Optimization of Preparation Technology and Stability Analysis of Coconut Oil Nanoemulsion
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摘要: 为制备较为稳定的椰子油乳液，将酪蛋白酸钠（Sodium caseinate，SC）和黄原胶（Xanthan gum，XG）复合作为乳化剂，椰子油为油相，采用超声方法制备椰子油乳液。以平均粒径、Zeta-电位、离心稳定性及浊度等为考察指标，通过单因素实验筛选出超声功率、超声时间、油相质量分数和水相pH的合理研究范围。以平均粒径为响应值，用Box-Behnken响应面法对超声功率、超声时间和水相pH做进一步优化实验并对制备的乳液进行稳定性实验。结果表明，最佳制备工艺参数为：超声功率为480 W，超声时间为18 min，水相pH为7，所得椰子油纳米乳液的平均粒径为304.5±13.2 nm。所制备的椰子油纳米乳液在热处理温度40~90 ℃，pH6~8，离子浓度0~0.5 mol/L条件下具有良好的稳定性，且经3次冻融循环后乳液保持稳定，为构建用于食品加工的高稳定性椰子油乳液提供了理论支持。Abstract: In order to prepare a more stable coconut oil emulsion, sodium caseinate (SC) and xanthan gum (XG) were combined as emulsifiers, and coconut oil was used as the oil phase, and the coconut oil emulsion was prepared by ultrasonic method. The average droplet sizes, Zeta-potentials, centrifugal stability and turbidity of emulsions were characterized to choose reasonable parameters concerning the ultrasonic treatment time, ultrasonic treatment power, mass fraction of oil phase, and pH values of aqueous phase, by the single factor test. The Box-Behnken response surface methodology (RSM) was used to optimize the parameter (including ultrasonic treatment power, ultrasonic treatment time, and pH values of aqueous phase) to prepare the stable emulsions. The optimal conditions were obtained as follows: Ultrasonic power 480 W, ultrasonic time 18 min, and pH7 of aqueous phase. Under this condition, the smallest droplets size of emulsions was obtained 304.5±13.2 nm. All coconut oil-based emulsions showed an extraordinary stability with heat treatment temperature of 40~90 ℃, pH6~8 and ion concentration of 0~0.5 mol/L, and the emulsion remained stable after three freeze-thaw cycles. The findings would provide a facile strategy to prepare stable coconut oil-based emulsions in the food processing.
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Keywords:
- sodium caseinate /
- xanthan gum /
- coconut oil /
- nano emulsion /
- stability
