Optimization of the Formula Process of the Peony Pollen Candy in Tablet and Evaluation of in Vitro Antioxidant Activity of Various Digestive Products
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摘要: 目的：优选牡丹花粉片糖的配方工艺，并评价其体外抗氧化活性。方法：通过单因素实验对牡丹花粉片糖配方进行遴选；以牡丹花粉、填充剂和甜味剂用量为考察因素，以牡丹花粉片糖的感官指标、硬度、崩解时限的综合评分为评价指标，利用响应面法对牡丹花粉片糖的配方进行优化，并测定其模拟人体各消化产物对DPPH和ABTS+自由基的清除能力。结果：优选出牡丹花粉片糖的最佳配方为牡丹花粉0.7 g，填充剂3.3 g，甜味剂1.7 g，该配方工艺的综合评分为6.39。模拟人体累加消化产物对DPPH和ABTS+自由基最高清除率为91.56%和96.42%。结论：该牡丹花粉片糖配方工艺简便，易于操作，保留了花粉的特有风味，具有体外抗氧化活性。Abstract: Objective: To optimize the formula process of peony pollen candy in tablets and evaluate its antioxidant activity in vitro. Methods: On the basis of the single-factor experiment, taking the dosage of peony pollen, filler, and sweetener as factors, applying the comprehensive scores of the sensory, hardness, and disintegration time as evaluation indexes, the formula process of the peony pollen candy in tablets was optimized by response surface methodology. The DPPH and ABTS+ free radical scavenging capacity of various digestive products of the peony pollen candy in tablets simulated in the human body were determined. Results: The optimal prescription of the candy was as follows: 0.7 g of peony pollen, 3.3 g of the filler, and 1.7 g of the sweetener. The comprehensive score of this formula process was 6.39. The maxima scavenging rates of DPPH and ABTS+ free radicals by accumulated digestive products simulated in the human body were 91.56% and 96.42%, respectively. Conclusion: The formula of the peony pollen candy in tablets is simple and easy to handle. It retains the unique flavor of the peony pollen and maintains in vitro antioxidant activity.
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Keywords:
- peony pollen /
- tablet candy /
- formulation optimization /
- surface analysis /
- antioxidant
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牡丹（Paeonia suffrutcosa）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）牡丹组（Sect.Moutan）多年生落叶灌木，因其花色艳丽，花朵硕大，被誉为“花中之王”[1-2]。牡丹除具有重要的观赏价值外，其根、皮、花和籽均具有很高的药用、营养和食用价值[3]。牡丹花粉营养丰富，含所有人体所需的常量、微量元素，且远高于牡丹花瓣和牡丹籽油，蛋白含量远高于其他40种常见的植物类花粉[4-7]。牡丹花粉虽具有较高的保健价值，目前开发的相关产品有口服液[8]、酸奶[9]、保健面条[10]等，对其开发利用仍存在产品形式单一、精深加工滞后等问题[11]。随着人们消费习惯和健康理念的转变，无糖食品越来越受到消费者的重视[12]，无糖片糖是近年来市场上出现的一种新型的便携食品，具有环保、无糖、保质期较长、食用方便并具有功能性等特点[13]。实验中采用糖醇为辅料，对牙齿具有良好的保健作用[14]，其中异麦芽酮糖醇具有高稳定性、低热量、甜味自然、吸湿性小等特性[15]，更适合于功能性食品的开发。
