Identification of Key Taste Components of Pixian Borad Bean Paste
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摘要: 为探究传统发酵调味品郫县豆瓣中的关键滋味成分，本研究分别采用氨基酸自动分析仪、高效液相色谱仪、电感耦合等离子发射光谱仪定性、定量分析了郫县豆瓣中的游离氨基酸、有机酸和无机离子，并通过滋味活性值（taste active value，TAV）、滋味重组实验、减除实验和添加实验结合确定了郫县豆瓣的关键滋味组分。结果表明，郫县豆瓣中共检测出29种滋味组分，通过感官实验确定丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、K+、Mg2+、Na+、PO43-和Cl-共13种呈味组分为郫县豆瓣的关键滋味物质。13种关键滋味组分的滋味重组液与29种完全滋味重组液有较好的一致性，但与郫县豆瓣的天然提取液相比，酸味存在一定差异。本研究加深了对郫县豆瓣的滋味成分和滋味本质的认知，为郫县豆瓣的发酵过程中滋味变化规律、质量监控与评价提供参考。Abstract: To explore the key taste components of Pixian Borad Bean Paste (PBBP), free amino acids, organic acids and inorganic ions were quantitatively analyzed by amino acid analyzer, high performance liquid chromatography, and inductively coupled plasma optical emission spectrometer, respectively. The key taste compounds were identified by taste activity value (TAV), taste reconstitution, omission and addition tests. The results showed 29 kinds of taste components were determined in PBBP. Furthermore, alanine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, tartaric acid, lactic acid, succinic acid, K+, Mg2+, Na+, PO43- and Cl- were confirmed as the key taste compounds in PBBP by sensory evaluation. Moreover, the taste reconstitutions of 13 key taste components were consistent with that of 29 complete taste components, while its sour taste was different with natural extract of PBBP. This research promotes the knowledge of the taste components and taste essence of PBBP, and provides reference for the taste change pattern, quality monitoring and evaluation during the fermentation of PBBP.
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郫县豆瓣是以红辣椒、蚕豆和小麦粉为主要原料，在米曲霉微生物作用下自然发酵而成的半固体粘稠状的调味品[1−2]，有“川菜之魂”之称[3−4]，因其浓厚的酱香和鲜辣醇厚的味感深受广大消费者喜爱[5]。目前对郫县豆瓣的研究主要集中在香气成分分析[6−8]以及后发酵期真菌细菌的掩体变化规律[9−10]，对郫县豆瓣滋味组分的研究大多集中在对单一类别的滋味物质如有机酸[11]、游离氨基酸[12−13]、糖类物质和脂肪酸[14−15]的定性定量分析，未考虑郫县豆瓣的总体滋味特性和滋味物质间的相关性[16−17]。
不同企业的郫县豆瓣在五种基本滋味属性上表现出了较好的一致性，主要表现出了突出的鲜味和咸味[13,18]。其中鲜味主要来源于微生物分解蛋白质形成的多肽、氨基酸和微生物自溶产生的钠盐等[13,19]；咸味主要来源于生产过程中添加的食盐；酸味主要来源有机酸，国标要求总酸度含量不应大于2%；甜味属性强度较低，主要由甜味氨基酸以及淀粉糖化产生的部分低聚糖和一些醇类物质共同影响[13]；苦味属性强度不明显，主要来源于生物碱、苦味肽、萜类和糖苷类物质[20]。但郫县豆瓣的最终滋味形成复杂，不仅取决于单一的某种滋味组分，还取决于各类滋味组分之间的相互作用[21]。
