Study on Characterization and Colonic Targeting of Ginger Essential Oil Nanoemulsion Stabilized by Palygorskite
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摘要: 为提高姜精油(Ginger essential oil, GEO)的稳定性和利用度,本实验室以酸改性凹凸棒为稳定剂、亚麻籽胶作为乳化剂、壳聚糖盐酸盐做壁材制备了姜精油纳米乳。本研究对姜精油纳米乳进行性质表征(包括形貌与形态、粒径分布、流变性、红外光谱、包埋率)并评价其结肠靶向和缓释性能。研究结果表明姜精油纳米乳粒径呈正态分布,液滴平均粒径为329.6 nm,PDI为0.259,包埋率为91.26%±0.03%;通过荧光显微镜和扫描电镜观察,表明所制备姜精油纳米乳分散度良好,呈表面光滑的球形;红外光谱结果表明,姜精油被包封进纳米乳中且化学组成未被破坏,纳米乳中各组分的结合方式为物理结合;姜精油纳米乳在 4、25、40 ℃贮藏28 d稳定性良好;通过体外模拟消化试验及动力学分析结果表明,姜精油纳米乳具有结肠靶向和缓释的性能。本研究为食品功能因子结肠递送体系的建立、以及后期姜精油纳米乳作为食品功能因子改善肠道健康中的应用提供了理论依据。Abstract: To improve the stability and utilization rate of ginger essential oil (GEO), GEO nanoemulsion stabilized by acid-modified attapulgite, emulsified by flaxseed gum and embedded by chitosan hydrochloride were prepared in this laboratory. The characteristics of GEO-loaded nanoemulsion were investigated, such as lmorphology, topography, particle size distribution, rheology, embedding rate, Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), as well as the release mechanisms. Results showed that the particle size of GEO nanoemulsion was normally distributed, the average droplet size was 329.6 nm, the polydispersity index (PDI) was 0.259 and the embedding rate was 91.26%±0.03%. GEO nanoemulsion had good dispersion and smooth spherical surface investigated by scanning electron microscope and fluorescence microscope. The results of FT-IR showed that GEO was encapsulated in the nanoemulsion and the binding mode was physical interaction, while its chemical composition did not changed. GEO nanoemulsion had good stability when stored at 4, 25 and 40 ℃ for 28 days. GEO nanoemulsion had colonic targeting and sustained release properties investigated by in vitro simulated digestion test and kinetic analysis. This study provided a theoretical basis for the establishment of the colonic delivery system of food functional factors, and the application of GEO nanoemulsion as food functional factors to improve intestinal health.
