Optimization of the Extraction of Rosmarinic Acid and Carnosic Acid from Rosmarinus officinalis L. with Deep Eutectic Solvents by Response Surface Methodology
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摘要: 目的：采用低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DESs）同时提取迷迭香中的迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）和鼠尾草酸（Carnosic acid，CA），并对提取工艺进行优化，为迷迭香抗氧化成分的有效开发利用提供参考。方法：首先制备37种不同组分的DESs，从中筛选出提取RA和CA得率最高的DESs组合；然后通过单因素实验研究不同的摩尔比、含水量（%）、液固比（mL/g）、提取时间（min）和提取温度（℃）对RA和CA得率的影响，在此基础上采用响应面法对提取工艺进行优化及验证，最后比较了DESs和传统溶剂（80%乙醇、正己烷）提取RA和CA的得率以及对DPPH·清除能力的差异。结果：乳酸/1, 4-丁二醇（摩尔比1:2）的DESs是同时提取RA和CA的DESs的最佳溶剂，优化的提取条件为：含水量12%、液固比44:1 mL/g、提取时间60 min，提取温度40 ℃。在该条件下RA和CA的得率分别为20.247和34.086 mg/g，相较于传统溶剂提取，DESs提取RA和CA的总得率分别提高了1.4倍（乙醇）和1.5倍（正己烷），且耗时更短。以维生素C清除DPPH·的能力（浓度为0.03 mg/mL，清除率89.77%）为对照，相同浓度迷迭香药材（0.625 mg/mL）下，DESs提取物清除率为73.17%，优于乙醇提取物（66.93%）和正己烷提取物（62.57 %）。结论：DESs能够同时提取迷迭香中的水溶性成分RA和脂溶性成分CA，得率高且能够保持良好的抗氧化活性，是一种绿色、环保、高效的迷迭香抗氧化剂提取方法。Abstract: Objective: To extract rosmarinic acid (RA) and carnosic acid (CA) from Rosmarinus officinalis L. using deep eutectic solvents (DESs) simultaneously and optimize the extraction process, which provided the basis for development and utilization of its antioxidant components. Methods: firstly, the DESs with the highest yield of RA and CA was screened out from 37 different DESs combination. Then, the effects of different molar ratio, water content (%), liquid-solid ratio (mL/g), extraction time (min) and extraction temperature (℃) on the yield of RA and CA were studied by single factor experiments. On this basis, the response surface method was employed to optimize the extraction process. Finally, the extraction yields of RA and CA and the DPPH· free radical scavenging ability were compared between DESs and traditional solvent extraction (80% ethanol, n-hexane). Results: lactic acid/1,4-butanediol (molar ratio 1:2) DESs was chosen as the optimal extraction solvent, and the optimum extraction parameters were as follow: Water content (12%), liquid-solid ratio (44:1 mL/g), extraction time (60 min), and extraction temperature (40℃). Under these conditions, the yields of RA and CA were 20.247 and 34.086 mg/g, respectively. Compared with the traditional extraction process, the total yields of RA and CA were increased by 1.4 times (ethanol) and 1.5 times (n-hexane), respectively, and the extraction time was shorted. Using vitamin C (0.03 mg/mL, scavenging rate 89.77%) as control, under the same concentration of R. officinalis L. (0.625 mg/mL), DESs scavenging rate was 73.17%, which was higher than ethanol (66.93%) and n-hexane (62.57%). Conclusions: DESs extraction method could simultaneously extract hydrophilic RA and hydrophobic CA from R. officinalis L., with higher yield and antioxidant activity. It could be a green, environmentally friendly and efficient extraction method for antioxidants from R. officinalis L..