目前针对郫县豆瓣的非挥发性滋味组分及TAV等的研究报道相对碎片化，并未作系统分析和量化比较。采用分子感官科学从分子水平上定性、定量描述滋味，确定食品中滋味的组成，能更加客观地评价食品的滋味品质[22−23]。但由于食品中的复杂相互作用，仅通过定量分析和个体滋味物质特征研究很难揭示每种滋味物质对食品整体风味的贡献。所以，感官重组实验、减除实验在对食品的潜在滋味化合物进行组分鉴定和定量模拟的基础上，通过重组的方式对滋味的化学本质进行阐明，并进一步通过减除实验描述滋味化合物与基本滋味属性之间的关系，发掘具有关键作用的滋味物质[24]，同时弥补了物理化学分析和感官数据之间的差距。此外，滋味组分之间的复杂关系，如协同效应或掩蔽效应 ，可以通过减除实验来简化，从而可以对所研究的食品提取物的滋味进行全面分析[25]。
本研究前期对市售不同等级和不同企业的11种郫县豆瓣的感官评价、理化指标和滋味物质定性定量分析，发现郫县豆瓣的基本滋味属性之间差异较小，不同郫县豆瓣中的滋味物质在其定性定量物质的种类、含量、比例与TAV>1水平上均表现出了较好的一致性，在此基础上选取滋味组分丰富、协调性和感官偏好性更高，更受消费者欢迎的市售郫县豆瓣为原材料，采用仪器分析和感官分析相结合的方法，对郫县豆瓣中的游离氨基酸、有机酸和无机盐离子3类潜在的滋味组分进行识别和量化，通过滋味重组、减除和添加实验确定关键滋味组分并验证其感官特征，进一步明确郫县豆瓣的关键滋味组分，旨在为郫县豆瓣的滋味变化规律和质量评价提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
郫县豆瓣样品 成都旺丰食品有限公司，为市售包装一级郫县豆瓣，发酵时间为1.5年，pH4.61±0.06，总酸1.718±0.082 g/100 g，氨氮0.503±0.007 g/100 g，水分53.02%±0.95%，盐分18.02%±2.32%；苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asn）、谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、缬氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、半胱氨酸（Cys）、草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸等 标准品，纯度均在98%以上，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、高氯酸、磷酸 色谱纯，成都市科龙化工试剂厂；柠檬酸、蔗糖、食盐、味精 食品级，成都市郫都区绿源超市。
PHS-320型pH计 成都世纪方舟科技有限公司；MVS-1旋涡混合器 北京金紫光科技发展有限公司；SB-5200DTN超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；H1850R冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；L-8800氨基酸自动分析仪 日立公司；Waterse2695高效液相色谱仪（配备Waters2998PAD检测器） 沃特世科技有限公司；MDS-6G微波消解仪 上海新仪微波化学科技有限公司；SXL-1002程控箱式电炉 上海精宏实验仪器有限公司；Avio200电感耦合等离子体发射光谱仪 美国PERKINELMER公司。
1.2 实验方法
1.2.1 郫县豆瓣滋味物质提取
将5.0 g打碎的郫县豆瓣样品与30 mL超纯水混合，涡流振荡1 min，4 ℃条件下10000 r/min冷冻离心10 min，收集上清液，重复3次以上操作，合并上清液定容至100 mL，得到滋味提取液，然后将其与超纯水以1:1的比例稀释得到天然提取液（natural extracts，NE），后续进行感官实验[26]。
1.2.2 游离氨基酸的测定
游离氨基酸的组成及含量的测定参考国标GB/T 30987-2020《植物中游离氨基酸的测定》[27]的全自动氨基酸分析仪法。
1.2.3 有机酸的测定
将5.0 g郫县豆瓣加入35 mL 70%乙醇，涡流振荡1 min，室温40 kHz频率下超声提取37 min，在4 ℃条件下10000 r/min冷冻离心10 min，收集上清液，重复以上操作，合并上清液定容至100 mL，得到待测液，然后采用0.22 μm尼龙过滤器过滤，滤液于4 ℃下保存备用。
HPLC色谱条件:色谱柱Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流速0.5 mL/min；流动相为甲醇和0.01 mol/L磷酸二氢钾体积比为3:97，pH2.8；采用光电二极管阵列检测器，检测波长210 nm；进样量10 μL[11]。
1.2.4 无机离子的测定
Na+、K+、Ca2+、Mg2+和PO43-的含量测定参考王冲等[28]的方法，通过微波消解对郫县豆瓣样品进行预处理，加入5 mL浓硝酸、2 mL浓过氧化氢置于消解罐中进行消解。第一阶段，控温120 ℃，升温5 min，恒温2 min；第二阶段，控温150 ℃，升温3 min，恒温4 min；第三阶段，控温190 ℃，升温4 min，恒温26 min，消解结束进行赶酸处理，并用5%硝酸定容至10 mL。样液稀释100倍后，用0.22 μm聚醚砜滤膜过滤。然后使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）检测郫县豆瓣中5种矿物质元素（K、Na、Ca、Mg、P）的定量分析。Cl-的测定方法参考GB/T 5009.44-2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》[29]。
