失拟项P=0.0515，A和C对响应值影响极显著（P<0.01），B对响应值影响不显著（P>0.05）；交互项AB对响应值影响显著（P<0.05），AC、BC对响应值影响不显著（P>0.05）；二次项对响应值影响均极显著（P<0.01）；表明优化实验结果具有较高的相关性和真实性，三个因素显著性影响大小分别为循环次数>提取温度>提取时间。
2.2.2 响应面及等高线图分析
图5展示了三因素（提取温度、提取时间和循环次数）两两交互的响应曲面和等高线图。如图所示，相对比较而言，多糖得率在提取温度较低（60~70 ℃）时随提取时间的增大呈递增趋势，在提取温度较高时（70~80 ℃），呈递减趋势。提取温度和提取时间的响应面图的曲面较陡，表明其交互作用显著（P<0.05）；多糖得率在提取温度较低（60~70 ℃）时随循环次数的增大呈递增趋势，在提取温度较高时（70~80 ℃），呈缓慢递减趋势（P>0.05）；多糖得率在提取时间较低（6~8 min）时随循环次数的增大呈递增趋势，在提取时间较高时（8~10 min），呈缓慢递减趋势（P>0.05）。综合分析可得，温度和时间交互作用最强烈，温度和循环次数交互作用次之，时间和循环次数交互作用最弱，和表3方差分析结果相符。
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图 5 AB、AC、BC对龙须菜多糖得率影响的响应面图和等高线图Figure 5. Response surface plots and contour plots of the effects of AB, AC and BC on the yield of GLP-K2.2.3 响应面优化试验结果验证
通过响应面软件对最佳提取工艺条件进行预测，得到龙须菜多糖快速溶剂萃取的最佳工艺条件为：蒸馏水为溶剂，萃取压力10 MPa，提取温度70.41 ℃，提取时间8.53 min，循环次数4.24次，预测得率为9.82%。基于实际情况，将最优条件调整为温度70 ℃，时间8.5 min，循环次数4次，在此条件下进行三次平行水平验证实验，龙须菜多糖得率为9.58%±0.31%，与多元回归方程得到的预测值相近，表明该模型的优化参数基本可靠，具有可行性。
2.3 多糖纯度测定
通过苯酚-硫酸法对葡萄糖标准溶液作图，得葡萄糖标准曲线方程：Y=0.006X+0.002，R2=0.998，代入方程计算GLP-K中总糖含量为75.28%。
2.4 红外光谱分析
如图6所示，在3386 cm−1处的宽而强的吸收峰是-OH伸缩振动特征吸收峰；在2916 cm−1处有一个-CH伸缩振动引起的弱而小的吸收峰，表明该样品类属于多糖类化合物[24]；在1643 cm−1和1444 cm−1处的吸收峰分别对应C=O和C-O的拉伸振动，表明此多糖存在糖醛酸[25]；1239 cm−1处的峰代表S=O的拉伸振动，表明含有硫酸基；1152 cm−1和1071 cm−1 的吸收表示半乳糖和葡萄糖的存在[26]。综上表明GLP-K是一种含有硫酸基和糖醛酸的粗多糖。
2.5 分子量分析
在最佳工艺参数下得到龙须菜多糖。图7给出了龙须菜多糖的HPLC洗脱曲线以及葡聚糖标准品[27]（重均分子量Mw分别为180、667、47100、344000、708000 Da）的标准矫正曲线。得到标准曲线的线性方程lgMw=−0.9822t+14.9794，其中R2=0.994，呈良好的线性关系[28]。由表4可知，此方法得到的多糖分子量范围较宽，在4.4~747.1 kDa，响应信号最大值对应的Mw为29787 Da。
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图 7 HPLC的标准矫正曲线和龙须菜多糖的HPLC洗脱曲线Figure 7. Standard calibrationcurve of HPLC and the HPLC elution profile of GLP-K表 4 保留峰时间和分子量Table 4. Retention peak time and molecular weight样品 峰 保留时间（min） Mn（Da） Mw（Da） D（Mw/Mn） 龙须菜多糖 1 10.69±0.03 4419±452 747122±7508 169.07±25.84 2.6 体外抗炎活性研究
2.6.1 GLP-K对RAW 264.7细胞活性的影响
如图8所示，本实验探究在7.8125~1000 μg/mL浓度的GLP-K的细胞存活率[29−31]。结果显示，与对照组相比，7.8125~1000 μg/mL浓度范围内的GLP-K组对巨噬细胞的活力分别增加了10.3%~46.7%，表明快速溶剂法萃取龙须菜多糖对细胞没有毒性作用。
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图 8 GLP-K对细胞活力的影响注：与对照组相比，***（P<0.001）。Figure 8. Effects of GLP-K on cells viability2.6.2 GLP-K 对 LPS 诱导的 RAW264.7 释放 NO 的影响
NO作为一种有毒气体存在于空气中，但它在生物生理方面充当重要的信号分子作用，参与生物体免疫调节或抗炎活动。在炎症细胞模型中，可以通过NO释放量减少来判断炎症反应是否得到改善[32−34]。由图9可知，与对照组相比，LPS组NO产生量有提升了4倍（P<0.001），证明炎症模型诱导成功；与模型组相比，不同浓度的实验组NO释放量降低，出现显著性差异（P<0.001），随着GLP-K实验组浓度的升高，NO抑制率呈正相关。在50 μg/mL时NO抑制率为43.76%，500 μg/mL时NO抑制率为69.47%。结果表明，GLP-K可以改善炎症反应。朱彦彬等[31]采用体外细胞实验，研究了桦褐孔菌醇抑制LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应，结果表明，该提取物能有效抑制LPS诱导RAW264.7细胞中促炎因子和过氧化物的产生，提高细胞抗炎和抗氧化能力，从而保护细胞免受损伤。
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图 9 不同浓度GLP-K 对 RAW264.7 细胞NO分泌水平的影响注：与对照组相比用“*”表示，***（P<0.001）；与LPS组相比用“#”表示，###（P<0.001）。Figure 9. Effect of different concentrations of GLP-K on the NO secretion of RAW264.7 cells3. 结论
