Study of the Thermal Protection Mechanism of Animal Proteins and Plant Proteins on Betanin
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摘要: 为探究不同蛋白质对甜菜苷的热保护作用，明晰其保护机制，本文拟采用两种动物蛋白（乳铁蛋白和β-乳球蛋白）、两种植物蛋白（大米蛋白和大豆分离蛋白）为原料，采用浊度、紫外光谱、粒径、分子模拟等手段表征蛋白-甜菜苷复合物的形成和相互作用机制。结果表明，四种蛋白质均能提高甜菜苷的热稳定性，保护效果为：乳铁蛋白>大豆分离蛋白>β-乳球蛋白≈大米蛋白，蛋白质对甜菜苷热稳定性的提高与蛋白-甜菜苷复合物的形成有关。通过浊度、紫外光谱、粒径的实验结果推测，甜菜苷与乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大豆分离蛋白的结合程度高于大米蛋白，这可能是由于大米蛋白的低溶解度和紧密结构造成的。此外，相互作用和分子对接的结果显示，乳铁蛋白与甜菜苷主要通过氢键和静电相互作用结合，β-乳球蛋白与甜菜苷主要通过氢键发生相互作用，大米蛋白与甜菜苷主要通过疏水相互作用结合，大豆分离蛋白与甜菜苷主要通过氢键和静电相互作用结合。本研究为蛋白-天然色素的相互作用及甜菜苷的护色研究提供理论基础。Abstract: In order to explore the thermal protective effects of different proteins on betanin and clarify its protective mechanism, two animal proteins-lactoferrin and β-lactoglobulin, and two plant proteins-rice protein and soybean protein isolate were used. The formation and interaction mechanism of protein-betanin complex were characterized from turbidity, UV spectrum, particle size, and molecular simulation. The results showed that all the four proteins could improve the thermal stability of betanin, the protective effect was: Lactoferrin>soy protein isolate>β-lactoglobulin≈rice protein. The improvement of the thermal stability of proteins to betanin was related to the formation of protein-betanin complex. The results of turbidity, UV spectrum and particle size experiments suggested that the affinity of betanin with lactoferrin, β-lactoglobulin and soy protein isolate was higher than that of rice protein, which might be caused by the low solubility and tight structure of rice protein. In addition, the results of interaction and molecular docking showed that lactoferrin and betanin were mainly bound through hydrogen bond and electrostatic interaction, hydrogen bond played a dominant role in the interaction between β-lactoglobulin and betanin, the main