Preparation of Herbal Tea Fermented by Lactobacillus from Lonicera japonica leaves and Analysis of Its Antioxidant Activity
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摘要: 为获得一款具强抗氧化活性的高保健性金银花叶发酵凉茶，以金银花叶为原材料，通过单因素实验和正交试验，研究了发酵时间、发酵温度、保加利亚乳酸杆菌（L. plantarum 758）接种量及糖的添加量（葡萄糖与蔗糖质量比为3:2）对金银花叶凉茶抗氧化活性的影响并对工艺条件进行了优化，还对比了金银花叶凉茶与市场上常见三种凉茶在抗氧化性及挥发性成分上的差异。结果表明，乳酸杆菌发酵金银花叶凉茶的最佳发酵条件为：发酵时间24 h、发酵温度38 ℃、接种量4%及糖添加量7%，在此发酵条件下所获得的金银花叶凉茶绿原酸含量达到7.11%，总黄酮含量为22.51%，DPPH自由基清除率为84.23%±3.32%，ABTS自由基清除率为85.30%±2.14%，均显著高于市场上的三种凉茶（P<0.05）；金银花叶凉茶中共有挥发性物质32种，其种类和含量都较其它对比组高。总体表明，保加利亚乳酸杆菌（L. plantarum 758）发酵的金银花叶凉茶抗氧化能力突出，具有较高的营养价值和实用功能性。Abstract: In order to obtain a kind of Lonicera japonica leaves herbal tea with strong antioxidant activity and high health care, an orthogonal array design based on single factor experiments was employed to examine the influence of time, temperature, inoculum amount of L. plantarum 758 and the concentration of sugar (The mass ratio of glucose to sucrose was 3:2) on the fermentation process. The antioxidant and volatile components of Lonicera japonica leaves herbal tea were compared with those of three common herbal tea in the market. Results showed that the optimal fermentation conditions were determined as fermentation of Lonicera japonica leaves extract containing 7% sugar added at 38 ℃ for 24 h with an inoculum amount of 4%. Under these conditions, the chlorogenic acid content of Lonicera japonica leaves herbal tea reached 7.11%, the total flavonoids content was 22.51%, the DPPH free radical clearance rate was 84.23%±3.32%, and the ABTS free radical clearance rate was 85.30%±2.14%, which were significantly higher than those of the three kinds of herbal tea on the market (P<0.05). There were 32 kinds of volatile substances in Lonicera japonica leaves herbal tea, and their types and contents were higher than those in other comparison groups. Overall, the antioxidant capacity of Lonicera japonica leaves herbal tea fermented by L.plantarum 758 is outstanding, and it has higher nutritional value and practical function.
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金银花，又名忍冬花、银花、金银藤，是忍冬科忍冬属多年生藤本植物[1-2]。金银花作为常见的药食同源类植物之一，具有抑菌抗病毒[3-4]、调节免疫系统[5]、降低血脂[6]、解热消炎[7]、抗氧化及止血等功效[8]，但其花产量低且金银花性寒[9]。金银花的副产物——金银花叶，具有易采集、产量大、活性成分丰富等优点[10]，但金银花叶作为金银花的非药用部位，其在生活中未得到充分利用[11]。据报道，金银花叶富含绿原酸、黄酮、萜类等活性成分[12]，且黄酮含量尤为丰富，金银花叶中黄酮含量是花中黄酮含量的2.78倍[13]。因此，对金银花叶的开发应用具有重要的社会效益和经济价值[14]。乳酸菌作为人体肠道的正常菌群[15]，具有维持肠道菌群生态平衡[16]、提高免疫力[17]、抗病毒及消炎[18]等功效。