本研究使用快速溶剂萃取法提取龙须菜多糖，首先利用单因素实验获得提取温度、提取时间和循环次数对龙须菜多糖得率影响的最佳条件，再利用响应面法对快速溶剂法龙须菜多糖提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺参数：温度70 ℃，时间8.5 min，循环次数4次，龙须菜多糖得率为9.58%±0.31%，与多元回归方程得到的预测值相近，表明该模型的优化参数基本可靠，具有可行性。红外光谱证实该多糖含有糖醛酸，重均分子量在4.4~747.1 kDa 之间；GLP-K在浓度1000 μg/mL及以下时对RAW264.7细胞增殖也无影响（P<0.001）；与模型组相比，GLP-K给药组（50、100、200、300、400、500 μg/mL）NO的释放量显著降低43.76%~69.47%（P<0.001）。本文首次快速溶剂萃取法应用于龙须菜多糖的提取，并初步证实其抗炎活性，其抗炎机理还需进一步研究。
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图 1 龙须菜多糖快速溶剂提取工艺流程图
Figure 1. Accelerated solvent extraction process flow chart of GLP-K
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图 5 AB、AC、BC对龙须菜多糖得率影响的响应面图和等高线图
Figure 5. Response surface plots and contour plots of the effects of AB, AC and BC on the yield of GLP-K
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图 7 HPLC的标准矫正曲线和龙须菜多糖的HPLC洗脱曲线
Figure 7. Standard calibrationcurve of HPLC and the HPLC elution profile of GLP-K
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图 8 GLP-K对细胞活力的影响
注：与对照组相比，***（P<0.001）。
Figure 8. Effects of GLP-K on cells viability
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图 9 不同浓度GLP-K 对 RAW264.7 细胞NO分泌水平的影响
注：与对照组相比用“*”表示，***（P<0.001）；与LPS组相比用“#”表示，###（P<0.001）。
Figure 9. Effect of different concentrations of GLP-K on the NO secretion of RAW264.7 cells
表 1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 The design factors and levels of response surface test
水平 A提取温度（℃） B提取时间（min） C循环次数（次） −1 60 6 3 0 70 8 4 1 80 10 5 
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表 2 龙须菜多糖提取工艺条件响应面优化方案及结果
Table 2 Response surface optimization scheme and results of extraction process conditions of GLP-K
实验号 A提取温度 B提取时间 C循环次数 Y龙须菜多糖得率（%） 1 −1 −1 0 7.38 2 1 −1 0 8.36 3 −1 1 0 7.79 4 1 1 0 8.20 5 −1 0 −1 7.38 6 1 0 −1 7.83 7 −1 0 1 8.42 8 1 0 1 9.16 9 0 −1 −1 8.15 10 0 1 −1 8.35 11 0 −1 1 8.99 12 0 1 1 9.13 13 0 0 0 9.68 14 0 0 0 9.73 15 0 0 0 9.75 16 0 0 0 9.69 17 0 0 0 9.59
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表 3 响应面回归方程模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of response surface regression equation model
来源 偏差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 11.24 9 1.25 99.36 <0.0001 ** A 0.83 1 0.83 66.13 <0.0001 ** B 0.044 1 0.044 3.53 0.1022 C 1.99 1 1.99 158.61 <0.0001 ** AB 0.081 1 0.081 6.45 0.0387 * AC 0.022 1 0.022 1.73 0.2298 BC 0.001 1 0.001 0.070 0.7989 A2 5.18 1 5.18 411.70 <0.0001 ** B2 1.77 1 1.77 140.97 <0.0001 ** C2 0.62 1 0.62 49.36 0.0002 ** 残差 0.088 7 0.013 失拟项 0.073 3 0.024 6.47 0.0515 不显著 纯误差 0.015 4 0.001 总和 11.33 16 注：R2=0.9922，R2adj=0.9822；*表示有显著性差异（P<0.05）；**表示有极显著性差异（P<0.01）。
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表 4 保留峰时间和分子量
Table 4 Retention peak time and molecular weight
样品 峰 保留时间（min） Mn（Da） Mw（Da） D（Mw/Mn） 龙须菜多糖 1 10.69±0.03 4419±452 747122±7508 169.07±25.84
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