Research Progress on Contamination Levels, Analytical Methods and Processing Effects of Pyrrolizidine Alkaloids in Food
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摘要: 吡咯里西啶类生物碱（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物次生代谢产生的一类天然毒素，其中大部分不饱和型PAs及其氮氧化物（Pyrrolizidine alkaloid N-oxides，PANOs）具有多种毒性作用，并可通过膳食补充剂或食物链的形式进行传递从而威胁人类健康。PAs已被发现广泛存在于茶叶、蜂蜜等多种食品基质中，其污染成为令人担忧的食品安全问题。鉴于此，本文详尽梳理了不同国家不同食品基质中PAs的污染水平与可能的污染路径，综述了近年来PAs检测的前处理方法和分析检测技术的最新进展及发展趋势，分析了不同食品加工技术或烹饪制备对PAs污染物稳定性的影响，旨在为食品中PAs的检测研究、安全风险评估及控制提供警示和参考依据。Abstract: Pyrrolizidine alkaloids (PAs) are a class of natural toxins produced by plant secondary metabolism, of which unsaturated PAs and most pyrrolizidine alkaloid N-oxides (PANOs) have multiple toxic effects. These toxic components can be transmitted through food supplements or food chain to threaten human health. To date, PAs have been found to be widely present in a variety of food and agricultural products such as honey and tea, highlighting their occurrence as a concerning food safety issue. Therefore, this paper summarizes the contamination levels and possible contamination pathways of PAs in different matrices of different countries, and reviews the latest advances and development trends in pretreatment methods and analytical detection techniques or cooking preparation on the stability of PAs contaminants, aiming to provide warning and reference basis for the detection research, safety risk assessment and control of PAs in foods.
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Keywords:
- food /
- pyrrolizidine alkaloids /
- natural toxins /
- analytical methods /
- food processing
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吡咯里西啶类生物碱（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物为防御昆虫和病原体及动物等而产生的一类次级代谢产物，在自然界分布极为广泛。据报道，目前已从多种植物中分离鉴定出600以上不同结构的PAs及其氮氧化物[1−3]。PAs的分布与植物种属有关，主要分布于远缘相关的被子植物科，涉及紫草科（Boraginaceae）、豆科（Leguminosae）及菊科（Asteracea）等13科植物。此外，在兰科（Orchidaceae）、禾本科（Poaceae）、毛茛科（Ranunculaceae）等植物中也有存在[4−5]。PAs的含量水平与植物种属有很大关系，从痕量至最高约百分之十九（以干重计）[6]。目前，已分离得到的PAs及PANOs中约50%具有较强的肝毒性，肺动脉高压、心脏肥大、肾脏退行性损伤等器官毒性，神经和胚胎毒性，甚至致畸、致癌和致突变等[7]。PAs在食品中也有不同程度地检出，常见的PAs暴露来源包括含PAs的植物以中草药、膳食补充剂、功能性食品等的原材料而被人体直接摄入，也可间接通过污染粮谷类作物或经动物采食等随食物链进入最终食品，而对人体健康造成潜在危害[8−10]。另外，最近还有研究提出了其他污染途径，如PAs/PANOs可被土壤吸收并进行水平转移或生产者为了经济利益而有意掺假[11−13]。近年来，经摄取含PAs的食物而中毒的案例已有较多报道，欧洲食品和饲料安全警报（Food and Feed Safe Alerts，RASFF）门户网站上报告的关于食品中PAs/PANOs的高发生率的食品警报数量显著增加[14]。鉴于PAs/PANOs广泛存在于不同类型的食品中及其对人类健康的潜在风险，其污染问题已成为重要的食品安全问题，了解食品中PAs的污染状况，并针对性开展有效防控对确保食品安全具有重要意义。因此，本文对PAs/PANOs的理化性质、毒性、污染状况、食品加工过程中的变化及相关分析检测技术等方面的研究进展进行了全面论述，以期为食品中PAs/PANOs的风险评估及防控策略的制定提供有利参考。