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椰子油（Coconut oil，CO）是一种主要由多种中链甘油三酯（MCTs）如月桂酸、肉豆蔻酸和辛酸等组成的可食用油，且被认为是MCT的重要来源[1-2]。而初榨椰子油（Virgin coconut oil，VCO）是不经高温加热和精炼从椰肉中制得的天然植物油[3-5]，它极大地保留了油脂中的一些生物活性成分，如多酚、维生素和植物甾醇等[6]，因其具有抗氧化、降血脂、抗菌和消炎等作用[7-9]，被广泛应用在食品、饮料及化妆产品中。但初榨椰子油熔点较高，为23~26 ℃[10]，在常温下易凝固，不易流动，水溶性差很难均匀分散在食品基质中[11]，这限制了其在工业中的大规模应用，因此开发椰子油递送体系，对扩大其应用范围有重要意义。已有研究表明，纳米乳液可作为一种将椰子油递送到液体食品体系的载体，提高其水溶性和生物利用度[12-13]，且开发基于椰子油的乳液产品作为新型营养食品补充剂将间接增加椰子油的价值。
纳米乳液是由油相、水相和表面活性剂（乳化剂）组成，其液滴尺寸在纳米范围内，在10~1000 nm之间[12]。目前，人们常用一些小分子的表面活性剂（如吐温、司盘等）作为乳化剂来制备纳米乳液，但这些合成的表面活性剂对人体存在一定的安全隐患[14]。因此，使用天然生物分子作为乳化剂制备乳液受到广泛关注。酪蛋白酸钠（Sodium caseinate，SC）被广泛用作乳液制备中的蛋白质基乳化剂，因为它可以吸附在乳液液滴的表面，以防止它们在乳化后通过静电和空间排斥再凝聚[15]。然而，有研究发现单一蛋白质的乳化作用有限，致使乳液产生分层，无法维持稳定状态[16]。为了提高酪蛋白酸钠制备乳液的稳定性，本试验将酪蛋白酸钠与多糖复合作为乳化剂来制备乳液。黄原胶（Xanthan gum，XG）是一种非吸附性多糖，具有高粘度和强剪切稀化特性。陈玲等[17]使用黄原胶和乳清分离蛋白复合乳化剂制备南瓜籽油O/W型乳液，发现黄原胶的添加显著改善了乳液的稳定性。目前关于椰子油纳米乳液的研究开发很受关注，高巍等[13]使用大豆卵磷脂制备椰子油基纳米乳液并对其特性进行研究；Liu等[18]使用大麻分离蛋白与多糖复合凝聚物制备椰子油乳液并对其稳定性进行研究，但使用蛋白和多糖作为复合乳化剂制备椰子油乳液的研究信息很少。
因此，本研究使用酪蛋白酸钠与黄原胶作为复合乳化剂制备椰子油乳液，通过单因素和Box-Behnken响应面法优化椰子油乳液的制备工艺，并对所制备的乳液进行稳定性实验。制备出稳定性较好的椰子油乳液，将为开发和生产基于椰子油的纳米乳产品提供理论支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
初榨椰子油 海口植之素有限公司；酪蛋白酸钠、黄原胶（食品级） 河南万邦实业有限公司；氢氧化钠、盐酸（分析纯） 广州化试厂；硫柳汞 阿拉丁试剂有限公司。
PL602-L电子天平、FE20实验室pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BL200搅拌机 江阴市保利科研机械有限公司；GL-20G冷冻高速离心机 上海安亭科学仪器厂；HR-500高速剪切乳化均质机 上海沪析实业有限公司；KQ-800KDE型超声波破碎仪 昆山市超声仪器有限公司；Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪 英国Malvern公司；Synergy LX酶标仪 美国Biotek Instruments公司。
1.2 实验方法
1.2.1 纳米乳液制备
将2 g酪蛋白酸钠（SC）溶解在100 mL的磷酸缓冲液（PBS，pH7.2~7.4）中，常温下以400 r/min的转速连续搅拌2 h后置于4 ℃冰箱中过夜水化，后通过离心（6000 r/min，15 min）去除不溶物得到SC溶液。加入硫柳汞（0.02wt%）作为抑菌剂。将1 g黄原胶溶于100 mL PBS缓冲液中，以800 r/min的转速搅拌1.5 h后放在4 ℃冰箱中备用。将酪蛋白酸钠溶液与黄原胶溶液1:1（v/v）混合作为水相，用0.1 mol/L HCl调pH至7，再将椰子油按不同比例加入到水相中，先用高速剪切乳化均质机于20000 r/min下均质3 min，然后经过超声进一步处理得到椰子油纳米乳液。在超声过程中须将纳米乳液放在冰浴条件下以避免发生在实验时由于超声处理而导致体系温度上升的现象。
1.2.2 单因素实验
以超声功率、超声时间、油相质量分数和水相pH为考察因素进行单因素实验，通过测定椰子油纳米乳液的平均粒径、Zeta-电位、离心稳定性及浊度确定制备酪蛋白酸钠-黄原胶椰子油纳米乳液的最佳参数范围。
1.2.2.1 超声功率对乳液稳定性的影响
在超声时间为15 min、椰子油添加量为10%（w/w）、水相pH为7±0.1时，测定在超声功率分别为160、240、320、400、480、560 W时制备的椰子油纳米乳液的粒径、Zeta-电位、离心稳定性和浊度。
