Effect of Sucrose on Rheological Properties and Structure of Enteromorpha prolifera Polysaccharide Gel
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摘要: 通过在浒苔多糖（Enteromorpha prolifera polysaccharide，EP）中分别添加0、0.2、0.3、0.4 g/mL蔗糖（Sucrose，SUC），建立复合凝胶体系。采用全自动流变仪分析复合凝胶的流变学特性，傅立叶红外光谱和扫描电子显微镜分析复合凝胶结构并考察二者之间的相互作用。结果表明，EP凝胶属于假塑性流体，加入SUC后没有改变EP的流体性质，但是，添加0.2~0.3 g/mL SUC显著增加了凝胶的黏度（P<0.05），增加了G′、G″和tanδ，表明SUC可以显著改良EP的黏弹性。此外，添加0.3 g/mL SUC显著增加了凝胶的触变性等特性和持水性（P<0.05）。结构分析结果显示SUC分子、水分子及EP分子间存在较强的氢键作用，微观结构显示添加0.3 g/mL SUC使EP凝胶基质更细密，且断面结构更平整，孔隙更小。而当SUC浓度达到0.4 g/mL时，维持EP凝胶结构的氢键减少，凝胶致密度下降，黏弹性降低，持水能力下降。本研究发现0.3 g/mL SUC促进了EP形成更加坚固、持水、稳定的凝胶结构，为进一步高值化利用海洋绿藻资源提供理论依据。Abstract: A composite gel system was established by adding 0, 0.2, 0.3 and 0.4 g/mL sucrose (SUC) in Enteromorpha prolifera polysaccharide (EP), respectively. The rheological properties of the composite gel were analyzed by automatic rheometer, and the structure of the composite gel was analyzed by fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and scanning electron microscopy (SEM) to investigate the interaction between the two. The results showed that EP gel was a pseudoplastic fluid, and the fluid properties of EP were not changed after the addition of SUC. However, the viscosity, G′, G″ and tanδ of EP gel mixed with 0.2~0.3 g/mL SUC was significantly increased (P<0.05), indicating that the SUC could significantly improve the viscoelasticity of EP. In addition, thixotropy and water holding capacity of the gel mixed with 0.3 g/mL SUC was significantly increased (P<0.05). The results of structural analysis showed that there were strong hydrogen bonds among SUC, water, and EP molecules. The microstructure showed that the addition of 0.3 g/mL SUC made the EP gel matrix finer, the cross-sectional structure was flatter and less porous. When the SUC concentration reached 0.4 g/mL, the hydrogen bonds maintaining the EP gel structure were reduced, and the gel density, viscoelasticity and water holding capacity were decreased. In this study, 0.3 g/mL sucrose promoted the formation of stronger, water-holding, and stable gel structure of EP, which would provide a theoretical basis for further high-value utilization of marine green algae resources.