1. 化学结构及毒性
PAs是一种复合分子，其化学结构通常由千里光次碱（necine）与千里光次酸（necic acid）两部分组成，其中千里光次碱的吡咯环结构是PAs母核，主要是由一个四氢吡咯环和一个羟甲基取代的四氢吡咯环经由氮原子和其邻位碳原子稠合构成的双环结构[15]（见图1a）。母核中的N可被氧化形成相应的氮氧化物（PANOs），与PAs原型共同存在于植物中。根据母核1,2位碳原子之间形成的键是否饱和，可将其分为饱和与不饱和PAs。当1,2位处于饱和状态时，PAs表现为无毒或毒性较弱；而当1,2位为双键呈不饱和状态时，其毒性和致病性成为关注的热点[16]（见图1b）。同样，根据千里光次碱基结构不同，可将不饱和PAs分为倒千里光碱型（retronecine-type），天芥菜碱型（heliotridine-type），奥索千里光裂碱（otonecine-types）等5种类型[17]（见图1c）。千里光次酸一般为5~10个碳原子的一元酸或二元酸，可同千里光次碱7或9位的羟基形成单酯、开链双酯或大环内酯[18]（见图1d）。
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目前关于PAs的毒性机制还没有明确的结论，但普遍观点认为不饱和PAs的原型化合物毒性很小，但易被细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A单加氧酶氧化，经肝脏代谢后形成高反应性脱氢吡咯生物碱（dehydropyrrolizidine alkaloids，DHPAs），化学结构见图2[16]。DHPAs具有较强的亲电子性，可迅速与细胞内的各种亲核性大分子发生结合，从而引起肝细胞代谢紊乱、脂肪变性和坏死性损伤等[19]。因CYP3A在肝脏中含量丰富，主要存在于胞浆的粗面内质网上，因此PAs作用的直接靶器官主要为肝脏，故PAs又称为肝毒吡咯里西啶生物碱（hepas-totoxic pyrrolizidine alkaloids，HPAs）。有机阳离子转运体特异性介导了肝脏对PAs的摄取，并与CYP3A一起在PAs诱导的肝毒性中发挥作用。此外，PAs还会引起肾、肺、神经和胚胎毒性，甚至致畸、致突变和致癌[20]。国际癌症研究机构（IARC）也已将PAs归类2B类致癌物。此外，最新研究表明PANOs也可产生毒性，PANOs可以逆转化为PAs并被氧化成亲电性DHPAs而发挥毒性作用[21]。
尽管所有的1,2-不饱和PAs都具有共同的代谢途径，但不同研究结果显示PAs的毒性大小与其结构有关。双稠吡咯环1,2位具有双键同时7位或9位的羟基至少有一个被酯化是PAs产生毒性的结构基础[15]。PAs毒性因酯键的个数及是否成环、千里光次酸的结构而呈现差异，通常环状二酯的毒性最大，其次是开链二酯，最后是单酯[16]。
PAs主要经氧化和水解等途径排出体外。当PAs暴露量较少时，其主要解毒途径是PAs的脱氢代谢物（DHPAs）与还原型谷胱甘肽相结合从而避免前者与DNA或蛋白质结合。另外，N-氧化对PAs的毒性也要贡献，因此，抗氧化物质可一定程度减弱PAs的毒性[20]。
2. 食品中PAs的污染水平及来源
近年来关于因PAs引发的人类肝中毒案例的报道逐渐增多，PAs的污染问题已引起全世界各国监管部门及研究机构的高度关注。表1列举了近年来不同国家不同食品中PAs/PANOs的污染水平。由表可知，PAs/PANOs广泛存在于来自植物的相关衍生制品中，欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）已将茶叶、花草茶、蜂蜜和膳食补充剂等确定为易受PAs/PANOs污染的高风险食品。
表 1 不同食品中PAs/PANOs的污染水平Table 1. Levels of PAs/PANOs in different items食品分类 名称 样本数量 PAs种类 含量水平（µg/kg） 来源
国家/地区参考文献 茶叶 花草茶 169 23 0~5668 德国 [22] 18 44 0.1~47.9 德国 [23] 18 14 10~1733 爱尔兰 [24] 168 28 454~4805 欧洲 [25] 黑茶、绿茶、花草茶及水果茶 274 17 0.3~5647.2 德国 [26] 黑茶、绿茶及花草茶 70 28 20~1729 以色列 [27] 蜂产品 蜂蜜 70 9 1~172 意大利 [28] 71 18 0.4~55 瑞士 [29] 150 14 2.9~545.5 爱尔兰 [24] − 5 2.4~2.7 加拿大 [30] 92 8 1.2~248 巴西 [31] 54 4 1.0~64.1 波兰及亚洲地区 [32] 32 12 1.4~14.2 亚洲、欧洲及美洲等国家或地区 [33] 25 9 0.2~17.5 意大利 [34] 255 17 0.2~281.1 中国 [8] 含蜂蜜成分的零食 13 