interaction between rice protein and betanin was hydrophobic interaction, and soy protein isolate bound to betanin mainly by hydrogen bond and electrostatic interaction. This study provides a theoretical basis for protein-natural pigment interaction and the research of protection of betanin.
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Keywords:
- betanin /
- protein /
- interaction /
- thermal stability /
- thermal protection
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甜菜苷是一种可食用的水溶性天然色素，呈现玫瑰红至紫红色，主要来源于甜菜根、苋菜和仙人掌科植物中。近年来，出于对安全和健康的考虑，消费者们越来越倾向于避免食用人工合成色素，而更加偏爱天然色素[1]。甜菜苷因具有抗氧化性、抗癌、抗炎等多种生物活性而引起了广泛的关注[2-3]。然而，高温、氧气、光照等多种因素都会促进甜菜苷的降解，使其从鲜艳的紫红色逐渐褪为浅黄色，其生物活性也因此而损失[4]。其中，高温作为最大的影响因素，极大地限制了甜菜苷在食品工业中的应用。在Herbach等[5]的研究中，甜菜苷在85 ℃下半衰期仅为11.1 min。目前有许多关于提高甜菜苷稳定性的研究，其中，大多数有效的方法为微胶囊、脂质体、水凝胶等包封体系[6-7]，但这些包封体系步骤繁多、成本较高，在食品工业生产中难以实现。因此，寻找一种效果显著且简单易行的方法至关重要且意义重大。
蛋白质是一种重要的大分子营养素，具有乳化性、凝胶性等多种功能性质，常被用做生物活性物质的载体[8]。许多研究表明，蛋白质能与天然色素通过相互作用形成复合物并提高天然色素的稳定性。如经热处理的牛乳蛋白[9]能显著提高花青素的热、光和氧化稳定性。大豆分离蛋白[10]与花青素发生疏水相互作用从而提高其稳定性。Zhao等[11]发现大豆分离蛋白纤维可与甜菜红素通过疏水相互作用结合并将甜菜红素的热保留率从55.3%提高至75.9%。乳清分离蛋白[12]与甜菜苷通过氢键或范德华力发生相互作用并提高甜菜苷的热稳定性。这些研究表明，与蛋白质通过非共价相互作用形成复合物是一种保护天然色素的有效方法。然而，到目前为止，利用蛋白质提高甜菜苷稳定性的研究依然十分有限，需要探索更多有效提高甜菜苷稳定性的可用资源。乳铁蛋白是牛奶中的一种铁结合糖蛋白，具有多种对人体有益的功能，如抗菌、抗炎和抗肿瘤，调节免疫系统，影响铁的代谢等[13-14]，β-乳球蛋白是乳清蛋白中的主要蛋白，乳铁蛋白和β-乳球蛋白均属于优质动物蛋白，常被生产商作为功能性食品原料开发功能性食品。植物蛋白相比动物蛋白来源丰富、价格低廉，且由于安全性和环境友好等优点，近年来引起生产商和消费者的关注[15]。大米蛋白是一种常见的植物膳食蛋白，具有低致敏性、降低胆固醇、降血压等功能活性，存在潜在的应用价值[16]。大豆分离蛋白是目前应用最广泛的植物蛋白，具有较好的溶解性，良好的起泡性、乳化性[17]。
本文拟采用两种动物蛋白——乳铁蛋白、β-乳球蛋白和两种植物蛋白——大米蛋白、大豆分离蛋白为原料，探究它们对甜菜苷热稳定性的影响，采用浊度、紫外光谱、粒径等方法表征蛋白-甜菜苷复合物的形成，并研究四种蛋白质与甜菜苷的相互作用机制，最后，采用分子对接的手段将蛋白质与甜菜苷的相互作用可视化。本研究为甜菜苷稳定性研究提供了更多的思路，拓宽了提高甜菜苷稳定性的可用蛋白质资源范围。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
甜菜苷（用糊精稀释的红甜菜根的提取物，CAS No.：7659-95-2） 上海源叶生物科技有限公司；乳铁蛋白（纯度97%） 新西兰Hokitika公司；β-乳球蛋白 美国Davisco Foods International公司；大米蛋白（纯度83.4%） 江西恒顶食品有限公司；大豆分离蛋白（纯度91.9%） 山东临沂山松生物有限公司；PBS磷酸盐缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；尿素、十二烷基硫酸钠 美国Sigma公司；氯化钠 西陇科学股份有限公司。