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姜精油是从姜的根茎中提取而得的挥发性脂溶性物质,主要由姜酚、烯萜、芳香醇等物质组成[1]。已有研究表明姜精油含有多种功能性因子,具有抑菌[2]、抗炎[3]、抗肿瘤增殖[4-5]、抗氧化[6]等作用。本课题组前期研究发现,姜精油具有调节小鼠肠道菌群结构、促进肠道健康的作用[7]。据此,为了使姜精油到达结肠部位与肠道菌群直接相互作用,提高其在结肠部位的生物利用度,本课题组前期研究已制备了一种以凹凸棒为稳定剂、亚麻籽胶为乳化剂、壳聚糖盐酸盐为壁材的姜精油纳米乳[8],以期解决姜精油稳定性差、结肠利用度低的问题。
提高食品功能性成分在体内的利用度,是近年来食品功能因子领域中的研究热点[9]。纳米乳液是粒径在50~500 nm、动力学稳定的胶体分散体系[10]。凹凸棒是一种层链状含水镁铝硅酸盐粘土矿物,我国已批准其作为食品添加剂使用[11],已有研究将其用于稳定乳液,且可实现对精油的包封与缓释[12]。亚麻籽胶是直接从亚麻籽壳皮中提取出的天然阴离子多糖,具有乳化性强的特点,有研究使用反溶剂法制备了玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶-亚麻籽胶纳米载体,负载的姜黄素可以在模拟肠液中缓慢释放[13]。壳聚糖盐酸盐是壳聚糖在盐酸溶液的氨基质子化改性得到的阴离子多糖,和壳聚糖相比其水溶性提高[14];有研究将壳聚糖盐酸盐与其他多糖或蛋白结合来包封活性物质,发现其具有结肠靶向和缓释的性能[14-15]。Tang等[16]使用酪蛋白酸钠、玉米醇溶蛋白制备了自组装的姜精油纳米乳,在将姜精油去质子化时需要将其高温加热、处于高碱性环境,会使得姜精油的一些成分挥发和遭到破坏。Ashraf等[17]用吐温 80作为乳化剂、采用相转化合成法制备了姜精油水包油型纳米乳,而在食品领域多用天然物质如多糖、蛋白质等替代人工表面活性剂作为乳化剂或壁材,提高了食品的安全性与健康性。因此,本研究采用高能乳化法制备姜精油纳米乳,旨在减少姜精油成分的损失;使用凹凸棒、亚麻籽胶、壳聚糖盐酸盐负载姜精油以减少人工表面活性剂的使用。
据此,本文将探究本课题组已研发制备的姜精油纳米乳的性能表征(乳液类型、粒径大小及其分布、微观形貌、表观粘度、包埋率、壁材间的相互作用)及其在不同温度下的贮藏稳定性,并进一步通过体外模拟消化实验评价其结肠靶向、缓释动力学性能,为姜精油纳米乳作为食品功能因子改善肠道健康中的应用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
姜精油 由本实验室使用超临界CO2萃取法萃取,再利用AB-8型大孔树脂纯化制备,纯度>98%[18];凹凸棒(Palygorskite,PGS) 购于江苏玖川纳米材料科技有限公司,经本实验室先前方法进行盐酸改性[7];亚麻籽胶、尼罗红 上海源叶生物科技有限公司;壳聚糖盐酸盐 鑫恒食品原料公司;其余有机与无机试剂 为国产分析纯。
RCD-1型高速均质乳化机 常州越新仪器制造有限公司; AMF-10型高压均质机 安拓思纳米技术(苏州)有限公司;Zetasizer Nano ZS90型纳米粒度仪 英国Malvern公司;Axio Vert A1型正置荧光显微镜 德国Carl Zeiss公司;TM3000型扫描电子显微镜、HT7800型透射电子显微镜、U-3900型紫外分光光度计 日本Hitachi公司。
1.2 实验方法
1.2.1 姜精油纳米乳的制备工艺
按照课题组之前的研究制备100 mL的姜精油纳米乳[8]:分别称取0.15、0.2、0.15 g的酸改性凹凸棒、亚麻籽胶、壳聚糖盐酸盐,将其分别溶于30、30、37 mL水,再将亚麻籽胶溶液与凹凸棒溶液超声混匀,得水相溶液;滴加3 mL姜精油于水相溶液中,12000 r/min、5 min高速分散得粗乳液。将粗乳液与壳聚糖盐酸盐溶液混合并调节 pH 至 5.0~5.5 之间,55 ℃ 搅拌 3 h 后 30 MPa高压均质5 min即得纳米乳(姜精油浓度为3%)。