28 0~0.36 比利时 [35] 含蜂蜜成分的糖果 39 28 0~0.56 比利时 [35] 禽蛋 鸡蛋 206 28 0~0.12 欧洲 [36] 6 28 0~0.049 中国香港 [37] 鸭蛋 6 28 0~0.19 中国香港 [37] 鹌鹑蛋 6 28 0~0.01 中国香港 [37] 肉制品 肉和动物肝脏 35 28 0 中国香港 [37] 273 28 0 欧洲 [36] 奶制品 牛奶 169 28 0.05~0.16 欧洲 [25] 182 28 0~0.12 欧洲 [36] 63 16 0~0.061 比利时 [38] 奶酪 25 28 0.05~0.15 欧洲 [36] 6 28 0~0.048 欧洲 [37] 其他 预包装沙拉 17 30 1.13 比利时 [13] 大豆 11 9 0.64~1.46 韩国 [39] 食用油 10 9 1.91~26.96 韩国 [39] 注：“−”表示样本数量不明。 2.1 茶叶及其他植物源衍生产品中的PAs
茶叶中PAs的污染问题因其污染程度与范围而不容小觑，欧美国家已开展针对市售花草茶中PAs污染水平的重点监测。如Bodi等[26]分析了德国市售的274种茶叶样品（包括红茶、绿茶、薄荷茶、洋甘菊茶和博士茶等）中的PAs/PANOs含量，检出10种PAs及7种PANOs化合物，其中博士茶的污染最为严重，含量可高达5647.2 µg/kg。Schulz等[22]分析了德国市售的169种药用茶叶，检出14种PAs和9种PANOs。Kaltner等[23]分析了德国市售的18种花草茶中PAs/PANOs的含量，发现18个茶叶样品中PAs的含量为0.1~47.9 µg/kg。近年来，为了进一步细化针对食品中PAs污染的防控措施，德国联邦风险评估研究所（Bundesinstitut für Risikobewertung，BfR）模拟常见的几种消费情景，对茶叶中的PAs进行了风险评估，发现长时间饮用某一特定类型的茶浸提液会增加PAs暴露风险[40]。此外，Griffin等[24]分析爱尔兰市售的18种花草茶时，发现某些阳性检出样品中PAs的含量可高达1733 µg/kg。而在最新一项针对欧洲六国食品中PAs污染水平的调查中，Mulder等[25]发现92%的茶中均有较高水平PAs检出，平均含量为460 µg/kg；花草茶、红茶、绿茶等几乎所有类型的茶叶均存在不同程度的PAs污染风险，尽管不同类型茶中PAs组成和浓度不同。有研究表明，千里光宁碱型、天芥菜碱型、石松胺型、奥索千里光裂碱型及野百合碱型是污染茶叶的5种主要PAs/PANOs类型，其中千里光宁碱型是占比最高的PAs，约占PAs总量的77%以上[7,13]。污染茶叶中约1/3的PAs由游离碱组成，2/3由PANOs组成。如Mulder等[25]的研究表明污染茶叶中千里光宁碱的氮氧化物的含量在60~200 µg/kg之间，约占茶叶中总PAs含量的一半。
事实上，茶叶本身并不含PAs，因茶园存在如一点红、千里光等含PAs的杂草，在采收阶段会意外地被共同采收而造成茶叶PAs污染。最近有研究还指出在茶叶种植阶段PAs可能通过土壤、水等发生自然转移从而间接污染茶叶[17−18]。Selmar等[11]用干燥的千里光叶（一种产生PAs的植物）覆盖薄荷和甘菊（不含PAs的植物）初步证实了后者可通过土壤吸收PAs。为了进一步证实这种通过土壤的水平自然转移也可能发生在附近生长的活植物中，Selmar等[12]在将千里光与欧芹（一种不含PAs的植物）共同种植于同一盆中，据观察由千里光供体植物产生的PAs转移到欧芹植物中。Izcara等[41]在最近一项针对野生牛至的研究中也提出了PAs/PANOs是通过土壤进行水平自然转移。以上这些研究结果强化了通过土壤作为污染途径的水平自然转移理论，因此诸如茶叶、香料等植物源食品中PAs污染物的出现不应仅被视为收获期间意外共同采收含PAs的外来植物而造成的交叉污染或人为掺假，还有可能是通过土壤的水平自然转移造成的间接污染。
除了茶叶，近年来也有研究对其他植物源衍生产品如谷物和沙拉中PAs的污染进行了评估，其污染程度相对较轻。实际上，自从谷物类粮食作物生产过程中引入了较为严格和规范的农业控制措施后，已有效避免了谷物中出现杂草和外来种子，并大大降低了谷物类食品中PAs的污染风险[19]。然而，有研究表明，从严重污染的谷物中完全去除含有PAs的外来种子后，剩余“清洁”的谷物中仍可检测到PAs[42]。同时也有许多研究报道了在小麦、面粉和其他谷物制品中检测到低水平PAs[43−44]。关于沙拉，目前已知的用于制作沙拉的可食用植物均不会产生PAs。但是，一些产生PAs的杂草因其叶子与可食蔬菜叶子的外观极为相似而在某些不知情的情况下被误作为沙拉进行市售，欧洲市面上销售的芝麻菜中检出有PAs就属于这种情况[7]。如Picron等[13]分析的17个预包装沙拉样品中有70%样品受到低于0.1 ng/g的PAs/PANOs污染，其中有三个样品的污染浓度高达2.59、5.20和10.47 ng/g。2007年德国联邦风险评估研究所（Bundesinstitut für Risikobewertung，BfR）也报道了德国某超市出售的沙拉中意外发现普通杂草千里光叶子的典型案例。沙拉中PAs的污染很可能是由于产PAs的杂草与可食蔬菜共同收获或交叉污染造成的[7]。近年来随着人们消费习惯的改变，尤其是对纯天然有机食品的推崇，使得含PAs杂草在人类膳食中的暴露风险增加，从而诱发了严重的食品安全隐患。另外，由于饮食习惯等因素，一些含PAs的植物仍会被用于制作酱汁等调味料，也常出现在烹饪香料中。早在2003年Rasenack等[45]就报道了香料中出现的PAs可能造成了胎儿死于肝功能衰竭。最近这两年，食品和饲料安全警报（Food and Feed Safety Alerts，RASFF）的门户网站上针对香料和香草等的警报明显增加，特别是在牛至样品发现了大量PAs，其含量范围在6660~133870 µg/kg[46]。