1.2.5 感官分析
所有感官实验在专业的感官分析实验室进行，室内温度为25±2 ℃，通风良好，照明正常。12名感官评价员（8名女性，4名男性，年龄20~24岁）均无味觉障碍，且每名成员具有郫县豆瓣的感官实验经历。在感官实验中评价员使用鼻夹，防止滋味与气味间的相互作用。
遵循ISO 8586-1:2012的要求，对所有小组成员进行三点检验法以评估基本滋味。五种基本味道的培训采用0.08%柠檬酸、1%蔗糖、0.5%L-亮氨酸、0.2%氯化钠和0.1%味精分别代表酸味、甜味、苦味、咸味和鲜味，感官评价员对所有标准液的浓度和滋味强度多次讨论达成共识[30]。
1.2.5.1 滋味轮廓分析
分别将4个样品呈送给感官员，包括新鲜制备的NE、完全滋味重组液（complete taste recombinant，CTR）、简化滋味重组液（simplified taste recombinant，STR），关键滋味重组液（key taste recombinant，KTR），使用九点强度标度法评估每个样品的五个滋味属性的强度（酸味、甜味、苦味、咸味、鲜味）。五种基本滋味的标准液被认为是5分，1~3分表示味道极弱或者没有味道；3~5表示味道弱；5~7表示味道强；7~9分表示滋味非常强。其中，CTR的制备是将所有滋味组分根据检测到的浓度溶解在超纯水中；STR制备将TAV>1的滋味组分以其检测到的浓度溶解在超纯水中；KTR制备将感官评价分析出的关键滋味组分以其天然浓度溶解在超纯水中。
1.2.5.2 减除实验
检测出的滋味物质根据检测方法和结构差异分为游离氨基酸、有机酸、无机离子三组，先通过对完全滋味重组液CTR中逐一减除单一组物质后，将减除后的样品和两份CTR进行三点检验法进行判别[31−32]，通过ISO 4120:2004（E）（Sensoryanalysis-Methodology-Triangletest）的标准表判定是否存在显著性差异（P<0.05）。若存在显著性差异，感官评价员使用九点强度标度法感官判定滋味属性强度大小。再从CTR中逐一减除单一滋味物质，重复上述操作。结果可用于衡量每一组或每一种滋味物质是否对整体滋味做出贡献和滋味属性强度大小。
1.2.5.3 添加实验
制备通过减除实验初步鉴定出的13种关键滋味物质的模型溶液，依次将未加入的滋味物质按照检测到的浓度加入到模型溶液中，将加入后的样品与两份CTR进行三点检验法进行判别，通过ISO 4120:2004（E）的标准表判定是否存在显著性差异。若存在显著性差异，使用九点强度标度法感官判定滋味属性强度变化大小。
1.2.6 TAV分析
评价单个滋味物质对食品滋味的贡献大小通常采用TAV值的大小，这是一种比较客观的评价方法，目前已经广泛应用于各种食品的风味研究。它的计算公式如下:
当TAV>1时，说明该物质对食品的风味有贡献，贡献程度与其数值大小成正比；当TAV<1时，则说明该物质对于食品的风味贡献较小。
1.3 数据处理
所有定量数据均独立测定三次，结果以平均值±标准偏差表示。所有感官实验重复三次，获得每个属性的36个响应值（12×3）。三点检验法的显著性差异（P<0.05，P<0.01和P<0.001）通过ISO 4120:2004（E）（Sensoryanalysis-Methodology-Triangle test）的标准表判定。采用ANOVA（SPSS 17.0）分析NE、CTR、STR、和KTR中各滋味属性在5%（P<0.05）的显著性水平的差异。
2. 结果与分析
2.1 游离氨基酸分析
水溶性的含氮化合物如短肽、氨基酸和其它蛋白降解产物对于发酵食品的特有滋味的形成起到重要作用，其中游离氨基酸通常被认为是郫县豆瓣中鲜味的主要来源[33]。由表1可知，郫县豆瓣中检测出18种游离氨基酸，包括17种游离氨基酸和1种酰胺类物质，总游离氨基酸含量在31.36±0.03 mg/g。参考林洪斌等[13]对不同游离氨基酸的呈味特性，将氨基酸分为甜鲜味、鲜酸味、苦甜味、苦味和咸味氨基酸五类。其中呈现鲜酸味氨基酸的含量最高，总量达到11.04±0.09 mg/g，其次是苦味氨基酸含量和甜鲜味氨基酸，分别达到了8.70±0.06 mg/g和6.15±0.14 mg/g，不同呈味特性的游离氨基酸存在显著差异（P<0.05）。其中Glu含量是单一游离氨基酸含量最高的，占总游离氨基酸的10.92%，Asp含量是单一游离氨基酸含量第二的，占总游离氨基酸的10.13%，所以Glu和Asp被认为是主要的鲜味氨基酸，具有形成鲜味和缓冲咸味等味道的特殊功效[34−35]，同时Glu和盐的复合反应能提高食品的鲜味[36−37]。而Pro、Leu、Arg、Ala、Val、Lys、Ser、Asn、Ile在郫县豆瓣中含量依次降低，其含量均占总游离氨基酸含量的5%以上。经文献研究发现，郫县豆瓣的游离氨基酸大多来自原料蚕豆的蛋白质降解，虽然不同发酵环境、产品类型和原料来源等因素会对郫县豆瓣的游离氨基酸总量差异产生影响，但其组成比例和TAV值大小表现出较好的一致性，同时不同滋味特性的氨基酸之间的比例也基本保持不变，与本研究基本一致[38−41]。