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迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）是唇形科迷迭香属植物[1]，原产于地中海地区[2]，我国多地均有种植，药食两用，是一种重要的香料，亦常用作化妆品、医药、食品等领域的原料[3]，在我国“迷迭香提取物”作为天然抗氧化食品添加剂（GB 1886.172-2016，食品安全国家标准，食品添加剂）[4]，广泛应用于油脂、肉类及海鲜等的运输、贮藏和加工过程中的抗氧化和保鲜[5-9]。迷迭香提取物中抗氧化活性成分以萜类物质为主[10]，包括迷迭香酚、迷迭香酸、鼠尾草酚、鼠尾草酸等[11]，其中代表性成分为水溶性的迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）和脂溶性的鼠尾草酸（Carnosic acid，CA）（化学结构如图1）[12]，在“迷迭香提取物”国家标准中，将迷迭香酸和鼠尾草酸的含量作为迷迭香提取物质量控制的成分，许多研究也表明迷迭香酸和鼠尾草酸具有预防糖尿病和肥胖[13]、抗肿瘤[14]、神经保护[15]、保肝[16]和抗菌[17]等作用。
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图 1 鼠尾草酸和迷迭香酸化学结构式Figure 1. Chemical structural formulae of carnosic acid and rosmarinic acid目前，做为食品添加剂的“迷迭香提取物”提取方法主要有乙醇热回流法、正己烷冷浸法和超临界流体萃取法[4]。超临界流体萃取法和正己烷冷浸提取法仅获得脂溶性成分[18]；乙醇加热回流提取容易使其中鼠尾草酸氧化成中间产物鼠尾草酚，迷迭香酸也易氧化降解，使得提取物抗氧化性能显著降低[19]。总之，现有的提取方法存在设备成本高、提取耗能耗时、所用溶剂易燃易爆、提取效率低等问题[20-22]。
低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent，DESs）这一概念最早在2003年由Abboot等[23]提出，它是由氢键受体（Hydrogen Bond Acceptors，HBAs）和氢键供体（Hydrogen Bond Donors，HBDs）混合而成的两组分或三组分低共熔混合物[24]，因其具有无毒、易于合成、成本低、提取效率高、保护活性物质、可回收降解、安全性高、节约能耗等特点[25-26]，已被广泛应用于多酚[27-28]、黄酮[29-30]、有机酸[31]等天然活性物质的提取。
Wojeicchowski等[31]研究了疏水性DESs提取迷迭香中的脂溶性成分鼠尾草酸和鼠尾草酚。Vladimir-Knežević等[32]研究了亲水性DESs提取迷迭香中的水溶性成分迷迭香酸等。Vieira等[33]研究了两相（疏水性和亲水性）DESs同时提取迷迭香中脂溶性和水溶性成分。到目前为止，未见采用单相DESs同时提取迷迭香中脂溶性和水溶性有效成分的报道。本研究以同时提取迷迭香中的代表成分迷迭香酸和鼠尾草酸为目标，从多种可能的DESs组合中，筛选出组成和组分比例最优的DESs作为提取试剂，通过单因素实验和响应面法优化探索迷迭香中主要抗氧化活性成分的提取工艺，为高效快速提取迷迭香抗氧化物及其资源开发提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
迷迭香药材 购自安徽亳州药材市场，经烟台大学药学院生药室李桂生博士鉴定为迷迭香枝叶（Rosmarinus officinalis L.）；迷迭香酸对照品 纯度98.9%，中国食品药品检定研究院；鼠尾草酸对照品 纯度≥99%，成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；乳酸、柠檬酸、氯化胆碱、甜菜碱、1,2-丙二醇、尿素、1,4-丁二醇、1,3-丁二醇、苹果酸、葡萄糖、异丙醇、丙三醇、乙二醇、L脯氨酸、L精氨酸、薄荷醇、月桂酸、壬酸、癸酸、无水乙醇 均为国产分析纯。
Agilent 1260型高效液相色谱仪（配DAD检测器） 美国Agilent公司；DF-101T集热式恒温加热磁力搅拌器 上海秋佐科学仪器有限公司；AR1140型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MS-12Pro高速离心机 群安实验仪器有限公司；AHA-A数显恒温振荡器 常州天瑞仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 低共熔溶剂的制备及筛选
1.2.1.1 低共熔溶剂的制备
分别选取氢键受体和氢键供体，二者混合后加入适量水，采用加热震荡方式进行制备，在80 ℃水浴下进行震荡使其形成稳定、均一体系的DESs[31]，冷却备用，不能互溶或者分层则不能形成DESs。
1.2.1.2 低共熔溶剂的筛选
分别以氯化胆碱、甜菜碱、柠檬酸和乳酸为HBA和选择的HBD按照摩尔比1:2，含水量30%共计37种组合（表1），组合包含亲水性DESs和疏水性DESs[34-35]，以相同的提取条件进行迷迭香中RA和CA的提取，考察不同DESs对RA和CA的提取得率，选择提取得率最高的DESs做后续工艺优化研究。
表 1 不同组分DESs的制备Table 1. Preparation of DESs with different components组别 氢键
受体氢键
供体摩尔
比含水
量组别 氢键
受体氢键
供体摩尔
比含水
量1 氯化
胆碱苹果酸 1:2 30% 20 甜菜
碱乙二醇 1:2 30% 2 葡萄糖 21 L-脯氨酸 3 柠檬酸 22 丙二醇 4 尿素 23 柠檬