本文以牡丹花雄蕊上的孢子、牡丹的繁殖细胞，即牡丹花粉为原料，研制一种机械化生产、成本低、服用携带方便，易被特殊人群（如三高、糖尿病）消费，适合各年龄段的人食用的花粉产品，并对牡丹花粉片糖的体外抗氧化性进行研究，为延伸牡丹的进一步精深加工和开发提供实验室依据，以确保牡丹花粉药食两用价值得到充分利用。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
牡丹花粉 兰州新区中川牡丹园基地2022年6月采收；木糖醇 山东福田药业有限公司；异麦芽糖醇 广西维科特生物技术有限公司；苹果酸 安徽雪狼生物科技股份有限公司；阿斯巴甜 江苏汉光甜味剂有限公司；柠檬酸 潍坊英轩实业有限公司；甘露醇 青岛明月海藻有限集团有限公司；以上辅料均为食品级；DPPH和ABTS 美国Sigma公司；抗坏血酸（VC） 国药集团化学试剂有限公司。
TDP-1.5型单冲压片机 上海绿翊机械造有限公司；YD-20KZ型片剂硬度仪 天津市天大天发科技有限公司；SHZ-8型恒温振荡器 常州国华电器有限公司；ZB-ID型智能崩解仪 天河医疗仪器有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计 日本岛津公司。
1.2 实验方法
1.2.1 牡丹花粉片糖的制备
将各原辅料粉碎过80目筛，取适量牡丹花粉与适量填充剂（木糖醇-甘露醇）、甜味剂（异麦芽糖醇）和矫味剂（阿斯巴甜-柠檬酸-苹果酸）粉碎混合均匀，加70%乙醇润湿，混合搅拌，所得软材过18目筛制粒，将制粒好的物料于50 ℃烘箱干燥，干燥后的物料经30目筛整粒，整粒后的颗粒加入适量的硬脂酸镁混合压片[16]，即得。
1.2.2 单因素实验
查阅文献和预实验基础上，选择木糖醇-甘露醇（4:1，g/g），阿斯巴甜-柠檬酸-苹果酸比例（1:1:1，g/g）用量8%，润滑剂硬脂酸镁用量1%，在填充剂、甜味剂、牡丹花粉各用量分别为3.0、0.5、0.5 g的条件下，按“1.2.1”项下的方法制备牡丹花粉片糖，选择填充剂用量（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g）、甜味剂用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g）、牡丹花粉用量（0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 g）进行单因素实验。
1.2.3 Box-Behnken响应面试验
根据单因素实验结果，应用Box-Behnken试验设计原理[17]，以牡丹花粉（A）、填充剂（B）、甜味剂（C）用量为自变量，以质量评价的综合评分（R）作为响应值进行响应面优化，对牡丹花粉片糖的配方工艺进行优化，试验因素水平表见表1。
表 1 响应面因素水平编码表Table 1. Factors and levels of RSM test因素 水平编码 A
牡丹花粉（g）B
填充剂（g）C
甜味剂（g）−1 0.50 2.00 1.00 0 0.75 3.00 1.50 1 1.00 4.00 2.00 1.2.4 牡丹花粉片糖质量评价方法
1.2.4.1 感官指标评分
牡丹花粉片糖的感官指标包括外观和口感评价[18]，随机抽取10名志愿者进行评价，其中裂片、松片或过酸或过甜、花粉味重，记0~3分；表面粗糙、花片或微酸、微甜，记4~6分；表面光洁、有光泽或酸甜可口，记7~9分。
1.2.4.2 硬度评分标准
将牡丹花粉片糖径向固定于片剂硬度仪两横杆之间，活动柱杆自动沿水平方向加压，当牡丹花粉片糖碎裂，记录硬度值，每组测6片，计算平均值。按测得的硬度值的大小范围给予评分，硬度小于150 N，记1分；150~200 N之间，记2分；大于200 N，记3分，满分3分。
1.2.4.3 崩解时限评分标准
按《中华人民共和国药典》2020年版（四部）崩解时限检查法[19]测定，崩解时限小于5 min或大于15 min，记1分；5~8 min或10~15 min，记2分；8~10 min，记3分，满分3分。
1.2.4.4 质量评价方法的建立
以牡丹花粉片糖的感官评价、硬度、崩解时限为评价指标，综合评分=感官评价×0.6+硬度×0.2+崩解时限×0.2[20]。
1.2.5 体外抗氧化活性测定
1.2.5.1 模拟人体消化液的配制
参考相关文献[20]，配制体外抗氧化活性所需消化液，其中模拟唾液中α-淀粉酶、模拟胃液中胃蛋白酶和模拟肠液中胰蛋白酶的酶活力分别达到200、2000和75 U/ mL。
1.2.5.2 模拟人体消化样品的制备