目前，党参[19]、黑枸杞[20]等营养丰富、好喝、易吸收的新型乳酸菌饮料快速发展并被大众喜爱。随着乳酸菌应用于饮料加工的不断深入，寻求将乳酸菌应用于金银花凉茶发酵，不仅能丰富凉茶口感及色泽，还能赋予凉茶特殊的营养成分[21]，从而增强其保健功效。已有大量研究将金银花作为原材料制作凉茶。如陈康等[21]研制了植物乳杆菌PMO发酵金银花凉茶，卢超等[22]采用金银花、枸杞和菊花为原料制得一款金银花茶饮，但将金银花叶制作凉茶还鲜有研究，对金银花叶凉茶品质也有待考究。
因此，本研究以金银花叶为原材料，采用本实验室筛选、驯化的优质保加利亚乳酸杆菌进行金银花叶凉茶的发酵，对乳酸菌发酵金银花叶凉茶发酵条件进行优化，旨在开发一款兼具高抗氧化活性和高保健性能的金银花叶凉茶饮料，为提高金银花叶的附加产值提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
金银花 宜宾市售；茶样1～3 购置于四川省宜宾市绿源超市；脱脂乳粉 内蒙古蒙牛乳业股份有限公司；保加利亚乳酸杆菌（L. plantarum 758） 四川轻化工大学实验室提供；MRS培养基 北京索莱宝科技有限公司；绿原酸标准品（纯度≥98%） 四川九州通医药有限公司；DPPH标准品 合肥博美生物科技有限公司。
PMHG恒温电热鼓风干燥机 普若迈德有限公司；M383907数显恒温水浴锅 金坛市晶玻实验仪器厂；UV-1800紫外可见分光光度计 翱艺仪器有限公司；TGL-21台式高速多功能冷冻离心机 上海百典仪器设备有限公司；SS-322高压蒸汽灭菌锅 奥豪斯仪器有限公司；PHS-3C酸度计 金坛市晶玻实验仪器厂；7890A气相色谱仪 四川蜀科仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程
金银花叶洗净、烘干→除去枝干粉碎→以1:60的料水比于80 ℃水浴40 min→抽滤→调节pH→灭菌→冷却至室温后接种驯化后的保加利亚乳酸杆菌→发酵。
1.2.2 操作要点
1.2.2.1 金银花叶浸提液的制备
挑选完整饱满无坏死的金银花叶，除去枝干放入高速粉碎机粉碎10 min，用粉碎机粉碎后的金银花叶以1:60的料水比于80 ℃水浴40 min（此条件由前期实验获得），于抽滤机下抽滤，放于4 ℃冰箱备用。
1.2.2.2 乳酸菌的活化与驯化
配制MRS液体培养基，在高压蒸汽灭菌锅中灭菌冷却后，接种筛选后的乳酸菌后置于37 ℃恒温培养箱培养36 h，发现锥形瓶底部有沉淀产生，活化成功，将活化好的菌种放入冰箱备用。在35 ℃条件下将活化好的菌种按照表1配制的培养基进行逐步驯化。
表 1 驯化培养基的制备Table 1. Preparation of domestication medium培养编号 1 2 3 4 5 6 金银花叶浸提液添加量 0 10% 20% 30% 40% 50% 10%脱脂乳粉添加量 50% 40% 30% 20% 10% 0 注：培养基中按葡萄糖:蔗糖=3:2的比例添加6%的糖。 1.2.2.3 接种、发酵及冷藏
调节金银花叶浸提液pH至6.4，用高压蒸汽灭菌锅灭菌20 min，冷却至室温后接种保加利亚乳酸杆菌发酵剂，放入37 ℃恒温培养箱中培养发酵24 h后置于4 ℃冰箱中冷藏。
1.2.3 乳酸菌发酵金银花叶凉茶单因素实验
1.2.3.1 发酵时间对金银花叶凉茶发酵的影响
取4只100 mL三角瓶，依加入金银花浸提液50 mL，添加6%的糖，高压蒸汽灭菌20 min，冷却后接种3%的乳酸菌发酵剂，放入37 ℃恒温培养箱分别培养12、24、36、48 h。培养完成后放入冰箱冷藏保存。
1.2.3.2 发酵温度对金银花叶凉茶发酵的影响
取4只三角瓶，依次加入金银花浸提液50 mL，添加6%的糖，高压蒸汽灭菌20 min，冷却后接种3%的乳酸菌发酵剂，分别放入35、37、39、41 ℃的培养箱中培养24 h。培养完成后放入冰箱冷藏保存。
1.2.3.3 乳酸菌接种量对金银花叶凉茶发酵的影响
取6只三角瓶，依次加入金银花浸提液50 mL，添加6%的糖，高压蒸汽灭菌20 min，冷却后分别接种1%、2%、3%、4%、5%、6%的乳酸菌发酵剂，放入37 ℃的培养箱中培养24 h。培养完成后放入冰箱冷藏保存。
1.2.3.4 糖添加量对金银花叶凉茶发酵的影响
取5只三角瓶，依次加入金银花浸提液50 mL，分别添加2%、4%、6%、8%、10%的糖（葡萄糖:蔗糖=3:2），高压蒸汽灭菌20 min，冷却后接种3%的乳酸菌发酵剂，放入37 ℃的培养箱中培养24 h。培养完成后放入冰箱冷藏保存。
1.2.3.5 金银花叶凉茶发酵工艺条件的优化
以金银花叶凉茶乳酸含量和DPPH自由基清除率为考察指标，选取发酵时间、发酵温度、接种量、糖添加量为主要影响因素，进行L9（34）正交试验。正交试验因素与水平表见表2。
表 2 正交试验因素与水平Table 2. Factors and levels of orthogonal design水平 A发酵时间（h） B发酵温度（℃） C接种量（%） D糖添加量（%） 1 22 36 2 5 2 24 37 3 6 3 26 38 4 7 1.2.4 乳酸含量