酸1,3-丁二醇 5 乳酸 24 1,4-丁二醇 6 丙三醇 25 丙三醇 7 1,3-丁二醇 26 异丙醇 8 1,4-丁二醇 27 1,2-丙二醇 9 乙二醇 28 乙二醇 10 1,2-丙二醇 29 尿素 11 L-脯氨酸 30 葡萄糖 12 甜菜碱 苹果酸 31 乳酸 尿素 13 葡萄糖 32 葡萄糖 14 柠檬酸 33 1,4-丁二醇 15 尿素 34 1,2-丙二醇 16 乳酸 35 1,3-丁二醇 17 丙三醇 36 丙三醇 18 1,3-丁二醇 37 乙二醇 19 1,4-丁二醇 1.2.2 迷迭香中RA和CA的提取
称取经粉碎过60目筛的迷迭香粉末约0.1 g，按液固比20:1（mL/g）加入DESs，45 ℃加热提取40 min，离心5 min（转速12000 r/min），取上清液稀释，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即待测样品。
1.2.3 RA和CA含量的测定及标准曲线绘制
1.2.3.1 RA和CA含量的测定
参考文献[4]，采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定RA和CA的含量。色谱柱Symmetry C18（4.6×250 mm，5 μm）；进样量20 μL，流速1 mL/min，柱温35 ℃；流动相：A相为0.2%磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱见表2。DAD检测器扫描范围为230～360 nm。将待测样品以上述色谱条件进行HPLC分析，按照下式计算RA和CA的得率。
表 2 流动相梯度洗脱程序Table 2. Mobile phase gradient elution procedure时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0 80 20 8 70 30 12 45 55 16 30 70 20 20 80 22 20 80 26 30 70 28 50 50 32 80 20 35 80 20 RA（CA）得率（mg/g）=提取液中RA（CA）浓度×提取液体积/迷迭香粉质量（g）
1.2.3.2 标准曲线绘制
精密称取迷迭香酸标准品20.87 mg和鼠尾草酸标准品34.78 mg，置于25 mL容量瓶中，以甲醇稀释定容作为母液。分别吸取1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中并以甲醇稀释定容，作为系列混合对照品溶液。分别吸取20 μL上述混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪中，记录色谱峰面积。
1.2.4 单因素实验
使用选择的DESs最优组合，依照1.2.2提取方法，固定提取温度35 ℃，提取时间30 min，含水量30%，液固比20:1 g/mL，考察不同摩尔比（1:1、1:2、1:3、1:4）对RA和CA提取得率的影响，确定最佳摩尔比。分别设定含水量，液固比，提取时间，提取温度4个影响提取得率的因素在以下条件进行单因素实验：含水量0、10%、20%、30%、40%、50%（提取温度35 ℃，提取时间30 min，液固比20:1 g/mL，摩尔比1:2）；液固比10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 g/mL（提取温度35 ℃，提取时间30 min，摩尔比1:2，含水量10%）；提取时间30、60、90、120 min（提取温度35 ℃，含水量10%，液固比为20:1 g/mL，摩尔比1:2）；提取温度25、35、45、55、65 ℃（提取时间60 min，含水量10%，液固比20:1 g/mL，摩尔比1:2）。
1.2.5 响应面优选提取方法
参考单因素实验结果，以提取时间（A），DESs含水量（B），液固比（C），提取温度（D）作为考察因素，以RA和CA的得率为考察指标，利用Box-Behnken Design（BBD）法设计四因素三水平的响应面优化试验，试验因素与水平见表3。
表 3 响应面因素水平设计Table 3. Factors and levels of response surface methodology水平 因素 提取时间A（min） 含水量B（%） 液固比C（mL/g） 提取温度D（℃） −1 40 0 30 35 0 60 10 40 45 1 80 20 50 55 1.2.6 传统有机溶剂提取迷迭香中的抗氧化成分
参考文献[3,36]，采用80%乙醇回流提取和正己烷冷浸法提取迷迭香中的有效成分RA和CA，和DESs提取液比较其提取率和体外清除DPPH自由基的能力。取迷迭香0.5 g，加入80%乙醇25 mL，回流提取1 h，放冷后过滤，用80%乙醇定容至25 mL，作为乙醇回流提取液；取迷迭香0.5 g，用25 mL正己烷室温下浸提24 h，过滤，旋蒸除去溶剂，用80%乙醇溶解并定容至25 mL，作为正己烷冷浸提取液。按照1.2.3项下“含量测定”方法，分别测定不同方法提取RA和CA的得率。
1.2.7 抗氧化活性测定
比较不同提取方法所得提取液DPPH自由基清除能力。参考文献[37]，用无水乙醇配制0.1 mmol/L DPPH溶液，避光备用，精密称取3.0 mg维生素C定容于100 mL容量瓶中，避光保存。取4支试管，分别加入DESs、乙醇、正己烷提取液各1 mL，并加入3 mL的DPPH溶液，避光反应30 min，此为样品组，记为A1；取1 mL提取液并加入3 mL无水乙醇，此为空白组，记作A2；取1 mL双蒸水加入3 mL的DPPH溶液，此为对照组，记为A0。在517 nm测吸光度。按照下列公式计算各自对DPPH自由基清除率：
1.3 数据处理
本实验中所有实验均重复3次，单因素实验数据处理使用SPSS 20.0和Origin 8.0，响应面试验设计及数据处理使用Design expert 12。
2. 结果与分析
2.1 RA和CA标准曲线及样品检测
