Optimization of Preparation Technology, Antioxidant Activity and Storage Analysis of Black Garlic Mushroom Paste by Fuzzy Mathematical Evaluation and Response Surface Methodology
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摘要: 以黑蒜、香菇、小米椒为主要原料，采用单因素、模糊数学评价、正交和响应面优化法研究了黑蒜香菇酱配方，并对其进行微生物和理化指标测定。以市售仲景香菇酱和蒙山红香菇酱为参照对比，进行抗氧化性测定分析，并添加防腐剂山梨酸钾，考察储藏时间。结果表明，最优配方为黑蒜20 g、香菇21 g、小米椒3.6 g、大豆油6.6 g、白糖3.3 g、葱姜蒜各3.3 g、豆瓣酱13.2 g、食盐4.4 g、淀粉4.4 g，此时酱制品口感香甜软糯、香辣可口，色泽鲜明，浓稠适中。在0.05~1 mL/mL体积浓度范围内，对DPPH•和•OH清除率最强，均大于市售仲景香菇酱和蒙山红香菇酱，差异显著（P<0.05），对DPPH•和•OH清除率最大分别达到98.8%和75.7%，表明黑蒜香菇酱具有良好的抗氧化性。0.04%和0.05%的山梨酸钾是较适宜添加量。黑蒜香菇酱理化及微生物指标检测结果均符合国家食品污染物和微生物限量标准。Abstract: Using black garlic, lentinus edodes, and millet pepper as main raw materials, the formulation of black garlic lentinus edodes sauce was studied by single factor, fuzzy mathematical evaluation, orthogonal design, and response surface methodology, and its microbial and physicochemical indexes were determined. With the commercial Zhongjing lentinus edodes sauce and mengshanhong lentinus edodes sauce as the reference, the antioxidant properties were determined and analyzed, and the preservative potassium sorbate was added to investigate the storage time. The results showed that the optimum formula was 20 g black garlic, 21 g lentinus edodes, 3.6 g millet pepper, 6.6 g oil, 3.3 g sugar, 3.3 g onion, ginger and garlic respectively, 13.2 g bean paste, 4.4 g salt and 4.4 g starch. At this time, the sauce products taste sweet and soft waxy, spicy and delicious, bright color, moderate consistency. In the range of 0.05~1 mL/mL volume concentration, the scavenging rate of DPPH• and •OH free radicals was the strongest, which was higher than the commercial Zhongjing mushroom paste and Mengshanhong mushroom paste, with significant difference (P<0.05). The maximum scavenging rate of DPPH• and •OH free radicals reached 98.8% and 75.7% respectively, indicating that the black garlic mushroom paste had good antioxidant properties. 0.04% and 0.05% potassium sorbate were suitable for addition. The physicochemical and microbial indicators of black garlic mushroom paste were in line with the national food pollutant and microbial limit standards.
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Keywords:
- black garlic /
- lentinus edodes sauce /
- formulation process /
- antioxidant properties /
- storage
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香菇，肉质肥厚细嫩，味道鲜美，营养丰富，含有粗纤维、矿物质、蛋白质、脂肪、维生素、微量元素等[1]。香菇中含有的生物活性物质，可以预防肥胖、便秘，含有的香菇多糖则具有抗肿瘤的作用，还可以预防流行性感冒、降低胆固醇、辅助治疗糖尿病，冠心病等[2-3]；香菇中含有较丰富的麦角甾醇，麦角甾醇一定条件下可转化为维生素D，能促进钙的吸收[4-5]。黑蒜是大蒜经高温、高湿处理（发酵）一定时间后得到的产品，口感酸甜软糯且无辛辣刺激的味道，深受人们喜爱[6]，不仅具有普通大蒜所含有的营养物质，而且含有更丰富的杀菌消毒物质和微量元素等，具有抗氧化性、抗酸化、降血糖、降血压、降血脂等功效[7-8]。由于黑蒜和香菇丰富的营养价值和良好的保健性能，且还未出现市售黑蒜香菇酱，同时以黑蒜为主要原料的酱制品也报道较少[9-10]。因此，本文以黑蒜、香菇和小米椒为主要原料，研制一款新型且营养丰富的黑蒜香菇酱制品，并对其理化和微生物指标进行测定，同时以市售仲景香菇酱和蒙山红香菇酱作为对比，进行抗氧化性研究。另外，山梨酸钾作为食品常用的防腐剂，对食品中的菌落总数和霉菌总数有较大的影响，所以本文又考察了山梨酸钾添加量对黑蒜香菇酱菌落总数和霉菌总数的影响。本研究不但丰富了黑蒜香菇酱制品种类，同时也为大蒜产业发展提供助力。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