1.2.2.2 超声时间对乳液稳定性的影响
在超声功率为480 W、椰子油添加量为10%（w/w）、水相pH 7±0.1时，测定在超声时间分别为5、10、15、20、25、30 min时制备的椰子油纳米乳液的粒径、Zeta-电位、离心稳定性和浊度。
1.2.2.3 油相质量分数对乳液稳定性的影响
在超声功率为480 W、超声时间为15 min、水相pH 7±0.1时，测定在油相质量分数分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%（w/w）时制备的椰子油纳米乳液的粒径、Zeta-电位、离心稳定性和浊度。
1.2.2.4 水相pH对乳液稳定性的影响
在超声功率为480 W、超声时间为15 min、椰子油添加量为10%（w/w）时，测定在水相pH分别为3、4、5、6、7、8时制备的椰子油纳米乳液的粒径、Zeta-电位、离心稳定性和浊度。
1.2.3 Box-Behnken响应面试验设计
在上述各单因素的实验结果的基础上，进一步使用Box-Behnken响应面法以确定制备酪蛋白酸钠-黄原胶椰子油纳米乳液的最优参数，而粒径是衡量乳液稳定性的重要指标，粒径越小乳液越稳定，且当油水体积比为一固定值时，纳米乳液的离心稳定性和浊度等指标与纳米乳液的平均粒径是呈正相关的[19]，故以超声功率（A）、超声时间（B）、水相pH（C）为自变量，粒径（Y）为响应值，进行三因素三水平响应面试验分析。响应面试验的因素水平表如表1所示。
表 1 响应面试验因素水平设计Table 1. Design of factors and levels of the response surface test水平 因素 A超声功率（W） B超声时间（min） C水相pH −1 400 10 6 0 480 15 7 1 560 20 8 1.2.4 平均粒径和Zeta-电位的测定
使用Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析仪测量纳米乳液的平均粒径和Zeta-电位。椰子油的折射率设置为1.46，磷酸盐缓冲液的折射率设置为1.33。为了避免多重散射效应，分析之前用PBS缓冲液（pH7.2~7.4）稀释椰子油乳液500倍测平均粒径，稀释50倍测Zeta-电位[19]。
1.2.5 椰子油纳米乳液离心稳定性测定
参考高健[19]的方法并适当修改，将椰子纳米乳液用PBS缓冲液（pH7.2~7.4）稀释50倍后倒入50 mL离心管中，于2500 r/min下离心5 min后吸取下层样品，用Synergy LX酶标仪测其在500 nm处的吸光值。计算离心稳定常数K：
(1) 式中：K为离心稳定常数；A0为样品离心前的吸光度；A1为样品离心后底层溶液吸光度。
1.2.6 椰子油纳米乳液浊度测定
参照江连洲等[20]的方法测定乳液浊度。将椰子油纳米乳液用PBS缓冲液溶液稀释40倍，以PBS缓冲液为空白对照，用酶标仪测定600 nm处的吸光度，浊度计算公式为：
(2) 式中：A为稀释乳液在600 nm处的吸光度；V为稀释倍数；I为光程差，取1 cm。
1.2.7 乳液稳定性研究
1.2.7.1 热稳定性
取10 g最优条件下制备的新鲜乳液于样品瓶中，分别将乳液在40、50、60、70、80、90 ℃温度下水浴加热30 min，取出快速冷却后测定平均粒径和Zeta-电位的变化[21]。
1.2.7.2 酸碱稳定性
取10 g最优条件下制备的新鲜乳液于样品瓶中，用0.1 mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH调节乳液的pH至3、4、5、6、7、8，测定平均粒径和Zeta-电位。
1.2.7.3 离子稳定性
参考江连洲等[20]的方法并做适当修改，配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液，用不同浓度的NaCl溶液将最优条件制备的酪蛋白酸钠-黄原胶椰子油纳米乳液稀释为原体积的2倍，静置24 h后测定平均粒径和Zeta-电位。
1.2.7.4 冻融稳定性
取10 g乳液于样品瓶中，放置−20 ℃冰箱24 h后取出，在室温下放置30 min观察其样品状态，预循环三次对样品进行观察。
1.3 数据处理
所有实验均经过3次重复实验，实验结果用平均值±标准差表示。用IBM SPSS Statistics 23对数据进行ANOVA差异显著性分析，P<0.05为显著性差异，利用Design-Expert 8.0.6软件分析制备椰子油纳米乳液的最佳工艺条件，对实验数据进行统计分析，用Origin 2021软件制图。
2. 结果与分析
2.1 椰子油纳米乳液制备的单因素实验
2.1.1 超声功率对乳液稳定性的影响