乳酸含量参照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。
1.2.5 金银花叶发酵凉茶体外抗氧化能力的测定
本实验通过测定DPPH自由基清除率及ABTS自由基清除率反映发酵液的抗氧化能力。
DPPH自由基清除率测定：配制浓度为0.0178 mmol/L的DPPH储备液，吸取2 mL DPPH溶液和2 mL无水乙醇在室温下避光静置30 min，在517 nm处测得其吸光值为A，以2 mL样品溶液和2 mL DPPH溶液在室温下避光静置30 min，在517 nm处测得吸光值为Ai，以2 mL样品溶液和2 mL无水乙醇溶液在室温下避光静置30 min，在517 nm处测得吸光值为Aj。DPPH自由基清除率按照公式（1）进行计算：
K(%)=[A−(Ai−Aj)]A×100 (1) ABTS自由基清除率测定：将配制好的7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的过硫酸钾等体积混合，避光静置过夜，形成ABTS自由基储备液并用0.01 mol/L的磷酸缓冲液（pH7.4）稀释，使其在734 nm下吸光度为0.70±0.02。吸取1 mL待测样品与3 mL ABTS自由基工作液，混合10 s后立即置于暗处准确反应6 min，在734 nm波长下测定吸光度（A样品）。同时，以等量蒸馏水代替样品作空白对照实验（A空白）。
ABTS自由基清除率(%)=(A空白−A样品)A空白×100 (2) 1.2.6 金银花叶发酵凉茶绿原酸及总黄酮含量测定
参照马懿等[23]所述研究方法分别对金银花叶凉茶及购买的三种市场凉茶进行绿原酸含量测定，在322 nm处测定最大吸光度值并绘制标准曲线，线性回归方程为：Y=0.6068X+0.232（R2=0.9997）。
参照许陈思菡等[24]所述硝酸铝法进行总黄酮含量测定，在324 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，线性回归方程为：y=82.00x−0.0078（R2=0.9993）。
1.2.7 挥发性物质的测定（SPME-GC-MS）
采用刁体伟等[25]描述的顶空固相微萃取-气质联用法（solid phase micro-extraction gas chromatography mass spectrometry，SPME-GC-MS）并加以改进用于测定样品挥发性物质。在15 mL顶空瓶中准确加入8.0 mL样茶，并加入1 g NaCl。茶样在45 ℃条件下预热10 min后，将老化后的微萃取头插入顶空瓶中，同时推出纤维头（距离茶液面1.5 cm），于顶空位置吸附35 min，吸附后，收回纤维头并迅速送至GC送样口，在250 ℃热解析3 min。GC条件：DB-WAX毛线管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为250 ℃；采用不分流进样模式；程序升温：初始温度40 ℃，保留5 min，以2 ℃/min升温至60 ℃，以5 ℃/min升温至180 ℃，保留5 min，以10 ℃/min升温至230 ℃，保留10 min；载气为高纯氦气，恒定流速1.2 mL/min。
MS条件：电子轰击电离源（EI），离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，采集模式为全扫描，MS四极杆温度150 ℃，溶剂延迟3 min。
挥发性物质定性定量：色谱峰对应的质谱通过与NIST/Wiley Database进行检索比对，保留匹配度大于80%的鉴定结果。通过内标物（2-辛醇）的峰面积和茶样中各组分的峰面积比值，计算各个组分的质量浓度。
1.2.8 感官品评
参照陈康等[21]所述方法进行感官品评。感官评价由10名经过培训的评估小组完成（5名女性和5名男性，平均年龄25岁，所有小组成员在饮料相关领域都有超过2年的经验）。在整个感官分析过程中，样品在标准感官室（EN ISO，8586）中进行评估。
1.3 数据处理
所有实验均重复测定3次，数据采用平均值（Mean）±标准差（SD）表示。SPSS软件用于统计分析与方差分析（Duncan检验，P<0.05表示显著差异），采用Origin 2018进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 金银花叶凉茶发酵的单因素实验结果
2.1.1 发酵时间对金银花叶凉茶发酵的影响
由图1可知，发酵时间的长短决定了发酵液中乳酸的含量，发酵时间过短，发酵过程中产生的乳酸累积量较少，整体口感和风味较差，而发酵时间过长，会造成乳酸大量积累，不利于乳酸菌的生长繁殖；且发酵时间的延长不仅增加了生产成本也会导致大量代谢副产物的积累，从而影响凉茶整体质量[26]；发酵时间越长，发酵凉茶的DPPH自由基清除率越高，凉茶抗氧化能力越强，作为保健品的效果越好。但考虑实际生产成本及综合凉茶品质，从本实验可知发酵时间最好设置为24 h，以确保兼具口感和保健效果。
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图 1 发酵时间对金银花叶发酵凉茶乳酸含量及DPPH自由基清除率的影响Figure 1. Effect of fermentation time on lactic acid content and DPPH free radical clearance rate of Lonicera japonica leaf fermented herbal tea2.1.2 发酵温度对金银花叶凉茶发酵的影响