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Keywords:
- Enteromorpha prolifera /
- polysaccharide /
- sucrose /
- rheological properties
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浒苔（Enteromorpha prolifera）是我国东南沿海区域最常见的海洋绿藻之一，具有较高的药食两用价值，历史典籍《本草纲目》及部分沿海城市地方志中均记载了当地居民有食用浒苔的习惯[1−4]。浒苔多糖（E. prolifera polysaccharide，EP）是从浒苔中提取的一种酸性多糖，约占浒苔干重48%~56%[5]，是浒苔中最主要的生物大分子物质。前期研究发现EP是一类含有硫酸根的多糖[6]，这种硫酸化多糖具有特殊的生物活性，如抗凝血[7]、抗氧化[8]、降血脂[9]、免疫调节[10]、抗炎症[11]、抗肿瘤[12]等。前期研究表明，EP由鼠李糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖和半乳糖组成[13]，其水溶液具有凝胶性，在功能性增稠剂、乳化剂、稳定剂等方向有良好应用潜能。然而，天然来源多糖组分形成的水合凝胶在性质上存在一定局限性，如凝胶强度差、持水能力弱、稳定性差等[14−15]。因此，探索和建立一种性状更加稳定、功能更加丰富的天然多糖复配凝胶体系将有助于浒苔多糖的开发与利用。
蔗糖（Sucrose，SUC）常被用于生产果冻、饮料、糕点等食品，能够增加产品的甜味，改善产品感官和风味[16]。现有研究表明蔗糖不仅改善食物风味，还可以提高多糖凝胶结构稳定性[17]，例如，明胶在加入蔗糖之后，动态黏弹性质及储能模量显著增加[18]，另一研究表明蔗糖可提高明胶的熔化温度[19]，这些性质的改变可以进一步提高明胶的稳定性。此外，糖分子与多糖凝胶原有的羟基结合形成氢键，而蔗糖同时具有较强的疏水作用，这种疏水作用与氢键构成的网状结构极大限制了水分子向外迁移的能力，从而显著提高凝胶持水性[20]。以上研究表明，蔗糖有助于改善多糖凝胶特性，而前期结构表征显示EP属于硫酸化杂多糖，而目前关于此类多糖凝胶特性及蔗糖对其增效作用的研究尚少。本实验通过添加不同浓度蔗糖建立浒苔多糖-蔗糖（EP-SUC）的复配水合凝胶体系，从流变学、微观结构、化学基团等角度考察复合凝胶的性质与结构，为浒苔在食品领域的产业化应用提供理论基础，为进一步开发和利用海洋绿藻提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
浒苔粉 福建省福清市海兴保健食品有限公司；蔗糖 食品级，福州奥研实验器材有限责任公司；其它所有试剂皆为分析纯。
DK-S24电热恒温水浴锅 上海精宏设备有限公司；BSA124S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；N-1300旋转蒸发仪 上海爱朗仪有限公司；MCR302流变仪 Anton Paar；TDZ5-WS离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MIX-2500迷你混合仪 杭州佑宁仪器有限公司；LyoQuest-85Plus真空冷冻干燥机 西班牙Telstar公司；Thermo Scientific Nicolet iS20傅立叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技有限公司；SC7620溅射镀膜仪 英国Quorum公司；TESCAN MIRA LMS扫描电子显微镜 泰思肯（中国）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 样品的制备
称取60 g浒苔粉加入到3 L蒸馏水中，于80 ℃水浴锅中水浴2 h，取上清液后继续加入60 g浒苔粉水浴2 h，使用纱布将无法溶解的物质过滤。将2次滤清液置于旋转蒸发仪中，设置温度为80 ℃，蒸发、浓缩1.5 h得到粗多糖。根据课题组前期研究报道，采用Sevag法除去多糖中蛋白质后，经过DEAE Sephadex A-25离子交换色谱及葡聚糖凝胶Sephadex G-100色谱柱层析对多糖进行纯化[21]，纯化后的溶液置于冷冻干燥获得EP粉末。最终，样品中含可溶性多糖56.12%。