RT-10磁力搅拌器 德国IKA公司；UV-2450紫外可见分光光度计 日本Shimadzu公司；Zetasizer Nano ZS纳米粒度仪 英国Malvern公司；SU8100扫描电子显微镜 日本Hitachi公司
1.2 实验方法
1.2.1 蛋白-甜菜苷复合物的制备
蛋白粉末溶于PBS缓冲液（10 mmol/L，pH7.0）中，过夜搅拌以使蛋白质充分水合，经4800 r/min离心30 min后取上清液备用。甜菜苷溶于相同PBS缓冲液中，现配现用。蛋白-甜菜苷复合物的制备方法在Zhao等[11]的基础上略加修改。将蛋白质溶液与甜菜苷溶液按一定比例混合，磁力搅拌30 min，形成蛋白-甜菜苷混合液。
1.2.2 蛋白质对甜菜苷热稳定性的影响
甜菜苷的热稳定性通常在70~90 ℃下进行研究[5,18]。参考胡婷等[12]的方法制备蛋白-甜菜苷混合溶液：蛋白质浓度为5、10、20 mg/mL，甜菜苷浓度为5 mg/mL，使得蛋白质与甜菜苷的质量比分别为1:1、2:1、4:1，将蛋白-甜菜苷混合液置于80 ℃下水浴加热，样品在相应的时间（0、10、20、40、60 min）取出并冰浴冷却至室温，经8000 r/min离心30 min后取上清液，在538 nm处测定紫外吸收值并代入标准曲线（R2=0.9999），得到相应的甜菜苷含量。采用甜菜苷保留率（RR）表示其热稳定性，通过下列公式计算甜菜苷的保留率。
式中：Ct表示加热t时间的甜菜苷含量（mg/mL）；C0表示初始样品的甜菜苷含量（mg/mL）。
1.2.3 蛋白质-甜菜苷复合物浊度的测定
蛋白-甜菜苷混合液的浊度按照Huang等[19]的方法采用紫外可见分光光度计在600 nm处测量，相应浓度的甜菜苷水溶液作为空白被扣除，通过宏观浊度的比较初步判定胶体复合物的形成。其中蛋白质终浓度为20 mg/mL，蛋白质与甜菜苷的质量比为8:0、8:1、8:2、8:3、8:4。
1.2.4 蛋白质-甜菜苷复合物紫外光谱测定
采用紫外光谱测定蛋白-甜菜苷复合物的紫外吸收，实验方法在Cai等[20]的方法上稍作修改。为使实验数据更加准确，调整蛋白质浓度使样品的紫外吸收落在0.2~0.8范围内。乳铁蛋白、β-乳球蛋白的终浓度为0.8 mg/mL，大米蛋白、大豆分离蛋白的终浓度分别为2.5 mg/mL和1.0 mg/mL，所有样品中蛋白与甜菜苷的质量比均为4:0、4:1、4:2。相应浓度的甜菜苷水溶液作为背景扣除。
1.2.5 蛋白质-甜菜苷复合物粒径的测定
蛋白-甜菜苷复合物的粒径（蛋白质终浓度为1 mg/mL，甜菜苷终浓度为0.5 mg/mL，蛋白质与甜菜苷质量比为8:0、8:1、8:2、8:3、8:4）通过纳米粒度仪Zetasizer Nano ZS测定，蛋白质和水的折射率分别为1.45和1.33。
1.2.6 蛋白质表面形态的测定
将蛋白粉末固定在载物台上进行喷金处理，随后采用扫描电子显微镜观察不同蛋白质的表面形态，加速电压为5 kV，放大倍数为200倍。
1.2.7 蛋白质与甜菜苷的相互作用机制
为了探明不同动物蛋白和植物蛋白与甜菜苷的相互作用机制，采用李如一[21]的方法并稍加修改，在蛋白-甜菜苷混合溶液中（蛋白质终浓度为20 mg/mL，蛋白质与甜菜苷的质量比为8:0、8:1、8:2、8:3、8:4）添加特定的干扰剂（尿素、十二烷基硫酸钠和氯化钠）以破坏或增强蛋白质与甜菜苷的相互作用力。并用样品的浊度表征作用力的改变。
1.2.8 分子对接模拟
采用先前的研究方法[12]，使用Discovery Studio 2019中的CDOCKER程序进行分子对接，将蛋白质与甜菜苷的相互作用可视化。简而言之，乳铁蛋白（PDB:1BLF）和β-乳球蛋白（PDB:3NPO）的结构来源于PDB数据库，大豆蛋白主结构（PDB:3AUP）也来源于PDB数据库，大米蛋白的结构来源于前期同源建模结果的研究[22]。从PubChem数据库中获得甜菜苷的分子结构。然后将甜菜苷与上述4中蛋白结构导入分子对接软件，对受体蛋白和配体甜菜苷进行优化并赋予CHARMm场，采用CDOCKER程序进行分子对接。选择相互作用能最低的对接结果作为相互作用分析的最佳构象。