由图2可知，发酵温度过高或者过低都会抑制乳酸菌的活性[27]，导致发酵凉茶的乳酸含量降低，且温度过高或过低都会降低凉茶抗氧化活性，作为保健品的保健效果也会降低。因此，在生产过程中要严格控制发酵温度，研究表明，35 ℃较接近乳酸菌生长的最适温度，此时在发酵凉茶中生长旺盛。但较高的发酵温度可增强乳酸菌的产酸能力，在短时间积累足够的酸度，从而缩短发酵时间[28]。综合考虑，发酵温度最好控制在37 ℃，此时乳酸菌活性相对较高，发酵液抗氧化活性最强。
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图 2 发酵温度对金银花叶发酵凉茶乳酸含量及DPPH自由基清除率的影响Figure 2. Effect of fermentation temperature on lactic acid content and DPPH free radical clearance rate of Lonicera japonica leaf fermented herbal tea2.1.3 乳酸菌接种量对金银花叶凉茶发酵的影响
乳酸菌接种量的多少在一定程度范围内决定了其产酸速率[29]。有研究表明，乳酸菌接种量过低形成的环境不利于发挥纯菌种生长优势，从而影响产酸[30]；而接种量过高，酸度急剧上升，不利于风味物质的生成，只有适中的接种量才能加快产酸速率的同时形成最佳风味。由图3也可看出，接种量对金银花发酵凉茶的品质有一定影响，特别是接种量过低时，乳酸产量和DPPH自由基清除率都明显降低，但是接种量过高又会导致乳酸含量过多，故在生产过程中乳酸菌的接种量应该合理控制。由本实验可知，最佳乳酸菌接种量为3%。
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图 3 乳酸菌接种量对金银花叶发酵凉茶乳酸含量及DPPH自由基清除率的影响Figure 3. Effect of inoculation amount of lactic acid bacteria on lactic acid content and DPPH free radical clearance rate of Lonicera japonica leaf fermented herbal tea2.1.4 糖添加量对金银花叶凉茶发酵的影响
糖不仅提供乳酸菌生长的碳源[31]，还可防止茶饮料中蛋白质聚沉现象。由图4可知，乳酸含量随着糖添加量增加呈现先增加后降低的趋势，糖添加量为6%时，乳酸含量达到最大值。较低的糖添加量无法为乳酸菌提供充足的营养，而当糖添加量到6%后，过高的糖添加量反而会抑制乳酸菌的生长繁殖。发酵液DPPH自由基清除率与乳酸含量变化趋势基本一致，较低糖添加量时，凉茶DPPH自由基清除率处于一个较低的水平，故在生产中需要控制适当的糖添加量，使乳酸菌的发酵处于较活跃的水平。综上，6%的糖添加量为最适糖添加量。
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图 4 糖添加量对金银花叶发酵凉茶乳酸含量及DPPH自由基清除率的影响Figure 4. Effect of sugar content on lactic acid content and DPPH free radical clearance rate of Lonicera japonica leaf fermented herbal tea2.2 金银花叶凉茶发酵工艺条件的优化
以乳酸含量和DPPH自由基清除率为正交试验考核指标，通过直观分析法，由表3中乳酸含量极值R可知，影响金银花叶发酵凉茶的因素主次顺序为：接种量（C）>发酵温度（B）>发酵时间（A）>糖添加量（D）；理论最优组合为：A3B3C3D2。
表 3 金银花叶凉茶发酵工艺条件正交试验设计及结果Table 3. Orthogonal experimental design and results of Lonicera japonica leaves herbal tea fermentation试验号 A发酵
时间B发酵
温度C接种量 D糖添
加量乳酸含
量（%）DPPH自由基
清除率（%）1 1 1 1 1 0.53 78.10 2 1 2 2 2 0.49 79.30 3 1 3 3 3 0.58 80.40 4 2 1 2 3 0.44 80.10 5 2 2 3 1 0.50 80.49 6 2 3 1 2 0.54 79.76 7 3 1 3 2 0.55 79.61 8 3 2 1 3 0.52 78.34 9 3 3 2 1 0.51 79.02 乳酸含量 k1 0.517 0.490 0.513 0.497 k2 0.493 0.503 0.480 0.527 k3 0.527 0.543 0.543 0.513 R 0.034 0.053 0.063 0.030 DPPH自由
基清除率k1 79.267 79.267 78.733 79.200 k2 80.133 79.367 79.467 79.567 k3 78.967 79.733 80.167 79.600 R 1.166 0.466 1.434 0.400 由表3中DPPH自由基清除率极值R可知，影响金银花叶凉茶发酵因素的主次顺序为：接种量（C）>发酵时间（A）>发酵温度（B）>糖添加量（D）；理论最优组合为：A2B3C3D3。