黑蒜 网购，山东金乡独头黑蒜；仲景香菇酱、蒙山红香菇酱、葱姜蒜、香菇、食盐、淀粉 市购；大豆油 福临门大豆油（转基因大豆油），四川省粮油集团有限责任公司；山梨酸钾（食品级） 六月食品配料商行；郫县豆瓣酱 四川省郫县豆瓣股份有限公司；白糖 安琪酵母（赤峰）有限公司。
QSJ-D03X1小熊料理机 佛山市小熊厨房电器有限公司；MST-18电炒锅 潮州市潮安区美胜特电器厂；DZKW-S-4电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；101-0AB3电热恒温干燥箱 上海科恒实业发展有限公司；JA2003A分析天平 上海精天电子仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；85-2恒温磁力搅拌器 国华电器有限公司；UV-2800H型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；LDZX-50KBS立式高压灭菌器 上海申安医疗器械厂；DHP-420型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；SW-CJ-2G型超净工作台 苏州净化设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黑蒜香菇酱生产工艺流程
工艺流程：加热功率1000 W将大豆油烧至八成熟（200 ℃）→加入葱姜蒜小米椒爆香、白糖提味→再加入黑蒜、香菇翻炒至粘稠→再加入豆瓣酱翻炒入味提色→加水、盐、淀粉搅拌，加热功率300 W熬制10 min→出锅装瓶、排气→杀菌→冷却→成品[11]
操作要点：原料处理：将黑蒜、香菇、葱姜蒜、小米椒剥皮洗干净放入料理机打成碎末备用。
工艺要点：在锅内加入大豆油6 g，并烧至八成热（200 ℃），放一定量葱姜蒜、小米椒爆香后，将白糖、黑蒜、香菇放入锅中翻炒粘稠，加入豆瓣酱再次翻炒10 s左右，然后加入适量水、食盐、淀粉，搅拌熬制10 min，在40 ℃左右装瓶，95 ℃水浴排气10 min，迅速拧盖密封，于1.01 MPa、121 ℃灭菌30 min，用冷水迅速冷却室温25 ℃，即为成品。
1.2.2 单因素实验
本研究实验方案设计参考前期研究方法[12]，黑蒜的添加量设定为20 g[9,12]，为确定各单因素添加水平，本研究进行预实验。根据预实验结果，当黑蒜添加量为20 g时，香菇25 g、大豆油6 g、葱姜蒜3 g（比例为1:1:1）、小米椒2 g、白糖2 g、豆瓣酱6 g、食盐2 g、淀粉3 g，此时感官评价为73分，黑蒜香菇酱辣味不够。将小米椒添加量增加至2.5 g，感官评价为78分，故单因素实验小米椒基础添加量为2.5 g，由此对各单因素实验设计如下：
在黑蒜添加量为20 g，香菇25 g、大豆油6 g、葱姜蒜各1 g、小米椒2.5g、白糖2 g、豆瓣酱6 g、食盐2 g、淀粉3 g条件下，考察香菇添加量（15、20、25、30、35 g）、葱姜蒜添加量（3、6、9、12、15 g）、大豆油添加量（2、4、6、8、10 g）、小米椒添加量（2、2.5、3、3.5、4 g）、食盐添加量（1、2、3、4、5 g）、豆瓣酱添加量（3、6、9、12、15 g）、白糖添加量（1、2、3、4、5 g）、淀粉添加量（1、2、3、4、5 g）对黑蒜香菇酱感官评价的影响。
1.2.3 正交试验设计
根据单因素实验结果，辅料葱姜蒜、淀粉的添加量直接由响应面来确定，所以除了黑蒜、香菇、小米椒，其余因素大豆油、食盐、糖和豆瓣酱采用四因素三水平L9（34）正交试验进行设计。正交试验设计因素水平见表1。
表 1 辅料的正交试验设计因素水平表Table 1. Orthogonal design of experiments factors and levels table of auxiliary materials水平 因素 A大豆油（g） B食盐（g） C白糖（g） D豆瓣酱（g） 1 6 2 1 6 2 8 3 2 9 3 10 4 3 12 1.2.4 响应面优化设计
根据单因素及正交试验结果，对香菇、小米椒、辅料采用三因素三水平响应面优化试验，辅料一份添加量为：大豆油6 g，食盐4 g，白糖3 g，豆瓣酱12 g，葱姜蒜共9 g（各3 g），淀粉4 g，以感官评价为响应值，采用Design-Exper 10.0.7版本软件，Box-Behnken设计原理，因素水平如表2所示。
表 2 响应面设计因素水平表Table 2. Table of response surface methdology factors and levels水平 因素 E香菇（g） G小米椒（g） H辅料（份） −1 15 3.0 0.5 0 20 3.5 1.0 1 25 4.0 1.5 1.2.5 感官评价标准
感官评分标准参照Q/TJ0001S-2019酱类制品的要求及标准，结合黑蒜香菇酱的实际情况而制定，如表3所示。将制作出的黑蒜香菇酱分别放入纸杯中，邀请10位经过培训的评价人员对此次所做出的酱制品进行评价打分，感官评价前温水漱口，评价期间禁止相互讨论。
表 3 黑蒜香菇酱感官评价标准Table 3. Sensory evaluation criteria of black garlic lentinus edodes spicy sauce项目 评定标准 等级 滋味U1
（30分）滋味鲜美，咸淡适中，黑蒜的香甜味以及香菇的鲜味浓厚，辣味
可口，无其他不良滋味（24~30）优V1 滋味较好，咸淡适中，黑蒜的香甜味以及香菇的鲜味适中，辣度
较弱，可口，无其他不良滋味（16~23）良V2 滋味一般，咸淡不适中，黑蒜的香甜味以及香菇的鲜味偏淡，辣味不明显，有轻微的其他异味（9~15） 中V3 滋味较差，咸淡不适中，无辣味或辣味过大，有焦糊味等其他不
良气（≤8）差V4 气味U2
（25分）酱香味较醇厚，有黑蒜的香甜味以及香菇的鲜味，无异味，整体协调（20~25） 优V1 整体气味较协调，黑蒜香甜味以及香菇的鲜味不够突出，稍平淡，无不良气味（14~19） 良V2 酱香味不明显，黑蒜香甜味以及香菇的鲜味不明显，稍有异味（8~13） 中V3 没有酱香味道，有其他不良气味如酸败味或焦糊味（≤7） 差V4 色泽U3
（25分）酱体黄棕色或者红棕色，色泽均匀，油润发亮，明快饱满（20~25） 优V1 酱体颜色稍暗，呈深褐色，色泽不够明亮，较均匀（14~19） 良V2 酱体稍有光泽，不明亮，颜色均匀，但过深或过浅（8~13） 中V3 酱体颜色呈黑褐色，不均匀，无光泽（≤7） 差V4 状态U4
（20分）酱体黏稠适中，颗粒大小均匀，能够清楚的看到香菇颗粒，无多余油脂，无杂质，无分层（15~20） 优V1 酱体稍稠或稍稀，稍有分层，无杂质，有香菇的颗粒，稍有漂浮的油脂，分布较均匀（10~14） 良V2 酱体较稠或较稀，有分层，无杂质，有油脂漂浮，香菇颗粒大小不一，颗粒分布不均匀（5~9） 中V3 酱体过稠或过稀，有分层，有杂质，有大块的香菇，漂浮油脂
较多，颗粒不均匀（≤4）差V4 1.2.6 模糊数学评价模型的建立
