Effect of Ammonia Pretreatment on Enzymatic Sugar Production from Corn Stover
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摘要: 为综合利用玉米秸秆，加快纤维素酶降解玉米秸秆。本文以玉米秸秆为原料，还原糖产量为主要指标，通过氨化预处理后酶解玉米秸秆，采用DNS法测定还原糖产量，并考察氨化剂种类、浓度、固含量和氨化时间对玉米秸秆酶解产糖的影响。结果表明，在以碳酸铵为氨化剂，氨化剂浓度为20%，固含量为50%，氨化时间为11 d，在此条件下，还原糖产量最高为314.18 mg/mL，与直接酶解秸秆相比提高51.80%。扫描电镜结果显示，米秸秆经碳酸铵氨化预处理后，木质素和纤维素的结构发生变化，表面结构变得粗糙疏松，纤维素暴露，更有利于纤维素酶的作用。此外，FTIR发现，氨化处理后玉米秸秆在2920和1650 cm−1处的吸收峰减弱，其峰值降低一定程度上代表木质素结构被破坏。总体来看，玉米秸秆经过碳酸铵氨化预处理后，更有利于酶解玉米秸秆。Abstract: To make comprehensive use of maize stover, cellulase degradation of maize stover was accelerated. In this paper, maize straw was used as raw material, and reducing sugar yield was the main indicator. The reducing sugar yield was determined by the DNS method after enzymatic digestion of maize straw by ammonification pretreatment, and the effects of ammonification agent type, concentration, solid content and ammonification time on the enzymatic sugar production from maize straw were investigated. The results showed that the highest reducing sugar yield of 314.18 mg/mL was achieved under this condition with ammonium carbonate as the ammoniating agent, ammoniating agent concentration of 20%, solid content of 50% and ammoniating time of 11 d, which was 51.80% higher compared to direct enzymatic digestion of the straw. In addition, it was found by SEM that the structure of lignin and cellulose changed after the ammoniated pretreatment of rice straw with ammonium carbonate, with the surface structure becoming rough and loose and the cellulose exposed, which was more favorable to the action of cellulase. In addition, FTIR revealed that the absorption peaks of maize straw at 2920 and 1650 cm−1 were weakened after ammoniation treatment, and the reduction of their peaks represented to some extent the destruction of the lignin structure. Overall, the enzymatic digestion of maize stover was more favorable after the ammoniated pretreatment of maize stover with ammonium carbonate.
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Keywords:
- maize stover /
- lignin /
- cellulose /
- ammoniated pretreatment /
- cellulase
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农作物秸秆是农业生产过程中的副产物，玉米秸秆每年产量在2.5亿吨以上，约占各类农作物秸秆总量的30%[1]。玉米秸秆富含碳、氮、磷、钾和碳水化合物等，也含有一定比例的蛋白质和脂肪，在饲料、肥料、燃料、食用菌基料、加工原料等方面具有很高的开发利用价值[2]。近几年随着建设节约型社会和发展循环经济政策的开展，人们逐步加强了对秸秆的综合利用，目前秸秆的主要利用方式包括直接还田、作为可再生能源原料和秸秆饲料化等[3]。但由于没有合理的秸秆处理方式和秸秆收获装备，玉米秸秆的随意抛弃和焚烧现象非常普遍，造成了极大的资源浪费与环境污染。我国玉米秸秆资源丰富、分布广，合理高效开发利用玉米秸秆资源对资源节约、环境保护及农民增收具有重大意义[4-5]。