EP凝胶的制备：在添加蔗糖之前，需要首先考察不同质量浓度EP形成凝胶的能力。分别配制10 mL浓度为30、40、50、60、70 mg/mL的EP溶液，并将各样品放置80 ℃水浴锅中水浴10 min，振荡30 s，待溶液降至室温25 ℃后备用。
EP-SUC复配体系的制备：参考蔗糖在加工食品过程中常用添加量[22]，分别配制浓度为0、0.2、0.3、0.4 g/mL的蔗糖溶液，称取EP分别加入不同浓度蔗糖溶液中，使样品中EP的终浓度均为60 mg/mL。将各样品放置在80 ℃水浴锅中水浴10 min，振荡30 s，待溶液降至室温25 ℃后备用。
1.2.2 流变特性的测定
流变特性测试采用安东帕MCR302流变仪平板-平板测量系统，平板直径25 mm，测量间隙1.000 mm，测试温度25 ℃[14]。
黏度测定：对不同浓度EP及EP-SUC样品分别进行旋转模式-剪切速率扫描实验，设定测量温度为25 ℃，观察各EP溶液黏度η随剪切速率γ变化规律，探究不同SUC浓度对EP黏度的影响。
线性黏弹区测定：对添加不同SUC浓度的EP溶液进行振荡扫描-线性黏弹区测定，设定温度25 ℃，频率10 rad/s，应变扫描范围0.1%~100%，测定G′随应变的变化情况，从而得到各EP溶液的线性黏弹区，再进行动态黏弹性测定。
动态黏弹性测定：对不同浓度EP-SUC复合凝胶进行振荡扫描-频率扫描实验，在线性黏弹区间内设定应变，设定角频率为0.1~100 rad/s，设定温度为25 ℃，观察G′、G″、tanδ（损耗角正切，tanδ=G″/G′）随角频率的变化情况，探究不同SUC浓度对EP黏弹性的影响。
触变性测定：对添加不同SUC浓度的EP溶液进行旋转测量-3ITT测量，测定温度25 ℃，分别在0.1 s−1、100 s−1、0.1 s−1剪切速率下测量EP结构破坏和恢复过程，探究经过较大剪切速率后含有不同SUC浓度的EP黏度恢复能力。
1.2.3 持水能力测定
分别制备1 mL不同浓度的EP-SUC复配凝胶溶液，置于1.5 mL离心管中，称量装有凝胶样品的离心管质量m1。于4000 r/min离心30 min，出去上层水后再次称量凝胶样品与离心管质量m2，称量空离心管质量m[23]。根据以下公式计算凝胶持水能力：
持水力(%)=m2−mm1−m×100 1.2.4 傅立叶红外光谱（FTIR）测试
对添加不同SUC浓度的EP溶液进行傅立叶红外光谱测试。测试前将不同浓度EP-SUC复配凝胶进行冷冻干燥，烘干至恒质量，且样品表面及内部无明显水分。采用ATR测试方法[24]制备红外扫描用样品，即取少量样品置于金刚石ATR模块中，波数范围4000~600 cm −1，扫描次数32，分辨率4 cm−1，记录样品的红外光谱。
1.2.5 扫描电镜（SEM）测试
对添加不同SUC浓度的EP溶液进行扫描电镜测试。测试前将不同浓度EP-SUC复配凝胶冷冻干燥至样品表面及内部无明显水分。取微量样品直接粘到导电胶上，并使用SC7620溅射镀膜仪喷金45 s，工作电流为10 mA；随后使用TESCAN MIRA LMS扫描电子显微镜观察样品形貌[25]。
1.3 数据处理
实验重复三次所得数据使用GraphPad Prism 8.0.1绘制相关图表，采用SPSS 23.0软件对多组样本进行样本间差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 EP凝胶的流变特性研究
如图1A所示，在测定剪切速率范围内（0.1~1000 s−1），各浓度EP均随着剪切速率的增大而减小，呈现出剪切稀化的假塑性流体特征，这一特征在天然植物提取多糖中较为常见，例如银耳多糖凝胶[26]、铁皮石斛多糖凝胶[27]，均属于假塑性流体。剪切稀化对食品加工过程有重要影响，在高剪切速率的物料体系中，加入假塑性流体特征的多糖可以改进物料输送和灌注工艺，使能量消耗减少，易于加工成型[25]。如图1B所示，在1 s−1剪切速率条件下，浓度为30 mg/mL时，EP的黏度约为23 Pa·s，当浓度增至50 mg/mL时，黏度可提升至60 Pa·s，这个过程可能是由于EP浓度升高使得分子链间作用加强，从而形成更加稳定的网络结构或缠绕结构[28]，使流体流动阻力增大。然而，浓度范围在50~70 mg/mL时，黏度随浓度变化的趋势并不显著（P>0.05），而此时EP凝胶尚处于流动状态，推测这个阶段依靠EP分子形成的凝胶网络可能出现卷曲，将部分化学键或基团包裹于内部[29]，削弱了凝胶的黏度。有研究表明，质量浓度过高时，水溶性多糖倾向于发送分子间缔合形成沉淀，导致黏度降低[28]。因此，为了拓展EP凝胶的应用范围，需要建立复配体系增加EP凝胶的黏度。