a.因素集的建立，以滋味（U1）、气味（U2）色泽（U3）和状态（U4）4个评价指标组成评价因素集。b.评语集的建立，以优V1、良V2、中V3、差V4组成每个因素的评语集。c.权重集的确定，方法采用用户调查法和二元对比法确定每个指标的权重，根据贾庆超等[13]的方法得到各因素的权重集如表4所示。d.模糊关系综合评判集，参考文献李梦倩等[14]的方法，采用模糊数学方法对黑蒜香菇酱感官综合评价结果进行评定，根据模糊数学矩阵变换原理，每组样品的评价结果L＝（权重矩阵M×模糊矩阵T），感官评分具体计算方法如下表所示。
表 4 各因素权重分布Table 4. Weight assignment of each factor评价指标 各项因素得分 滋味 气味 色泽 状态 总计 权重 滋味U1 10 7 9 9 35 0.35 气味U2 3 10 7 6 26 0.26 色泽U3 1 3 10 5 19 0.19 状态U4 1 4 5 10 20 0.20 1.2.7 微生物和理化指标检验方法
采用GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法对水分进行测定；采用GB 5009.33-2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法对亚硝酸盐含量进行测定；采用GB 12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》中的滴定法对总酸含量进行测定；采用GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的菌落总数测定法来对菌落总数进行测定；采用GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中的大肠菌群最大或然数（most probable number，MPN）计数法对大肠菌群进行测定；采用GB 4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》测定霉菌总数；采用GB/T 12457-2008《食品中氯化钠的测定》滴定法测定食盐含量（以NaCl计）；采用GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》中的第一法酸度计法测定氨基酸态氮含量。
1.2.8 抗氧化性的测定
a.待测样液的制备，参考赵晓娟等[15]和李吉达等[16]中样品处理的方法，制备样品溶液。将酱制品在打浆机中打碎成浆，准确称取2.0000 g，准确加入100 ml体积分数为50%的乙醇溶液，于超声提取器中300 W，常温，提取60 min，再于均质机中3000 r/min条件下离心20 min，取上清液重新离心，4000 r/min条件下离心20 min，上清液即为样品提取液，稀释10倍，得到2.0 mg/mL样品提取液（与VC溶液浓度一致），备用。b.待测样液的浓度配制，参考贾庆超等[12]和刘静等[17]样品液的处理方法，将所得样品提取液与2.0 mg/mL的VC溶液分别稀释至其浓度的的5%、25%、50%、75%、100%（即待测样液体积浓度为0.05、0.25、0.50、0.75、1.00 mL/mL）。c.抗氧化性的测定，以VC溶液的抗氧化性为对照，对黑蒜香菇酱、市售仲景牌香菇酱和市售蒙山红香菇酱制品分别进行抗氧化性的测定，并进行数据对比分析。参考赵晓娟等[15]的测定方法，进行DPPH•、•OH、O2−•清除活性的测定；参考王喜波等[18]测定样品还原性的方法，进行酱制品还原能力的测定。
1.2.9 山梨酸钾防腐储藏试验
将山梨酸钾溶于少量去离子水中，以酱制品质量为标准，待酱制品制备结束时，分别添加0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的山梨酸钾（以山梨酸计），搅拌均匀，趁热装罐、排气，121 ℃下杀菌30 min，常温25 ℃左右储藏90 d，而后每次室温25 ℃左右开盖30 min，每隔3 d测定菌落总数和霉菌总数，后盖好继续在室温25 ℃左右条件下储藏，每次做三次平行实验，结果取平均值。
1.3 数据处理
单因素实验结果以平均值±标准误来表示，SPSS 21.0用于数据方差分析及误差值的结果计算，Origin 2018用于误差折线图的绘制，以P<0.05作为差异显著性判断标准，字母不同表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果分析
由图1a可知，大豆油添加量为2~8 g时，感官评价得分逐渐上升，差异显著（P<0.05）。添加量为2 g的时候，香味及滋味不足，感官评价较低，随着添加量的增多酱体香味也更加浓郁，评分逐渐升高，添加量为8 g时，感官评价最高，此时口感最佳，到10 g的时候酱制品有些油腻，感官评价下降，与8 g差异显著（P<0.05），因此8 g的添加量为最佳。故将6、8、10 g作为正交试验的三个水平。
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图 1 不同原辅料添加量对黑蒜香菇香辣酱感官评分影响的单因素实验结果注：图a~f为辅料；图g~h为主料；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 1. Single factor experimental results of the effects of different amounts of raw and auxiliary materials on the sensory score of black garlic mushroom paste由图1b可知，食盐添加量为1~4 g时，感官评价先升高后降低，差异显著（P<0.05），食盐的添加量为1 g时，酱制品咸味不足，感官评价较低；2 g时稍淡，香味不足；3 g时呈现出来的酱制品口感更佳，有咸香味道；4、5 g时味道偏咸，感官评价较低，尤其是添加量为5 g时，虽然与2 g差异不显著（P>0.05），但与4、3 g差异显著（P<0.05），所以添加量3 g为最佳。故将2、3、4 g作为正交试验的三个水平。
由图1c可知，在五个白糖添加水平下，感官评价差异显著（P<0.05），添加量为1 g的时候，评分较低，滋味不足，当添加量升至3 g时，味道比较协调，感官评价最高。此后，随着添加量增加至4 g，评分下降，因此时白糖添加量过多，使得酱制品比较甜腻，感官评价下降较大。由于添加量1和2 g时，感官评价均大于添加量4 g时的感官评价，且1和2 g均与4 g差异显著（P<0.05），又因为正交试验最终结果是选择某个试验点为最优水平，所以此时4 g不宜作为正交试验的一个试验水平。因此选择1、2和3 g作为正交试验水平。