超声功率对乳液稳定性影响的实验结果如图1所示，由图1（a）可知，椰子油纳米乳液的平均粒径随超声功率的增大呈现先减小后增大的趋势，在480 W时达到最低。当超声功率大于480 W时，可能因为使用的超声功率过高而使纳米乳液液滴之间的碰撞过于频繁从而破坏液滴的结构，受损的液滴积累导致形成不均匀的聚集体[22]，导致纳米乳液的平均粒径变大。也有可能是因为随着空化效应增强，较小的液滴被强制挤压并重新聚集在一起[23]。高巍等[13]研究了超声功率对稳定纳米乳液粒径的影响与本研究结果相似。Zeta-电位是检验乳液稳定性的关键指标，Zeta-电位的绝对值越大，乳液的稳定性越好[24]，由图1（b）可知，超声功率对乳液Zeta-电位影响不显著（P>0.05），但Zeta-电位的绝对值是随着超声功率的增加先增大后减小的，在400 W时绝对值达到最大。
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通常认为离心稳定常数越小纳米乳液的离心稳定性越好，且在20%以下是比较稳定的[19]。由图1（c）可知，纳米乳液的离心稳定性随着超声功率的增加先减小后增大，在超声功率大于400 W时，制备乳液的离心常数在20%以下，椰子油纳米乳液的离心稳定性较好。浊度可以作为衡量乳液的宏观指标，且乳液的浊度与其稳定性呈负相关[23]。由图1（d）所知，经超声波处理后，乳液的浊度发生了明显的变化。浊度随超声功率的增大先降低后增大，在480 W的超声波功率下，观察到乳液的浊度达到最低。而随着超声功率进一步增加到560 W，超声处理的热效应导致液滴聚集，从而导致乳液浊度增加[23]。
根据超声功率对椰子油纳米乳液的平均粒径、Zeta-电位、离心稳定性和浊度的影响，选择超声功率为400~560 W做进一步研究。
2.1.2 超声时间对乳液稳定性的影响
超声时间对椰子油纳米乳稳定性的影响结果如图2所示，由图2（a）可知，平均粒径随超声时间的增加先减小后增大，在超声时间为15 min时达到最小值，之后呈增大趋势。这是因为纳米乳液遭受长时间的碰撞和过高的空化能，进而导致其液滴结构遭到破坏[25]，从而导致纳米乳液液滴平均粒径的增大。高巍等[13]的相关研究结果与本研究结果相似。由图2（b）可知，Zeta-电位随超声时间的增加变化不显著（P>0.05）。纳米乳液体系中，当油水体积比为一固定值时，纳米乳液的离心稳定性和浊度等指标与纳米乳液的平均粒径是呈正相关的[19]。由图2（c）、图2（d）可知，椰子油纳米乳液的离心稳定性和浊度的变化趋势与平均粒径的变化趋势大致一致。因此选择超声时间为10~20 min来进一步实验。
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图 2 超声时间对乳液平均粒径（a）、Zeta-电位（b）、离心稳定性（c）和浊度（d）的影响Figure 2. Effect of ultrasonic time on mean particle size (a), Zeta-potential (b), centrifugal stability (c) and turbidity (d) of emulsions2.1.3 油相质量分数对乳液稳定性的影响
油相质量分数对乳液稳定性的影响结果如图3所示，由图3（a）可知，椰子油纳米乳液的平均粒径随着椰子油添加量的增加而增大，且当油相质量分数低于15%时，纳米乳液的平均粒径还处在较低的范围内；而当油相质量分数大于15%时，纳米乳液的平均粒径显著增大（P<0.05）。这可能是因为椰子油的浓度增大，且超声后产生的分散相也增多，乳液体系中有些椰子油没有覆盖住，导致其粘附在乳液液滴表面，进而导致液滴发生黏连，增强了液滴的聚集[19]，引起了粒度的增大。通过图3（b）可以看出，随着油相质量分数的增加，Zeta-电位绝对值变化不大，说明乳液的Zeta-电位与油相的添加量没有很好的相关性，这一结果与Ma等[26]的结果相似。由图3（c）可知，椰子油纳米乳液的离心稳定性随着油相质量分数的增加而增大，在油相质量分数小于15%时，乳液的离心常数小于20%，说明乳液的离心稳定性较好。由图3（d）可知，油相质量分数由15%增加至20%时，乳液的浊度显著增大（P<0.05）。故在确保纳米乳液稳定性的条件下，确定油相质量分数为15%。
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图 3 油相质量分数对乳液平均粒径（a）、Zeta-电位（b）、离心稳定性（c）和浊度（d）的影响Figure 3. Effect of oil phase mass fraction on mean particle size (a), Zeta-potential (b), centrifugal stability (c) and turbidity (d) of emulsions2.1.4 水相pH对乳液稳定性的影响