表 1 郫县豆瓣中游离氨基酸的含量、滋味阈值和TAVTable 1. Free amino acid content, taste threshold and TAV in Pixian Borad Bean Paste呈味特性 物质 含量（mg/g） 呈味阈值[36,42] （mg/g） TAV 甜鲜味 苏氨酸（Thr） 1.46±0.00i 2.60 0.56 丝氨酸（Ser） 1.75±0.00h 1.50 1.17 甘氨酸（Gly） 0.88±0.00l 1.30 0.68 丙氨酸（Ala） 2.07±0.01f 0.60 3.45 甜鲜味氨基酸总量 6.15±0.14c 鲜酸味 脯氨酸（Pro） 2.75±0.00c 3.00 0.92 天冬氨酸（Asp） 3.14±0.06b 1.00 3.14 天冬酰胺（Asn） 1.72±0.03h ND nd 谷氨酸（Glu） 3.43±0.00a 1.00 3.43 鲜酸味氨基酸总量 11.04±0.09a 苦甜味 赖氨酸（Lys） 1.89±0.01g 0.50 3.78 组氨酸（His） 0.47±0.01m 0.20 2.35 精氨酸（Arg） 2.13±0.04e 0.50 4.25 苦甜味氨基酸总量 4.49±0.02d 苦味 缬氨酸（Val） 1.92±0.02g 0.40 4.80 甲硫氨酸（Met） 0.16±0.00n 0.30 0.55 异亮氨酸（Ile） 1.57±0.01i 0.90 1.75 亮氨酸（Leu） 2.51±0.01d 1.90 1.32 酪氨酸（Tyr） 1.06±0.01k 0.9 1.17 苯丙氨酸（Phe） 1.48±0.01i 0.90 1.64 苦味氨基酸总量 8.70±0.06b 咸味 半胱氨酸（Cys） 0.03±0.00o 0.3 0.11 游离氨基酸总量 31.36±0.03 注：同列小写字母不同表示差异显著（P<0.05），表2~表3同；ND表示未查询出；nd表示未检测出。 同时，由表1中的TAV值可知，游离氨基酸中的Ser、Ala、Asp、Glu、Lys、His、Arg、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe的TAV值均大于1，因此，这12种游离氨基酸被初步认定为郫县豆瓣的潜在关键滋味组分。
2.2 有机酸分析
有机酸作为郫县豆瓣中呈酸味的滋味物质，大多数是在制曲及发酵过程中通过微生物作用由原料中的蛋白质、淀粉和脂肪等物质转化而来，而少量有机酸来自于原料[43−44]。由表2可知，郫县豆瓣中检测发现草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸7种有机酸，富马酸的含量较低（TAV<0.01）不参与讨论。郫县豆瓣样品中测得的总有机酸含量达到9.26 mg/g，其中有机酸含量最高的是乳酸，含量高达6.776±0.016 mg/g，占总有机酸含量的73%，具有温和的酸味[45−46]。其次是酒石酸和琥珀酸，含量分别为1.322±0.009 mg/g和0.801±0.192 mg/g，不同有机酸物质存在显著含量差异（P<0.05），单一有机酸的含量差异和有机酸种类间的含量比例都会影响郫县豆瓣的口感和质量[47]。酒石酸其呈味阈值高达88.15，不仅表达出了强烈的酸味，也表达出了微弱的咸味，这可能是味感之间的掩蔽作用[48]。另外琥珀酸呈味阈值是7.55，产生明显酸味，同时文献报导显示琥珀酸具有和谷氨酸相似的增味效应，具有鲜味增效作用[49]。优势酸为乳酸、酒石酸、琥珀酸，与前人研究结果有较好的一致性，其含量差异主要与其微生物和原料相关[11]。
表 2 郫县豆瓣中有机酸的含量、滋味阈值和TAVTable 2. Organic acid content, taste threshold and TAV in Pixian Borad Bean Paste呈味特性 物质 含量（mg/g） 呈味阈值[50]（mg/g） TAV 酸味 草酸 0.050±0.000e 0.504 0.10 酸味 酒石酸 1.322±0.009b 0.015 88.15 酸味/苦味 苹果酸 0.275±0.031d 0.496 0.55 酸味 乳酸 6.776±0.016a 1.260 5.38 酸味 柠檬酸 0.035±0.019e 0.450 0.08 酸味/鲜味 琥珀酸 0.801±0.192c 0.106 7.55 酸味 富马酸 0.0009±0.0004e 0.300 <0.01 由表2可知，有机酸中的酒石酸、乳酸和琥珀酸的TAV值均大于1，因此，这3种游离氨基酸被初步认定为郫县豆瓣的潜在关键滋味组分。
2.3 无机离子分析
通常无机离子来自主要显示出来的味感是咸味，正、负无机离子都会影响咸味的生成。咸味由阳离子产生，阴离子起到修饰或改善咸味的作用。其中Na+产生咸味强烈且纯正，Ca2+和K+咸中带苦，而PO43-、Cl-对的咸味起到了消杀和抑制的作用，其中PO43-产生温和爽快的酸味，抑制作用更为明显[20,51]。由表3可知，郫县豆瓣中检测发现了Ca2+、K+、Mg2+、Na+、PO43-和Cl-这6种无机离子，其中含量最高的无机离子是Na+，含量高达62.504±0.508 mg/g，是呈味阈值的41.67倍，Na+含量的显著差异与郫县豆瓣的咸味表现出了一致性（P<0.05），主要来源于甜瓣子和椒肧发酵中食盐的添加[19]。其次含量第二的是Cl-，含量为10.934±1.406 mg/g，是呈味阈值的4.11倍，而郫县豆瓣中Cl-含量明显低于Na+含量主要是由于在形成的同时也与谷氨酸和天冬氨酸生成化合物谷氨酸钠等重要的呈鲜物质。含量第三的是K+，含量为7.063±0.051 mg/g，是呈味阈值的5.43倍。目前对无机离子的含量与滋味分子主要集中在水产品和菜肴呈味特性研究[52−54]。