由图1d可知，豆瓣酱添加量为3~12 g时，感官评价逐渐增加，且差异显著（P<0.05），当添加量为3~6 g时，由于添加量较少，酱香味不足，感官评价较低；当达到9 g时，味道较醇厚，但色泽不够好；达到12 g时，酱醇香鲜辣、色泽油润红亮，感官评价最高；15 g时，豆瓣酱过多掩盖了酱制品的其他味道，感官评价下降较大，且与6、9和12 g差异显著（P<0.05），同时，添加量为6和9 g时，感官评价均大于添加量为15 g时的感官评价，且差异显著（P<0.05），又因为正交试验最终结果是选择某个试验点为最优水平，所以此时15 g不宜作为正交试验的一个试验水平，因此选择6、9和12 g作为正交试验水平。
由图1e可知，葱姜蒜添加量为3~9 g时，感官评价逐步增大，差异显著（P<0.05）。同时因为姜和大蒜的独特味道，添加量较大时，会掩盖酱制品其他调味品的味道，对酱的口感有一定影响，所以添加量为9~15 g时，感官评价逐渐降低，差异显著（P<0.05），所以9 g为最适添加量。因此若将葱姜蒜作为一个因素做正交试验，其正交试验水平选择应为6、9和12 g，但此时感官评价变化为81.6~83.6，变化较小，且6和12 g差异不显著（P>0.05），因此本研究葱姜蒜添加量直接由响应面优化其最佳添加量。
由图1f可知，当淀粉添加量为1~3 g时，感官评价不高，且变化不大，差异不显著（P>0.05），此时酱体稍稀，组织状态不好，添加量4 g时，粘稠度适中，与添1~3 g差异显著（P<0.05），5 g时感官评价下降，此时酱制品粘稠度较大，与1~3 g差异不显著（P>0.05）。由于淀粉主要影响酱的组织状态，对其他酱品质的影响较小，所以淀粉的添加量主要通过响应面优化确定。
由图1g可知，香菇添加量15~25 g时，感官评价先升高后降低，差异显著（P<0.05），添加量为15 g时，香菇的滋味及气味较低，感官评价较低，添加量为20 g时评分最高，此时酱制品的滋味及气味较好。随着香菇添加量不断增加，香菇的味道掩盖了酱制品中其他因素的滋味及气味，香菇添加量大于25 g时，感官评价稍降低，但差异不显著（P>0.05）。因此，香菇添加量为20 g时为最佳。刘馥源等[3]研究鲜辣香菇酱时，香菇是唯一主料，香菇添加量为40%，而本试验经过核算为31%，本试验还有黑蒜主料，且需要二者相互协调味道，故添加量偏低。
由图1h可知，随着小米椒添加量的增加，感官评价先升后降。在五个添加水平下，差异显著（P<0.05）。小米椒主要影响酱制品的香辣程度，在2 g的时候辣味不明显，评分不高；2.5和3 g则较辣；当达到3.5 g时，感官最高，香辣，味道鲜美，辣、咸味适中；4 g时，由于过辣，感官评价下降，此时酱制品其他味道不明显，所以3.5 g添加量为最佳。王新悦等[19]研究香辣酱辣椒的添加量为3.6%，本试验为4.2%，比较接近。
2.2 黑蒜香菇酱中辅料的正交试验结果分析
2.2.1 感官评价投票数统计
对10名感官评价人员感官评价投票数统计，辅料正交试验模糊数学评价各因素投票数如表5所示。
表 5 正交试验各因素票数Table 5. Number of votes for each factor of orthogonal test序号 滋味 气味 色泽 状态 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 1 4 3 1 2 3 3 2 2 3 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 2 1 3 2 2 3 3 3 1 3 3 2 2 3 3 6 2 2 0 5 1 4 0 6 4 0 0 5 5 0 0 4 4 3 2 1 3 2 4 1 3 4 1 2 4 2 3 1 5 3 3 3 1 2 3 2 3 2 3 3 2 3 3 2 2 6 2 3 2 3 2 4 2 2 3 3 2 2 4 3 2 1 7 2 2 1 5 2 3 2 3 3 2 4 1 3 3 2 2 8 4 3 2 1 4 3 1 2 4 2 1 3 4 2 2 2 9 4 3 2 1 3 4 1 2 4 2 2 1 4 2 2 2 2.2.2 模糊矩阵的建立
将表5中的数据建立模糊评价矩阵，可得到各个模糊矩阵T1~T9。以1号产品为例：滋味的评价人数分别为：4人选优，3人选良，1人选中，2人选差，则U滋味=（0.4，0.3，0.1，0.2），同理，U气味=（0.3，0.3，0.2，0.2），U色泽=（0.3，0.2，0.2，0.3），U状态=（0.2，0.2，0.4，0.2），由此可得到矩阵T1。同理，可以依次得到T2~T9。
2.2.3 模糊评价综合得分
按照矩阵相乘方法，1号产品感官评价结果L1=（权重集U×模糊矩阵T1）=（0.315，0.261，0.205，0.219），同理可得L2~L9。
分别赋予优、良、中、差分值为90、80、70和60分，将L1中的各个量分别与相应分值相乘再相加即可得到1号感官评分，即1号样品感官评分=0.315×90+0.261×80+0.205×70+0.219×60=76.7，同理可以计算出2~9号样品的感官得分。
2.2.4 正交试验结果
根据2.2.3计算出每个实验样品的感官得分，正交试验结果如表6所示，方差分析如表7所示。
表 6 正交试验结果分析Table 6. Analysis of orthogonal expenimental results因素 A 大豆油 B 食盐 C 白糖 D 豆瓣酱 感官评分 1 1 1 1 1 76.7 2 1 2 2 2 77.3 3 1 3 3 3 83.8 4 2 1 2 3 78.6 5 2 2 3 1 76.2 6 2 3 1 2 76.2 7 3 1 3 2 74.1 8 3 2 1 3 78.7 9 3 3 2 1 77.5 K1 237.8 229.4 231.6 230.4 K2 231.0 232.2 233.4 227.6 K3 230.3 237.5 234.1 241.1 k1 79.3 76.5 77.2 76.8 k2 77.0 77.5 77.4 75.9 k3 76.8 79.2 78.2 80.4 极差R 2.5 2.7 1.0 4.5 较优水平 A1B3C3D3 因素影响大小 D>B>A>C 表 7 正交试验方差分析Table 7. Anova of orthogonal experiments源 III型平方和 df 均方 F值 P值 校正模型 169.140a 8 21.143 23.196 0.000 截距 163893.813 1 163893.813 179810.360 0.000 A 35.607 2 17.303 19.081 0.000 B 36.616 2 18.308 20.086 0.000 C 4.542 2 2.271 2.492 0.001 D 91.376 2 45.688 50.125 0.000 误差 16.407 18 0.911 总计 164079.360 27 校正的总计 185.547 26 R2=0.912，Radj2=0.872 注：“*”表示对结果影响显著（P<0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P<0.01）。 由表6可知，影响自制黑蒜香菇酱得分的因素是：豆瓣酱的添加量>食盐的添加量>大豆油的添加量>白糖的添加量。得到最好的较优参数组合为A1B3C3D3，即大豆油的添加量为6 g，食盐的添加量为4 g，白糖的添加量为3 g，豆瓣酱的添加量为12 g。由表7中方差分析可知，A、B、C、D 4个因素对感官评分影响均较显著（P<0.05），说明正交试验4个因素选择合理，根据F值，因素影响大小顺序与表6极差分析结果一致，表明正交试验数据可靠。