以对照品浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标进行线性回归分析，得到的迷迭香酸的回归方程为：y=16593x+305.29，R2=0.9978，表明在0.03843~0.8348 mg/mL范围内线性良好；鼠尾草酸的回归方程为：y=16593x+305.29，R2=0.9978，表明在0.6956~1.39120 mg/mL范围内线性良好。图2为高效液相含量测定色谱图。
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图 2 正己烷（A）、乙醇（B）和DESs（C）提取所得RA（1）和CA（2）及标准品（D）的HPLC色谱图Figure 2. HPLC chromatograms of RA (1) and CA (2) and standards (D) obtained by extraction with n-hexane (A), ethanol (B), and DESs (C)2.2 DESs的筛选
经过筛选舍去不能形成DESs的组合，采用其余37种组合以相同的方法提取迷迭香中的RA和CA，以二者得率为考察指标，结果如图3所示。由图3得知，以乳酸作为氢键受体，1,4-丁二醇作为氢键供体，RA和CA的得率最高，分别达到11.78和21.14 mg/g。因此选择以乳酸/1,4-丁二醇构成的DESs体系提取迷迭香中的RA和CA。
2.3 单因素实验结果
2.3.1 摩尔比对提取的影响
以乳酸/1,4-丁二醇构成的DESs体系，考察二者摩尔比对RA和CA提取得率的影响，结果见图4。由图4得知，随着氢键受体乳酸和氢键供体1,4-丁二醇摩尔比的增加，RA和CA的得率均呈现先增加后略降低的趋势。DESs是由HBA和HBD通过分子间氢键形成的一种在室温下均一稳定的液态混合物，二者摩尔比影响DESs的电导率和凝固点[28]，从而影响到DESs的形成和提取效果，在摩尔比1:2时，RA和CA的得率均较高，可能是1,4-丁二醇增强了溶剂离子对RA和CA的亲和力，从而增强了其溶出速率；随着供体的增加，DESs中氢键受体的比例降低，相对减弱了其对RA和CA的分子作用力，使得两者的得率均下降。因此选择乳酸/1,4-丁二醇的摩尔比为1:2。
2.3.2 含水量对提取的影响
含水量对RA和CA提取得率的影响见图5。由图5得知，当DESs的含水量从0%至10%时，RA和CA得率均逐渐提高，当含水量达到10%，RA和CA的得率分别达到最大值17.24和29.88 mg/g，之后随着含水量的继续增加，RE和CA的得率均下降，其中CA的下降明显快于RA。乳酸/1,4-丁二醇为亲水性DESs，本身具有一定的流动性，适当增加含水量，可以进一步降低DESs的黏度从而增加了溶剂的传效率，有利于CA和RA的溶出，然而随着含水量的不断增加，DESs的极性进一步增强，极性过大会引起分子间氢键的断裂，降低了DESs和CA及RA之间的相互作用[34]，这种影响对脂溶性的CA最为突出。因此选择含水量10%作为提取条件。
2.3.3 液固比对提取的影响
考察了不同液固比对CA和RA提取效率的影响，结果如图6所示，随着液固比的增加，DESs对CA和RA的提取得率均呈现先增加后下降的趋势，当液固比达到40:1 g/mL时，RA和CA的得率达到最高，分别为18.81和30.02 mg/g，以后随着溶剂的增加，二者得率逐步下降。可能是随着提取液增加，逐步增大了迷迭香粉末及细胞与提取液的接触机会，有利于CA和RA的溶出；但当液固比增加到一定程度后，二者在DESs中的溶解达到饱和，继续增加液固比会降低它们的浓度，导致细胞内外渗透压下降，影响其溶出[28,35] ，进而使CA和RA的得率下降，提取量降低，故选择液固比40:1 g/mL进一步优化。
2.3.4 提取时间对提取的影响
一般来说，提取时间长短决定被提取物能否充分溶出。提取时间对CA和RA的影响见图7。由图7可知，提取时间短时，RA和CA的溶出量少，得率低，当提取时间增加到60 min时，RA和CA的得率分别为22.18和37.49 mg/g，达到最大值，以后随着提取时间的延长，二者得率呈现下降趋势。这种现象可能是随着提取时间的增加，溶剂透过细胞壁进入细胞内，使得目的物在细胞内外产生浓度差，目的物溶出度加大，提取时间达到60 min时，大多数目的物溶出，继续延长提取时间，会造成大量杂质溶出而使目标物溶出受限；另外，由于CA和RA结构不稳定，过长的提取时间造成其氧化降解[28]。因此，提取时间选择为60 min。
2.3.5 温度对提取的影响
温度是影响提取效果的重要因素，因为温度影响DESs的扩散系数、黏度，从而影响DESs对RA和CA的得率。不同温度对RA和CA得率的影响结果如图8所示，随着温度的升高，RA和CA的得率呈现先增大后减小的趋势，当温度从25 ℃上升到45 ℃时，RA和CA的提取得率随着温度提高而上升，可能是因为温度升高降低了DESs的黏度同时增加了RA和CA的溶解度和扩散系数[28]，使得RA和CA的得率增加，温度在45 ℃时，得率最高，分别为18.79和32.54 mg/g。当温度超过45 ℃，RA的得率基本保持不变，但CA的得率逐步降低，这可能是由于CA的化学结构相对于RA不稳定，温度的升高加速了CA的氧化从而导致CA的得率下降[36]。
2.4 响应面试验优化结果
2.4.1 回归模型建立与方差分析
在单因素实验结果的基础上，确定以提取时间（A）、含水量（B）、液固比（C）和提取温度（D）4个因素，每个因素3水平，以RA和CA的得率为指标，共计29组进行BBD实验，通过Design-Expert 12软件进行二次响应面回归分析，其结果见表4~表6。
表 4 响应面试验设计与结果Table 4. Response surface experimental design and results实验号 因素 RA得率
YRA（mg/g）CA得率
YCA（mg/g）A提取
时间B含水量 C液固比 D提取