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2.2 不同浓度EP-SUC复合凝胶黏度测定
如图2A所示，不同浓度EP-SUC复合凝胶的黏度在剪切速率0.1~1000 s−1范围内，同样随着剪切速率的增加而逐渐降低，呈现出假塑性流体特征，表明添加SUC并不会改变EP的流体类型。此外，在同一剪切速率下，随着SUC添加量增大，EP-SUC复合凝胶的黏度显著增大（P<0.05），表明SUC可以适当增加EP的黏度（图2B）。但可以观察到，相较浓度0.3 g/mL，添加0.4 g/mL SUC的EP凝胶黏度反而略有下降，表明EP-SUC复合凝胶可能存在凝胶临界点，超过临界点时，SUC和EP分子很可能发生聚集[24]，导致黏度出现下降趋势。
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图 2 不同浓度EP-SUC复合凝胶流变特性曲线Figure 2. Rheological characteristic curves of EP-SUC composite gel with different concentrations2.3 不同浓度EP-SUC复合凝胶动态黏弹性测定
线性黏弹区是指在一个范围的应变下储能模量G′能够保持基本不变的区域，即可执行测试而不破坏样品结构的范围。因此，在对样品的动态黏弹性进行分析时，首先需要确认线性黏弹区内的应力范围[30]。如图3所示，在EP中加入不同浓度SUC的样品，其G′在0.1%~100%剪切应变范围内均基本无显著变化，所以0.1%~100%为EP的线性黏弹区。
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图 3 不同浓度EP-SUC复合凝胶的线性黏弹区测定Figure 3. Linear viscoelastic region determination of EP-SUC composite gel如图4结果显示，含有不同浓度SUC的EP-SUC的复合凝胶，其G′均大于G″（即tanδ<1），当tanδ<1时，体系主要表现为固体弹性特征[31]，这个结果表明不论是EP凝胶还是SUC-EP复合凝胶，其弹性在黏弹性中均占主导地位，并处于类固体的凝胶状态。此外，在SUC浓度较低的范围内，随着SUC浓度的增加，G′和G″也相应增大（图4A~图4C），并在SUC浓度为0.3 g/mL时分别达到最大值，继续提高SUC浓度，G′和G″反而下降，并出现G′和G″曲线间距缩小的现象（图4D），表明此时凝胶强度减弱。有研究表明，当物质浓度过高时，由热诱导方式形成的凝胶会出现不均匀的分子聚集，导致凝胶结构收缩，强度减弱[32]；此外，由图5可知，EP和EP-SUC的tanδ值始终介于0.01~1范围内，表明二者均为弹性大于黏度，SUC的加入没有改变这个特性。
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图 4 不同浓度EP-SUC复合凝胶在角频率下模量的变化注：A：未添加蔗糖；B：添加0.2 g/mL蔗糖；C：添加0.3 g/mL蔗糖；D：添加0.4 g/mL蔗糖。Figure 4. Changes in modulus of EP-SUC composite gel with different concentrations at angular frequency![]()
图 5 不同浓度EP-SUC复合凝胶在角频率下tanδ的变化Figure 5. Changes of tanδ of EP-SUC composite gels with different concentrations at angular frequencies综上所述，EP凝胶及EP-SUC复合凝胶的黏弹性呈现明显不同，即低SUC浓度范围内（小于0.3 g/mL），SUC能增加复配体系黏弹性；在高SUC浓度范围（大于0.3 g/mL），SUC反而降低了复配体系黏弹性，根据类似水溶性多糖凝胶形成机制的研究[33]，SUC对EP凝胶体系黏弹性的影响可能与EP化学基团改变相关。
2.4 不同浓度EP-SUC复合凝胶触变性测定
触变性指物质经过较大剪切速率作用后，在小剪切速率下物质仍能恢复原有结构的能力。触变性作为一种可逆的溶胶现象，反映了物质黏度与剪切时间的关系，和物质被打破结构之后重建的能力[34]。如图6A所示，6~60 s 为低剪切速率段（γ=0.1 s−1），此时EP的黏度均处于较高水平。61~65 s为高剪切速率段（γ=100 s−1），EP在高剪切速率下结构可能被破坏，表现为黏度突然降低。66~185 s为低剪切速率段（γ=0.1 s−1），黏度有所恢复但并未达到原来的黏度值，显示EP重建的结构，与原先结构仍有不同。经高剪切后60 s黏度恢复程度如图6B所示，随着SUC浓度的增加，EP黏度值的恢复程度也相应增大，并在SUC浓度为0.3 g/mL时达到最大值63.59%，之后继续增加SUC浓度不再显著提高EP黏度值的恢复程度。因此，浓度低于0.3 g/mL的SUC溶液能显著提高EP黏度值的恢复程度，意味着在一定浓度范围内的SUC有助于EP凝胶的结构重建。