2.3 响应面试验与结果分析
2.3.1 响应面试验
对10名感官评价人员模糊数学评价各因素投票数统计，如表8所示，响应值感官评分计算方法与2.2中感官评分计算方法一致，响应面实验设计与结果见表9。
表 8 响应面各因素评价票数Table 8. Number of evaluation votes for each factor of response surface序号 滋味 气味 色泽 状态 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 1 9 1 0 0 9 1 0 0 9 0 1 0 9 1 0 0 2 5 2 2 1 4 2 2 2 4 2 3 1 5 2 3 0 3 7 3 0 0 7 2 1 0 7 3 0 0 10 0 0 0 4 9 1 0 0 8 2 0 0 9 1 0 0 9 1 0 0 5 10 0 0 0 9 1 0 0 9 1 0 0 9 1 0 0 6 3 3 2 2 3 2 2 3 2 3 4 1 3 3 3 1 7 5 3 1 1 6 3 1 0 5 2 3 0 4 4 1 1 8 3 1 4 2 2 2 3 3 3 2 3 2 2 2 4 2 9 4 2 2 2 3 3 3 1 3 2 3 2 3 3 3 1 10 5 3 2 0 4 3 2 1 3 3 3 1 3 2 4 1 11 4 4 2 0 3 4 2 1 3 3 3 1 3 2 4 1 12 10 0 0 0 9 1 0 0 8 2 0 0 10 0 0 0 13 6 2 1 1 6 1 2 1 5 3 1 1 5 2 2 1 14 3 3 2 2 2 3 3 2 3 3 3 1 2 3 2 3 15 2 1 2 5 2 2 1 5 2 2 1 5 2 1 2 5 16 5 2 2 1 5 2 1 2 5 2 1 2 3 4 2 1 17 5 2 3 0 4 2 3 1 5 2 2 1 5 2 2 1 表 9 响应面试验设计与结果Table 9. Response surface experimental design and results试验号 E G H Y感官评分 1 0 0 0 88.81 2 −1 1 0 80.00 3 0 0 0 87.34 4 0 0 0 88.74 5 0 0 0 89.00 6 1 0 −1 76.49 7 1 0 1 82.58 8 1 1 0 74.47 9 −1 0 −1 77.62 10 0 −1 −1 80.07 11 1 −1 0 79.46 12 0 0 0 89.36 13 −1 0 1 81.15 14 −1 −1 0 76.07 15 0 1 −1 70.56 16 0 −1 1 80.15 17 0 1 1 80.83 根据响应面数据，回归分析响应面方程为Y=91.89−0.27E−1.26G+2.58H−2.24EG+0.75EH+2.59GH−6.43E2−7.97G2−6.14H2，方差分析如表10所示。
表 10 响应面回归模拟的方差分析Table 10. Analysis of variance of response surface regression model方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 785.60 9 87.29 43.91 <0.0001 ** E 0.60 1 0.60 0.30 0.5999 G 12.78 1 12.78 6.43 0.0389 * H 53.15 1 53.15 26.74 0.0013 ** EG 20.07 1 20.07 10.10 0.0155 * EH 2.24 1 2.24 1.12 0.3242 GH 26.88 1 26.88 13.53 0.0079 ** E2 174.33 1 174.33 87.70 <0.0001 ** G2 267.42 1 267.42 134.54 <0.0001 ** H2 158.84 1 158.84 79.91 <0.0001 ** 残差 13.91 7 1.99 失拟项 8.85 3 2.95 2.33 0.2160 纯误差 5.07 4 1.27 总离差 799.51 16 R2=0.9826，Radj2= 0.9602 C.V.%=1.71 注：“*”表示对结果影响显著（P<0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P<0.01）。 由表10可知，模型的P<0.0001，表明试验所采用的二次模型极显著[20]。失拟项P=0.2160>0.05，不显著，则表明此模型的拟合程度良好，试验误差小；对试验模型的可信度进行分析，得到R2=0.9826，表明响应值的变化98.26%来自于所选因素，模型的拟合度较好，方程的调整决定系数RAdj2=0.9602,说明有96.02%的试验符合该模型，与实际情况符合良好[21]。变异系数C.V.%=1.71，较小，方程模型具有良好重现性[22]。一次项H及二次项GH、E2、G2、H2对结果影响极显著（P<0.01），一次项G及二次项EG对结果影响显著（0.01<P<0.05），根据F值，各因素对实验结果影响的先后顺序为H>G>E，即辅料>小米椒>香菇。
2.3.2 响应面结果分析
根据回归方程建立响应面图2。由图2可知，EG、EH、GH三个响应面图均存在一个最高点，说明响应面优化因素的水平选择合理，在选择的水平范围内，存在最大值。等高线越密集，表明对实验结果影响越显著[23]。GH影响最显著，其次是EG、EH，这与方差分析结果是一致的。等高线越接近于椭圆形，交互作用越显著[24]。由等高线图可知，GH、EG有一定交互作用，而EH交互作用较弱。利用Design-Expert10.0.7对回归方程进行回归分析，得到预测最佳添加量为香菇21 g、小米椒3.6 g、辅料1.1份，得分88.18分。
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图 2 黑蒜香菇酱的响应面等高线图Figure 2. Response surface and contour map of black garlic mushroom paste2.3.3 验证试验
由响应面优化预测所得最佳黑蒜香菇酱最佳配方为：黑蒜20 g、香菇21 g、小米椒3.6 g、大豆油6.6 g、白糖3.3 g、葱姜蒜各3.3 g、豆瓣酱13.2 g、食盐4.4 g、淀粉4.4 g，得分88.18分。此条件下进行验证试验，重复三次，感官评分分别为88.88分、87.65分、89.03分，平均分为88.52±0.62分，与理论值很接近。此时黑蒜香菇酱为红褐色，色泽最佳，具有酱的香味和本品的特色辣味，香菇香鲜味浓郁，酱体比较粘稠，可见黑蒜辣椒粒，味道香辣醇厚，咸甜合适。