水相pH对乳液稳定性的影响结果如图4所示，由图4（a）可知，乳液随着水相pH的增加呈现先增大后减小的趋势，在pH3和8下的粒径相似且显著小于其他pH下的乳液（P<0.05），且在pH8时乳液粒径小于pH3的粒径。在水相pH为4~7时，粒径变化不显著（P>0.05），但在pH5时，达到最大，这种现象可以解释为蛋白与多糖之间的静电排斥不足以克服吸引相互作用，并导致颗粒聚集导致颗粒尺寸增加[27]。王曼笛等[28]的相关研究也发现了乳液粒径随水相pH的增加呈现先增后减的变化趋势。由图4（b）可知，随着水相pH的增加，Zeta-电位变化不大，但在pH为7时，其Zeta-电位的绝对值达到最大。纳米乳液体系中，当油水体积比为一固定值时，纳米乳液的离心稳定性和浊度等指标与纳米乳液的平均粒径是呈正相关的[19]。由图4（c）和（d）可知，离心稳定性和浊度的变化趋势与粒径的变化趋势大致相同，且在pH为8时乳液的离心稳定性和浊度小于pH为3时的离心稳定性和浊度。故选择水相pH为6~8进行下一步研究。
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图 4 水相pH对乳液平均粒径（a）、Zeta-电位（b）、离心稳定性（c）和浊度（d）的影响Figure 4. Effect of pH of aqueous phase on mean particle size (a), Zeta-potential (b), centrifugal stability (c) and turbidity (d) of emulsions2.2 响应面工艺优化试验
2.2.1 响应面试验结果与分析
在上述各单因素的实验结果的基础上，使用Box-Behnken响应面法对制备工艺进行优化，以超声功率（A）、超声时间（B）、水相pH（C）为自变量，平均粒径（Y）为响应值，进行三因素三水平响应面试验分析。其设计及结果见表2。
表 2 响应面试验设计及结果Table 2. Design and results of response surface test实验号 A B C 平均粒径（nm） 1 0 0 0 304.3±14.5 2 1 0 −1 614.1±29.2 3 0 0 0 308.7±13.5 4 0 −1 −1 405.4±12.5 5 0 −1 1 354.2±12.8 6 −1 0 −1 474.4±32.8 7 0 1 −1 370.9±11.3 8 −1 1 0 392.3±4.5 9 1 −1 0 589.3±42.3 10 −1 −1 0 406.7±3.2 11 0 1 1 323.2±11.2 12 1 1 0 495.8±20.3 13 0 0 0 297.7±15.0 14 1 0 1 579.4±11.0 15 −1 0 1 368.0±4.2 16 0 0 0 317.1±30.4 17 0 0 0 301.3±15.4 对表2中的试验结果进行二次多项回归拟合分析，得到拟合回归模型方程为：Y=305.82+79.65A−21.67B−30.00C−19.78AB+17.93AC+0.88BC+155.38A2+9.83B2+47.78C2（其中：A：超声功率，B：超声时间，C：水相pH，Y：平均粒径）。
对回归方程进行方差分析，其分析结果如表3所示。由表3可以看出，模型P<0.0001，说明响应面试验所选用的模型极显著。失拟项不显著（P>0.05），说明残差均是由随机误差引起的[13]。乳液的制备工艺对椰子油纳米乳液的平均粒径的影响从大到小的顺序为：A>C>B，即超声功率>水相pH>超声时间。该模型的R2=0.9934，R2adj=0.9850，说明此模型对试验的拟合程度好，因此，可以选用该模型对椰子油纳米乳液的平均粒径进行可靠的预测。
表 3 回归模型的方差分析Table 3. Variance analysis of regression model方差来源 平方和 自由度 方差 F值 P值 显著性 模型 181300 9 20147 117.56 <0.0001 ** A 50752.98 1 50753.98 296.14 <0.0001 ** B 3758.45 1 3758.45 21.93 0.0023 ** C 7200 1 7200 42.01 0.0003 ** AB 1564.2 1 1564.2 9.13 0.0194 * AC 1285.22 1 1285.22 7.5 0.0290 * BC 3.06 1 3.06 0.018 0.8974 A2 101700 1 101700 593.13 <0.0001 ** B2 406.65 1 406.65 2.37 0.1674 C2 9611.32 1 9611.32 56.08 0.0001 ** 残余项 1199.66 7 171.38 失拟项 975.45 3 325.15 5.8 0.0613 纯误差 224.21 4 56.05 总和 182500 16 注：*代表P<0.05，差异显著；**代表P<0.01，差异极显著。 2.2.2 响应曲面图分析