2.2 蜂蜜及其衍生产品中的PAs
蜂蜜及其衍生产品是研究最为广泛且相对较早的食品基质，其PAs/PANOs的污染水平较高，究其原因是花粉中PAs被意外或人为引入花蜜从而污染蜂蜜及其相关产品[7,42,47]。自然界中含PAs的蓝蓟属（Echium spp.）、千里光属（Senecio spp.）等植物常意外或人为的成为蜜蜂采食对象[21,48]。Kempf等[49]对德国市场上的200余种蜂蜜进行了PAs污染调查分析，研究发现有19个样品检出PAs，含量范围在19~120 μg/kg。Martinello等[28]对意大利当地超市零售的蜂蜜进行了PAs含量分析，结果表明阳性样品中PAs的含量范围在1~169 mg/kg。2016年，欧洲药品监管局（European Medicine Agency, EMA）规定了PAs的监测清单，并对其进行相关风险评估，建议成人每日摄入量不超过0.35 μg[50]。我国目前对蜂蜜中残留的PAs也开展了一些调查研究，但尚缺乏系统性风险排查以及风险评估研究，最大残留限量等安全评价指标也处于缺失状态。昝珂等[51]对国内市场采购的30批蜂蜜样品进行28种PAs/PANOs化合物的分析测定，结果发现有10批样品检出PAs，阳性样品中总含量为4.85~78.34 μg/kg。He等[52]对国内市售蜂蜜中的PAs污染进行了全面调查，从我国17个地区采购的255份蜂蜜样品中检出的阳性样品占比为58%，总PAs含量范围在0.2~281.1 mg/kg之间；此外，还发现蜂蜜中的PAs种类及污染水平存在地理环境差异，我国国内市售蜂蜜样品中检出了野百合碱型PAs（来自猪屎豆属），该类型PAs化合物与蓝蓟定（来自车前草）和石松胺型（来自千里光属）是我国蜂蜜中污染最主要的三类PAs化合物。其他国家蜂蜜中PAs污染水平及种类同样受地理来源的影响，如Picron等[35]2020年在比利时进行的一项市场调查中，评估了来自于比利时本土，其他欧洲国家及拉丁美洲等不同国家地区的蜂蜜样品中PAs的污染情况，研究结果发现比利时本土的蜂蜜受PAs污染的程度相对较低，阳性样品占比为67%，而其他国家的蜂蜜中PAs阳性样品占比高达90%，且污染样品主要来自于西班牙等地中海国家；另外，比利时原产蜂蜜主要受天芥菜型PAs的污染，地中海蜂蜜的PAs污染物主要包括印美定、蓝蓟定、石松胺型与天芥菜碱型4种类型，其中石松胺与天芥菜碱是最主要的类型，而在产自希腊的蜂蜜中首次检出有欧天芥菜碱型PAs化合物，这种污染差异可能与比利时及地中海当地不同的植物种群分布密切相关。
除蜂蜜外，花粉、蜂胶和蜂王浆等膳食补充剂以及零食、糖果等蜂蜜类制品也均被发现会受到PAs的污染。如Mulder等[25]在对欧洲蜂产品PAs污染的调查研究中发现，花粉相关产品中PAs阳性检出率约为91.6%，平均浓度为576.0 µg/kg，而蜂胶和蜂王浆产品中PAs的平均浓度分别为0.6和15.5 µg/kg，由此可见，花粉类膳食补充剂更易受PAs污染。Picron等[35]发现PAs呈阳性的花粉样品中，其检出浓度可高达1672 μg/kg。花粉样品中发现的主要生物碱有石松胺、蓝蓟定、印美定等化合物及其相应的氮氧化物，其次有少量的千里光宁碱型PAs。另外，相较于蜂蜜类膳食补充剂，零食、糖果等含蜂蜜类的衍生产品受PAs污染的水平较低。如Kempf等[53]2010年对含一定蜂蜜成分的60余种产品进行分析，发现8种产品有PAs检出，浓度范围在10~484 μg/kg。2011年Kempf等[47]又对10种糖果、7种能量棒和麦片、5种软饮料、3种婴儿食品和3种婴儿果冻及其他含蜂蜜食品进行了分析，仅在2种糖果中检出有PAs，浓度分别为10和40 ng/g。2020年Picron等[35]对早餐麦片等39种含蜂蜜类零食进行PAs污染评估，发现1/3的零食和54%的糖果受到PAs污染，最大污染水平分别为0.36和7.61 ng/g。以上这些研究均证实了含PAs的蜂蜜在食物链下游的污染。
2.3 动物源相关衍生制品中PAs
目前，在动物源性产品中发现PAs污染的情况并不常见。但是，鉴于动物采食的牧场或田地中可能存在产PAs的植物或饲料，因此在肉、蛋、奶等动物性产品中可检测到少量PAs[7,25,54]。如Diaz等[55]报道鸡蛋中发现的PAs污染物主要是其游离碱类型，其氮氧化物PANOs对污染的贡献较小。Edgar等[56]报道产蛋鸡因谷物饲料成分中含有天芥菜和车前草从而造成鸡蛋中PAs污染，浓度范围在5~168 mg/kg之间。Mulder等[25]对欧洲市场进行的一项最新调查分析中显示，6%的牛奶样本和1%的鸡蛋样本检出PAs阳性，其中有一或两种牛奶样品其PAs含量高于检出限，鸡蛋中PAs的污染浓度为0.1~0.12 μg/kg。
3. PAs的限量标准与安全风险管理