2.4 理化指标和微生物测定
根据1.2.9中理化和微生物检测方法，对成品酱制品进行分析检测，结果如下表11所示。
表 11 理化和微生物检测结果Table 11. Physicochemical and microbiological test results序号 测定项目 测定结果 GB 31644-2018
《食品安全国家标准
复合调味料》要求是否符合
国家要求1 水分含量 20.6 g/100 g <65 g/100 g 符合 2 总酸含量 2.01 g/100 g <4 g/kg 符合 3 菌落总数 <104 CFU/g 104 CFU/g 符合 4 霉菌总数 <103 CFU/g <103 CFU/g 符合 5 微生物大肠
菌群计数未检出 无 符合 6 亚硝酸盐含量 1.08 mg/kg <20 mg/kg 符合 7 氨基酸氮含量 2.58 g/100 g 无 符合 8 食盐含量（NaCl计） 13.5 g/100 g >12 g/100 g 符合 由表11可知，理化指标水分含量为20.6 g/100 g、总酸含量为2.01 g/100 g等均符合国标要求，菌落总数、霉菌总数和微生物大肠杆菌含量等微生物关键指标亦符合国标要求，说明黑蒜香菇成品酱各项主要理化和微生物指标均符合国标相关要求。黑蒜香菇酱制作复杂，在制作过程中，可能发生较多的物理、化学、微生物的变化反应，而这些反应对黑蒜香菇酱的品质有直接影响，所以为保证食品安全，在制作过程中，要严格把控制作环境，保证卫生条件。
2.5 抗氧化性结果
由图3可知，随着体积浓度的增大，三者对DPPH•的清除能力均逐渐增加，呈正相关的量效关系。在整个体积浓度范围内，黑蒜香菇酱对DPPH•的清除能力最强，与市售仲景香菇酱与蒙山红香菇酱差异显著（P<0.05），且远高于市售蒙山红香菇酱，这应该是黑蒜和香菇二者均含有丰富的抗氧化性较强的活性物质[8，24]。同时也可以看出，仲景香菇酱对自由基清除能力大于蒙山红香菇酱的清除能力，二者差异显著（P<0.05），这应该是仲景香菇酱香菇的含量大于蒙山红香菇酱香菇的含量导致的。当体积浓度达到1 mL/mL时，黑蒜香菇酱对自由基的清除能力达到91.9%左右。
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图 3 DPPH·和·OH的清除能力注：不同字母表示清除率差异显著（P<0.05）。Figure 3. Scavenging ability of DPPH· and·OH radical由图3可知，在整个体积浓度范围内，随着体积浓度的增大，三者对羟自由基（•OH）清除能力逐渐增加，且呈现正相关的量效关系。黑蒜香菇酱对羟自由基（•OH）的清除能力是最强的，当浓度<0.25 mL/mL时，与仲景香菇酱和蒙山红相差较大，差异显著（P<0.05），黑蒜香菇菌酱对羟自由基（•OH）清除能力应主要取决于黑蒜和香菇中含有的多酚类物质、黄酮类物质、含硒蛋白和含硒多糖[24-25]等物质，当其浓度较低时，有利于增大这些物质的溶解度，促使其对羟自由基（•OH）清除能力的增大。体积浓度为0.05 mL/mL的黑蒜香菇酱与体积浓度为0.25 mL/mL的蒙山红香菇酱差异不显著（P>0.05），随着浓度的增大，与仲景香菇酱差距逐渐缩小，差异仍然显著（P<0.05），但与蒙山红香菇酱差距却逐渐增大。当体积浓度达到1 mL/mL时，黑蒜香菇酱对羟自由基（•OH）清除率达到75.7%。
2.6 山梨酸钾对黑蒜香菇酱菌落总数和霉菌总数的影响
山梨酸钾是我国允许使用的食品防腐剂，具有低毒、安全、高效的特点，其防腐原理是通过破坏微生物的酶系统来抑制腐败菌和霉菌，对细菌、霉菌等均有抑制作用，被普遍用于食品的防腐保鲜[26]。翟众贵[26]研究表明山梨酸钾对菌落总数和霉菌总数均有抑制作用，0.01%~0.05%添加范围内，添加量越大，菌落总数和霉菌总数越低，呈负相关的量效关系。故本研究山梨酸钾添加量选择为0.04%和0.05%。
由图4可知，菌落总数和霉菌总数均随着保藏时间的增加而增加，添加量为0.04%和0.05%时，整体保藏时间内，抑制效果均最好。Q/NYBF 0001 S-2021半固态微生物限量要求菌落总数小于104 CFU/g，霉菌总数小于103 CFU/g，翟众贵[26]研究风味香菇酱时，认为菌落总数应小于0.5（104 CFU/g，所以为了使结果更加严谨，本研究参考翟忠贵研究指标，山梨酸钾添加量0.04%和0.05%时，保藏时间为21 d时，菌落总数和霉菌总数均满足此要求。而翟众贵[26]研究的风味香菇酱，山梨酸钾添加量为0.04%和0.05%，保藏天数16 和18 d，才符合此要求，保藏时间均小于本研究的黑蒜香菇酱，这应该是与黑蒜中含有大量抗氧化物质具有保鲜作用有关。GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》规定山梨酸钾最大使用量为0.05%，由此可见，在菌落总数指标小于0.5×104条件下，0.04%~0.05%山梨酸钾为合适添加量。
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图 4 山梨酸钾添加量对菌落总数和霉菌总数的影响注：不同字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 4. Effects of potassium sorbate addition on the total number of bacterial colonies and molds3. 结论
设定黑蒜的添加量为20 g，以感官评价为依据，对影响黑蒜香菇酱的香菇、小米椒和食盐等因素采用单因素、正交试验和响应面优化法其最佳配方，对黑蒜香菇酱进行微生物理化检验，并以市售仲景香菇酱和蒙山红香菇酱作为对比，进行抗氧化性测定。结果表明，最优配方为黑蒜20 g、香菇21 g、小米椒3.6 g、大豆油6.6 g、白糖3.3 g、葱姜蒜各3.3 g、豆瓣酱13.2 g、食盐4.4 g、淀粉4.4 g，此时各项感官品质最好，口感香甜软糯并带有较大的香辣味，色泽鲜明，酱体浓稠度适中，其各项理化指标和微生物均符合国家标准。在0.05~1.00 mL/mL体积浓度范围内，黑蒜香菇酱对DPPH•和•OH清除率均优于市售仲景香菇酱和蒙山红香菇酱，差异显著（P<0.05），表明黑蒜香菇酱是一款具有良好抗氧化性的酱制品，加入0.04%和0.05%的山梨酸钾，开盖后在室温25 ℃下储藏天数达到21 d，为适宜添加量。本研究为黑蒜香菇酱的发展及工业化提供数据参考，以此促进黑蒜的深加工，进一步提升大蒜产业发展，下步工作丰富黑蒜酱制品种类，为早日实现黑蒜酱制品的市场化打下基础。
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图 1 不同原辅料添加量对黑蒜香菇香辣酱感官评分影响的单因素实验结果