由于两组理论最优组合均不在表3的9组试验中，因此，对A3B3C3D2、A2B3C3D3及表中直观最优组合A2B2C3D1分别进行验证实验，采用A3B3C3D2进行验证实验，测得金银花叶发酵凉茶乳酸含量为0.56%，DPPH自由基清除率为80.41%±2.14%；采用A2B3C3D3进行验证实验，测得金银花叶发酵凉茶乳酸含量为0.58%，DPPH自由基清除率为82.15%±2.45%；采用A2B2C3D1进行验证实验，测得金银花叶发酵凉茶乳酸含量为0.55%，DPPH自由基清除率为80.94%。因此，金银花叶发酵凉茶最优工艺组合为A2B3C3D3，即发酵时间为24 h，发酵温度为38 ℃，接种量为4%，糖添加量为7%。
2.3 活性成分与抗氧化性结果
绿原酸是金银花的代表性酚酸类药效成分[32]，作为含量最高的有机酸，其奠定了金银花抑菌消炎等保健基础[33]。金银花中总黄酮是其发挥清除自由基、抗氧化作用的主要功能物质，具有天然、无毒、抗衰老等优点。DPPH是一种具有3个苯环结构的人工合成的稳定自由基，易溶于乙醇溶液并在其中呈紫红色，于517 nm左右处有最大吸收。当与自由基清除剂共存时，DPPH的颜色会减退，其褪色程度与自由基清除剂的清除能力及数量存在定量关系。由于DPPH法稳定性好、操作方便，目前已广泛应用于体外抗氧化性评价。由于反应机制和特性差异，通常需要使用两种及以上方法来测定抗氧化能力。
因此，本实验对比了金银花叶凉茶与市场上三种凉茶绿原酸、总黄酮含量与抗氧化活性来判断金银花叶凉茶的品质。由表4可知，绿原酸含量及抗氧化活性均为金银花叶凉茶>市场茶2>市场茶1>市场茶3，且差异显著（P<0.05），说明本研究金银花叶凉茶中活性成分相对较多，品质较好。
表 4 金银花叶凉茶与市场上三种凉茶活性成分与抗氧化活性对比Table 4. Comparison of active ingredients and antioxidant activities between Lonicera japonica leaves herbal tea and three kinds of herbal tea on the market种类 绿原酸
（%）总黄酮
（%）DPPH自由基
清除率（%）ABTS自由基
清除率（%）金银花叶凉茶 7.11±0.01a 22.51±1.52a 84.23±3.32a 85.30±2.14a 茶1 5.32±0.02c 17.42±1.34b 65.23±2.10c 78.41±2.35c 茶2 5.67±0.01b 17.28±1.60b 73.29±2.54b 80.12±2.03b 茶3 3.66±0.03d 12.66±1.22c 60.86±2.33d 75.38±1.98d 注：表中同一列不同字母代表差异显著（P<0.05）。 2.4 活性成分与抗氧化性相关性分析
由图5可知，金银花叶凉茶中绿原酸及总黄酮含量都与DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率呈正相关关系，相关系数均大于0.9，表明绿原酸与黄酮类物质都属于金银花叶凉茶中有效抗氧化活性成分，金银花叶凉茶抗氧化活性的增加一部分原因是绿原酸、总黄酮等物质含量增加导致。
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图 5 绿原酸含量、总黄酮含量与DPPH自由基、ABTS自由基清除率的相关性分析Figure 5. Correlation analysis of chlorogenic acid content, total flavonoids content and DPPH, ABTS free radical clearance rate2.5 香气成分的测定
选取本研究与市面中不同抗氧化能力和营养物质含量的四组茶（金银花叶茶、茶1、茶2、茶3）挥作发性成分比较。结果如表5所示，四组金银花叶茶中挥发性物质共检出42种，主要分为5类（醇类、酯类、酸类、醛酮类、烷类），其中酯类和醇类是茶样中主要挥发性物质。本研究的金银花叶凉茶中共检测挥发性物质32种，茶1组26种，茶2组22种，茶3组17种。四组茶的差异性可能是因为不同发酵方式和处理工艺导致挥发性成分种类不一致。总体而言，金银花叶凉茶挥发性物质种类和含量较多，抗氧化能力突出，优于选取的三种市面茶种类，具有很好的营养价值和实用性，是一款功能性饮用茶。
表 5 金银花叶凉茶与市场上三种凉茶挥发性成分比较Table 5. Comparison of volatile components between Lonicera japonica leaves herbal tea and three kinds of herbal tea on the market序号 挥发性化合物 金银花叶茶
（mg/L）茶1
（mg/L）茶2
（mg/L）茶3