1.2.2 包埋率的测定
1.2.2.1 姜精油标准曲线的测定
精确称量100 mg姜精油,用正己烷定容至10 mL,使用该溶液分别配制成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的姜精油-正己烷标准溶液。在姜精油最大吸收波长290 nm处测定标准溶液的吸光值,得出姜精油标准曲线[7]。
1.2.2.2 样品测定
表面油:5 mL正己烷中加入2 mL纳米乳,振荡1 min,静置分层后取上层有机相,测定其吸光值。
总油:取4 mL纳米乳在400 W超声破碎10 min,使其破乳[19],加入10 mL正己烷后振荡1 min,静置分层,取上层有机相测定其吸光值。用下面的公式计算包埋率[16]:
包埋率(%)=总油吸光值−表面油吸光值总油吸光值×100 1.2.3 姜精油纳米乳的性能表征
1.2.3.1 微观形态与形貌
a:微观形态的观察:配制0.02%(w/v)的尼罗红-丙酮染液,于−20 ℃避光保存。滴加5 µL尼罗红染液于稀释5倍的1 mL姜精油纳米乳,混匀后在荧光显微镜下观察[7]。
b:微观形貌的观察:在样品扫描电镜前将其喷雾干燥成粉末。将少量粉末样品粘在导电胶上,喷金处理后使用扫描电镜对姜精油纳米乳的微观形貌进行观察。
1.2.3.2 粒度分析
用超纯水将姜精油纳米乳纳米乳稀释100倍后,在25 ℃下用粒度仪测定其粒径以及多分散性指数(Polymer dispersity index,PDI)。
1.2.3.3 表观粘度
参考文献[20]的方法并修改。取1 mL乳液置于夹具(PP50,直径20 mm)底部,设置间距高度为0.5 mm,在25 ℃下用不同的剪切速率(0.01~100 s−1)来测量乳液的剪切应力。
1.2.3.4 傅里叶红外光谱
取亚麻籽胶、酸改性凹凸棒、姜精油、壳聚糖盐酸盐和姜精油纳米乳粉末,将样品与溴化钾按照1:100(m/m)的比例混合,研磨均匀[21]。取适量样品压片,将压制好的样品放入样品池进行测定。
1.2.4 姜精油纳米乳的贮藏稳定性
将姜精油纳米乳分别在4 、25和40 ℃下放置0、1、3、7、14、21 d,测定其粒径、Zeta电位。
1.2.5 姜精油纳米乳的体外模拟消化研究
1.2.5.1 模拟消化液的配制
采用人工模拟胃液(Simulated gastric fluid,SGF)、人工模拟小肠液(Simulated intestinal fluid,SIF)、人工模拟结肠液(Simulated Colon Fluid,SCF)模拟人体消化。
SGF:参考中国药典中方法配制[22],取16.4 mL 稀盐酸及10 g胃蛋白酶,加超纯水溶解摇匀,调节pH至1.2并定容到1000 mL;
SIF:参考中国药典中的方法配制[22],取6.8 g 磷酸二氢钾,加超纯水溶解摇匀。另称取10 g胰蛋白酶,加超纯水溶解后与上述磷酸二氢钾溶液混合均匀,调节pH至6.8并定容至1000 mL;
SCF:参考文献中的方法配制[23],无菌收集正常实验小鼠的结肠并取出结肠内容物,取30 g溶解于100 mL磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L)中,调节pH至 7.8。
1.2.5.2 体外模拟消化实验
将装有纳米乳的透析袋放入SGF中2 h,37 ℃水浴振荡(100 r/min)。接着放入 SIF 中消化 4 h,最后放入 SCF 中 42 h。前 6 h每隔0.5 h取样,后42 h每隔1 h取样[24],使用正己烷萃取姜精油来测定累积释放率,并根据纳米乳的累积释药率和释放时间进行缓释动力学方程分析。在各消化阶段结束后使用荧光显微镜观察纳米乳的状态。
1.3 数据处理
试验平行测定三次,数据用平均值±标准差来表示。应用SPSS 16.0和Origin 2019b软件对实验数据进行统计分析和作图。
2. 结果与分析
2.1 姜精油纳米乳的包埋率