取适量牡丹花粉片糖于研钵中，研磨成细粉，精密称定2.0 g，于锥形瓶，加入模拟唾液25 mL，密闭，于摇床（37 ℃、180 r/min）孵育10 min后，沸水浴灭酶10 min，快速冷却，加入无水乙醇25 mL，离心（5000 r/min），取上清液于50 mL容量瓶中，超纯水定容至刻度[21]。模拟胃液和肠液的消化样品制备时，相同条件下孵育2 h，其余制备方法同模拟唾液的消化样品的制备[21-22]。
1.2.5.3 模拟人体累加消化样品的制备
取适量牡丹花粉片糖于研钵中，研磨成细粉，精密称定2.0 g，于锥形瓶，加入模拟唾液25 mL，密闭，于摇床（37 ℃、180 r/min）孵育10 min后，5 mol/L HCL溶液调pH约1.2，加入胃蛋白酶0.08 g，孵育2 h，1 mol/L NaOH溶液调pH约6.8，加入胰蛋白酶0.0125 g和胆酸钠0.625 g，孵育2 h，待模拟人体消化完毕后，与“1.2.5.2”项下相同条件下灭酶、冷却和离心，制备累加消化样品[23-24]。
1.2.5.4 DPPH自由基清除能力测定
分别吸取一定量的各模拟消化样品、累加消化样品及对照品VC溶液，配制成2、6、10、14、18 mg/mL的溶液[20]，准确吸取上述溶液各1 mL于10 mL的比色管中，加入2 mL DPPH（0.2 mmol/L）溶液和2 mL超纯水，避光反应30 min，以无水乙醇为参比，于517 nm处测定样品吸光度值（A1）和空白溶液吸光度值（A0）[25-26]，计算牡丹花粉片糖各消化样品对DPPH自由基的清除率MDPPH（%），清除率公式为：
MDPPH(%)=A0−A1A0×100 1.2.5.5 ABTS+自由基清除能力测定
分别吸取一定量的模拟消化样品、累加消化样品及对照品VC溶液，配制成1、2、3、4、5、6 mg/mL 的溶液，准确吸取上述溶液各1 mL于10 mL的比色管中，加入2 mL ABTS工作液（2份35 mol/L的ABTS溶液和1份25 mol/L的K2S2O8溶液混匀，避光12 h，临用前用无水乙醇稀释，吸光度0.6±0.1）和1 mL超纯水，以超纯水为参比，于734 nm处测定样品吸光度值（A1）和空白溶液吸光度值（A0）[16]，计算牡丹花粉片糖各消化样品对ABTS+自由基的清除率MABTS（%），清除率公式为：
MABTS(%)=A0−A1A0×100 1.3 数据处理
利用Design-Expert.V 8.0.6软件对响应面模型数据进行多元回归拟合；使用 SPSS 22.0软件各项试验数据进行方差分析及显著性检验（P<0.05）。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 填充剂用量的筛选
结果见图1。随填充剂用量的增大，牡丹花粉片糖的质量评价综合评分呈现先上升后下降的趋势，所制软材细粉逐渐增多，颗粒均匀，易于制粒，硬度变小，崩解时间明显降低；所含的木糖醇成分的增多，片剂酸味逐渐变弱。当填充剂用量达到3.0 g时，制粒和压片效果较好，牡丹花粉片糖的质量评价综合评分最高。综合上述，选择填充剂用量2.0、3.0、4.0 g三个水平进行响应面试验。
2.1.2 甜味剂用量筛选
结果见图2。固定填充剂用量，随着甜味剂用量的逐渐增大，牡丹花粉片糖的质量评价综合评分上升趋势平缓，软材的黏性逐渐变小，所制得的颗粒均匀，牡丹花粉片糖的硬度适中，当甜味剂增大至2.0 g时，软材的黏性小，细粉较多，牡丹花粉片糖的硬度小，崩解时限变小，使牡丹花粉片糖的酸味逐渐变弱，甜味增加明显。综合上述，选择甜味剂用量1.0、1.5、2.0 g三个水平进行响应面试验。
2.1.3 牡丹花粉用量考察
结果见图3。随着花粉用量的增加，牡丹花粉片糖的质量评价综合评分下降的趋势明显，制得的颗粒细粉多，硬度变小，出现松片或花片现象，牡丹花粉片糖的花粉味加重，涩感逐渐增强，当牡丹花粉用量为0.75 g时，牡丹花粉片糖的酸甜度适中，口感和硬度适中。综合上述，选择牡丹花粉用量0.50、0.75、1.00三个水平进行响应面实验。
2.2 响应面法优化试验
2.2.1 方案设计及试验结果
根据表1进行响应面优化实验，研究牡丹花粉、填充剂、甜味剂与牡丹花粉片糖的综合评分之间的关系，实验结果见表2。
表 2 Box-Behnken试验设计方案及结果Table 2. Design and results of Box-Behnken experiments实验号 A 牡丹花粉 B 填充剂 C 甜味剂 R 综合评分 1 −1 0 1 4.64 2 −1 1 0 5.23 3 1 1 0 1.83 4 −1 −1 0 3.59 5 1 0 −1 1.68 6 0 0 0 6.20 7 1 −1 0 2.26 8 0 0 0 6.18 9 0 1 −1 3.70 10 0 0 0 6.22 11 0 −1 −1 3.83 12 0 0 0 6.02 13 −1 0 −1 4.23 14 0 0 0 6.34 15 0 1 1 5.63 16 1 0 1 3.24 17 0 −1 1 3.63 2.2.2 模型的建立及显著性检验
利用Design-Expert.V 8.0.6软件对表2的数据进行多元回归拟合，得牡丹花粉片糖对牡丹花粉（A）、填充剂（B）、甜味剂（C）用量的二次多项回归模型方程为：R=−25.0388+42.99400A+6.98350B+6.65200C−2.07000AB+2.30000AC+1.106500BC−29.71600A2−1.10725B2−3.54900C2，分析实验结果见表3。
