Adjuvant Prevention of Type 2 Diabetes of Citrus Peel Based on Bionetwork Analysis
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摘要: 目的：初步阐明柑橘属植物果皮辅助预防2型糖尿病的主成分与机制。方法：体外测定柑橘属植物果皮对α-糖苷酶的抑制活性，后通过网络药理学预测其可能的活性成分及其可能的作用机制，再用分子对接验证。结果：13批柑橘属植物果皮均对α-糖苷酶有一定的抑制作用，且在线性范围内呈现量效关系。网络药理学和分子对接技术预测，得到活性成分柚皮素、桔皮素、月桂酸可能通过氧化应激等途径来抑制高血糖，与炎症中的PI3K-Akt、Ras、HIF-1信号通路有关，和血管相关的VEGF信号通路等有关。桔皮素为主成分。结论：柑橘属植物果皮对α-糖苷酶有抑制作用，可能对2型糖尿病有一定的辅助预防的作用。Abstract: Objective: To elucidate the main components and mechanism of adjuvant prevention of type 2 diabetes of Citrus peel. Methods: The inhibitory activity of Citrus peel of α-glycosidase was determined in vitro. It were used to predict the material basis and potential mechanism of Citrus peel in the treatment of type 2 diabetes by network pharmacology, and verified the results by molecular docking. Results: The α-glucosidase was inhibited by 13 kinds of Citrus peel and showed a dose-effect relationship in the linear range. It was predicted that the active ingredients naringin, tangeretin and lauric acid might inhibit hyperglycemia through oxidative stress by network pharmacology and molecular docking. Citrus peel treatment of type Ⅱ diabetes was related to PI3K-Akt, Ras, HIF-1 signaling pathway in inflammation and vascular related VEGF signaling pathway. Tangeretin was the main component. Conclusion: Citrus peel had an inhibitory effect on α-glycosidase , which might play a role in the prevention of type 2 diabetes.
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Keywords:
- Citrus peel /
- enzyme inhibition /
- network pharmacology /
- hypoglycemic effect
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芸香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培变种的成熟果皮为陈皮[1]，最常见的变种为广陈皮即茶枝柑（Citrus reticulata 'Chachi'）[2−3]。酸橙（Citrus reticulata Blanco）及其栽培变种的未成熟果实为枳壳[2−3]。以上品种与甜橙（Citrus sinensis Osbeck）的幼果为枳实[2−3]。近年来出现橘、橙、柑的园艺栽培变种及杂交种[2−3]，例如沃柑、砂糖橘等，其外果皮被广大消费者自行使用，用以理气健脾，燥湿化痰[1−3]，其活性成分中黄酮类、柠檬苦素类和挥发油类与代谢性疾病治疗密切相关[4−8]。有学者通过体内外实验证实橘皮有降糖的作用[9−10]。
糖尿病（diabetes mellitus，DM）为常见慢性病。我国是世界上糖尿病患病率上升最快的国家，约有1.1亿患者[11]，其中2型糖尿病（T2DM）占90%以上。目前治疗T2DM除注射胰岛素外，可口服降糖药包括双胍类、α-糖苷酶抑制剂等[12]，而以上降糖药物存在不良反应，故寻找高效、低毒性的纯天然降糖活性物质来辅助降糖是重要的研究方向。抑制α-葡萄糖苷酶可影响人体对碳水化合物的消化吸收，从而抑制血糖升高[4]，故评价体外对α-葡萄糖苷酶抑制作用可快捷方便筛选降糖活性物质。
生物网络分析采用网络药理学，利用计算机技术和大数据从系统层次和生物网络的角度，对“成分-靶点-疾病”进行多层次交互，解析植物提取物中多成分之间的关联规律，阐释其药效物质基础及机制[13−14]。再用分子对接模拟成分和作用靶点间相互作用、结合模式和亲和力[15−16]。生物网络分析已广泛应用于活性成分发现与评价领域，但尚未见该方法对柑橘属植物果皮降糖作用的研究。
本研究先用体外α-葡萄糖苷酶抑制作用评价13批柑橘属植物果皮的降糖效果，然后用生物网络分析中常用的网络药理学与分子对接技术预测其可能辅助预防T2DM的成分与作用机制，以期阐明常见的芸香科柑橘属植物果皮可否作为保健品新资源应用于2型糖尿病的预防中。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
酵母源α-葡萄糖苷酶（26 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；PNPG（P-Nitrophenyl-d-D-glucopyranoside，4-硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷） 上海麦克林科技有限公司；阿卡波糖（BR，纯度≥95%） 都莱生物技术有限公司；无水乙醇（AR，纯度≥99.7%） 天津市欧博凯化工有限公司；Na2CO3 分析纯，天津大茂化学试剂厂；纯净水 实验室自制；柑橘属植物果皮样品 自制，详见表1，晒干的样品均为室温16~22 ℃通风自然干燥。