表 3 郫县豆瓣中无机盐离子的含量、滋味阈值和TAVTable 3. Inorganic salt ion content, taste threshold and TAV in Pixian Borad Bean Paste呈味特性 物质 含量（mg/g） 呈味阈值[55]（mg/g） TAV 苦味 Ca2+ 0.482±0.045d 1.50 0.32 咸味 K+ 7.063±0.051c 1.30 5.43 苦味 Mg2+ 1.591±0.071d 0.96 1.66 咸味 Na+ 62.504±0.508a 1.50 41.67 咸味 PO43- 1.709±0.155d 1.4246 1.20 无味 Cl- 10.934±1.406b 2.66 4.11 由表3可知，除了Ca2+，郫县豆瓣中的Na+、K+、Mg2+、PO43-和Cl-的含量均超过呈味阈值，因此这五种无机盐离子在郫县豆瓣中对味道贡献较大[56]。
综合以上对郫县豆瓣中游离氨基酸、有机酸和无机盐离子的定量，通过对其TAV进行分析，Ser、Ala、Asp、Glu、Lys、His、Arg、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、酒石酸、琥珀酸、乳酸、Na+、K+、Mg2+、PO43-和Cl-这20种滋味物质可能是郫县豆瓣的潜在关键滋味组分。但是，滋味物质中有部分特殊的物质，这些物质本身无味或仅仅呈现非常弱的基本味，但当这些物质在模型溶液或另一些基本味觉的存在时（鲜味、甜味、苦味等），能够体现出提升、抑制、变调或非常复杂的味道，即本身滋味较弱的滋味物质在鉴定时会遗漏造成整体滋味缺失[57]，因此郫县豆瓣中TAV<1的滋味物质可能在亚阈值浓度下也对滋味做出贡献。为探讨滋味物质对郫县豆瓣滋味的影响，将通过滋味轮廓分析、减除实验和增添实验进行下一步实验。
2.4 感官评价结果
2.4.1 滋味轮廓分析
以上可知，郫县豆瓣中共检测出31种滋味组分，富马酸TAV<0.01对感官影响较小，天冬酰胺存在标品上的限制，因此在实际感官实验中仅采用其余29种滋味物质进行感官分析。根据上述游离氨基酸、有机酸和无机盐离子的定性定量结果制备由29种TAV>0.01滋味物质（表1~表3）构成的CTR和根据TAV>1的20种潜在滋味物质构成的STR。通过滋味轮廓图的对比，结果如图1所示，CTR表现出突出的咸味和鲜味，滋味属性强度分别是7.9和7.3，其次是轻微的酸味和甜味，滋味属性强度分别是4.6和4.0，而苦味属性特别微弱，可忽略不计。CTR和STR的滋味属性轮廓高度相似，都具有突出的咸味、鲜味和酸味，且各属性强度基本相同。两者都在咸味和鲜味属性上较好的模拟出NE的典型滋味特征，但酸味属性呈现出显著差异（P<0.05）。
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图 1 NE、CTR、STR、KTR的滋味属性强度值Figure 1. Intensity of taste attribute of NE, CTR, STR and KTR2.4.2 减除实验分析
在对郫县豆瓣滋味的化学本质进行阐述后，减除实验可以进一步描述某一个或某一类化学物对所有滋味属性的映射关系，可以进一步消除滋味物质，进一步压缩对郫县豆瓣滋味溶液中具有关键的物质，达到以“最少”的滋味组分对原有食品滋味进行模拟的效果。
2.4.2.1 组间减除实验
滋味物质按照物质的结构分类探讨每一组滋味物质对整体滋味的影响，分别从CTR中移除组1（游离氨基酸）、组2（有机酸）和组3（无机离子）时后评价其是否对整体滋味轮廓造成的影响，若存在显著的滋味差异，则评价员使用九点强度法描述样品与CTR之间的滋味属性强度的差异变化。三点检验法的正确鉴别的个数对应着感官的显著性水平。对于36个响应值，当正确鉴别数<18，表示结果不显著；当18<正确鉴别数<20，表示结果具有显著性差异（P<0.05）；当20<正确鉴别数<22，表示结果具有极显著差异（P<0.01）；当正确鉴别数>22，表示结果具有高度显著差异（P<0.001）。滋味差异的水平即滋味强度的改变，是在三点检验法基础上探究减除液与CTR之间的五个滋味属性强度的差异变化。
由表4可知，当从CTR中移除各组滋味物质，感官评价员能够在三点检验法时正确判别出减除后的样品34、36和36次，即减除游离氨基酸、有机酸和无机离子后均能观察到高度显著的滋味差异（P<0.001）。从CTR中减除组1游离氨基酸时，酸味、鲜味发生高度显著性降低（P<0.001），即游离氨基酸是提供鲜味的主要成分。从CTR中减除组2有机酸后，酸味、咸味和鲜味发生高度显著的降低（P<0.001），甜味发生了极显著性降低（P<0.01）。从CTR中减除组3无机离子，咸味和鲜味发生高度显著的降低（P<0.001），酸味反而发生了高度显著的升高（P<0.001），验证了无机离子和咸味、鲜味存在了高度相关性。这与文献结果类似，即游离氨基酸、有机酸和无机离子的减除会造成鲜味和鲜味的降低[52,58]。