由于PAs在自然界中的广泛存在，含PAs食品的安全性已成为国内外相关监管机构和部门共同关注的热点。迄今为止，已发现13种可诱发大鼠肝脏肿瘤的PAs/PANOs，其中倒千里光碱、毛果天芥菜碱、野百合碱等被列为2B类致癌物[16]。由于PAs对人体健康造成的潜在危害，许多国家和机构对PAs的安全摄入量作出明确规定，如1989年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）颁布了《IPCS健康与安全指南第26号》，建议PAs的日摄入限量为15 μg/kg[3]；2005年荷兰国家公共卫生和环境研究所建议的每日安全摄入量为0.00043 μg/kg[17]；2008年英国毒性委员会规定PAs每日摄入量不高于0.007 μg/kg；2013年德国联邦风险评估研究所（Bundesinstitut für Risikobewertung， BfR）的建议值同样是不超过0.007 μg/kg[57]；欧洲药物管理局则规定成人的每日摄入量不超过0.35 μg/kg，儿童为0.007 μg/kg[58]；美国食品药品管理局禁止含PAs的紫草科植物用于食品加工业[18]；同样，比利时禁止将产PAs的植物琉璃苣作为食品食用，而其种子压榨的油也只能在用适当的检测方法分析不含PAs后才能用于膳食补充剂。最近，欧盟委员会（EU）于2020年新修订的1881/2006号法规对一些食品中PAs的最大允许限量进行了规定[59]。如表2所示，不同食品中PAs/PANOs的最大允许浓度水平范围在1.0~1000 μg/kg之间。此外，欧盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）还推荐了在食品中必须监测的21种PAs/PANOs清单[13]。然而，我国目前尚未对PAs的摄入量及食品中PAs的最大允许限量作出明确规定与建议。
表 2 不同食品中PAs（含其氮氧化物）的最大允许浓度Table 2. Maximum concentration levels for pyrrolizidine alkaloids (including N-oxides) in different food products食品种类 最大允许浓度（μg/kg） 茶浸提液（博士茶、茴香茶、柠檬薄荷茶、甘菊茶、百里香茶、胡椒薄荷茶、柠檬马鞭草茶以及由以上组成的混合茶） 400 其他茶浸提液（不包括以上提及的） 200 山茶（Camellic sinensis）与花茶（Camellic sinensis） 75 婴幼儿食用的山茶（Camellic sinensis）与花茶（Camellic sinensis）及其浸提液 1.0 中草药提取物及含中草药成分的膳食补充剂 400 花粉及其相关产品 500 玻璃苣、欧当归、马乔莲、牛至等干香料 1000 新鲜的或冷冻的玻璃苣叶子 750 孜然籽（种子香料） 400 4. 食品中PAs/PANOs的分析检测方法
4.1 提取
根据PAs的结构特征可知，PAs是含有特征性碱性氮的还原性生物碱，极易被氧化为相应的氮氧化物PANOs。PAs与PANOs均属于极性较强的有机化合物，提取溶剂常用甲醇、乙醇等极性较强的有机溶剂或与水的混合溶液[60]。PAs在pH较低时以离子形式存在，因此往提取溶剂中加入一定量的酸（0.05~1.00 mol/L）可提高萃取效率[16]。目前，应用于植物中PAs/PANOs的提取方式主要有沸水提取、超声波辅助提取、微波萃取及超临界流体萃取等[23,61−63]。
4.2 净化
食品基质成分复杂，需对其进行净化以减少杂质对目标物的干扰。近年来关于PAs从食品基质中净化的方式有传统液液萃取（Liquid-liquid extraction， LLE）、固相萃取（Solid phase extraction，SPE）、QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe）法以及分散液-液微萃取（Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）等新型前处理方法[34,41,64−69]。
LLE的基本原理是“相似相溶”，通常提取PAs时采用的策略是先用酸性溶液提取，生物碱将以离子形式存在于水相中，再将酸性溶液与不相溶的有机溶剂（如氯仿、二氯甲烷）一起振荡，氯仿会溶解并去除大部分共萃取的物质。弃去有机层，通过加入强氨等碱性溶液使水提取物呈强碱性。碱性条件利于生物碱从水相中释放出来，再用不相混溶的有机溶剂萃取以达到净化效果[60]。LLE操作耗时繁琐且易发生乳化，导致PAs损失，很难满足痕量分析的检测要求[70]。
固相萃取（SPE）是基于液相色谱的选择性吸附与洗脱原理，去除杂质的同时对目标物进行富集，具有易于操作、快速、高效等优点，是迄今为止应用最为广泛的纯化PAs的方法。前期常应用的SPE小柱有C8柱、C18柱及强阳离子交换柱（SCX）等，近年来SCX-SPE柱常用于PAs净化，其优点是在有效去除极性杂质的同时可将PAs及PANOs以高产率准确洗脱[71]。如许秀丽等[72]以甲醇甲酸水溶液提取茶叶样品中的PAs，经超声提取后，采用SCX-SPE柱净化，15种PAs的回收率均达到70%以上。Wang等[33]采用SCX-SPE柱对蜂蜜样品中12种PAs进行净化，回收率为79%~104%。此外，有研究表明混合型阳离子交换固相萃取柱（PCX-SPE）可同时提供离子交互与反相保留的两种保留模式，显著提高了净化能力[23,73]。值得强调的是，固相萃取净化前通常需要将待测样品提取液的pH范围调节至6.0~7.0的中和状态或9.0~11.0的碱性范围之间，尤其是在使用诸如C8及C18等反相吸附材料时，上样液处于中性或碱性范围时可促进目标分析物与吸附剂之间的相互作用。