表 1 样品信息及来源Table 1. Sample information and source编号 年份 名称 拉丁文 来源 备注 S1 2017 酸橙皮 Citrus aurantium L. 药材市场 商品名：生枳壳 S2 2020 酸橙皮 Citrus aurantium L. 药材市场 商品名：生枳壳 S3 2020 酸橙皮 Citrus aurantium L. 药材市场 商品名：炒枳壳 S4 2019 柚皮 Citrus maxima （Burm.） Merr. 农贸市场 室温通风自然干燥 S5 2021 柚皮 Citrus maxima （Burm.） Merr. 农贸市场 室温通风自然干燥 S6 2021 甜橙皮 Citrus sinensis （L.） Osbeck 农贸市场 室温通风自然干燥 S7 2018 皇帝柑皮 Tribute×Citru 农贸市场 室温通风自然干燥 S8 2019 沙糖桔皮 Citrus reticulata cv. Citrus tachibana Blanco 农贸市场 室温通风自然干燥 S9 2021 沙糖桔皮 Citrus reticulata cv. Citrus tachibana Blanco 农贸市场 室温通风自然干燥 S10 2022 沙糖桔皮 Citrus reticulata cv. Citrus tachibana Blanco 农贸市场 室温通风自然干燥 S11 2021 桔皮 Citrus reticulata Blanco 农贸市场 室温通风自然干燥 S12 2020 沃柑皮 Citrus reticulate cv. 'Chachiensis' 农贸市场 室温通风自然干燥 S13 2021 沃柑皮 Citrus reticulate cv. 'Chachiensis' 农贸市场 室温通风自然干燥 Readman1900/1900plus型光吸收型全波长酶标仪 上海闪谱生物科技有限公司；KQ5200E型超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；N-1300D型旋转蒸发仪、CCA-1112A型冷却水循环装置、NVP-1000型隔膜真空泵 东京理化器械株式会社；SQP型电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 柑橘属植物果皮提取物浸膏的制备及体外α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
13批柑橘属植物果皮50 ℃干燥60 min后粉碎过24目筛，精密称取样品5.0 g置于250 mL具塞锥形瓶中，加50 mL无水乙醇200 Hz超声提取30 min，过滤，提取2次，合并滤液，减压浓缩，蒸干得样品提取物浸膏。
方法参考文献[17−18]。分别称取以上各样品60 mg浸膏，于5 mL容量瓶加PBS溶解并定容，得12 mg/mL的样品溶液，稀释得4、6、8、10、12 mg/mL的待测样品溶液。精密称取1.8 mg（26 U/mg）α-葡萄糖苷酶冻干粉于5 mL容量瓶用PBS溶解并定容，制得9.36 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。称取PNPG 14.5 mg于10 mL容量瓶，用PBS溶解并定容，制得4.8 mmol/L的PNPG溶液。称取5.2295 g Na2CO3，于50 mL容量瓶溶解并定容即得1.0 mol/L Na2CO3溶液。称取60 mg阿卡波糖，于5 mL容量瓶溶解并定容，得12 mg/mL的阿卡波糖溶液，稀释为4、6、8、10 mg/mL阿卡波糖溶液。
在96孔板中，各试剂加样体积见表2，依次加入PBS缓冲液，α-葡萄糖苷酶溶液和样品溶液，37 ℃恒温孵育15 min，加入PNPG溶液，37 ℃恒温30 min，加入Na2CO3溶液中止反应，在405 nm波长下，用酶标仪测定不同浓度的样品在反应后吸光度。根据公式（1）计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率，其他按表2加入，A5组为阳性对照，用样品溶液同浓度的阿卡波糖代替样品，平行操作三次。
表 2 α-葡萄糖苷酶抑制实验加样表Table 2. Addition table for α-glucosidase inhibition test组别 PBS（µL） 酶（µL） 样品（µL） PNPG（µL） Na2CO3（µL） A1 120 15 15 30 60 A2 135 / 15 30 60 A3 135 15 / 30 60 A4 150 / / 30 60 A5 120 15 阿卡波糖 30 60 抑制率(%)=(A3−A4)−(A1−A2)(A3−A4)×100 (1) 式中：A1、A2、A3、A4分别为样品组、样品空白组、阴性对照组和空白组阳性的吸光度。
1.2.2 柑橘属植物果皮降糖活性成分的预测
从TCMSP数据库和查阅中英文文献（截止2022年4月）获得柑橘属植物果皮的主成分，使用ChemDraw绘制2D结构，将获取的成分名称导入Pubchem网站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），将Pubchem网站显示的2D结构和绘制的2D结构图进行比对，确认化合物，从Pubchem下载其2D Save文件，导入到SwissADME网站（http://www.swissadme.ch/），计算化合物的分子特性。根据胃肠道吸收和药物相似性规则的标准筛选标准来选择化合物，即GI=high且drug-likeness项下有大于等于两个yes[19−20]，将符合要求的活性成分编号列表。
生物活性化合物目标预测：将以上筛选的化合物导入Swiss TargetPredicition网站（http://www.swisstargetpreduction.ch）预测药物作用靶点，下载靶点信息，以probability>0为标准，将化合物与靶点信息对应，整理靶点信息[21]。