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图 6 不同浓度EP-SUC复合凝胶触变性变化注：A：三段式触变性曲线；B：凝胶黏度恢复测定。Figure 6. Thixotropy of EP-SUC composite gel at different concentrations2.5 不同浓度SUC-EP复合凝胶持水能力测定
此外，SUC对EP凝胶持水能力也有显著影响，如图7所示，EP凝胶持水力约为77%，当添加0.3 g/mL SUC后，持水能力显著增强（P<0.05），表明此时凝胶网状结构限制水分子迁移的能力很强，其原因可能是SUC的多羟基结构对水分子有较强的吸附力，另外，在SUC的存在情况下，多糖分子之间形成更多的氢键，从而增加凝胶的持水能力，这一结果与SUC对果胶持水能力影响的研究结果一致[20]。而当SUC浓度达到0.4 g/mL时，持水能力有所下降，表明过量SUC导致凝胶网络可能出现空隙，吸附水分子的能力减弱，其原因可能与上述的氢键数量减少有关。
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图 7 不同浓度SUC对EP凝胶持水能力的影响Figure 7. Effect of SUC with different concentrations on water-holding capacity of EP gel2.6 不同浓度SUC对EP结构的影响
如图8所示，不同SUC浓度复合凝胶在3400~3200 cm−1均出现宽而强的吸收峰，表现为不饱和的缔合O-H伸缩振动[9]；在1680~1620 cm−1处出现很弱的吸收峰，表现为C=C伸缩振动[11]；在1430 cm−1附近出现O-H弯曲振动峰[9]；在1300~1000 cm−1处存在多个C-O伸缩振动，1105.40 cm−1附近存在醚类物质C-O-C的吸收峰；这些官能团构成了EP凝胶的基本结构骨架。在880~680 cm−1处出现的硫酸基团S-O的反对称伸缩振动[27]，再次证明EP是硫酸化的多糖。相较于单纯EP凝胶，SUC-EP复合凝胶在2926±10 cm−1范围内还多出现了一个弱吸收峰，即-CH2的不对称伸缩振动峰[28]，表明-CH2基团更可能与其他侧链相互作用，从而对EP的结构产生一定的影响[35]。当SUC浓度由0 g/mL升高至0.3 g/mL时，3296.57、3264.83、3261.20、3265.85 cm−1的O-H振动峰的逐渐增强，且羟基伸缩振动峰向低波长方向迁移，表明这个过程氢键是维持凝胶结构的主导作用力，并随着SUC浓度升高氢键数目逐渐增加，而当SUC浓度达到0.4 g/mL时，O-H振动峰开始减弱，表明此时氢键的数量在减少，这可能是由于SUC疏水性较强，而过量的SUC降低了系统水分活度，使疏水作用的形成更加容易，削弱了氢键的作用，导致凝胶强度减弱[36]，类似的结果在SUC和大豆多糖的复合凝胶体系中也被观察到[37]。
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图 8 不同浓度EP-SUC复合凝胶傅立叶红外光谱图Figure 8. Fourier infrared spectrum of different concentrations of EP-SUC composite gels2.7 不同浓度EP-SUC复合凝胶微观结构分析
由图9可知，含有不同浓度SUC的EP-SUC复合凝胶的微观结构具有明显差异。其中，单纯EP凝胶（图9A）的微观结构较为松散，孔隙较大，呈现为片状结构，同时伴有卷曲现象。加入SUC后，EP凝胶的基质愈发细密化，且断面结构也愈加平整，孔隙也呈降低趋势，这种趋势在含有0.3 g/mL SUC的SUC-EP复合凝胶上表现最为显著，其凝胶微观结构均一，排列较为整齐规律，呈现连续的立体菱形状结构（图9C）。当SUC浓度达到0.4 g/mL时，其凝胶结构致密度反而下降，孔隙开始变大，立体菱形状结构被削弱，表现为立体菱形状和平面片状结构并存。这表明在一定浓度范围内，SUC的加入能够强化EP的微观结构，而超过该浓度范围后，SUC则削弱了复合凝胶的微观结构，这个削弱现象与上述黏弹性、红外光谱、持水能力等结果一致，即当SUC浓度达到0.4 g/mL时，维持EP凝胶结构的氢键减少，凝胶弹性降低，持水能力下降。因此，向60 mg/mL EP中添加0.3 g/mL SUC可以获得结构致密、高弹性、高持水性的复合凝胶。