表 3 回归统计分析结果Table 3. Result of regression statistical analysis方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 40.19 9 4.47 164.37 < 0.0001 ** A 9.42 1 9.42 346.64 < 0.0001 ** B 1.19 1 1.19 43.65 0.0003 ** C 1.71 1 1.71 62.99 < 0.0001 ** AB 1.07 1 1.07 39.43 0.0004 ** AC 0.33 1 0.33 12.17 0.0101 * BC 1.13 1 1.13 41.75 0.0003 ** A2 14.52 1 14.52 534.58 < 0.0001 ** B2 5.16 1 5.16 190.00 < 0.0001 ** C2 3.31 1 3.31 122.00 < 0.0001 ** 残差 0.19 7 0.027 失拟 0.13 3 0.046 3.50 0.1289 不显著 误差 0.052 4 0.013 总差 40.38 16 注： **表示差异极显著（P<0.01）；*表示差异显著（P<0.05）。 由表3可知，三个因素中填充剂对牡丹花粉片糖配方工艺影响最小。模型的F=164.37（P<0.0001），表明模型方程具有高度的显著性；失拟项F=3.50（P>0.05），表明模型拟合合理[27]。模型的决定系数为R2=0.9953，说明回归方程拟合度高、误差小[28]，表明了该模型可用于牡丹花粉片糖配方工艺的优化。试验结果显示，A（牡丹花粉）、B（填充剂）、C（甜味剂）、AB、BC、A2、B2和C2项具有极其显著的影响（P<0.05），可以得出各项考察因素对牡丹花粉片糖的工艺影响除具有线性关系外，还存在一定的交互综合影响，可采用该线性回归方程对其配方工艺进行分析与预测。
2.2.3 响应面试验分析与优化
图4为各两两实验因素对牡丹花粉片糖配方工艺综合评分的响应面图和等高线图。响应面图均为凸形曲面图，存在最高点，响应面曲线图的陡峭程度直观反映了各因素工艺的影响，坡度越陡，说明实验因素对综合评分的影响越大，坡度平缓则影响较小[29]，等高线图中，两两交互因素之间交互作用的强弱表现为图中椭圆程度和密集程度，等高线较密，趋于椭圆形交互作用越强[30]。由此可见，因素A和因素C对牡丹花粉片糖配方工艺感官评分的影响最大；各因素交互作用对牡丹花粉片糖配方工艺感官评分的影响的显著性，依次为：BC>AB>AC，这与方差分析结果相一致。
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图 4 各因素用量交互作用对综合评分影响的响应面和等高线图Figure 4. Response surface maps and contour lines of the influence of various factors on the comprehensive scoring2.2.4 最佳配方工艺优化与验证
通过回归模型方程的预测，得出牡丹花粉片糖的最佳配方为：牡丹花粉0.68 g、填充剂3.32 g、甜味剂1.65 g，考虑到实验条件的可操作性，将其参数进行修正，确定的最佳配方比为牡丹花粉：牡丹花粉0.7 g ，填充剂3.3 g，甜味剂1.7 g。在此最优配比条件下进行验证实验，平行实验3次，结果发现牡丹花粉片糖的综合评分为6.39，模型预测值为6.42，两者吻合良好。
2.3 体外抗氧化活性
2.3.1 DPPH自由基清除能力
由图5可见，牡丹花粉片糖各模拟消化样品均对DPPH自由基有一定的清除力，其清除能力依次为：肠液消化样品>唾液消化样品>胃液消化样品，肠液消化样品对DPPH自由基清除率的IC50值最小，表明抗DPPH自由基活性成分主要在肠液中消化，累加消化样品的清除率最高值为91.56%，IC50值为5.720±0.478 mg/mL。
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图 5 模拟各消化样品对DPPH自由基的清除能力Figure 5. Scavenging ability of simulated digestion sample to DPPH free radical2.3.2 ABTS+自由基清除能力
如图6可见，牡丹花粉片糖各模拟消化样品均对ABTS+自由基有一定的清除力，其清除能力依次为：胃液消化样品>肠液消化样品>唾液消化样品，胃液消化样品对ABTS+自由基清除率的IC50值最小，表明抗ABTS+自由基活性成分主要在胃液中消化，累加消化样品的清除率最高值为96.42%，IC50值为1.451±0.114 mg/mL。