温度1 1 0 0 −1 15.9064 30.9083 2 0 0 0 0 20.7679 35.0205 3 0 0 0 0 19.8956 34.1383 4 −1 0 0 −1 16.3223 30.1771 5 0 1 0 1 18.8287 25.8098 6 −1 0 0 1 15.949 28.3691 7 0 0 0 0 19.4534 35.1834 8 1 0 1 0 17.4312 28.6489 9 0 0 −1 1 16.9506 27.4402 10 0 1 −1 0 18.5835 26.3429 11 0 1 0 −1 19.1281 29.8569 12 0 0 1 1 20.1701 31.1854 13 0 0 1 −1 19.2963 30.6748 14 0 −1 0 1 16.9203 28.0832 15 −1 0 1 0 19.873 30.8394 16 −1 0 −1 0 14.9627 27.8161 17 −1 −1 0 0 14.7949 29.8171 18 0 −1 −1 0 14.8765 31.5501 19 0 1 1 0 20.0764 30.1807 20 1 −1 0 0 13.4082 26.2485 21 0 −1 0 −1 15.3324 30.2328 22 1 0 0 1 18.1494 26.0213 23 0 0 0 0 20.6987 34.8756 24 0 0 0 0 20.7679 32.9205 25 0 0 −1 −1 19.6539 29.9712 26 1 1 0 0 19.8903 28.9093 27 −1 1 0 0 15.6959 26.7842 28 1 0 −1 0 18.4469 30.8750 29 0 −1 1 0 17.6322 29.0845 表 5 迷迭香酸得率的方差分析结果Table 5. Analysis of variance of rosmarinic acid方差来源 平方和 自由度 均分 F值 P值 模型 122.83 14 8.77 23.38 < 0.0001 ** A 2.65 1 2.65 7.05 0.0188 * B 30.84 1 30.84 82.18 < 0.0001 ** C 10.09 1 10.09 26.89 0.0001 ** D 0.1471 1 0.1471 0.3920 0.5413 AB 7.79 1 7.79 20.75 0.0004 ** AC 8.78 1 8.78 23.39 0.0003 ** AD 1.71 1 1.71 4.56 0.0509 BC 0.3987 1 0.3987 1.06 0.3202 BD 0.8905 1 0.8905 2.37 0.1458 CD 3.20 1 3.20 8.52 0.0112 * A² 39.99 1 39.99 106.54 < 0.0001 ** B² 24.43 1 24.43 65.09 < 0.0001 ** C² 0.7608 1 0.7608 2.03 0.1764 D² 6.63 1 6.63 17.66 0.0009 ** 残差 5.25 14 0.3753 失拟项 3.78 10 0.3779 1.02 0.5375 纯误差 1.48 4 0.3689 总离差 128.09 28 注：**表示P<0.01，差异极显著；*表示P<0.05，差异显著；表6同。 表 6 鼠尾草酸得率的方差分析Table 6. Analysis of variance of carnosic acid方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 189.17 14 13.51 16.30 < 0.0001 ** A 0.4003 1 0.4003 0.4827 0.4986 B 4.24 1 4.24 5.11 0.0402 * C 3.65 1 3.65 4.40 0.0545 D 18.53 1 18.53 22.35 0.0003 ** AB 8.10 1 8.10 9.77 0.0074 ** AC 6.89 1 6.89 8.31 0.0121 * AD 2.37 1 2.37 2.86 0.1130 BC 9.93 1 9.93 11.98 0.0038 ** BD 0.9001 1 0.9001 1.09 0.3151 CD 2.31 1 2.31 2.79 0.1171 A² 59.54 1 59.54 71.81 < 0.0001 ** B² 72.54 1 72.54 87.48 < 0.0001 ** C² 22.94 1 22.94 27.66 0.0001 ** D² 44.37 1 44.37 53.51 < 0.0001 ** 残差 11.61 14 0.8292 失拟项 8.13 10 0.8130 0.9349 0.5791 纯误差 3.48 4 0.8696 总离差 200.77 28 根据表4得出的RA得率的回归方程如下：
YRA=20.32+0.4695A+1.60B+0.9171C+0.1107D+1.40AB−1.48AC+0.6541AD−0.3157BC−0.4718BD+0.8943CD−2.48A2−1.94B2−0.3425C2−1.01D2
方差分析结果如表5所示，模型P<0.01，表示模型显著有效；R2=0.9590，校正决定系数R2Adj=0.9180，失拟项P>0.05不显著，表明模型拟合度好，预测值与真实值偏差不大，实验误差对于实验结果影响较小。在设定的四个因素中，各因素对RA的提取影响：含水量（B）>液固比（C）>提取时间（A）>提取温度（D），说明在所设因素范围内，含水量和液固比对RA的提取影响是极显著的，其次是提取时间，提取温度对其影响不显著。