QuEChERS法常用于复杂样品基质中多种目标物的提取净化，近年来也渐渐被应用于测定多种食品基质中的PAs，但该方法必须用锌粉还原PANOs[16]。Izcara等[41]采用QuEChERS法，在仅使用少量样品（0.2 g）、有机溶剂（1 mL）、净化吸附剂（175 mg）及分配盐（0.65 g）的情况下，即实现了对牛至样品中21种PAs/PANOs的净化处理，符合绿色分析化学原则并表现出良好的方法性能，回收率在77%~96%范围内。
近年来也有诸如分散液液萃取（DLLME）等新型技术尝试应用于植物等复杂基质中PAs的前处理过程。鉴于其省时、消耗溶剂少、萃取效率高等优势而具有应用潜力。Celano等[34]在最近的另一项研究工作中使用最小体积的有机溶剂（500 μL的氯仿）和分散剂（500 μL的异丙醇），建立了基于DLLME的超高效液相色谱-质谱方法，从蜂蜜样品中微萃取出9种PAs/PANOs化合物并对其进行测定，回收率在63%~103%之间，自述实际样品的分析结果与SPE相当。QuEChERS法与DLLME法均秉持简化前处理操作的原则，且具有绿色环保的优点，被逐渐应用到茶叶等复杂食品基质中多种PAs的痕量分析中。随着前处理技术的不断发展，目前一些新型前处理技术如固相微萃取、分子印迹法等不断应用于PAs等生物碱的检测分析中[57,74]。新型前处理技术具有萃取效率高、绿色、环保等优势，有望成为未来实现对多种PAs痕量分析的主要趋势。
4.3 分析技术
食品基质中PAs的分析检测方法有分光光度法、毛细管电泳法、免疫学方法、核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）法、色谱学方法以及近年来发展起来的基于LC-MS、GC-MS等色谱-质谱联用技术的高精度分析方法[7]。
分光光度法和薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）的检测原理均是基于显色反应，如PAs的吡咯衍生物可与Ehrilich试剂发生显色反应，产生具有特征吸收波长的络合物，实验操作简便，但存在灵敏度低、检出限高等问题[75−77]。酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）针对性的对某个特定PAs进行分析和快速筛查，不能准确获得含量信息，主要用于PAs的毒理学研究[78]。NMR法具有强大的定性分析能力，可实现无损检测，主要应用于PAs的结构鉴定，较低的灵敏度是制约其应用的主要瓶颈[79]。
GC和GC-MS法可用于大多数PAs（除奥索千里光裂碱）的分析；由于PAs难挥发的特点，需对其进行衍生化处理后再用GC或GC-MS分析[7,80−82]。GC和GC-MS的局限性还在于其不能对PANOs进行分析，需将其转化后为相应的游离PAs后再进行分析，该策略又称为“求和参数法”。该策略最早由Kempf等[47,81]提出，其建立了分析蜂蜜中1,2-不饱和PAs的GC-MS方法，具体操作是经溶剂提取后，先采用Zn2+粉将PANOs还原为相应的游离PAs，然后经净化处理后用LiAlH4将所有不饱和PAs转化为同一种类型的化合物（具有共同的千里光次碱骨架结构），再用衍生试剂（N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺）进行对所有PAs进行衍生化处理，最后上机分析衍生物。该方法的定量限为0.01 mg/L，后来也应用于其他基质的报道[83−85]。GC-MS法虽在一定程度上提高了方法灵敏度，但是衍生化操作耗时繁琐，PAs稳定性差易分解，目前PAs/PANOs法分析中已较少使用。
HPLC法无需衍生处理，但由于PAs的最大紫外吸收较弱，检测灵敏度低，难以满足痕量分析的要求。因此，液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是目前分析食品样品中PAs/PANOs的最主要的检测手段[1,9,52,86]。PAs/PANOs属极性化合物，色谱柱固定相选择反相色谱柱；流动相选用甲醇/水或乙腈/水，并在水相中添加适量酸或碱以提高分离度[7]。电喷雾（Electron Spray Ionization，ESI）与大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ion source，APCI）是LC-MS/MS常采用的离子源，其中ESI的应用更广。已有文献报道了部分PAs的[M+H]+离子的MS/MS的碎裂途径[9]（见图3）。Yoon等[39]利用LC-MS/MS结合冷冻脂质沉淀和固相萃取净化分析测定了高脂食品中的9种PAs化合物，检出限为0.06~0.60 ng/mL。Dzuman等[87]基于UPLC-MS/MS建立了一种更灵敏的方法用于分析牛至等食品中的PAs/PANOs，定量限为0.5~10 μg/kg。LC-MS/MS具有高选择性、高灵敏度等诸多优点，但有些PAs/PANOs尚缺乏商业化的标准物质，这在一定程度上限制了LC-MS/MS在高通量分析。