1.3 数据处理
所有实验均重复三次。方差分析和显著性差异检验由SPSS 26.0进行，采用Origin 2021软件绘图。P<0.05代表样品间存在显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 蛋白质对甜菜苷热稳定性的影响
如图1所示，甜菜苷水溶液在80 ℃下加热60 min后大幅度降解，甜菜苷保留率仅为6.26%，而添加乳铁蛋白后，甜菜苷保留率随乳铁蛋白比例的增大而提高至20.48%、27.01%和23.81%，较大程度地提高了甜菜苷的热稳定性，添加β-乳球蛋白后，甜菜苷保留率随着β-乳球蛋白比例的增加分别提高至8.49%、7.25%和13.86%。大米蛋白的加入使甜菜苷保留率提高至9.94%、12.80%和12.59%。大豆分离蛋白的加入使甜菜苷保留率提高至10.87%、13.19%和16.04%。以上结果表明，动物蛋白乳铁蛋白、β-乳球蛋白和植物蛋白大米蛋白、大豆分离蛋白对甜菜苷的热稳定性均有一定程度的提高，且热稳定性的提高效果乳铁蛋白>大豆分离蛋白>β-乳球蛋白≈大米蛋白。蛋白质对甜菜苷热稳定性的提高可能与蛋白-甜菜苷复合物的形成有关。值得注意的是，甜菜苷热稳定性随着β-乳球蛋白、大豆分离蛋白比例的增加而升高，但随着乳铁蛋白和大米蛋白比例的增加而先升高后降低，这可能是因为在一定范围内，蛋白质与甜菜苷发生了非共价相互作用形成了复合物，在一定范围内，蛋白质的比例越高，与甜菜苷复合的蛋白质越多，提高了甜菜苷的热稳定性[23]。此外，尽管乳铁蛋白和β-乳球蛋白都是乳清分离蛋白的主要组成成分，但乳铁蛋白对甜菜苷热稳定性的提高效果与乳清分离蛋白的效果十分接近[12]，而β-乳球蛋白的效果则相对微弱，这一结果表明，在乳清分离蛋白中，对甜菜苷起热保护作用的主要物质可能是乳铁蛋白。
2.2 蛋白质-甜菜苷复合物浊度的表征
胶体体系是一种高度分散的介稳体系，电荷斥力和布朗运动使得胶体粒子能够抵御重力沉降，始终保持悬浮状态。胶体体系的浊度取决于胶体粒子的数量、大小和折射率。胶体复合物的粒径越大，数量越多，其光透过率则越小，其浊度也越大。因此，胶体复合物的形成可通过样品的浊度变化初步证明[24]。图2显示了不同甜菜苷比例的添加对乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白浊度与外观的影响。当将蛋白质与甜菜苷的比例从8:0增加到8:4时，蛋白质的浊度随着甜菜苷比例的增加而显著增加（P<0.05），从外观上可以观察到溶液变得越来越浑浊，且静置24 h后未出现沉淀和聚集现象，这些结果表明蛋白质乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白与甜菜苷形成了稳定的胶体复合物，具有较强的抗重力作用[24]。
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2.3 蛋白质-甜菜苷复合物紫外光谱的变化
蛋白质分子中芳香氨基酸残基微环境的变化可能会改变蛋白质的紫外吸收。蛋白质的紫外吸收随着配体小分子的加入而增强可作为判断二者是否结合的有力依据[20]。如图3所示，乳铁蛋白和β-乳球蛋白在280 nm处有最大吸收峰，大米蛋白和大豆分离蛋白在260 nm处有最大吸收峰。260~280 nm处的吸收峰主要源于蛋白质色氨酸和酪氨酸的吸收[25]，随着甜菜苷比例的增加，蛋白质的紫外吸收逐渐增强，表明蛋白质的氨基酸残基微环境发生了改变，蛋白质与甜菜苷之间结合形成了复合物。类似的现象也发生在大豆分离蛋白与原花青素的相互作用中，与原花青素结合后，大豆分离蛋白的紫外吸收显著增强[10]。从四种蛋白质紫外光谱的变化可看出，蛋白质紫外吸收增强的程度和其对甜菜苷的热保护效果呈现正相关，这意味着蛋白质对甜菜苷的热保护效果与甜菜苷-蛋白结合程度有关。
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图 3 甜菜苷浓度对蛋白质紫外光谱的影响Figure 3. Effect of betanin concentration on UV spectrum of proteins2.4 蛋白质-甜菜苷复合物粒径的变化