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图 9 不同浓度SUC-EP复合凝胶的扫描电子显微镜图（2000×）注：A：未添加蔗糖；B：添加0.2 g/mL蔗糖；C：添加0.3 g/mL蔗糖；D：添加0.4 g/mL蔗糖。Figure 9. SEM of different concentrations of SUC-EP composite gels (2000×)3. 结论
本研究通过添加不同浓度SUC构建EP-SUC复合凝胶体系，并考察了凝胶的流变学特性和结构。结果表明，添加SUC会对EP的动态流变特性产生影响，在低于0.3 g/mL的浓度范围内，随着SUC的添加，EP的黏度增大、弹性和黏性增加、持水能力增强、经高剪切速率破坏后的恢复程度也随之提高，但SUC浓度高于0.3 g/mL时，SUC则不再对EP流变学特性产生显著影响。同时，基于傅立叶红外光谱和微观结构分析，初步判断SUC分子与水分子及EP分子间的氢键作用在EP流变学特性中起主要作用。本研究通过分析不同浓度SUC-EP复合凝胶的流变特性和结构特点，以满足不同产品对黏度、凝胶性及流变学特性的需求，为EP相关产品的质量、配方和加工条件提供评估参数，从而进一步优化产品品质，进一步高值化利用海洋资源。
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图 2 不同浓度EP-SUC复合凝胶流变特性曲线
Figure 2. Rheological characteristic curves of EP-SUC composite gel with different concentrations
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图 3 不同浓度EP-SUC复合凝胶的线性黏弹区测定
Figure 3. Linear viscoelastic region determination of EP-SUC composite gel
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图 4 不同浓度EP-SUC复合凝胶在角频率下模量的变化
注：A：未添加蔗糖；B：添加0.2 g/mL蔗糖；C：添加0.3 g/mL蔗糖；D：添加0.4 g/mL蔗糖。
Figure 4. Changes in modulus of EP-SUC composite gel with different concentrations at angular frequency
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图 5 不同浓度EP-SUC复合凝胶在角频率下tanδ的变化
Figure 5. Changes of tanδ of EP-SUC composite gels with different concentrations at angular frequencies
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图 6 不同浓度EP-SUC复合凝胶触变性变化
注：A：三段式触变性曲线；B：凝胶黏度恢复测定。
Figure 6. Thixotropy of EP-SUC composite gel at different concentrations
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图 7 不同浓度SUC对EP凝胶持水能力的影响
Figure 7. Effect of SUC with different concentrations on water-holding capacity of EP gel
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图 8 不同浓度EP-SUC复合凝胶傅立叶红外光谱图
Figure 8. Fourier infrared spectrum of different concentrations of EP-SUC composite gels
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期刊类型引用(1)
1. 季文婷，韩天祥，徐友梅，刘明，陈春旭. 滁菊多糖CCPS-3-1凝胶制备及其特性研究. 食品安全质量检测学报. 2025(03): 130-138 . 
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