由图5（a）可知，超声功率-超声时间交互作用中，超声功率对平均粒径的影响显著，造成曲面有较明显的先减后增的变化，而超声时间引起的变化比较小，说明超声功率在AB两因素交互作用中的贡献比超声时间大。图5（b）可以看出，此曲面的趋势较其他曲面趋势较陡，说明对纳米乳的平均粒径影响更加显著[29]。当水相pH一定时，粒径随超声功率的增大，先显著减小后稍有增加；当超声功率一定时，粒径大小随pH的增加而明显减小。但超声功率方向的曲面波动比水相pH大，说明二者交互作用中，超声功率对平均粒径的影响比水相pH显著。由图5（c）可看出，当超声时间固定时，平均粒径随水相pH的增加明显减小，而超声时间方向的曲面波动变化不明显，表明水相pH对平均粒径的影响比超声时间大。此结论与模型的方差分析的结果一致。
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图 5 两因素的交互作用对椰子油纳米乳平均粒径的影响Figure 5. Effects of interactions of two factors on the average particle sizes of coconut oil-based nano-emulsions2.2.3 最优制备条件实验验证
为进一步确定最优制备工艺，以平均粒径最小为优化目标，依据Design-Expert 8.0.6软件所得到最优制备工艺为：超声功率为479.26 W，超声时间为18.05 min，水相pH为6.97，预测在此条件下制备得到的椰子油纳米乳液的平均粒径为296.507 nm。
为了验证最优制备工艺的可靠性，结合实际操作工艺条件的可行性，将最优制备工艺条件改为：超声功率为480 W，超声时间为18 min，水相pH为7。在此条件下进行了3次重复验证实验，得到椰子油纳米乳液的平均粒径为304.5±13.2 nm，与理论的预测值的相对误差为2.7%，说明根据此响应面模型得到的结果与实际测验值吻合良好。
2.3 乳液稳定性研究
2.3.1 热稳定性
因为在食品加工过程中难以避免对样品进行商业杀菌，所以对乳液的热稳定性进行检测是必不可少的。乳液的加热稳定性结果如图6所示，温度在40~80 ℃的范围内，乳液的平均粒径和Zeta-电位的变化不显著（P>0.05），超过80 ℃，平均粒径显著增加，电位绝对值也显著降低（P<0.05），其可能原因是加热处理使酪蛋白酸钠和黄原胶发生变性，其相互作用减弱[19]，但加热温度在40~90 ℃的范围内乳液的Zeta-电位绝对值均大于30 mV，有研究表明，当纳米乳液的Zeta-电位绝对值高于30 mV时，乳液体系的稳定性是比较理想的[30]，说明本研究在最优条件下制备的乳液具有较好的热稳定性。陈玲等[17]对乳清蛋白-黄原胶复合乳剂制备的乳液进行了类似的观察，发现乳液经热处理后其电位大于30 mV，这与本研究结果相似。
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图 6 加热处理对椰子油纳米乳液平均粒径（a）和Zeta-电位（b）的影响Figure 6. Effects of heating treatment on the average particle sizes (a) and Zeta-potentials (b) of coconut oil-based nano-emulsions2.3.2 酸碱稳定性
在商业食品中，乳液可能必须在一系列不同的pH条件下运行，因此研究它们的pH稳定性很重要。乳液的酸碱稳定性结果如图7所示，乳液的平均粒径在pH6~8条件下差异不显著（P>0.05），但在pH3~5时的粒径显著大于pH6~8（P<0.05），说明酪蛋白酸钠-黄原胶稳定的椰子油纳米乳液在酸性条件下不稳定发生絮凝聚集。乳液的Zeta-电位绝对值随着pH的增加呈现先增后减的趋势，但在pH6~8范围内，电位绝对值都在40以上，说明乳液在中性环境下的稳定性良好。Sharma等[31]对酪蛋白酸钠和果胶混合制备的乳液进行了类似研究，发现乳液在pH3~5时由于乳液的静电排斥力减弱导致乳液不稳定，这与本研究结果一致。
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图 7 pH对椰子油纳米乳液平均粒径（a）和Zeta-电位（b）的影响Figure 7. Effects of pH on the average particle sizes (a) and Zeta-potentials (b) of coconut oil-based nano-emulsions2.3.3 离子稳定性