靶点交叉获取共有靶点：MalaCards数据库（https://www.malacards.org/）和GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）搜索“diabetes mellitus type 2”获得两个数据库中关于T2DM的相关靶基因的信息。将柑橘属植物果皮活性成分作用靶点与Ⅱ型糖尿病靶点导入Venny2.1.0（https:bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）网站，得到活性成分与疾病的共同靶标。整理活性成分共同靶点，使用Cytoscape 3.9.0软件（http://cytoscape.org/）绘制“橘皮活性成分-靶点-T2DM”网络图，使其可视化，并使用其内置的软件工具Network Analyzer计算以及靶点的网络拓扑参数筛选出主要有效成分[22−23]。
1.2.3 柑橘属植物果皮可能降糖机制的预测
T2DM靶点的PPI网络构建：将交集靶点上传到STRING网站（https://stringdb.org），限定物种为“Homo sapiens”，选择置信度（medium cofidence）>0.4，隐藏网络中游离的靶点（hide disconnected nodes in the network），将结果以TSV形式导出，并使用Cytoscape 3.9.0软件将导入的TSV文件转成可视化PPI网络，并用小插件“CentiScape 2.2 Menu”，选中其中的度值（Degree），介度（Betweenness）和紧密度（Closeness）为指标，分析其结果得到陈皮干预T2DM的核心靶点[19−20]。
GO和KEGG富集分析：将核心靶点导入Metascape（https://metascape.org/）网站进行GO分析和KEGG通路分析，以P<0.05条件进行筛选，将GO富集图和KEGG富集图通过微生信（www.bioinformatics.com.cn）可视化[19−20]。
1.2.4 分子对接验证
将1.2.3项下预测的关键靶点在PDB数据库找到相应的蛋白，保存为PDB格式。在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）寻找Degree值前四的活性成分即1.2.2项下预测到的活性成分2D结构，并以mol2格式保存，用PyMOL软件转化为PDB格式。利用MOE软件对蛋白进行去水、加氢、计算电荷、能量最小化等优化，后与活性小分子成分的PDB格式进行对接，结合能<−5.0 kJ/mol结合力良好，数值越小结合能力越强[19−20]。
1.3 数据处理
体外酶活性测定数据用¯X±S表示，用OriginPro 2021处理。网络药理学及分子对接部分运用TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、Metascape（https://metascape.org/）、SwissADME数据库（http://www.swissadme.ch/）、SwissTargetPrediction网站（http://www.swisstargetprediction.ch/）、Pubchem网站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、MalaCards（https://www.malacards.org/）、MOE软件、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、STRING网站（https://stringdb.org）、Venny 2.1.0（https:bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）、ChemDraw（19.0版本）、PDB数据库、微生信（www.bioinformatics.com.cn）、CentiScape 2.2 Menu、PyMOL软件（2.3.5版本）、Cytoscape 3.9.0软件（http://cytoscape.org/）、Network Analyzer软件处理[19−20]。
2. 结果与分析
2.1 柑橘属植物果皮体外α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
由表3可知13批柑橘属植物包括杂交种的果皮体外对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用。S1~S13的半数抑制浓度IC50值分别为8.4、9.1、8.3、15.6、7.8、8.7、9.0、2.6、2.7、3.0、10.0、7.4、5.5 mg/mL，IC50值越小说明抑制活性越好，其中S8、S9、S10即园艺栽培品种砂糖橘果皮各浓度抑制α-葡萄糖苷酶活性最好。故砂糖橘、沃柑、皇帝柑等常见的园艺栽培种、杂交种与该属药用品种陈皮、枳实、枳壳等同样有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，并呈浓度依赖关系，其中沙糖桔皮、沃柑等近年来涌现的园艺栽培品种果皮对酶抑制效果较好。
表 3 不同浓度样品对α-葡萄糖苷酶抑制率（%）Table 3. Inhibition rate of α-glucosidase by samples with different concentrations (%)组别 浓度 4.0 mg/mL 6.0 mg/mL 8.0 mg/mL 10.0 mg/mL 12.0 mg/mL S1 26.71±1.31 38.74±0.98 47.07±0.41 58.90±1.55 67.68±1.24 S2 28.54±1.27 38.07±1.12 46.24±0.73 54.74±1.73 60.50±1.36 S3 29.36±0.65 40.93±1.67 49.13±0.68 58.04±0.95 64.86±1.61 S4 5.37±0.33 13.45±0.26 20.92±0.15 28.60±0.72 36.24±0.85 S5 27.04±0.79 39.43±0.31 52.05±0.89 63.56±1.68 74.80±1.33 S6 26.74±0.53 33.02±0.46 45.45±0.05 57.29±1.23 69.20±1.29 S7 27.62±0.27 35.03±0.77 43.66±0.66 54.27±1.31 65.46±1.39 S8 54.73±1.16 62.36±1.41 69.14±1.48 76.79±1.26 83.06±1.09 S9 55.13±1.54 61.68±1.28 69.91±1.59 77.16±1.84 84.74±1.33 S10 52.92±1.27 60.49±1.33 67.97±1.27 74.98±1.91 81.19±0.31 S11 23.82±0.28 33.51±0.58 42.45±0.97 50.32±1.93 57.33±0.09 S12 32.23±0.37 43.40±0.76 54.81±1.11 63.91±0.81 71.29±0.06 S13 43.20±0.84 52.62±0.94 60.82±1.37 67.60±0.69 74.11±0.31 2.2 柑橘属植物果皮降糖活性成分的预测