图9为不同因素交互作用对RA得率影响的响应面，由图9可知，各因素之间的交互作用对RA的得率有着较大的影响，对模型中的各因素进行交互分析发现，AB、AC、CD之间交互作用对响应值的影响是显著的，只改变提取时间时，RA的得率先上升再趋于平缓，可见随着时间的增加RA已经基本提取完全。当固定其他因素时，RA的得率随着含水量的增加呈现先上升再平缓再下降的趋势，原因是RA是水溶性良好的成分，在一定范围内含水量的增加会使得RA的得率增加，但过多的水会破坏DESs体系从而影响RA的得率。当其他因素不变时，RA的得率随着液固比的改变变化较小，原因可能是RA在DESs溶剂中达到饱和。当其他因素固定时，提取温度改变时，RA的得率先增加后减小但总体变化不大，原因是温度升高可以降低DESs的粘度，增加其与迷迭香的接触和分子间的碰撞，但温度过高会导致RA不稳定，可能会影响得率，但变化不大可能是RA已经饱和。影响RA得率的交互作用影响顺序AC>AB>CD>AD>BD>BC。
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图 9 迷迭香酸得率各因素交互作用响应面图Figure 9. Rosmarinic acid response surface of interaction of various factors根据表4得出的CA的回归方程如下：
YCA=34.43−0.1826A−0.5944B+0.5515C−1.24D+1.42AB−1.31AC−0.7697AD+1.58BC−0.4744BD+0.7604CD−3.03A2−3.34B2−1.88C2−2.62D2
方差分析如表6所示，模型P<0.01，表示模型显著可靠，R2=0.9422，校正决定系数R2Adj=0.8844，失拟项P>0.05，不显著，证明模型相关度良好，拟合度良好。由上表可知，四种因素中，料液比和提取温度对鼠尾草酸的提取影响是显著的，各因素对鼠尾草酸提取的影响：提取温度（D）>含水量（B）>液固比（C）>提取时间（A）。对模型中各因素交互作用分析发现，各因素交互作用对鼠尾草酸提取的影响顺序BC>AB>AC>AD>CD>BD，其中BC、AB和AC的交互作用对鼠尾草酸的提取效果影响显著。
图10为不同因素交互作用对DESs提取迷迭香中CA得率的影响的响应面图，当其他因素固定不变时，CA得率随着提取时间的增加呈现轻微的先增后降的趋势，这可能是因为DESs具有高效的提取效率，能够短时间溶解迷迭香中的有效成分，但随着时间的延长，CA具有的不稳定性和强氧化性会使得自身转变成为其他成分，从而降低得率。当其他因素不变时，CA的得率随着含水量的增加而减少，因为CA本身为脂溶性物质，水的增多不利于CA的提取[38]。当其他因素不变时，液固比对CA得率的影响较小，但随着液固比的增加，CA的得率也有所增加，因为DESs溶剂的增多更能够将迷迭香中的CA有效提取，但过多的溶剂反而可能将其余杂质提出。当其他因素不变，提取温度改变时，对CA得率，呈现随着温度的上升先升后降的情况，原因是CA对于温度比较敏感，过高的温度可能会破坏CA的结构导致得率的下降。
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图 10 鼠尾草酸得率各因素交互作用响应面图Figure 10. Carnosic acid response surface of interaction of various factors2.4.2 验证实验
通过Design Expert 12.0软件优化得到的最佳的DESs提取RA和CA的工艺为：提取时间59.44 min，含水量11.54%，液固比43.84:1 mL/g，提取温度39.23 ℃，预测RA理论上的得率是20.761 mg/g，CA理论上的得率是34.357 mg/g。但考虑实际情况，最后设定提取时间60 min，含水量12%，液固比为44:1，提取温度为40 ℃，平行三组实验最后测得RA的得率是20.247 mg/g，与软件预测误差为2.476%，CA的实际得率为34.086 mg/g，与软件预测误差为0.795%，实际与模型误差较小，证明模型的有效性。
2.5 不同提取方法得率比较
在相同的液固比条件下，比较了80%乙醇回流提取1 h、正己烷冷浸提取24 h和优选出的DESs提取迷迭香中的RA和CA，结果见表7。
表 7 传统提取方法提迷迭香中RA和CA的得率Table 7. Yields of RA and CA from Rosmarinus officinalis L. by traditional extraction methods提取工艺 迷迭香酸得率
（mg/g）鼠尾草酸得率
（mg/g）总得率
（mg/g）正己烷冷浸24 h − 35.10±1.16 35.93 80%乙醇回流 14.30±1.07 23.45±1.13 37.75 DESs提取 20.25±3.25 34.09±3.11 54.34 由表7可知，传统的正己烷冷浸提取仅能提出脂溶性的CA，根据相似相溶原理，作为非极性有机溶剂的正己烷很难提出水溶性的RA。DESs是依靠氢键供体和氢键受体结合产生的氢键作用力，并且不同的组合对提取物具有不同的选择性，十分灵活。Vieira等[33]研究了亲水性和疏水性DESs提取迷迭香中化学成分的差异，以薄荷醇/月桂酸（摩尔比2:1）组成的疏水性DESs从迷迭香中提到的是脂溶性的鼠尾草酸和鼠尾草酚；以乳酸/葡萄糖（摩尔比5:1）组成的亲水性DESs从迷迭香中提取得到的是水溶性的迷迭香酸；将两种DESs溶剂按照1:1比例混合形成双相DESs，可以将迷迭香中的鼠尾草酸和迷迭香酸同时提出，分别分布在上下两相中。本试验采用的乳酸/1,4-丁二醇（摩尔比1:2）单相DESs体系，能够将鼠尾草酸和迷迭香酸同时提出，表明极性和80%乙醇相近，但是相较于DESs提取，80%乙醇回流因其过高的提取温度，RA和CA不同程度的氧化，使得得率显著低于DESs提取。
2.6 抗氧化能力测定结果
不同提取方法所得提取液DPPH自由基清除能力实验结果见图11。由图11可知，迷迭香DESs提取物、80%乙醇回流提物、正己烷冷浸提取物（三者均为0.625 mg/mL迷迭香提取液）和维生素C（0.03 mg/mL）的DPPH清除率分别为73.17%、66.93%、62.57%和89.77%。从抗氧化方面进一步验证了建立的DESs提取工艺相较于传统的迷迭香提取方法，更好的保留了抗氧化活性成分RA和CA。