不同的食品具有不同的离子组成，只有食品乳剂具有较高的离子强度稳定性，才能更好地应用于食品工业中。乳液的离子稳定性结果如图8所示，盐离子的存在使得乳液的平均粒径大体上变大和Zeta-电位绝对值变小，但其影响不显著（P>0.05），这可能是因为酪蛋白酸钠与黄原胶的结合会在液滴的表面生成较大的电荷密度，Na+因静电作用被吸附到蛋白质分子上使附着在椰子油滴表面的蛋白质分子的数量明显增加[32]。这也可说是乳液液滴间产生的大量静电排斥力可防止Na+的电荷中和作用[31]。随着Na+浓度增大，乳液的Zeta-电位绝对值呈现下降的趋势，这可能是NaCl的静电屏蔽作用导致的，这与陈玲等[17]的研究结果相似。在离子浓度为0~0.5 mol/L范围内，乳液的Zeta-电位绝对值均大于40，说明乳液的离子稳定性较好。
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图 8 离子强度对椰子油纳米乳液平均粒径（a）和Zeta-电位（b）的影响Figure 8. Effects of ionic strength on the average particle sizes (a) and Zeta-potentials (b) of coconut oil-based nano-emulsions2.3.4 冻融稳定性
食品级乳液需要考察其冻融稳定性，因为在储运过程中会遇到因冻融导致乳液发生破乳的现象。由图9可知，此次制备的乳液经过3个冻融循环后未出现破乳现象，说明乳液的冻融稳定性较好。万文瑜等[33]考察了核桃蛋白和黄原胶复配乳液的冻融稳定性，发现经一个循环后，乳液就出现明显破乳现象，而本研究所制备的乳液经3个冻融循环都还保持稳定，表明酪蛋白酸钠-黄原胶复合制备的乳液具有良好的冻融稳定性。
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图 9 乳液经3次冻融循环后的表观图注：从左到右为1~3次循环。Figure 9. Apparent diagram of emulsion after three freeze-thaw cycles3. 结论
本实验将酪蛋白酸钠和黄原胶复合作为乳化剂，采用超声的方法制备椰子油乳液。通过响应面优化试验得出其最佳制备工艺参数为：超声功率为480 W，超声时间为18 min，水相pH为7，所得椰子油纳米乳液的平均粒径为304.5±13.2 nm。通过稳定性实验发现：制备的椰子油纳米乳液具有良好热稳定性，中性条件下稳定，离子稳定性和冻融稳定性均比较好，这为之后开发用于食品加工的高稳定性椰子油乳液提供了理论支持。
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图 2 超声时间对乳液平均粒径（a）、Zeta-电位（b）、离心稳定性（c）和浊度（d）的影响
Figure 2. Effect of ultrasonic time on mean particle size (a), Zeta-potential (b), centrifugal stability (c) and turbidity (d) of emulsions
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图 3 油相质量分数对乳液平均粒径（a）、Zeta-电位（b）、离心稳定性（c）和浊度（d）的影响
Figure 3. Effect of oil phase mass fraction on mean particle size (a), Zeta-potential (b), centrifugal stability (c) and turbidity (d) of emulsions
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图 4 水相pH对乳液平均粒径（a）、Zeta-电位（b）、离心稳定性（c）和浊度（d）的影响
Figure 4. Effect of pH of aqueous phase on mean particle size (a), Zeta-potential (b), centrifugal stability (c) and turbidity (d) of emulsions
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图 5 两因素的交互作用对椰子油纳米乳平均粒径的影响
Figure 5. Effects of interactions of two factors on the average particle sizes of coconut oil-based nano-emulsions