2.2.1 活性成分
从TCMSP数据库和查阅文献共获得柑橘属植物果皮中黄酮类、萜类、柠檬苦素类、挥发油类和生物碱类等65种主要化合物成分，经SwissADME网站筛选出40种生物活性化合物。均符合药物相似性和口服胃肠道吸收[21]，结果见表4。
表 4 柑橘属植物果皮活性化合物信息Table 4. Information on active compounds of Citrus peel序号 MOL编号 名称 结构式 分子式 1 000118 （L）-α-松油醇 
C10H18O 2 000121 癸醛 
C10H20O 3 000127 柠檬醛
（3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛）
C10H16O 4 000198 芳樟醇
（沉香醇；里那醇；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇）
C10H18O 5 002050 异兰香酸（3-羟基-4-甲氧基苯甲酸） 
C8H8O4 6 002092 Antioxidant No.33 
C14H22O 7 002095 邻苯二甲酸二乙酯 
C12H14O4 8 002138 2-（4-甲基苯基）丙-2-醇
（对甲基苯异丙醇）
C10H14O 9 002456 [（3R）-3,7-Dimethyloct-6-enyl] butanoate 
C14H26O2 10 000259 香芹酚
（5-异丙基-2-甲基苯酚）
C10H14O 11 002944 （E）-Linalolpyranoxide 
C10H18O2 12 000305 月桂酸
（十二酸；正十二酸；十二烷酸）
C12H24O2 13 003450 2-十二烯醛醇 
C12H22O 14 003508 1-癸醇
（癸烷-1-醇；正癸醇；癸醇；壬基甲醇）
C10H22O 15 003949 2-（甲氨基）苯甲酸甲酯
（N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯；邻甲氨基苯甲酸甲酯）
C9H11NO2 16 004328 柚皮素
（4',5,7-三羟基黄酮）
C15H12O5 17 005100 橙皮苷 
C16H14O6 18 005577 十一醛 
C11H22O 19 000057 邻苯二甲酸二异丁酯 
C16H22O4 20 005811 Hepta-3 
C22H24O9 21 005814 桔皮素
（5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮）
C20H20O7 22 005815 柠檬酸 
C21H24O8 23 005817 2-（2-丁炔基）-环己酮 
C10H14O 24 005820 22410-74-8 
C10H18O 25 005821 （2S）-2-Ethoxypentane 
C7H16O 26 005822 香叶醇（（E）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇） 
C10H18O 27 005823 3-甲基-3-丁烯-1-醇 
C5H10O 28 005824 4-乙酰基苯甲酸（对乙酰基苯甲酸） 
C9H8O3 29 005825 6-庚烯-1-醇 
C7H14O 30 005828 川陈皮素 
C21H22O8 31 005829 醋酸十一酯（乙酸十一酯） 
C13H26O2 32 000597 乙酸橙花酯（橙花乙酸酯；（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯） 
C12H20O2 33 000608 （s）-Terpinen-4-ol 
C10H18O 34 000635 香兰素
（香草醛；3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）
C8H8O3 35 000696 β-松油醇 
C9H16O 36 000710 正辛醛（辛醛；羊脂醛） 
C8H16O 37 000748 5-羟甲基糠醛 
C6H6O3 38 000771 4-羟基肉桂酸
（对羟基肉桂酸；对羟基苯基丙烯酸；对香豆酸）
C9H8O3 39 000922 （R）-p-Menth-1-en-4-ol 
C10H18O 40 001803 Sinensetin 
C22H24O7 2.2.2 柑橘属植物果皮干预T2DM重要的目标化合物预测
从Swiss Target Prediction网站中获得柑橘属植物果皮生物活性化合物的潜在目标。删除重复后确定了480个橘皮活性成分靶点。从MalaCards数据库和GeneCards数据库通过搜索术语“diabetes mellitus type 2”共获得577个关于T2DM的相关靶基因的信息。分别将收集的480个活性成分靶点和收集的577个T2DM疾病靶点上传到Venny 2.1[19−22]，获取交集靶点共98个见表5，可视化结果见图1。将活性成分与交集靶蛋白导入到Cytoscape 3.9.0软件构建“柑橘属植物果皮成分-靶点-T2DM网络图”，见图2。拓扑参数由高到低分别为α-松油醇、柚皮素、桔皮素、月桂酸，以上可能是橘皮辅助干预T2DM重要的核心成分[19−22]。