蛋白质与配体小分子发生相互作用后常常形成聚集的复合物，导致粒径增大。Dai等[26]研究了大豆分离蛋白与儿茶素的相互作用，发现大豆分离蛋白-儿茶素复合物的粒径随着儿茶素浓度的增大而增大。图4 显示了 4 种蛋白质与甜菜苷复合物的 PDI（多分散系数）和平均粒径的变化，PDI用于描述样品粒径分布，PDI越小，说明样品尺寸越均一，PDI越大，粒径分布越宽，指示着样品发生了聚集现象。四种蛋白质的PDI值始终低于0.7，说明粒径的数据准确可靠。乳铁蛋白的初始粒径为37.71 nm，当与甜菜苷复合后，复合物的粒径逐渐增加，并在乳铁蛋白：甜菜苷=8:2时达到最高值55.44 nm，其PDI值略有升高，但无显著性变化（P>0.05）。β-乳球蛋白的粒径为1957 nm，随着甜菜苷比例的增加，β-乳球蛋白-甜菜苷复合物的粒径呈现先增加后减小的趋势，在β-乳球蛋白:甜菜苷=8:3时达到最大值3184 nm，PDI的逐步增加表明复合物随着甜菜苷比例的增加逐渐发生聚集。大豆分离蛋白的粒径为80.83 nm，在大豆分离蛋白：甜菜苷=8:3时达到最大值342.9 nm，其PDI值逐渐升高意味着甜菜苷的加入促进了蛋白质的聚集。不同的是，当甜菜苷的比例逐渐增加时，大米蛋白-甜菜苷复合物的粒径和PDI值皆无显著性变化（P>0.05）。以上结果表明，乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大豆分离蛋白与甜菜苷复合后引起了蛋白质的聚集，导致了粒径的增大。而大米蛋白-甜菜苷的粒径随着甜菜苷含量的增加并无显著性差别（P>0.05），这可能说明大米蛋白与甜菜苷之间没有形成聚集性复合物，或是大米蛋白与甜菜苷之间的相互作用过弱而无法引起聚集。这个现象与紫外光谱的结果吻合，甜菜苷与乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大豆分离蛋白的结合比与大米蛋白的结合更加紧密。
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图 4 甜菜苷浓度对蛋白质-甜菜苷复合物粒径的影响Figure 4. Effect of betanin concentration on particle size of protein-betanin complex2.5 蛋白质的表面形态
甜菜苷是一种水溶性色素，更加亲水的环境能够容纳更多的甜菜苷。因此，蛋白质的表面结构或许与它们的相互作用有关。乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白四种蛋白质的表面形态如图5所示，通过扫描电子显微镜在200倍放大的条件下观察，可以观察到乳铁蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白是不规则形状的蛋白质，而β-乳球蛋白是典型的球型蛋白。从结构上而言，乳铁蛋白、大米蛋白和大豆分离蛋白均具有褶皱型的粗糙表面，可能有更多与小分子相互作用的位点，有利于它们与甜菜苷发生相互作用。从溶解性方面，乳铁蛋白、β-乳球蛋白是高溶解度的动物蛋白，大豆分离蛋白是一种溶解性较高的植物蛋白，然而大米蛋白因具有高度的表面疏水性而难以溶解，因此可能与甜菜苷结合的蛋白含量较少，且较低的表面亲水性也导致了其缺乏足够的甜菜苷结合位点。这可能是大米蛋白与甜菜苷的结合能力远小于其他三类蛋白的原因。
2.6 蛋白质与甜菜苷的相互作用机制
为了探明乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白分别与甜菜苷结合的相互作用机制，本文采用了添加干扰剂并测定浊度的方法表征蛋白质与甜菜苷之间存在的相互作用力。前文浊度的实验结果已经说明，蛋白质与甜菜苷形成了胶体复合物，这主要依靠二者间的非共价相互作用。因此，假定蛋白质与甜菜苷之间存在着氢键、疏水相互作用和静电相互作用等非共价相互作用，若添加干扰剂后浊度下降，则表明复合物中相应的作用力被破坏，复合物无法形成，进而从逆向角度表征蛋白质与甜菜苷的主要相互作用力。尿素（Urea）是一种很强的氢键受体，能有效破坏分子间的氢键作用力[27]。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种破坏疏水相互作用的两亲性分子[28]。而氯化钠（NaCl）是一种可电离的盐，可改变水分子在物质中的结合形式以此来增强疏水相互作用，屏蔽静电相互作用[27]。由图6A可看出，乳铁蛋白-甜菜苷复合物的浊度随着干扰剂的添加而降低，且尿素和氯化钠的干扰效果最强，该结果表明，在乳铁蛋白-甜菜苷复合物中存在着氢键、疏水作用力和静电相互作用，而氢键和静电相互作用占主导地位；图6B显示了干扰剂对β-乳球蛋白-甜菜苷复合物的影响，结果表明，氢键是β-乳球蛋白与甜菜苷结合的主要作用力；在图6C中，疏水作用力是大米蛋白-甜菜苷复合物的主要相互作用力；图6D显示了三种干扰剂对大豆分离蛋白-甜菜苷复合物浊度的影响，结果表明，尿素和氯化钠使得复合物的浊度略有下降，表明在大豆分离蛋白-甜菜苷复合物中存在氢键和静电相互作用。