表 4 组间和组内成分的减除对郫县豆瓣滋味属性的影响Table 4. Effect of absence of group or individual compounds on the taste attributes of the complete taste recombinant of Pixian Borad Bean Paste减除的组分 正确鉴别的
个数（n=36）显著性 滋味差异的水平
（滋味强度的改变）组1：游离氨基酸 34 *** Sa↓***（8.6→6.0）、U↓***（8.5→6.0）、So↓、S↓、B↓ 苏氨酸（Thr） 12 − 丝氨酸（Ser） 10 − 甘氨酸（Gly） 15 − 丙氨酸（Ala） 18 * U↓*（8.5→8.0）、Sa↓、So↓ 脯氨酸（Pro） 11 − 天冬氨酸（Asp） 25 *** U↓***（8.5→7.6）、Sa↓、So↓ 谷氨酸（Glu） 29 *** U↓***（8.5→7.8）、Sa↓、So↓ 赖氨酸（Lys） 26 *** Sa↓、B↓ 组氨酸（His） 12 − 精氨酸（Arg） 25 *** Sa↓、B↓、U↓ 缬氨酸（Val） 11 − 甲硫氨酸（Met） 14 − 异亮氨酸（Ile） 13 − 亮氨酸（Leu） 12 − 酪氨酸（Tyr） 12 − 苯丙氨酸（Phe） 7 − 半胱氨酸（Cys） 6 − 组2：有机酸 36 *** Sa↓***（8.6→5.4）、U↓***（8.5→5.3）、So↓***（7.6→6.8）、S↓**（4.4→3.4）、B↓ 草酸 16 − 酒石酸 26 *** So↓***（7.6→6.4）、U↓*（8.5→8.0）、S↓、B↓ 苹果酸 13 − 乳酸 25 *** So↓***（7.6→6.6）、U↓、S↓ 柠檬酸 14 − 琥珀酸 28 *** Sa↓***（8.6→7.6）、U↓***（8.5→7.4）、So↓、B↓ 组3：无机离子 36 *** Sa↓***（8.6→3.3）、U↓***（8.5→3.3）、So↑***（7.6→8.6）、S↓、B↓ Ca2+ 15 − K+ 20 ** Sa↓**（8.6→7.5）、U↓**（8.5→7.5）、S↓、B↑ Mg2+ 19 ** Sa↓**（8.6→7.0）、U↓**（8.5→7.2）、S↓、B↑ Na+ 34 *** Sa↓***（8.6→5.6）、U↓***（8.5→6.7）、So↑、S↓、B↑ PO43- 36 *** So↓***（7.6→3.3）、Sa↓***（8.6→7.6）、U↓、S↓、B↓ Cl- 29 *** Sa↓**（8.6→6.4）、U↓**（8.5→7.1）、B↓ 注:So，酸味；S，甜味；B，苦味；Sa，咸味；U，鲜味；“−”无显著性差异；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；“↓”，滋味属性强度下降；“↑”滋味属性强度上升。 2.4.2.2 组内减除实验
在组间减除实验的基础上进一步通过组内减除实验确定郫县豆瓣中的关键滋味组分，阐明关键滋味物质与感官属性之间的映射关系。
组1中，总游离氨基酸的减除对滋味属性的影响主要体现在鲜味和咸味的降低。由表4可知，Ala、Asp、Glu、Lys、Arg的减除使整体的感官滋味属性呈现显著性差异。其中，减除Ala导致鲜味的显著降低（P<0.05），减除Glu和Asp导致鲜味的高度显著性降低（P<0.001），而减除Asp、Glu则表现出鲜味的高度显著性降低（P<0.001）。其他游离氨基酸的缺失对重组物的滋味属性结构没有明显影响。
组2中，有机酸的减除对滋味属性的影响主要体现在酸味、鲜味、咸味的高度显著性降低上（P<0.001），和甜味的较显著性降低（P<0.01）。减除酒石酸后，滋味重组物的酸味呈现出了高度显著降低（P<0.001），鲜味呈现显著降低（P<0.05）；减除乳酸后，重组物的酸味呈现出了高度显著降低（P<0.001）；移除琥珀酸后咸味和鲜味表现出高度显著性降低（P<0.001）。有机酸的减除实验中鉴定出了酒石酸、乳酸和琥珀酸为关键滋味组分，这与有机酸的滋味阈值强度表现出了一致性，即TAV>1的该三种有机酸在郫县豆瓣的滋味属性中表现出显著贡献。即减除实验进一步在TAV的判定基础上确定了有机酸中的关键滋味物质。
组3中，无机离子的减除对滋味属性的影响主要体现在酸味、鲜味和咸味的极显著性降低（P<0.001）。其中K+、Mg2+、Cl-的缺失主要导致了咸味和鲜味的极显著性降低（P<0.01），Na+的缺失导致咸味和鲜味高度显著性降低（P<0.001）；PO43-的缺失导致了酸味和咸味的高度显著性的降低（P<0.001），即PO43-表现出显著的酸味，这可能是滋味轮廓结果中CTR和STR与NE在酸味属性上存在显著差异的原因。无机离子的减除实验中鉴定出了K+、Mg2+、Na+、PO43-、Cl-为关键滋味组分，这同时与无机离子的滋味阈值强度表现出了一致性。
综合组间和组内减除实验可知，确定了Ala、Asp、Glu、Lys、Arg、酒石酸、乳酸、琥珀酸、K+、Mg2+、Na+、PO43-和Cl-13种滋味物质为郫县豆瓣的关键滋味组分。
2.4.3 添加实验分析
为了避免关键滋味物质在减除试验中遗漏，进一步采用添加实验以确定几种物质的关联是否对一种或多种滋味特性产生影响。以减除实验鉴定出的13种郫县豆瓣关键滋味组分制备模型溶液，逐一添加筛选出的非关键滋味组分的单一物质。如表5所示，均未观察到显著的滋味差异（P<0.05），进一步印证了减除实验结果的有效性和可靠性。