在290 nm处测得姜精油-正己烷溶液的标准曲线:y=1.7870x−0.0965(R2=0.9991),线性关系良好。将表面油吸光值和总油吸光值代入标准曲线,用包埋率公式计算得到姜精油纳米乳的包埋率为91.26%±0.03%。
2.2 姜精油纳米乳的微观形态和形貌
尼罗红为亲脂性染液,经染色后纳米乳中的姜精油在荧光下为红色(图1),可见分散的细小红色荧光液滴,说明姜精油纳米乳分散度良好,液滴大小较为均一,极少产生液滴聚集现象[25]。
姜精油纳米乳经喷雾干燥后在扫描电子显微镜的微观形貌如图2所示。姜精油纳米乳的微观形貌呈球形颗粒状,一小部分有凹陷,可能是由于干燥过程中水分蒸发速率不同所致[26]。说明乳液形状良好,其结构基本形成。
2.3 姜精油纳米乳的粒径分布和PDI
粒径大小和多分散性指数是影响乳液装载能力和释放动力学的关键因素[27];有研究表明,PDI<3.0的乳液稳定性较好[26]。由图3可知,姜精油纳米乳液滴粒径呈正态分布,液滴平均粒径为329.6 nm,PDI为0.259。说明所制备的姜精油纳米乳液滴大小分布较为均匀,稳定性较好,有良好的品质。
2.4 姜精油纳米乳的表观粘度
乳液的流变学性质与其内部的体系结构有紧密的联系,反映了乳液本身的微观结构[28]。如图4所示,姜精油纳米乳随着剪切力的增加,表观粘度不断降低并趋近于0,流动性不断增强,呈现剪切变稀现象。因此,姜精油纳米乳为假塑性流体。剪切速率的增加提高了两种聚合物的链弹性。聚合物溶液的粘度同时也受分子内相互作用的影响,这种相互作用会改变聚合物链的构象[29],但在剪切速率减小或停止时粘度会恢复。
2.5 姜精油纳米乳的红外光谱
姜精油纳米乳及其各组分的红外光谱图如图5所示,结果分析如下:
酸改性凹凸棒500 cm−1附近有一个较强的Ca2+伸缩振动峰,在1000 cm−1附近的磷酸根伸缩振动峰[30]。
亚麻籽胶在3300 cm−1附近有一个-OH拉伸形成的吸收峰,在1600 cm−1附近的吸收峰为羰基的不对称伸缩振动,是由糖醛酸或结合水的存在引起的,在1000 cm−1附近有一个较强的伸缩振动峰,该吸收峰是糖分子中C-O-C官能团的特征吸收峰[31]。
姜精油在2900 cm−1附近有一个亚甲基的C-H的伸缩振动形成的吸收峰,在1400 cm−1附近的吸收峰与-CH3和-CH2基团的C-H的面内弯曲振动有关,在870 cm−1附近的吸收峰与-CH3基团的C-H的面外弯曲振动有关[2]。
壳聚糖盐酸盐在3280 cm−1附近有一个O-H伸缩振动形成的一个吸收峰,在1600 cm−1附近的为酰胺基团的特征带,在1000 cm−1附近的吸收峰与C-N的弯曲振动有关[29]。
综合上述,比较纳米乳的红外光谱图线的主要吸收峰与酸改性凹凸棒、亚麻籽胶、姜精油和壳聚糖盐酸盐的主要吸收峰,发现有许多相似之处,说明姜精油纳米乳中保留了这些成分。姜精油纳米乳在2900、1400 cm−1处的特征峰可与姜精油相对应且透光率大大降低,对比姜精油来说,纳米乳没有出现新的特征峰且有部分特征峰消失,说明姜精油已被纳米乳成功负载,姜精油与纳米乳其他组分可能是以静电作用力相互结合的;在纳米乳的红外谱图线中对照单个组分,部分特征峰的增强或减弱或是略微偏移,没有新的特征峰出现,说明姜精油纳米乳中酸改性凹凸棒、亚麻籽胶和壳聚糖盐酸盐的相互作用为物理作用。
2.6 姜精油纳米乳的贮藏稳定性
通过测定不同贮存时间后乳液液滴直径的变化,可以用来表征纳米乳的稳定性[32]。随存放时间的延长,纳米乳的平均粒径均有增大(表1)。其中,40 ℃条件下的姜精油纳米乳平均粒径增长趋势最大,可能是由于较高温度下纳米乳中的姜精油不稳定,加速了姜精油纳米乳液滴的凝聚。Zeta电位绝对值大于30可说明乳液液滴间具有足够的静电斥力来维持其自身稳定性,是一个评价纳米流体稳定性的良好指标[33]。不同储存温度和天数下,纳米乳的电位值变化不大且绝对值都大于30。在4周的贮存下,4、25、40 ℃下的姜精油纳米乳稳定性均良好,没有发生明显的絮凝、分层等现象,综合来看,姜精油纳米乳更适宜在4 ℃条件下储存。