2.7 分子对接模拟
将乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大米蛋白、大豆分离蛋白四种蛋白质分别与甜菜苷进行分子对接模拟，以确认蛋白质与甜菜苷的结合位点，结果如图7所示。图7A为乳铁蛋白与甜菜苷的分子对接结果，乳铁蛋白中的HIS A:253、SER A:185、PRO A:188、GLU A:187与甜菜苷之间发生氢键相互作用，键长分别为2.58、2.52、2.41、2.62 Å，而氨基酸ASP A:297（5.10 Å）、GLU A:15（5.44 Å）、LYS A:197（4.35 Å）与甜菜苷主要依靠静电相互作用结合。图7B展示了β-乳球蛋白与甜菜苷的分子对接结果，β-乳球蛋白的氨基酸GLN A:120（2.68 Å）和PRO A:38（2.60 Å）是其与甜菜苷发生氢键相互作用的位点，PHE A:105（4.74 Å）与甜菜苷通过静电相互作用结合。在图7C中，大米蛋白的氨基酸MET 394与甜菜苷之间通过疏水相互作用结合，键长为4.28 Å。从图7D中可以看出，大豆分离蛋白的氨基酸SER A:331（4.36 Å）、SER A:383（3.73 Å）、THR A:384（4.65 Å）、TYR A:313（4.00 Å）、GLY A:332（3.97 Å）与甜菜苷之间主要通过氢键发生相互作用，而ASP A:334（4.18 Å）、ARG A:188（8.30 Å）主要通过静电相互作用与甜菜苷结合。这些结果与前文所述相互作用的结果基本一致。
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图 7 蛋白质与甜菜苷的分子对接结果Figure 7. Results of molecular docking between proteins and betanin3. 结论
本文研究了两种动物蛋白和两种植物蛋白对甜菜苷热稳定性的影响，并探究了保护作用机制。研究结果表明，四种蛋白质均提高了甜菜苷的热稳定性，保护效果乳铁蛋白>大豆分离蛋白>β-乳球蛋白≈大米蛋白。蛋白质对甜菜苷的保护作用与蛋白-甜菜苷复合物的形成有关，四种蛋白质与甜菜苷通过非共价相互作用形成了胶体复合物，乳铁蛋白与甜菜苷主要通过静电相互作用结合，β-乳球蛋白与甜菜苷主要通过氢键和静电相互作用结合，大米蛋白与甜菜苷主要通过疏水相互作用发生相互作用，大豆分离蛋白与甜菜苷主要通过氢键和静电相互作用结合。蛋白质对甜菜苷的热保护效果可能受蛋白质-甜菜苷相互作用的亲和力和蛋白质的结构性质影响。复合物的形成引起蛋白质的聚集，并导致了乳铁蛋白、β-乳球蛋白、大豆分离蛋白粒径的显著增大。本文为蛋白质提高甜菜苷稳定性的研究提供了理论基础，拓宽了提高甜菜苷稳定性的可用蛋白质资源范围。今后可继续探究更多可提高甜菜苷热稳定性的蛋白质资源，并深入研究能够有效提高甜菜苷稳定性的蛋白质具有的共性特征，将蛋白质-甜菜苷的相互作用及热保护作用的研究系统化。
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图 3 甜菜苷浓度对蛋白质紫外光谱的影响
Figure 3. Effect of betanin concentration on UV spectrum of proteins
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图 4 甜菜苷浓度对蛋白质-甜菜苷复合物粒径的影响
Figure 4. Effect of betanin concentration on particle size of protein-betanin complex
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