（mg/L）A1 3-甲硫基丙醇 3.34 3.40 3.44 3.44 A2 苯乙醇 3.28 3.14 3.24 3.28 A3 1-辛醇 3.23 3.08 3.23 3.23 A4 2,3-丁二醇 − 3.23 3.08 6.45 A5 2-乙基己醇 2.94 − − 2.94 A6 苯甲醇 3.31 − − − A7 1-壬醇 3.19 − − − A8 丙醇 2.76 − − − A9 新薄荷醇 2.76 − − − A10 正己醇 1.78 − − − A11 （R）-1,2-丙二醇 − 3.05 − − A12 正丁醇 − 1.71 − − A13 3-甲基-1-戊醇 − − 3.05 − A14 庚酸乙酯 3.10 3.28 3.34 2.76 A15 辛酸乙酯 2.67 2.67 2.67 5.71 A16 正己酸乙酯 2.05 2.03 2.03 1.78 A17 乙酸异戊酯 1.93 1.93 1.93 1.78 A18 癸酸乙酯 3.31 3.38 3.38 − A19 月桂酸乙酯 2.01 2.10 2.08 − A20 棕榈酸乙酯 1.99 2.08 1.99 − A21 乙酸乙酯 3.89 − 3.89 3.77 A22 乙酸苯乙酯 1.93 1.93 − 1.93 A23 壬酸乙酯 2.49 2.92 − − A24 乙酸己酯 − 1.84 1.84 − A25 反式-2-己烯酸乙酯 2.79 − − − A26 乙酸苄酯 2.05 − − − A27 癸酸3-甲基丁酯 − 2.76 − − A28 丙酸-2-苯乙酯 − − 2.86 − A29 乙酸 1.93 1.95 1.95 1.95 A30 辛酸 2.80 2.80 − 2.46 A31 苯甲酸 6.00 − − − A32 癸酸 − 2.76 − − A33 2-甲基四氢噻吩-3-酮 − 3.37 − A34 十二甲基环六硅氧烷 5.75 2.86 2.67 2.55 A35 六甲基环三硅氧烷 2.80 8.29 5.97 5.97 A36 十甲基环五硅氧烷 2.67 5.59 2.80 5.31 A37 十四烷 5.68 2.49 2.80 − A38 十二烷 2.95 − 8.29 5.28 A39 八甲基环四硅氧烷 2.97 3.10 − − A40 十六烷 − 2.80 − − A41 二十七烷 3.10 − − − A42 2-亚甲基戊二腈 2.87 − − − 采用主成分分析（principal component analysis）的方法对各组茶挥发性成分进行直观分析。由表6可知，主成分1、2累积贡献率达到76.9%，表明主要的香气成分得到了保留，可以反映原始变量的主要信息。PC1 解释了 44.9% 的变异，PC2 解释了 32.0% 的变异，由图6可知，四种凉茶香气成分明显不同，其中茶2、茶3距离比较近，说明这两种产品的相似程度较高，而茶1和金银花叶茶与其他两种产品相距较远，说明茶1和金银花叶茶香气成分较为独特，这可能是由于它们含有的挥发性成分总量较大及种类较多的原因[34]。2-乙基己醇、苯甲醇、1-壬醇、丙醇、新薄荷醇、正己醇是金银花叶茶中特征性醇类物质；反式-2-己烯酸乙酯、乙酸苄酯是金银花叶茶中特征性酯类物质；苯甲酸及二十七烷、2-亚甲基戊二腈等共同构成金银花叶茶特征性风味成分。
表 6 金银花叶凉茶主成分特征值及贡献率Table 6. Characteristic values and contribution rates of principal components of Lonicera japonica leaves herbal tea主成分 特征值 贡献率（%） 1 13.44 44.9 2 9.70 32.0 ![]()
图 6 金银花叶凉茶挥发性成分主成分分析Figure 6. Principal component analysis of volatile components of Lonicera japonica leaves herbal tea2.6 感官品评
分别从口感、色泽及香气三个方面对金银花叶凉茶及茶1、茶2、茶3进行了感官品评。结果如图7所示。可看出，本研究金银花叶凉茶感官品评分数最高，达到了85分，这可能与乳酸菌发酵改善凉茶口感及色泽有关。
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图 7 金银花叶凉茶感官品评注：图中不同小写字母表示差异显著P<0.05。Figure 7. Sensory evaluation of Lonicera japonica leaves herbal tea3. 讨论与结论
本研究首先按照料水比1:60、浸提温度80 ℃、浸提时间40 min的浸提条件制备金银花叶浸提液，将保加利亚乳酸杆菌（L. plantarum 758）进行渐进驯化培养并用于金银花叶凉茶发酵。以DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、乳酸含量为指标，利用直观分析法，分析了发酵工艺中发酵时间、发酵温度、乳酸菌接种量和糖添加量对金银花发酵凉茶工艺的影响并进行了正交工艺优化。得到最优工艺组合为：发酵时间24 h、发酵温度38 ℃、接种量4%及糖添加量7%。此时，金银花叶凉茶绿原酸含量达到7.11%，总黄酮含量为22.51%，DPPH自由基清除率为84.23%±3.32%，ABTS自由基清除率为85.30%±2.14%，均显著高于市场上的三种凉茶（P<0.05）；金银花叶凉茶中挥发性物质种类（32种）及含量均高于选取的茶一（26种），茶2（22种），茶3（17种），表明按此工艺获得的金银花叶乳酸杆菌发酵叶凉茶具有良好的保健功能与酸甜适宜的口感。
在今后的研究中，可考虑采用两种或两种以上微生物混合发酵金银花叶浸提液，利用混菌发酵的协同增效作用，研究混菌发酵对金银花叶凉茶营养成分、风味物质的改善作用，本研究利用金银花叶发酵凉茶为提高金银花叶的附加产值提供新思考。