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图 11 不同提取方法所得提取液与维生素C的DPPH清除能力Figure 11. DPPH scavenging capacity of extracts obtained by different extraction methods3. 结论
本实验研究建立了DESs同时提取迷迭香中水溶性成分RA和脂溶性成分CA的新工艺。以RA和CA的最高提取得率为指标，从合成的37种DESs体系中，筛选出以乳酸/1,4-丁二醇（摩尔比1:2）构成的最适DESs体系。在单因素实验的基础上，采用响应面法优化出了同时提取迷迭香中RA和CA的最佳提取工艺（含水量12%、液固比44:1 mL/g、提取时间60 min，提取温度40 ℃），在此条件下，RA和CA的得率分别为20.247和34.086 mg/g，相较于乙醇回流和正己烷冷浸传统提取工艺，DESs提取RA和CA总得率分别提高了1.4倍和1.5倍；通过DPPH自由基清除实验，进一步验证了DESs提取迷迭香所得迷迭香抗氧化物，其质量明显优于传统的有机溶剂提取。和已有文献[31-33]报道的DESs提取迷迭香抗氧化物成分工艺相比，能够实现单相DESs同时将水溶性迷迭香酸和脂溶性鼠尾草酸提出。本研究为高效快速提取迷迭香抗氧化物及其资源开发利用提供科学依据。
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图 1 鼠尾草酸和迷迭香酸化学结构式
Figure 1. Chemical structural formulae of carnosic acid and rosmarinic acid
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图 2 正己烷（A）、乙醇（B）和DESs（C）提取所得RA（1）和CA（2）及标准品（D）的HPLC色谱图
Figure 2. HPLC chromatograms of RA (1) and CA (2) and standards (D) obtained by extraction with n-hexane (A), ethanol (B), and DESs (C)
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图 9 迷迭香酸得率各因素交互作用响应面图
Figure 9. Rosmarinic acid response surface of interaction of various factors
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图 10 鼠尾草酸得率各因素交互作用响应面图
Figure 10. Carnosic acid response surface of interaction of various factors
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图 11 不同提取方法所得提取液与维生素C的DPPH清除能力
Figure 11. DPPH scavenging capacity of extracts obtained by different extraction methods
表 1 不同组分DESs的制备
Table 1 Preparation of DESs with different components
组别 氢键
受体氢键
供体摩尔
比含水
量组别 氢键
受体氢键
供体摩尔
比含水
量1 氯化
胆碱苹果酸 1:2 30% 20 甜菜
碱乙二醇 1:2 30% 2 葡萄糖 21 L-脯氨酸 3 柠檬酸 22 丙二醇 4 尿素 23 柠檬
酸1,3-丁二醇 5 乳酸 24 1,4-丁二醇 6 丙三醇 25 丙三醇 7 1,3-丁二醇 26 异丙醇 8 1,4-丁二醇 27 1,2-丙二醇 9 乙二醇 28 乙二醇 10 1,2-丙二醇 29 尿素 11 L-脯氨酸 30 葡萄糖 12 甜菜碱 苹果酸 31 乳酸 尿素 13 葡萄糖 32 葡萄糖 14 柠檬酸 33 1,4-丁二醇 15 尿素 34 1,2-丙二醇 16 乳酸 35 1,3-丁二醇 17 丙三醇 36 丙三醇 18 1,3-丁二醇 37 乙二醇 19 1,4-丁二醇 
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表 2 流动相梯度洗脱程序
Table 2 Mobile phase gradient elution procedure
时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0 80 20 8 70 30 12 45 55 16 30 70 20 20 80 22 20 80 26 30 70 28 50 50 32 80 20 35 80 20
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表 3 响应面因素水平设计
Table 3 Factors and levels of response surface methodology
水平 因素 提取时间A（min） 含水量B（%） 液固比C（mL/g） 提取温度D（℃） −1 40 0 30 35 0 60 10 40 45 1 80 20 50 55
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表 4 响应面试验设计与结果
Table 4 Response surface experimental design and results
实验号 因素 RA得率
YRA（mg/g）CA得率
YCA（mg/g）A提取
时间B含水量 C液固比 D提取