注：图a~f为辅料；图g~h为主料；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 1. Single factor experimental results of the effects of different amounts of raw and auxiliary materials on the sensory score of black garlic mushroom paste
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图 2 黑蒜香菇酱的响应面等高线图
Figure 2. Response surface and contour map of black garlic mushroom paste
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图 3 DPPH·和·OH的清除能力
注：不同字母表示清除率差异显著（P<0.05）。
Figure 3. Scavenging ability of DPPH· and·OH radical
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图 4 山梨酸钾添加量对菌落总数和霉菌总数的影响
注：不同字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 4. Effects of potassium sorbate addition on the total number of bacterial colonies and molds
表 1 辅料的正交试验设计因素水平表
Table 1 Orthogonal design of experiments factors and levels table of auxiliary materials
水平 因素 A大豆油（g） B食盐（g） C白糖（g） D豆瓣酱（g） 1 6 2 1 6 2 8 3 2 9 3 10 4 3 12 
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表 2 响应面设计因素水平表
Table 2 Table of response surface methdology factors and levels
水平 因素 E香菇（g） G小米椒（g） H辅料（份） −1 15 3.0 0.5 0 20 3.5 1.0 1 25 4.0 1.5
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表 3 黑蒜香菇酱感官评价标准
Table 3 Sensory evaluation criteria of black garlic lentinus edodes spicy sauce
项目 评定标准 等级 滋味U1
（30分）滋味鲜美，咸淡适中，黑蒜的香甜味以及香菇的鲜味浓厚，辣味
可口，无其他不良滋味（24~30）优V1 滋味较好，咸淡适中，黑蒜的香甜味以及香菇的鲜味适中，辣度
较弱，可口，无其他不良滋味（16~23）良V2 滋味一般，咸淡不适中，黑蒜的香甜味以及香菇的鲜味偏淡，辣味不明显，有轻微的其他异味（9~15） 中V3 滋味较差，咸淡不适中，无辣味或辣味过大，有焦糊味等其他不
良气（≤8）差V4 气味U2
（25分）酱香味较醇厚，有黑蒜的香甜味以及香菇的鲜味，无异味，整体协调（20~25） 优V1 整体气味较协调，黑蒜香甜味以及香菇的鲜味不够突出，稍平淡，无不良气味（14~19） 良V2 酱香味不明显，黑蒜香甜味以及香菇的鲜味不明显，稍有异味（8~13） 中V3 没有酱香味道，有其他不良气味如酸败味或焦糊味（≤7） 差V4 色泽U3
（25分）酱体黄棕色或者红棕色，色泽均匀，油润发亮，明快饱满（20~25） 优V1 酱体颜色稍暗，呈深褐色，色泽不够明亮，较均匀（14~19） 良V2 酱体稍有光泽，不明亮，颜色均匀，但过深或过浅（8~13） 中V3 酱体颜色呈黑褐色，不均匀，无光泽（≤7） 差V4 状态U4
（20分）酱体黏稠适中，颗粒大小均匀，能够清楚的看到香菇颗粒，无多余油脂，无杂质，无分层（15~20） 优V1 酱体稍稠或稍稀，稍有分层，无杂质，有香菇的颗粒，稍有漂浮的油脂，分布较均匀（10~14） 良V2 酱体较稠或较稀，有分层，无杂质，有油脂漂浮，香菇颗粒大小不一，颗粒分布不均匀（5~9） 中V3 酱体过稠或过稀，有分层，有杂质，有大块的香菇，漂浮油脂
较多，颗粒不均匀（≤4）差V4
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表 4 各因素权重分布
Table 4 Weight assignment of each factor
评价指标 各项因素得分 滋味 气味 色泽 状态 总计 权重 滋味U1 10 7 9 9 35 0.35 气味U2 3 10 7 6 26 0.26 色泽U3 1 3 10 5 19 0.19 状态U4 1 4 5 10 20 0.20
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表 5 正交试验各因素票数
Table 5 Number of votes for each factor of orthogonal test
序号 滋味 气味 色泽 状态 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 1 4 3 1 2 3 3 2 2 3 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 2 1 3 2 2 3 3 3 1 3 3 2 2 3 3 6 2 2 0 5 1 4 0 6 4 0 0 5 5 0 0 4 4 3 2 1 3 2 4 1 3 4 1 2 4 2 3 1 5 3 3 3 1 2 3 2 3 2 3 3 2 3 3 2 2 6 2 3 2 3 2 4 2 2 3 3 2 2 4 3 2 1 7 2 2 1 5 2 3 2 3 3 2 4 1 3 3 2 2 8 4 3 2 1 4 3 1 2 4 2 1 3 4 2 2 2 9 4 3 2 1 3 4 1 2 4 2 2 1 4 2 2 2
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表 6 正交试验结果分析
Table 6 Analysis of orthogonal expenimental results
因素 A 大豆油 B 食盐 C 白糖 D 豆瓣酱 感官评分 1 1 1 1 1 76.7 2 1 2 2 2 77.3 3 1 3 3 3 83.8 4 2 1 2 3 78.6 5 2 2 3 1 76.2 6 2 3 1 2 76.2 7 3 1 3 2 74.1 8 3 2 1 3 78.7 9 3 3 2 1 77.5 K1 237.8 229.4 231.6 230.4 K2 231.0 232.2 233.4 227.6 K3 230.3 237.5 234.1 241.1 k1 79.3 76.5 77.2 76.8 k2 77.0 77.5 77.4 75.9 k3 76.8 79.2 78.2 80.4 极差R 2.5 2.7 1.0 4.5 较优水平 A1B3C3D3 因素影响大小 D>B>A>C