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图 6 加热处理对椰子油纳米乳液平均粒径（a）和Zeta-电位（b）的影响
Figure 6. Effects of heating treatment on the average particle sizes (a) and Zeta-potentials (b) of coconut oil-based nano-emulsions
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图 7 pH对椰子油纳米乳液平均粒径（a）和Zeta-电位（b）的影响
Figure 7. Effects of pH on the average particle sizes (a) and Zeta-potentials (b) of coconut oil-based nano-emulsions
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图 8 离子强度对椰子油纳米乳液平均粒径（a）和Zeta-电位（b）的影响
Figure 8. Effects of ionic strength on the average particle sizes (a) and Zeta-potentials (b) of coconut oil-based nano-emulsions
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图 9 乳液经3次冻融循环后的表观图
注：从左到右为1~3次循环。
Figure 9. Apparent diagram of emulsion after three freeze-thaw cycles
表 1 响应面试验因素水平设计
Table 1 Design of factors and levels of the response surface test
水平 因素 A超声功率（W） B超声时间（min） C水相pH −1 400 10 6 0 480 15 7 1 560 20 8 
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表 2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface test
实验号 A B C 平均粒径（nm） 1 0 0 0 304.3±14.5 2 1 0 −1 614.1±29.2 3 0 0 0 308.7±13.5 4 0 −1 −1 405.4±12.5 5 0 −1 1 354.2±12.8 6 −1 0 −1 474.4±32.8 7 0 1 −1 370.9±11.3 8 −1 1 0 392.3±4.5 9 1 −1 0 589.3±42.3 10 −1 −1 0 406.7±3.2 11 0 1 1 323.2±11.2 12 1 1 0 495.8±20.3 13 0 0 0 297.7±15.0 14 1 0 1 579.4±11.0 15 −1 0 1 368.0±4.2 16 0 0 0 317.1±30.4 17 0 0 0 301.3±15.4
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表 3 回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
方差来源 平方和 自由度 方差 F值 P值 显著性 模型 181300 9 20147 117.56 <0.0001 ** A 50752.98 1 50753.98 296.14 <0.0001 ** B 3758.45 1 3758.45 21.93 0.0023 ** C 7200 1 7200 42.01 0.0003 ** AB 1564.2 1 1564.2 9.13 0.0194 * AC 1285.22 1 1285.22 7.5 0.0290 * BC 3.06 1 3.06 0.018 0.8974 A2 101700 1 101700 593.13 <0.0001 ** B2 406.65 1 406.65 2.37 0.1674 C2 9611.32 1 9611.32 56.08 0.0001 ** 残余项 1199.66 7 171.38 失拟项 975.45 3 325.15 5.8 0.0613 纯误差 224.21 4 56.05 总和 182500 16 注：*代表P<0.05，差异显著；**代表P<0.01，差异极显著。
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