表 5 柑橘属植物果皮活性成分和T2DM的共同靶点Table 5. Common targets of Citrus peel active components and T2DM编号 靶点 编号 靶点 编号 靶点 1 AR 34 CXCL8 67 IGF1R 2 AKR1B1 35 RBP4 68 FABP2 3 TLR4 36 ALB 69 NOS3 4 EP300 37 SMARCA4 70 KDR 5 ALDH2 38 HMGCR 71 TTR 6 FASN 39 ADRA2A 72 PTGS2 7 HNF4A 40 SERPINE1 73 PARP1 8 CDK4 41 GSR 74 SHBG 9 BCL2 42 F2 75 MMP2 10 MMP3 43 SCN9A 76 MMP9 11 VEGFA 44 OPRM1 77 HMOX1 12 MMP8 45 MPO 78 SIRT2 13 ALOX5 46 NR3C1 79 SCD 14 MTNR1B 47 FABP1 80 HSD11B1 15 MMP1 48 PPARD 81 FABP5 16 FABP3 49 NPC1L1 82 BCHE 17 FABP4 50 SREBF2 83 PTPN1 18 ACP1 51 CYP19A1 84 AKT1 19 PTPN2 52 NR1H3 85 PDE5A 20 ACHE 53 SLC5A2 86 MAPK10 21 CYP1A2 54 CYP1A1 87 GCGR 22 GPBAR1 55 IKBKB 88 CNR1 23 NR1H4 56 PIK3R1 89 MIF 24 VDR 57 PRKAB1 90 ARG1 25 AOC3 58 LIPE 91 PRKCD 26 NOS1 59 MC4R 92 ELANE 27 RET 60 PLA2G2A 93 F3 28 MEN1 61 INSR 94 GSK3B 29 ERBB2 62 IGFBP3 95 TERT 30 FGFR1 63 CYP2C9 96 NOS2 31 PPARA 64 CYP3A4 97 AVPR2 32 PPARG 65 DRD2 98 CYP2C19 33 ESR1 66 CYP17A1 ![]()
图 1 柑橘属植物果皮活性成分和T2DM的共同靶点韦恩图Figure 1. Venn diagram of the common target of Citrus peel active components and T2DM![]()
图 2 柑橘属植物果皮活性成分-靶点-T2DM网络图注：绿色为橘皮活性成分，蓝色为靶点。Figure 2. Network diagram Citrus peel active components-target-T2DM2.2.3 柑橘属植物果皮降糖作用靶点的预测
柑橘属植物果皮与T2DM共有靶点的PPI网络，见图3。将TSV格式导出结果可视化，见图4。以度值（Degree unDir）介度（Betweenness unDir）和精密度（Closeness unDir）这三个标准[19−22]来筛选橘皮干预T2DM的核心靶点，筛选出17个核心靶点，见表6。其中AKT1、ALB、PPARG、VEGFA靠前。
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图 3 柑橘属植物果皮治疗T2DM共有靶点的PPI网络Figure 3. PPI network of common targets of Citrus peel in the treatment of T2DM![]()
图 4 柑橘属植物果皮治疗T2DM共有靶点的PPI网络可视化Figure 4. PPI network visualization of common targets of Citrus peel in the treatment of T2DM表 6 T2DM的PPI网络核心靶点拓扑学分析结果Table 6. Topological analysis results of PPI network core targets of T2DM编号 靶点 度值 介度 精密度 编号 靶点 度值 介度 精密度 1 ALB 67 1335.1156 0.0078125 10 CXCL8 34 199.1637067 0.006134969 2 AKT1 67 1262.660625 0.0078125 11 F2 22 127.6764313 0.005586592 3 PTGS2 43 296.8887643 0.006578947 12 HNF4A 27 128.4767872 0.005813953 4 INSR 20 117.5407933 0.005555556 13 NOS2 18 127.9912985 0.005555556 5 PPARG 54 939.0000537 0.007092199 14 CYP3A4 25 291.3906018 0.005847953 6 VEGFA 50 372.4423703 0.006896552 15 TLR4 32 177.3151086 0.006097561 7 PPARA 45 566.219661 0.006622517 16 ESR1 42 357.6428551 0.006451613 8 NR3C1 24 292.4289529 0.005780347 17 CYP1A1 21 117.8376291 0.005649718 9 EP300 31 152.7547866 0.00591716 GO和KEGG富集分析：将以上筛选出来的核心靶点导入metascape网站进行GO分析，包括三部分：生物过程（Biological process，BP）、细胞组分（Cellular components，CC）和分子功能（Molecular function，MF）[19−20]。以P Value Cutoff<0.05筛选[20−22]，共富集到284个BP，6个CC，38个MF。根据P值筛选出来的前10条BP、6条CC和前10条MF，用微生信进行可视化处理，结果见图5。
由图5可知，柑橘属植物果皮辅助参与预防T2DM靶点的生物过程可能与氧化应激（response to decreased oxygen levels）、脂质代谢调控（positive regulation of lipid metabolic process）有关。可能与细胞膜（side of membrane）与内质网（endoplasmic reticulum lumen）功能有关。可能与脂质结合受体（lipid blinding）、转录因子（transcription factor blinding）、类固醇受体（nuclear steroid receptor activity）、RNA、DNA、结合转录辅酶（ligand-activated transcription factor activity）等分子功能有关[19−22]。
KEGG通路富集分析经过P<0.05的筛选结果显示，柑橘属植物果皮辅助参与T2DM过程共有51条通路，P值筛选出靠前10条通路，见图6。