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图 1 发酵时间对金银花叶发酵凉茶乳酸含量及DPPH自由基清除率的影响
Figure 1. Effect of fermentation time on lactic acid content and DPPH free radical clearance rate of Lonicera japonica leaf fermented herbal tea
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图 2 发酵温度对金银花叶发酵凉茶乳酸含量及DPPH自由基清除率的影响
Figure 2. Effect of fermentation temperature on lactic acid content and DPPH free radical clearance rate of Lonicera japonica leaf fermented herbal tea
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图 3 乳酸菌接种量对金银花叶发酵凉茶乳酸含量及DPPH自由基清除率的影响
Figure 3. Effect of inoculation amount of lactic acid bacteria on lactic acid content and DPPH free radical clearance rate of Lonicera japonica leaf fermented herbal tea
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图 4 糖添加量对金银花叶发酵凉茶乳酸含量及DPPH自由基清除率的影响
Figure 4. Effect of sugar content on lactic acid content and DPPH free radical clearance rate of Lonicera japonica leaf fermented herbal tea
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图 5 绿原酸含量、总黄酮含量与DPPH自由基、ABTS自由基清除率的相关性分析
Figure 5. Correlation analysis of chlorogenic acid content, total flavonoids content and DPPH, ABTS free radical clearance rate
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图 6 金银花叶凉茶挥发性成分主成分分析
Figure 6. Principal component analysis of volatile components of Lonicera japonica leaves herbal tea
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图 7 金银花叶凉茶感官品评
注：图中不同小写字母表示差异显著P<0.05。
Figure 7. Sensory evaluation of Lonicera japonica leaves herbal tea
表 1 驯化培养基的制备
Table 1 Preparation of domestication medium
培养编号 1 2 3 4 5 6 金银花叶浸提液添加量 0 10% 20% 30% 40% 50% 10%脱脂乳粉添加量 50% 40% 30% 20% 10% 0 注：培养基中按葡萄糖:蔗糖=3:2的比例添加6%的糖。 
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表 2 正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal design
水平 A发酵时间（h） B发酵温度（℃） C接种量（%） D糖添加量（%） 1 22 36 2 5 2 24 37 3 6 3 26 38 4 7
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表 3 金银花叶凉茶发酵工艺条件正交试验设计及结果
Table 3 Orthogonal experimental design and results of Lonicera japonica leaves herbal tea fermentation
试验号 A发酵
时间B发酵
温度C接种量 D糖添
加量乳酸含
量（%）DPPH自由基
清除率（%）1 1 1 1 1 0.53 78.10 2 1 2 2 2 0.49 79.30 3 1 3 3 3 0.58 80.40 4 2 1 2 3 0.44 80.10 5 2 2 3 1 0.50 80.49 6 2 3 1 2 0.54 79.76 7 3 1 3 2 0.55 79.61 8 3 2 1 3 0.52 78.34 9 3 3 2 1 0.51 79.02 乳酸含量 k1 0.517 0.490 0.513 0.497 k2 0.493 0.503 0.480 0.527 k3 0.527 0.543 0.543 0.513 R 0.034 0.053 0.063 0.030 DPPH自由