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表 7 正交试验方差分析
Table 7 Anova of orthogonal experiments
源 III型平方和 df 均方 F值 P值 校正模型 169.140a 8 21.143 23.196 0.000 截距 163893.813 1 163893.813 179810.360 0.000 A 35.607 2 17.303 19.081 0.000 B 36.616 2 18.308 20.086 0.000 C 4.542 2 2.271 2.492 0.001 D 91.376 2 45.688 50.125 0.000 误差 16.407 18 0.911 总计 164079.360 27 校正的总计 185.547 26 R2=0.912，Radj2=0.872 注：“*”表示对结果影响显著（P<0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P<0.01）。
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表 8 响应面各因素评价票数
Table 8 Number of evaluation votes for each factor of response surface
序号 滋味 气味 色泽 状态 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 优 良 中 差 1 9 1 0 0 9 1 0 0 9 0 1 0 9 1 0 0 2 5 2 2 1 4 2 2 2 4 2 3 1 5 2 3 0 3 7 3 0 0 7 2 1 0 7 3 0 0 10 0 0 0 4 9 1 0 0 8 2 0 0 9 1 0 0 9 1 0 0 5 10 0 0 0 9 1 0 0 9 1 0 0 9 1 0 0 6 3 3 2 2 3 2 2 3 2 3 4 1 3 3 3 1 7 5 3 1 1 6 3 1 0 5 2 3 0 4 4 1 1 8 3 1 4 2 2 2 3 3 3 2 3 2 2 2 4 2 9 4 2 2 2 3 3 3 1 3 2 3 2 3 3 3 1 10 5 3 2 0 4 3 2 1 3 3 3 1 3 2 4 1 11 4 4 2 0 3 4 2 1 3 3 3 1 3 2 4 1 12 10 0 0 0 9 1 0 0 8 2 0 0 10 0 0 0 13 6 2 1 1 6 1 2 1 5 3 1 1 5 2 2 1 14 3 3 2 2 2 3 3 2 3 3 3 1 2 3 2 3 15 2 1 2 5 2 2 1 5 2 2 1 5 2 1 2 5 16 5 2 2 1 5 2 1 2 5 2 1 2 3 4 2 1 17 5 2 3 0 4 2 3 1 5 2 2 1 5 2 2 1
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表 9 响应面试验设计与结果
Table 9 Response surface experimental design and results
试验号 E G H Y感官评分 1 0 0 0 88.81 2 −1 1 0 80.00 3 0 0 0 87.34 4 0 0 0 88.74 5 0 0 0 89.00 6 1 0 −1 76.49 7 1 0 1 82.58 8 1 1 0 74.47 9 −1 0 −1 77.62 10 0 −1 −1 80.07 11 1 −1 0 79.46 12 0 0 0 89.36 13 −1 0 1 81.15 14 −1 −1 0 76.07 15 0 1 −1 70.56 16 0 −1 1 80.15 17 0 1 1 80.83
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表 10 响应面回归模拟的方差分析
Table 10 Analysis of variance of response surface regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 785.60 9 87.29 43.91 <0.0001 ** E 0.60 1 0.60 0.30 0.5999 G 12.78 1 12.78 6.43 0.0389 * H 53.15 1 53.15 26.74 0.0013 ** EG 20.07 1 20.07 10.10 0.0155 * EH 2.24 1 2.24 1.12 0.3242 GH 26.88 1 26.88 13.53 0.0079 ** E2 174.33 1 174.33 87.70 <0.0001 ** G2 267.42 1 267.42 134.54 <0.0001 ** H2 158.84 1 158.84 79.91 <0.0001 ** 残差 13.91 7 1.99 失拟项 8.85 3 2.95 2.33 0.2160 纯误差 5.07 4 1.27 总离差 799.51 16 R2=0.9826，Radj2= 0.9602 C.V.%=1.71 注：“*”表示对结果影响显著（P<0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P<0.01）。
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表 11 理化和微生物检测结果
Table 11 Physicochemical and microbiological test results
序号 测定项目 测定结果 GB 31644-2018
《食品安全国家标准
复合调味料》要求是否符合
国家要求1 水分含量 20.6 g/100 g <65 g/100 g 符合 2 总酸含量 2.01 g/100 g <4 g/kg 符合 3 菌落总数 <104 CFU/g 104 CFU/g 符合 4 霉菌总数 <103 CFU/g <103 CFU/g 符合 5 微生物大肠
菌群计数未检出 无 符合 6 亚硝酸盐含量 1.08 mg/kg <20 mg/kg 符合 7 氨基酸氮含量 2.58 g/100 g 无 符合 8 食盐含量（NaCl计） 13.5 g/100 g >12 g/100 g 符合
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