温度1 1 0 0 −1 15.9064 30.9083 2 0 0 0 0 20.7679 35.0205 3 0 0 0 0 19.8956 34.1383 4 −1 0 0 −1 16.3223 30.1771 5 0 1 0 1 18.8287 25.8098 6 −1 0 0 1 15.949 28.3691 7 0 0 0 0 19.4534 35.1834 8 1 0 1 0 17.4312 28.6489 9 0 0 −1 1 16.9506 27.4402 10 0 1 −1 0 18.5835 26.3429 11 0 1 0 −1 19.1281 29.8569 12 0 0 1 1 20.1701 31.1854 13 0 0 1 −1 19.2963 30.6748 14 0 −1 0 1 16.9203 28.0832 15 −1 0 1 0 19.873 30.8394 16 −1 0 −1 0 14.9627 27.8161 17 −1 −1 0 0 14.7949 29.8171 18 0 −1 −1 0 14.8765 31.5501 19 0 1 1 0 20.0764 30.1807 20 1 −1 0 0 13.4082 26.2485 21 0 −1 0 −1 15.3324 30.2328 22 1 0 0 1 18.1494 26.0213 23 0 0 0 0 20.6987 34.8756 24 0 0 0 0 20.7679 32.9205 25 0 0 −1 −1 19.6539 29.9712 26 1 1 0 0 19.8903 28.9093 27 −1 1 0 0 15.6959 26.7842 28 1 0 −1 0 18.4469 30.8750 29 0 −1 1 0 17.6322 29.0845
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表 5 迷迭香酸得率的方差分析结果
Table 5 Analysis of variance of rosmarinic acid
方差来源 平方和 自由度 均分 F值 P值 模型 122.83 14 8.77 23.38 < 0.0001 ** A 2.65 1 2.65 7.05 0.0188 * B 30.84 1 30.84 82.18 < 0.0001 ** C 10.09 1 10.09 26.89 0.0001 ** D 0.1471 1 0.1471 0.3920 0.5413 AB 7.79 1 7.79 20.75 0.0004 ** AC 8.78 1 8.78 23.39 0.0003 ** AD 1.71 1 1.71 4.56 0.0509 BC 0.3987 1 0.3987 1.06 0.3202 BD 0.8905 1 0.8905 2.37 0.1458 CD 3.20 1 3.20 8.52 0.0112 * A² 39.99 1 39.99 106.54 < 0.0001 ** B² 24.43 1 24.43 65.09 < 0.0001 ** C² 0.7608 1 0.7608 2.03 0.1764 D² 6.63 1 6.63 17.66 0.0009 ** 残差 5.25 14 0.3753 失拟项 3.78 10 0.3779 1.02 0.5375 纯误差 1.48 4 0.3689 总离差 128.09 28 注：**表示P<0.01，差异极显著；*表示P<0.05，差异显著；表6同。
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表 6 鼠尾草酸得率的方差分析
Table 6 Analysis of variance of carnosic acid
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 189.17 14 13.51 16.30 < 0.0001 ** A 0.4003 1 0.4003 0.4827 0.4986 B 4.24 1 4.24 5.11 0.0402 * C 3.65 1 3.65 4.40 0.0545 D 18.53 1 18.53 22.35 0.0003 ** AB 8.10 1 8.10 9.77 0.0074 ** AC 6.89 1 6.89 8.31 0.0121 * AD 2.37 1 2.37 2.86 0.1130 BC 9.93 1 9.93 11.98 0.0038 ** BD 0.9001 1 0.9001 1.09 0.3151 CD 2.31 1 2.31 2.79 0.1171 A² 59.54 1 59.54 71.81 < 0.0001 ** B² 72.54 1 72.54 87.48 < 0.0001 ** C² 22.94 1 22.94 27.66 0.0001 ** D² 44.37 1 44.37 53.51 < 0.0001 ** 残差 11.61 14 0.8292 失拟项 8.13 10 0.8130 0.9349 0.5791 纯误差 3.48 4 0.8696 总离差 200.77 28
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表 7 传统提取方法提迷迭香中RA和CA的得率
Table 7 Yields of RA and CA from Rosmarinus officinalis L. by traditional extraction methods
提取工艺 迷迭香酸得率
（mg/g）鼠尾草酸得率
（mg/g）总得率
（mg/g）正己烷冷浸24 h − 35.10±1.16 35.93 80%乙醇回流 14.30±1.07 23.45±1.13 37.75 DESs提取 20.25±3.25 34.09±3.11 54.34
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