表 1 不同储存条件下姜精油纳米乳平均粒径和Zeta电位的变化Table 1. Changes of Z-average and Zeta potential of ginger essential oil nanoemulsion at different storage conditions天数(d) 指标 平均粒径(nm) Zeta电位(mV) 4 ℃ 25 ℃ 40 ℃ 4 ℃ 25 ℃ 40 ℃ 1 324.9±2.9a 329.8±2.1a 344.8±19.2a −39.0±0.8bc −39.3±0.5c −40.4±0.4b 3 388.0±6.3b 389.3±10.4b 411.4±12.6b −38.4±0.4cd −39.5±1.2c −32.0±0.8c 7 398.2±6.2b 400.8±15.5bc 424.1±3.9b −39.3±0.8bc −39.2±1.3c −39.4±1.1b 14 425.2±10.5c 439.0±2.6 c 469.8±29.0c −37.7±0.8d −42.6±1.4b −39.2±0.5b 21 430.8±9.0 c 445.1±34.4cd 500.1±8.9 cd −39.7±0.4b −44.5±0.5a −42.7±0.7a 28 453.6±18.7d 461.2±37.9 d 520.8±32.7d −41.9±0.9a −44.4±1.4a −40.0±1.6b 注: 表格中数据表示为平均值±标准差。不同小写字母表示在相同温度下样品的平均粒径和Zeta电位随着天数的变化有显著差异(P<0.05)。 2.7 姜精油纳米乳的体外模拟消化实验
2.7.1 体外模拟消化的累积释放曲线与荧光显微图
从图6中可得姜精油纳米乳的最终释放率为95.05%±2.31%。在人工模拟胃液(SGF)消化过程中几乎没有释放,释放率为4.88%±0.05%(0~2 h);在人工模拟小肠液(SIF)消化过程中释放较少,释放率为12.49%±0.15%(2~6 h); 在人工模拟结肠液(SCF)消化过程中释放明显增加,且呈缓慢逐渐释放趋势,消化至36 h释放率达 90.86%±3.23%(6~48 h)。在SGF和SIF阶段中,姜精油纳米乳仅有少部分姜精油的释放,可能是由于纳米乳液滴表面的姜精油的释放及少部分液滴壁材的水解。由此说明由凹凸棒、壳聚糖盐酸盐、亚麻籽胶构成的液滴“外壁”可以有效地防止姜精油在胃、小肠消化阶段释放。在SCF阶段,大部分姜精油被释放到模拟结肠液中,可能是因为壳聚糖盐酸盐和亚麻籽胶在结肠特有菌群所产生的酶的作用下得到降解,姜精油纳米乳的结构被逐渐破坏。有研究表明,肠道菌群中的梭状芽胞杆菌可能是降解亚麻籽胶的关键菌属[34]。壳聚糖及其衍生物能够通过肠道菌群产生的溶菌酶的酶促作用在人体内降解[35]。
从图7中可以看出,在SGF消化结束后,姜精油纳米乳液滴较小且分散;在SIF消化结束后,姜精油纳米乳出现部分粘连和姜精油少量释放的情况;在模拟结肠消化结束即消化48 h后,显现更多较大的红色荧光,姜精油纳米乳颗粒有较多粘连和结构破坏。
综上所述,姜精油纳米乳具有结肠靶向和缓释性能。
2.7.2 体外模拟消化的动力学分析
分析主要成分在体外模拟消化液中的释放行为,可以一定程度地预测其在体内的释放行为。根据中国药典2020年版[22],缓释制剂的释药数据可以用一级方程、Higuchi方程、Rigter-Peppas方程等拟合,零级方程一般用以拟合控释体系。
决定系数R2越高的动力学模型被认为是最符合的药物释放动力学模型[36]。由表2可知,Rigter-Peppas方程释药模型更符合姜精油纳米乳在体外模拟消化的释放性能。由相关研究可知,动力学模拟方程中n为扩散指数,它是分析释放速率机制的重要参数。当n≤0.45 时,为 Fickian 自由扩散;当0.45<n<0.85 时,为骨架溶蚀和扩散作用协同的 non-Fickian 扩散;当n≥0.85 时,为骨架溶蚀[37]。姜精油纳米乳的n为0.872,因此,姜精油纳米乳在体外模拟消化中的释放行为可以用骨架溶蚀机制来解释,这为多糖负载精油的乳液体系的缓释提供了释放动力学依据。
表 2 姜精油纳米乳体外模拟结肠消化释放动力学方程拟合Table 2. Kinetic equation fitting of ginger essential oil nanoemulsion in vitro simulating colon digestion and release动力学模型 方程 K n R2 Zero-order Q=Kt+C 2.2079 2.1548 0.9541 First-order Q=C(1-exp(-Kt)) 294.4363 0.0095 0.9193 Higuchi Q=Kt1/2+C 10.6912 −7.2047 0.7448 Rigter-Peppas Q=KtC 4.4119 0.872 0.9648 注:Q 代表累积释放率,t 代表消化时间,R2代表动力学模型决定系数,K 为释放速率常数,n 为扩散指数。 3. 结论