基清除率k1 79.267 79.267 78.733 79.200 k2 80.133 79.367 79.467 79.567 k3 78.967 79.733 80.167 79.600 R 1.166 0.466 1.434 0.400
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表 4 金银花叶凉茶与市场上三种凉茶活性成分与抗氧化活性对比
Table 4 Comparison of active ingredients and antioxidant activities between Lonicera japonica leaves herbal tea and three kinds of herbal tea on the market
种类 绿原酸
（%）总黄酮
（%）DPPH自由基
清除率（%）ABTS自由基
清除率（%）金银花叶凉茶 7.11±0.01a 22.51±1.52a 84.23±3.32a 85.30±2.14a 茶1 5.32±0.02c 17.42±1.34b 65.23±2.10c 78.41±2.35c 茶2 5.67±0.01b 17.28±1.60b 73.29±2.54b 80.12±2.03b 茶3 3.66±0.03d 12.66±1.22c 60.86±2.33d 75.38±1.98d 注：表中同一列不同字母代表差异显著（P<0.05）。
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表 5 金银花叶凉茶与市场上三种凉茶挥发性成分比较
Table 5 Comparison of volatile components between Lonicera japonica leaves herbal tea and three kinds of herbal tea on the market
序号 挥发性化合物 金银花叶茶
（mg/L）茶1
（mg/L）茶2
（mg/L）茶3
（mg/L）A1 3-甲硫基丙醇 3.34 3.40 3.44 3.44 A2 苯乙醇 3.28 3.14 3.24 3.28 A3 1-辛醇 3.23 3.08 3.23 3.23 A4 2,3-丁二醇 − 3.23 3.08 6.45 A5 2-乙基己醇 2.94 − − 2.94 A6 苯甲醇 3.31 − − − A7 1-壬醇 3.19 − − − A8 丙醇 2.76 − − − A9 新薄荷醇 2.76 − − − A10 正己醇 1.78 − − − A11 （R）-1,2-丙二醇 − 3.05 − − A12 正丁醇 − 1.71 − − A13 3-甲基-1-戊醇 − − 3.05 − A14 庚酸乙酯 3.10 3.28 3.34 2.76 A15 辛酸乙酯 2.67 2.67 2.67 5.71 A16 正己酸乙酯 2.05 2.03 2.03 1.78 A17 乙酸异戊酯 1.93 1.93 1.93 1.78 A18 癸酸乙酯 3.31 3.38 3.38 − A19 月桂酸乙酯 2.01 2.10 2.08 − A20 棕榈酸乙酯 1.99 2.08 1.99 − A21 乙酸乙酯 3.89 − 3.89 3.77 A22 乙酸苯乙酯 1.93 1.93 − 1.93 A23 壬酸乙酯 2.49 2.92 − − A24 乙酸己酯 − 1.84 1.84 − A25 反式-2-己烯酸乙酯 2.79 − − − A26 乙酸苄酯 2.05 − − − A27 癸酸3-甲基丁酯 − 2.76 − − A28 丙酸-2-苯乙酯 − − 2.86 − A29 乙酸 1.93 1.95 1.95 1.95 A30 辛酸 2.80 2.80 − 2.46 A31 苯甲酸 6.00 − − − A32 癸酸 − 2.76 − − A33 2-甲基四氢噻吩-3-酮 − 3.37 − A34 十二甲基环六硅氧烷 5.75 2.86 2.67 2.55 A35 六甲基环三硅氧烷 2.80 8.29 5.97 5.97 A36 十甲基环五硅氧烷 2.67 5.59 2.80 5.31 A37 十四烷 5.68 2.49 2.80 − A38 十二烷 2.95 − 8.29 5.28 A39 八甲基环四硅氧烷 2.97 3.10 − − A40 十六烷 − 2.80 − − A41 二十七烷 3.10 − − − A42 2-亚甲基戊二腈 2.87 − − −
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表 6 金银花叶凉茶主成分特征值及贡献率
Table 6 Characteristic values and contribution rates of principal components of Lonicera japonica leaves herbal tea
主成分 特征值 贡献率（%） 1 13.44 44.9 2 9.70 32.0
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