图6可知，柑橘属植物果皮辅助参与预防T2DM的通路分别为癌症中的通路（pathways in cancer）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathways）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma- associated herpesvirus infection）、癌症中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathways）、人乳头瘤病毒感染（human papillomavirus infection）、人巨细胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、VEGF信号通路（VEGF signaling pathways）、肾细胞癌（renal cell carcinoma）、AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）在糖尿病并发症中的作用[19−22]。
2.3 分子对接验证
将2.2.2项下根据Degree值分别筛选出来主要活性成分α-松油醇、柚皮素、桔皮素、月桂酸与2.2.3项下得到的T2DM相关核心靶蛋白AKT、VEGFA、PPARG和ALB做分子对接，打分结果见表7。结合能<-5.0 kJ/mol可认为结合能力良好，数值越小结合能力他越强。以此为筛选依据[19−22]，桔皮素与关键靶点生物亲和力最强，活性最好。桔皮素与关键蛋白对接2D与3D模型，见图7~图8。
表 7 有效成分与T2DM靶点对接打分Table 7. Docking score of active ingredient and T2DM target靶点 PDB ID α-松油醇 柚皮素 桔皮素 月桂酸 AKT1 2UZS −4.1511 −5.3559 −5.4150 −5.1724 ALB 6RQ7 / −5.8827 −7.5564 −5.0959 PPARG 2VST / −5.9649 −6.4267 −6.1526 VEGFA 1CZ8 / −4.4706 −6.6152 −6.1376 ![]()
图 7 桔皮素与T2DM分子对接2D模型注：A-AKT；B-VEGFA；C-PPARG；D-ALB；图8同。Figure 7. 2D model of tangeretin-T2DM molecular docking3. 讨论与结论
本研究发现芸香科柑橘属其果皮均可作为食品添加剂应用于糖尿病的辅助预防中，在保健领域有一定的研究价值，有较强的应用前景。如果将芸香科柑橘属植物及砂糖橘、沃柑等园艺栽培种和杂交种的果皮利用起来，可“变废为宝”，实现农副产品的综合利用与开发。通过生物网络分析，本研究初步揭示柚皮素、桔皮素、月桂酸可能为柑橘属植物果皮中辅助预防2型糖尿病的活性成分。再结合分子对接初步揭示柑橘属植物果皮对2型糖尿病辅助预防的可能作用靶点，有一定的创新性。
生物网络分析初步预测柑橘属植物果皮预防2型糖尿病的机制可能通过氧化应激等途径，与炎症中的PI3K-Akt、Ras、HIF-1信号通路及血管相关的VEGF信号通路等有关[24]。具体作用如下：第一，调控PI3K-Akt信号通路，与胰岛素调节有关[24−25]。胰岛素受体底物磷酸化，激活PI3K，刺激磷脂酰肌醇，再进一步激活调节葡萄糖转化和糖原合成的作用的AKT[24−25]。第二，调控RAS/MAPK信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、免疫应答，与炎症及血管新生的关系密切。第三，调控糖尿病视网膜病变相关的血管内皮生长因子VEGF信号通路。桔皮素与以上通路中蛋白激酶B-1（AKT1）、白蛋白（ALB）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）、血管内皮生长因子A（VEGFA）结合作用良好，以上蛋白可能为柑橘属果皮降糖机制的主要作用靶点[26]。桔皮素可进入该活性蛋白中心，与蛋白受体形成氢键。分子对接可视化图可以看出其形成氢键的个数较多且作用力较强。但因时间有限以上猜想尚未通过体内及细胞水平的验证，后续将进一步完善。
综上所述，芸香科柑橘属植物果皮在预防2型糖尿病方面有应用前景，可进一步深入研究。
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图 1 柑橘属植物果皮活性成分和T2DM的共同靶点韦恩图
Figure 1. Venn diagram of the common target of Citrus peel active components and T2DM
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图 2 柑橘属植物果皮活性成分-靶点-T2DM网络图
注：绿色为橘皮活性成分，蓝色为靶点。
Figure 2. Network diagram Citrus peel active components-target-T2DM
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图 3 柑橘属植物果皮治疗T2DM共有靶点的PPI网络
Figure 3. PPI network of common targets of Citrus peel in the treatment of T2DM
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图 4 柑橘属植物果皮治疗T2DM共有靶点的PPI网络可视化
Figure 4. PPI network visualization of common targets of Citrus peel in the treatment of T2DM
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图 7 桔皮素与T2DM分子对接2D模型
注：A-AKT；B-VEGFA；C-PPARG；D-ALB；图8同。
Figure 7. 2D model of tangeretin-T2DM molecular docking
表 1 样品信息及来源
Table 1 Sample information and source