表 5 添加实验的结果Table 5. Results of addition tests添加的组分 正确鉴别的个数（n=36） 显著性水平 组1：游离氨基酸 苏氨酸（Thr） 15 − 丝氨酸（Ser） 14 − 甘氨酸（Gly） 11 − 脯氨酸（Pro） 9 − 组氨酸（His） 12 − 缬氨酸（Val） 11 − 甲硫氨酸（Met） 10 − 异亮氨酸（Ile） 14 − 亮氨酸（Leu） 8 − 酪氨酸（Tyr） 13 − 苯丙氨酸（Phe） 12 − 半胱氨酸（Cys） 6 − 组2：有机酸 草酸 10 − 苹果酸 8 − 柠檬酸 14 − 组3：无机离子 Ca2+ 14 − 注：“−”表示无显著差异。 根据减除实验和添加实验的结果，最终确定Ala、Asp、Glu、Lys、Arg、酒石酸、乳酸、琥珀酸、K+、Mg2+、Na+、PO43-和Cl-共13种物质配制的简化滋味液可模拟郫县豆瓣的滋味。
2.4.4 KTR滋味分析
由图1可知，CTR和KTR在郫县豆瓣的典型滋味属性上表现出了较好的一致性。CTR的典型滋味属性是显著的咸味和鲜味，重组液KTR整体滋味与CTR几乎没有差异（正确响应值=12/36），即关键滋味重组液能够较好的复刻完全滋味重组液的滋味信息。同时，根据TAV计算组成的简单滋味重组液STR也与CTR表现出了较好的滋味一致性，可能因为滋味化合物通常有感官受体直接感受，不经历基质释放过程，受到基质作用的影响较小[30]。
3. 结论
通过对郫县豆瓣的关键滋味组分探究，明确了咸味和鲜味是郫县豆瓣滋味提取液的典型滋味属性；并确定Ala、Asp、Glu、Lys、Arg、酒石酸、乳酸、琥珀酸、K+、Mg2+、Na+、PO43-和Cl-是郫县豆瓣的关键滋味物质。目前对关键滋味组分的构成研究大多局限于水产品，其特征性关键滋味物质类型和含量是造成水产品的风味差异的主要原因[30,52]。在对调味品滋味物质研究中，郫县豆瓣与其他发酵调味品如腐乳、鱼露和酱油等[59−61]中的滋味成分具有很高的相似性，这些成分构成了发酵调味品的基本味觉特征，而典型滋味组分类型的差异和共有组分定量差异导致了每种发酵调味品的特征滋味。
后续可以加强在郫县豆瓣特征滋味物质形成机制方面的研究，并进一步探究其变化规律及形成机制，从滋味方面对产品进行质量控制。另外，可以通过分子感官科学技术对区域性郫县豆瓣进行研究，建立产品风味物质和指纹图谱数据库，形成数字化评价标准，进行质量评价，以扩大分子感官科学技术的应用范围，为保障食品质量发挥更大的作用。
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图 1 NE、CTR、STR、KTR的滋味属性强度值
Figure 1. Intensity of taste attribute of NE, CTR, STR and KTR
表 1 郫县豆瓣中游离氨基酸的含量、滋味阈值和TAV
Table 1 Free amino acid content, taste threshold and TAV in Pixian Borad Bean Paste
呈味特性 物质 含量（mg/g） 呈味阈值[36,42] （mg/g） TAV 甜鲜味 苏氨酸（Thr） 1.46±0.00i 2.60 0.56 丝氨酸（Ser） 1.75±0.00h 1.50 1.17 甘氨酸（Gly） 0.88±0.00l 1.30 0.68 丙氨酸（Ala） 2.07±0.01f 0.60 3.45 甜鲜味氨基酸总量 6.15±0.14c 鲜酸味 脯氨酸（Pro） 2.75±0.00c 3.00 0.92 天冬氨酸（Asp） 3.14±0.06b 1.00 3.14 天冬酰胺（Asn） 1.72±0.03h ND nd 谷氨酸（Glu） 3.43±0.00a 1.00 3.43 鲜酸味氨基酸总量 11.04±0.09a 苦甜味 赖氨酸（Lys） 1.89±0.01g 0.50 3.78 组氨酸（His） 0.47±0.01m 0.20 2.35 精氨酸（Arg） 2.13±0.04e 0.50 4.25 苦甜味氨基酸总量 4.49±0.02d 苦味 缬氨酸（Val） 1.92±0.02g 0.40 4.80 甲硫氨酸（Met） 0.16±0.00n 0.30 0.55 异亮氨酸（Ile） 1.57±0.01i 0.90 1.75 亮氨酸（Leu） 2.51±0.01d 1.90 1.32 酪氨酸（Tyr） 1.06±0.01k 0.9 1.17 苯丙氨酸（Phe） 1.48±0.01i 0.90 1.64 苦味氨基酸总量 8.70±0.06b 咸味 半胱氨酸（Cys） 0.03±0.00o 0.3 0.11 游离氨基酸总量 31.36±0.03 注：同列小写字母不同表示差异显著（P<0.05），表2~表3同；ND表示未查询出；nd表示未检测出。 
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表 2 郫县豆瓣中有机酸的含量、滋味阈值和TAV
Table 2 Organic acid content, taste threshold and TAV in Pixian Borad Bean Paste