本文研究结果表明:通过各项性能表征,表明所制备姜精油纳米乳的液滴大小分布均匀,颗粒表面较为光滑且呈球状,姜精油被包封进了纳米乳中且其化学结构没有受到破坏,壁材间的结合方式为物理结合方式;姜精油包埋率为91.26%±0.03%,包埋效果较好;姜精油纳米乳在4、25、40 ℃贮藏28 d,具有良好的物理稳定性,4 ℃比25、40 ℃更有利于姜精油纳米乳的贮藏;体外模拟消化实验结果表明,姜精油纳米乳具有良好的结肠靶向和缓释性能。因此,本研究以酸改性凹凸棒为稳定剂、亚麻籽胶为乳化剂的姜精油纳米乳,具有结肠靶向、缓释性能,为姜精油纳米乳作为食品功能因子在改善肠道健康、调节肠道菌群中的应用提供依据。
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表 1 不同储存条件下姜精油纳米乳平均粒径和Zeta电位的变化
Table 1 Changes of Z-average and Zeta potential of ginger essential oil nanoemulsion at different storage conditions
天数(d) 指标 平均粒径(nm) Zeta电位(mV) 4 ℃ 25 ℃ 40 ℃ 4 ℃ 25 ℃ 40 ℃ 1 324.9±2.9a 329.8±2.1a 344.8±19.2a −39.0±0.8bc −39.3±0.5c −40.4±0.4b 3 388.0±6.3b 389.3±10.4b 411.4±12.6b −38.4±0.4cd −39.5±1.2c −32.0±0.8c 7 398.2±6.2b 400.8±15.5bc 424.1±3.9b −39.3±0.8bc −39.2±1.3c −39.4±1.1b 14 425.2±10.5c 439.0±2.6 c 469.8±29.0c −37.7±0.8d −42.6±1.4b −39.2±0.5b 21 430.8±9.0 c 445.1±34.4cd 500.1±8.9 cd −39.7±0.4b −44.5±0.5a −42.7±0.7a 28 453.6±18.7d 461.2±37.9 d 520.8±32.7d −41.9±0.9a −44.4±1.4a −40.0±1.6b 注: 表格中数据表示为平均值±标准差。不同小写字母表示在相同温度下样品的平均粒径和Zeta电位随着天数的变化有显著差异(P<0.05)。 表 2 姜精油纳米乳体外模拟结肠消化释放动力学方程拟合
Table 2 Kinetic equation fitting of ginger essential oil nanoemulsion in vitro simulating colon digestion and release
动力学模型 方程 K n R2 Zero-order Q=Kt+C 2.2079 2.1548 0.9541 First-order Q=C(1-exp(-Kt)) 294.4363 0.0095 0.9193 Higuchi Q=Kt1/2+C 10.6912 −7.2047 0.7448 Rigter-Peppas Q=KtC 4.4119 0.872 0.9648 注:Q 代表累积释放率,t 代表消化时间,R2代表动力学模型决定系数,K 为释放速率常数,n 为扩散指数。 -
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期刊类型引用(1)
1. 张倩,刘芳,张芮苑,邓鸿丹,杨璐萍,任虹. 厚朴挥发油纳米乳凝胶的制备及其对溃疡性结肠炎小鼠的药效评价. 中草药. 2024(03): 746-756 . 百度学术
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