编号 年份 名称 拉丁文 来源 备注 S1 2017 酸橙皮 Citrus aurantium L. 药材市场 商品名：生枳壳 S2 2020 酸橙皮 Citrus aurantium L. 药材市场 商品名：生枳壳 S3 2020 酸橙皮 Citrus aurantium L. 药材市场 商品名：炒枳壳 S4 2019 柚皮 Citrus maxima （Burm.） Merr. 农贸市场 室温通风自然干燥 S5 2021 柚皮 Citrus maxima （Burm.） Merr. 农贸市场 室温通风自然干燥 S6 2021 甜橙皮 Citrus sinensis （L.） Osbeck 农贸市场 室温通风自然干燥 S7 2018 皇帝柑皮 Tribute×Citru 农贸市场 室温通风自然干燥 S8 2019 沙糖桔皮 Citrus reticulata cv. Citrus tachibana Blanco 农贸市场 室温通风自然干燥 S9 2021 沙糖桔皮 Citrus reticulata cv. Citrus tachibana Blanco 农贸市场 室温通风自然干燥 S10 2022 沙糖桔皮 Citrus reticulata cv. Citrus tachibana Blanco 农贸市场 室温通风自然干燥 S11 2021 桔皮 Citrus reticulata Blanco 农贸市场 室温通风自然干燥 S12 2020 沃柑皮 Citrus reticulate cv. 'Chachiensis' 农贸市场 室温通风自然干燥 S13 2021 沃柑皮 Citrus reticulate cv. 'Chachiensis' 农贸市场 室温通风自然干燥 
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表 2 α-葡萄糖苷酶抑制实验加样表
Table 2 Addition table for α-glucosidase inhibition test
组别 PBS（µL） 酶（µL） 样品（µL） PNPG（µL） Na2CO3（µL） A1 120 15 15 30 60 A2 135 / 15 30 60 A3 135 15 / 30 60 A4 150 / / 30 60 A5 120 15 阿卡波糖 30 60
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表 3 不同浓度样品对α-葡萄糖苷酶抑制率（%）
Table 3 Inhibition rate of α-glucosidase by samples with different concentrations (%)
组别 浓度 4.0 mg/mL 6.0 mg/mL 8.0 mg/mL 10.0 mg/mL 12.0 mg/mL S1 26.71±1.31 38.74±0.98 47.07±0.41 58.90±1.55 67.68±1.24 S2 28.54±1.27 38.07±1.12 46.24±0.73 54.74±1.73 60.50±1.36 S3 29.36±0.65 40.93±1.67 49.13±0.68 58.04±0.95 64.86±1.61 S4 5.37±0.33 13.45±0.26 20.92±0.15 28.60±0.72 36.24±0.85 S5 27.04±0.79 39.43±0.31 52.05±0.89 63.56±1.68 74.80±1.33 S6 26.74±0.53 33.02±0.46 45.45±0.05 57.29±1.23 69.20±1.29 S7 27.62±0.27 35.03±0.77 43.66±0.66 54.27±1.31 65.46±1.39 S8 54.73±1.16 62.36±1.41 69.14±1.48 76.79±1.26 83.06±1.09 S9 55.13±1.54 61.68±1.28 69.91±1.59 77.16±1.84 84.74±1.33 S10 52.92±1.27 60.49±1.33 67.97±1.27 74.98±1.91 81.19±0.31 S11 23.82±0.28 33.51±0.58 42.45±0.97 50.32±1.93 57.33±0.09 S12 32.23±0.37 43.40±0.76 54.81±1.11 63.91±0.81 71.29±0.06 S13 43.20±0.84 52.62±0.94 60.82±1.37 67.60±0.69 74.11±0.31
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表 4 柑橘属植物果皮活性化合物信息
Table 4 Information on active compounds of Citrus peel
序号 MOL编号 名称 结构式 分子式 1 000118 （L）-α-松油醇 C10H18O 2 000121 癸醛 C10H20O 3 000127 柠檬醛
（3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛）C10H16O 4 000198 芳樟醇
（沉香醇；里那醇；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇）C10H18O 5 002050 异兰香酸（3-羟基-4-甲氧基苯甲酸） C8H8O4 6 002092 Antioxidant No.33 C14H22O 7 002095 邻苯二甲酸二乙酯 C12H14O4 8 002138 2-（4-甲基苯基）丙-2-醇
（对甲基苯异丙醇）C10H14O 9 002456 [（3R）-3,7-Dimethyloct-6-enyl] butanoate C14H26O2 10 000259 香芹酚
（5-异丙基-2-甲基苯酚）C10H14O 11 002944 （E）-Linalolpyranoxide C10H18O2 12 000305 月桂酸
（十二酸；正十二酸；十二烷酸）C12H24O2 13 003450 2-十二烯醛醇 C12H22O 14 003508 1-癸醇
（癸烷-1-醇；正癸醇；癸醇；壬基甲醇）C10H22O 15 003949 2-（甲氨基）苯甲酸甲酯
（N-甲基邻氨基苯甲酸甲酯；邻甲氨基苯甲酸甲酯）C9H11NO2 16 004328 柚皮素
（4',5,7-三羟基黄酮）C15H12O5 17 005100 橙皮苷 C16H14O6 18 005577 十一醛 C11H22O 19 000057 邻苯二甲酸二异丁酯 C16H22O4 20 005811 Hepta-3 C22H24O9 21 005814 桔皮素