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图 6 模拟各消化样品对ABTS+自由基的清除能力Figure 6. Scavenging ability of simulated digestion sample to ABTS+ free radical3. 结论
牡丹花粉片糖的生产受填充剂、润滑剂和甜味剂用量等诸多因素的影响，在单因素实验中，选择填充剂木糖醇-甘露醇比例为4:1，矫味剂用量为8%，润湿剂为70%乙醇，润滑剂硬脂酸镁用量为1%，进行湿法制粒压片。通过响应面法优化得到牡丹花粉片糖配方工艺为：将0.7 g牡丹花粉，3.3 g填充剂和1.7 g甜味剂混合均匀，加入70%乙醇润湿制软材，过18目筛制粒，50 ℃条件下干燥，30目筛整粒，所得颗粒与1%硬脂酸镁混合后压片，得到牡丹花粉片糖，在此配方条件下制作的牡丹花粉片糖片面光滑、硬度适中、口感较好，无明显涩感，质量评价综合评分较高，符合相关要求。
为评价牡丹花粉片糖抗氧化活性，实验测定了牡丹花粉片糖模拟人体各消化样品的DPPH和ABTS+自由基的清除率。结果显示，肠液消化样品对DPPH自由基的清除能力较强，而胃液消化样品对ABTS+自由基的清除能力较强，其累加消化样品的最高清除率分别为91.56%和96.42%。
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图 4 各因素用量交互作用对综合评分影响的响应面和等高线图
Figure 4. Response surface maps and contour lines of the influence of various factors on the comprehensive scoring
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图 5 模拟各消化样品对DPPH自由基的清除能力
Figure 5. Scavenging ability of simulated digestion sample to DPPH free radical
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图 6 模拟各消化样品对ABTS+自由基的清除能力
Figure 6. Scavenging ability of simulated digestion sample to ABTS+ free radical
表 1 响应面因素水平编码表
Table 1 Factors and levels of RSM test
因素 水平编码 A
牡丹花粉（g）B
填充剂（g）C
甜味剂（g）−1 0.50 2.00 1.00 0 0.75 3.00 1.50 1 1.00 4.00 2.00 
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表 2 Box-Behnken试验设计方案及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments
实验号 A 牡丹花粉 B 填充剂 C 甜味剂 R 综合评分 1 −1 0 1 4.64 2 −1 1 0 5.23 3 1 1 0 1.83 4 −1 −1 0 3.59 5 1 0 −1 1.68 6 0 0 0 6.20 7 1 −1 0 2.26 8 0 0 0 6.18 9 0 1 −1 3.70 10 0 0 0 6.22 11 0 −1 −1 3.83 12 0 0 0 6.02 13 −1 0 −1 4.23 14 0 0 0 6.34 15 0 1 1 5.63 16 1 0 1 3.24 17 0 −1 1 3.63
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表 3 回归统计分析结果
Table 3 Result of regression statistical analysis
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 40.19 9 4.47 164.37 < 0.0001 ** A 9.42 1 9.42 346.64 < 0.0001 ** B 1.19 1 1.19 43.65 0.0003 ** C 1.71 1 1.71 62.99 < 0.0001 ** AB 1.07 1 1.07 39.43 0.0004 ** AC 0.33 1 0.33 12.17 0.0101 * BC 1.13 1 1.13 41.75 0.0003 ** A2 14.52 1 14.52 534.58 < 0.0001 ** B2 5.16 1 5.16 190.00 < 0.0001 ** C2 3.31 1 3.31 122.00 < 0.0001 ** 残差 0.19 7 0.027 失拟 0.13 3 0.046 3.50 0.1289 不显著 误差 0.052 4 0.013 总差 40.38 16 注： **表示差异极显著（P<0.01）；*表示差异显著（P<0.05）。
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