基于高分辨质谱精确质量数测定优势，结合液相色谱开发的联用技术（liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS），无需对每个化合物的质谱参数进行优化，可实现对样品中未知PAs/PANOs的结构及其同分异构体的筛选鉴定和痕量分析。超高效液相色谱-四级杆/轨道阱质谱（ultra high-performance liquid chromatography-quadrupole/Exactive Orbitrap mass spectrometry，UPLC-Q Exactive-MS）与超高效液相色谱-四级杆/飞行时间质谱（ultra high-performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）是目前用于复杂样品中的生物碱进行结构解析和确证分析的主要技术[88−91]。Jeong等[90]建立了可快速准确分析植物样本中PAs的UPLC-ESI-Q-TOF-MS方法，检出限为0.4~2.0 ng/mL，定量限为0.6~6.0 ng/mL。Martinello等[88]发现，与Q-TOF-MS相比UPLC-Q Exactive-MS可实现更高的的分辨率。
5. 食品加工和烹饪制作对PAs/PANOs的影响
5.1 热处理对PAs/PANOs的影响
近年来，PAs/PANOs在蜂蜜[52]、茶叶[83]、谷物[44]、肉类[92]、鸡蛋[55]及牛奶[93]等多种农产品中均能检出。为了更加真实评估人类对PAs的膳食暴露，针对这种生物碱污染的原材料开展加工工艺或烹饪制作对其PAs/PANOs含量水平影响的研究则很有必要。食品加工或烹饪制作中最普遍的工艺是热处理，因此有关PAs/PANOs在加热过程中的稳定性、含量种类变化及相关转化产物检测等方面的研究也很重要。实际上，早在20世纪初就报道了多起因食用被PAs/PANOs污染的谷物制作的面包而引发的严重生物碱中毒案例，这也反映了PAs/PANOs在烘烤的加热工艺下，具有一定的热稳定性[94]。70年代进行的另一项研究同样表明加热并不会破坏污染肉中的PAs[95]。Rosemann等[96]还专门开展了针对倒千里光碱（1,2-不饱和PAs）在食品加工过程中的热稳定性研究，该实验用被已知浓度倒千里光碱污染的玉米粉来制备玉米粥，沸水浴加热处理3 h后分别对原材料玉米粉和最终产品玉米粥中的倒千里光碱进行分析以便进行比较。研究结果表明玉米粥中的倒千里光碱的含量仅有少量减少，但差异不显著，分析含量减少的真正原因很可能是加热过程中乳剂的形成导致了提取效率降低，不是蒸煮过程中倒千里光碱自身的热不稳定性引起的降解。为了进一步验证，该实验又对凉茶样品进行了类似的加热处理，结果同样显示未煮过的凉茶原材料与煮过的凉茶样品中倒千里光碱的含量没有显著差异。因此，该研究得出的结论是在正常的加热烹饪过程中倒千里光碱具有热稳定性，其浓度含量不受高温影响。但是，也有研究得出相反结论，即加热工艺可以影响样品中PAs与其氮氧化物PANOs的比例关系以及PAs的总含量。如Boppré等[97]采用加热的方式干燥被PAs污染的花粉，结果表明PANOs降解转化为相应的游离PAs，导致其数量大大减少，但是PAs的总量保持不变。而Kaltner等[98]的研究则发现被PAs污染的蜂蜜在20 ℃下长期储藏时，PANOs的含量水平随着贮藏时间的延长而不断下降，但并没有降解转化为相应的PAs，意味着PAs的总量减少了。以上两项研究工作得出的结论有不一致的地方，但基本可以得出加热条件会造成PANOs含量的降低。此外，针对茶叶、草药等样品的特殊加热处理方式主要是浸提工序，这会在很大程度上影响最终产品中PAs含量。然而，目前仅有少数研究对此影响进行了评估。Picron等[13]采用沸水冲泡的方式对不同品种的干茶进行浸提以研究此过程中PAs的转移效率，结果表明经沸水冲泡后干茶叶中仅有16%~28%的PAs/PANOs转移至浸提液中（野百合碱除外，为45%）。值得注意的是，茶叶、草药等的浸提工艺会涉及许多参数，如浸提时间、温度、叶子的颗粒大小等，这些都可能对PAs/PANOs的转移效率产生影响。如Chen等[99]评估了茶叶颗粒大小对PAs/PANOs的浸提效果的影响，结果表明用粉碎茶叶末冲泡得到浸提液中的PAs含量比用完整茶叶叶片冲泡得到的浸提液中PAs的含量高1.1~4.1倍。
5.2 发酵工艺对PAs/PANOs的影响
除热处理外，发酵工艺也是食品加工中常用到的工艺之一。Kempf等[53]通过分析含蜂蜜成分的糖果和蜂蜜酒中的PAs/PANOs的污染状况得出蜂蜜原材料在经过加热和/或发酵处理后仍可将PAs/PANOs污染延续到最终产品中。Picron等[35]同样证实了被PAs/PANOs污染蜂蜜的下游食品中，如糖果和零食中仍可检测到PAs/PANOs，只是阳性产品检出率为1/3且污染水平相对较低。Cao等[64]以已知PAs/PANOs浓度污染的蜂蜜为原料制备蜂蜜酒，评估发酵过程如何影响PAs/PANOs的含量，研究结果表明在制备的蜂蜜酒样品中检出的PAs含量约为原蜂蜜中含量的30%和70%，但是仍不确定这种显著减少是由于发酵过程本身还是制备过程中的稀释作用。
综上所述，目前所开展的这些研究工作仅仅评估了常见的热处理、发酵等加工工艺对PAs/PANOs的含量的影响，研究结论存在不一致的地方且影响机制尚不明确，而关于其他加工技术如烘烤、油炸、煮沸、微波处理等对PAs/PANOs含量是如何影响的仍处于空白。鉴于此，有必要在这一领域进行更加细致和深入的研究，这将有助于可靠地评估PAs/PANOs的真实摄入量和膳食暴露水平以便对其制定更有效和安全的监管措施。
6. 结论与展望