（5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮）C20H20O7 22 005815 柠檬酸 C21H24O8 23 005817 2-（2-丁炔基）-环己酮 C10H14O 24 005820 22410-74-8 C10H18O 25 005821 （2S）-2-Ethoxypentane C7H16O 26 005822 香叶醇（（E）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇） C10H18O 27 005823 3-甲基-3-丁烯-1-醇 C5H10O 28 005824 4-乙酰基苯甲酸（对乙酰基苯甲酸） C9H8O3 29 005825 6-庚烯-1-醇 C7H14O 30 005828 川陈皮素 C21H22O8 31 005829 醋酸十一酯（乙酸十一酯） C13H26O2 32 000597 乙酸橙花酯（橙花乙酸酯；（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯） C12H20O2 33 000608 （s）-Terpinen-4-ol C10H18O 34 000635 香兰素
（香草醛；3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）C8H8O3 35 000696 β-松油醇 C9H16O 36 000710 正辛醛（辛醛；羊脂醛） C8H16O 37 000748 5-羟甲基糠醛 C6H6O3 38 000771 4-羟基肉桂酸
（对羟基肉桂酸；对羟基苯基丙烯酸；对香豆酸）C9H8O3 39 000922 （R）-p-Menth-1-en-4-ol C10H18O 40 001803 Sinensetin C22H24O7
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表 5 柑橘属植物果皮活性成分和T2DM的共同靶点
Table 5 Common targets of Citrus peel active components and T2DM
编号 靶点 编号 靶点 编号 靶点 1 AR 34 CXCL8 67 IGF1R 2 AKR1B1 35 RBP4 68 FABP2 3 TLR4 36 ALB 69 NOS3 4 EP300 37 SMARCA4 70 KDR 5 ALDH2 38 HMGCR 71 TTR 6 FASN 39 ADRA2A 72 PTGS2 7 HNF4A 40 SERPINE1 73 PARP1 8 CDK4 41 GSR 74 SHBG 9 BCL2 42 F2 75 MMP2 10 MMP3 43 SCN9A 76 MMP9 11 VEGFA 44 OPRM1 77 HMOX1 12 MMP8 45 MPO 78 SIRT2 13 ALOX5 46 NR3C1 79 SCD 14 MTNR1B 47 FABP1 80 HSD11B1 15 MMP1 48 PPARD 81 FABP5 16 FABP3 49 NPC1L1 82 BCHE 17 FABP4 50 SREBF2 83 PTPN1 18 ACP1 51 CYP19A1 84 AKT1 19 PTPN2 52 NR1H3 85 PDE5A 20 ACHE 53 SLC5A2 86 MAPK10 21 CYP1A2 54 CYP1A1 87 GCGR 22 GPBAR1 55 IKBKB 88 CNR1 23 NR1H4 56 PIK3R1 89 MIF 24 VDR 57 PRKAB1 90 ARG1 25 AOC3 58 LIPE 91 PRKCD 26 NOS1 59 MC4R 92 ELANE 27 RET 60 PLA2G2A 93 F3 28 MEN1 61 INSR 94 GSK3B 29 ERBB2 62 IGFBP3 95 TERT 30 FGFR1 63 CYP2C9 96 NOS2 31 PPARA 64 CYP3A4 97 AVPR2 32 PPARG 65 DRD2 98 CYP2C19 33 ESR1 66 CYP17A1
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表 6 T2DM的PPI网络核心靶点拓扑学分析结果
Table 6 Topological analysis results of PPI network core targets of T2DM
编号 靶点 度值 介度 精密度 编号 靶点 度值 介度 精密度 1 ALB 67 1335.1156 0.0078125 10 CXCL8 34 199.1637067 0.006134969 2 AKT1 67 1262.660625 0.0078125 11 F2 22 127.6764313 0.005586592 3 PTGS2 43 296.8887643 0.006578947 12 HNF4A 27 128.4767872 0.005813953 4 INSR 20 117.5407933 0.005555556 13 NOS2 18 127.9912985 0.005555556 5 PPARG 54 939.0000537 0.007092199 14 CYP3A4 25 291.3906018 0.005847953 6 VEGFA 50 372.4423703 0.006896552 15 TLR4 32 177.3151086 0.006097561 7 PPARA 45 566.219661 0.006622517 16 ESR1 42 357.6428551 0.006451613 8 NR3C1 24 292.4289529 0.005780347 17 CYP1A1 21 117.8376291 0.005649718 9 EP300 31 152.7547866 0.00591716
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表 7 有效成分与T2DM靶点对接打分
Table 7 Docking score of active ingredient and T2DM target
靶点 PDB ID α-松油醇 柚皮素 桔皮素 月桂酸 AKT1 2UZS −4.1511 −5.3559 −5.4150 −5.1724 ALB 6RQ7 / −5.8827 −7.5564 −5.0959 PPARG 2VST / −5.9649 −6.4267 −6.1526 VEGFA 1CZ8 / −4.4706 −6.6152 −6.1376
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