呈味特性 物质 含量（mg/g） 呈味阈值[50]（mg/g） TAV 酸味 草酸 0.050±0.000e 0.504 0.10 酸味 酒石酸 1.322±0.009b 0.015 88.15 酸味/苦味 苹果酸 0.275±0.031d 0.496 0.55 酸味 乳酸 6.776±0.016a 1.260 5.38 酸味 柠檬酸 0.035±0.019e 0.450 0.08 酸味/鲜味 琥珀酸 0.801±0.192c 0.106 7.55 酸味 富马酸 0.0009±0.0004e 0.300 <0.01
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表 3 郫县豆瓣中无机盐离子的含量、滋味阈值和TAV
Table 3 Inorganic salt ion content, taste threshold and TAV in Pixian Borad Bean Paste
呈味特性 物质 含量（mg/g） 呈味阈值[55]（mg/g） TAV 苦味 Ca2+ 0.482±0.045d 1.50 0.32 咸味 K+ 7.063±0.051c 1.30 5.43 苦味 Mg2+ 1.591±0.071d 0.96 1.66 咸味 Na+ 62.504±0.508a 1.50 41.67 咸味 PO43- 1.709±0.155d 1.4246 1.20 无味 Cl- 10.934±1.406b 2.66 4.11
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表 4 组间和组内成分的减除对郫县豆瓣滋味属性的影响
Table 4 Effect of absence of group or individual compounds on the taste attributes of the complete taste recombinant of Pixian Borad Bean Paste
减除的组分 正确鉴别的
个数（n=36）显著性 滋味差异的水平
（滋味强度的改变）组1：游离氨基酸 34 *** Sa↓***（8.6→6.0）、U↓***（8.5→6.0）、So↓、S↓、B↓ 苏氨酸（Thr） 12 − 丝氨酸（Ser） 10 − 甘氨酸（Gly） 15 − 丙氨酸（Ala） 18 * U↓*（8.5→8.0）、Sa↓、So↓ 脯氨酸（Pro） 11 − 天冬氨酸（Asp） 25 *** U↓***（8.5→7.6）、Sa↓、So↓ 谷氨酸（Glu） 29 *** U↓***（8.5→7.8）、Sa↓、So↓ 赖氨酸（Lys） 26 *** Sa↓、B↓ 组氨酸（His） 12 − 精氨酸（Arg） 25 *** Sa↓、B↓、U↓ 缬氨酸（Val） 11 − 甲硫氨酸（Met） 14 − 异亮氨酸（Ile） 13 − 亮氨酸（Leu） 12 − 酪氨酸（Tyr） 12 − 苯丙氨酸（Phe） 7 − 半胱氨酸（Cys） 6 − 组2：有机酸 36 *** Sa↓***（8.6→5.4）、U↓***（8.5→5.3）、So↓***（7.6→6.8）、S↓**（4.4→3.4）、B↓ 草酸 16 − 酒石酸 26 *** So↓***（7.6→6.4）、U↓*（8.5→8.0）、S↓、B↓ 苹果酸 13 − 乳酸 25 *** So↓***（7.6→6.6）、U↓、S↓ 柠檬酸 14 − 琥珀酸 28 *** Sa↓***（8.6→7.6）、U↓***（8.5→7.4）、So↓、B↓ 组3：无机离子 36 *** Sa↓***（8.6→3.3）、U↓***（8.5→3.3）、So↑***（7.6→8.6）、S↓、B↓ Ca2+ 15 − K+ 20 ** Sa↓**（8.6→7.5）、U↓**（8.5→7.5）、S↓、B↑ Mg2+ 19 ** Sa↓**（8.6→7.0）、U↓**（8.5→7.2）、S↓、B↑ Na+ 34 *** Sa↓***（8.6→5.6）、U↓***（8.5→6.7）、So↑、S↓、B↑ PO43- 36 *** So↓***（7.6→3.3）、Sa↓***（8.6→7.6）、U↓、S↓、B↓ Cl- 29 *** Sa↓**（8.6→6.4）、U↓**（8.5→7.1）、B↓ 注:So，酸味；S，甜味；B，苦味；Sa，咸味；U，鲜味；“−”无显著性差异；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；“↓”，滋味属性强度下降；“↑”滋味属性强度上升。
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表 5 添加实验的结果
Table 5 Results of addition tests
添加的组分 正确鉴别的个数（n=36） 显著性水平 组1：游离氨基酸 苏氨酸（Thr） 15 − 丝氨酸（Ser） 14 − 甘氨酸（Gly） 11 − 脯氨酸（Pro） 9 − 组氨酸（His） 12 − 缬氨酸（Val） 11 − 甲硫氨酸（Met） 10 − 异亮氨酸（Ile） 14 − 亮氨酸（Leu） 8 − 酪氨酸（Tyr） 13 − 苯丙氨酸（Phe） 12 − 半胱氨酸（Cys） 6 − 组2：有机酸 草酸 10 − 苹果酸 8 − 柠檬酸 14 − 组3：无机离子 Ca2+ 14 − 注：“−”表示无显著差异。
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