PAs是一种天然代谢产物，其不饱和型PAs及大部分PANOs具有毒性。近年来，PAs污染问题在蜂蜜、茶叶等食品中均有不同程度发现。长时间接触含PAs/PANOs的食品，即使是含量较少也很容易导致其在体内的累积，最终引起毒性事件的发生。鉴于食品中PAs对人体健康造成的潜在危害，目前已有多个国家和机构针对个别食品制定了PAs最大允许含量的相关标准或措施。但是，由于PAs种类繁多，食品基质复杂，有关PAs/PANOs的加工稳定性方面的研究数据有限且不确定等原因，对PAs/PANOs的实际摄入量做出可靠和准确评估并对其制定合理的限量标准及风险管理措施仍是未来面临的一项具有挑战性工作。为此，这一领域仍有大量工作亟需开展：覆盖更为全面的食品基质并对其进行广泛的PAs污染状况调查与研究，尽可能多地了解并掌握所有可能被PAs污染的食品种类及其污染程度；对更多PAs同系物及其可能的代谢产物进行毒理学研究以评估可能存在化学结构-毒性关系，进一步补充PAs污染物监测清单；对潜在被污染的原材料，进行不同食品加工技术或烹饪制备对PAs/PANOs稳定性影响的研究以评估更为真实的膳食暴露；根据PAs/PANOs在不同食品基质中的污染状况，开发更为灵敏、高效、且绿色环保的分析检测技术，以形成系统化的控制方法与标准，有效确保食品质量安全。
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图 1 PAs （a）、1,2位饱和PAs、1,2位不饱和PAs （b）的基本结构及代表性饱和、不饱和 （c）、酯型、开链双酯型与环酯型千里光次碱（d）的化学结构[15−18]
Figure 1. Basic structures of PAs (a), 1,2-saturated PAs and 1,2-unsaturated PAs (b) and chemical structures of representative pyrrolizidine alkaloids according to the necine base (c) and different types of esterification (d)[15−18]
表 1 不同食品中PAs/PANOs的污染水平
Table 1 Levels of PAs/PANOs in different items
食品分类 名称 样本数量 PAs种类 含量水平（µg/kg） 来源
国家/地区参考文献 茶叶 花草茶 169 23 0~5668 德国 [22] 18 44 0.1~47.9 德国 [23] 18 14 10~1733 爱尔兰 [24] 168 28 454~4805 欧洲 [25] 黑茶、绿茶、花草茶及水果茶 274 17 0.3~5647.2 德国 [26] 黑茶、绿茶及花草茶 70 28 20~1729 以色列 [27] 蜂产品 蜂蜜 70 9 1~172 意大利 [28] 71 18 0.4~55 瑞士 [29] 150 14 2.9~545.5 爱尔兰 [24] − 5 2.4~2.7 加拿大 [30] 92 8 1.2~248 巴西 [31] 54 4 1.0~64.1 波兰及亚洲地区 [32] 32 12 1.4~14.2 亚洲、欧洲及美洲等国家或地区 [33] 25 9 0.2~17.5 意大利 [34] 255 17 0.2~281.1 中国 [8] 含蜂蜜成分的零食 13 28 0~0.36 比利时 [35] 含蜂蜜成分的糖果 39 28 0~0.56 比利时 [35] 禽蛋 鸡蛋 206 28 0~0.12 欧洲 [36] 6 28 0~0.049 中国香港 [37] 鸭蛋 6 28 0~0.19 中国香港 [37] 鹌鹑蛋 6 28 0~0.01 中国香港 [37] 肉制品 肉和动物肝脏 35 28 0 中国香港 [37] 273 28 0 欧洲 [36] 奶制品 牛奶 169 28 0.05~0.16 欧洲 [25] 182 28 0~0.12 欧洲 [36] 63 16 0~0.061 比利时 [38] 奶酪 25 28 0.05~0.15 欧洲 [36] 6 28 0~0.048 欧洲 [37] 其他 预包装沙拉 17 30 1.13 比利时 [13] 大豆 11 9 0.64~1.46 韩国 [39] 食用油 10 9 1.91~26.96 韩国 [39] 注：“−”表示样本数量不明。 
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表 2 不同食品中PAs（含其氮氧化物）的最大允许浓度
Table 2 Maximum concentration levels for pyrrolizidine alkaloids (including N-oxides) in different food products
食品种类 最大允许浓度（μg/kg） 茶浸提液（博士茶、茴香茶、柠檬薄荷茶、甘菊茶、百里香茶、胡椒薄荷茶、柠檬马鞭草茶以及由以上组成的混合茶） 400 其他茶浸提液（不包括以上提及的） 200 山茶（Camellic sinensis）与花茶（Camellic sinensis） 75 婴幼儿食用的山茶（Camellic sinensis）与花茶（Camellic sinensis）及其浸提液 1.0 中草药提取物及含中草药成分的膳食补充剂 400 花粉及其相关产品 500 玻璃苣、欧当归、马乔莲、牛至等干香料 1000 新鲜的或冷冻的玻璃苣叶子 750 孜然籽（种子香料） 400
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