木质纤维素生物质的细胞壁是由纤维素、木质素和半纤维素基质组成的，其细胞壁复杂的化学组成和层次结构阻碍了生物转化进程[6-7]。为了实现木质纤维素生物质的高价值利用，有必要采取有效的预处理方法来克服天然生物质的顽固性，增加纤维素酶对纤维素水解的可及性[8]。通常采用水热处理、蒸汽爆破和酸、碱预处理等预处理方法对木质纤维素结构进行分解[9-10]。碱预处理作为木质纤维素生物精炼的主要预处理技术之一，在过去的10年中得到了广泛的研究[11]，其中氨化预处理是一种弱碱处理，具有低毒、腐蚀性强、易回收和低温脱木质素效率高特点[12]，目前常用的氨化剂主要有无水液氨、氨水、碳酸铵、尿素和碳酸[13]。其中碳酸铵、尿素和碳酸氢铵价格低廉、毒性和腐蚀性都较低，在储藏运输中无需特殊的设备，因此作为常用作氨化剂[14-15]。在氨化预处理中，固含量是一个影响因素，固含量是指玉米秸秆质量所占玉米秸秆质量与水质量的百分比[16]。Zhang等[17]研究发现，在氨水浓度13.2%，固体含量20.0%处理7.9 h条件下，预处理玉米秸秆时，木质素去除率为60.7%，还原糖产量为337.22±3.58 mg/g，然而Huang等[18]利用碱盐处理玉米秸秆，木质素去除率高达76.6%，但是较低的固含量（10%）和较长的预处理时间（>6 d）问题仍然存在。Yuan等[19]发现低水分氨化预处理能有效破坏水稻秸秆中木质纤维素的结构，并能分解部分纤维素、半纤维素和木质素，是提高稻秆厌氧消化性能的一种简单有效的方法。然而，这种氨化预处理方法很少用于生物质乙醇的生产[20]。
本研究以玉米秸秆为原料，采用不同的氨化剂种类、浓度、固含量和氨化时间处理玉米秸秆，目的在于考察氨化处理对玉米秸秆酶解产糖的影响，分析了高固含量氨化预处理对玉米秸秆微观形貌和FTIR的影响，最后考察了玉米秸秆经碳酸铵氨化预处理后对玉米秸秆酶解产糖的影响，旨在为木质纤维素生物质预处理的工业化提供技术支持和理论指导。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
玉米秸秆 江苏省连云港东海县白塔埠镇；尿素 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；碳酸氢铵、结晶乙酸钠 分析纯，天津市天大化工实验厂；碳酸铵、乙酸、无水葡萄糖、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、醋酸、醋酸钠 分析纯，天津市光复精细化工研究所；无水亚硫酸钠 分析纯，维科特化工产品贸易有限公司；纤维素酶 北京索莱宝科技有限公司；实验用水为去离子水。
101-1ASB电热鼓风干燥箱 北京科伟永兴仪器有限公司；SHZ-82A数显水浴恒温振荡器 金坛市友联仪器研究所；Quanta-200扫描电子显微镜 荷兰FEI公司；Nicolet iS10红外光谱仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Bede D1 HR X X射线衍射仪 Bede科技有限公司；SU 8200扫描电子显微镜（SEM） 日本日立（Hitachi）公司；LR10-2.4A高速冷冻离心机 北京雷勃尔离心机有限公司；6202高速粉碎机 欣镇精密企业有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 秸秆预处理
玉米秸秆（来自江苏省连云港东海县白塔埠镇），玉米秸秆风干后经粉碎机粉碎过40目筛，取筛下玉米秸秆。
1.2.2 秸秆氨化预处理
参考宋振华等[21]的方法并适当修改，称取玉米秸秆粉20.00 g，采用尿素、碳酸铵和碳酸氢铵三种氨化剂，对氨化剂浓度、固含量和氨化时间进行单因素实验。按不同质量分数（相对于秸秆的干质量）添加量称取不同种类的氨化剂，以水为溶剂配置相应固含量溶液，将溶液加入到秸秆粉中，30℃下密封在锥形瓶里30 min，使之充分混合均匀。氨化结束后于45 ℃下烘干，保存备用。
1.2.2.1 氨化剂浓度对玉米秸秆酶解产糖的影响
在氨化时间为11 d，固含量为50%条件下，研究氨化剂浓度（5%、10%、15%和20%）玉米秸秆酶解产糖的影响。
1.2.2.2 固含量对玉米秸秆酶解产糖的影响
在氨化剂浓度为15%，氨化时间为11 d条件下，研究固含量（10%、30%、50%和70%）对玉米秸秆酶解产糖的影响。
1.2.2.3 氨化时间浓度对玉米秸秆酶解产糖的影响
在氨化剂浓度为15%，固含量为50%条件下，研究氨化时间（3、7、11和15 d）玉米秸秆酶解产糖的影响。
1.2.3 酶水解
取0.2 g氨化后的样品于50 mL离心管中，加入30 mg纤维素酶（15 FPU/g底物）、0.8 mL的四环素盐酸盐溶液（1 g/L）和pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液（0.05 moL·L−1），使其固液比为1:20（g:mL），于50 ℃水浴振荡器内反应48 h，转速为150 r/min。酶解结束后，10000 r/min离心10 min，吸取上清液用于还原糖的测定。
1.2.4 采用DNS法测定还原糖
参考裴芳霞[22]的方法制作葡萄糖标准曲线。得标准曲线为：y=0.7563x−0.00665（x为质量，mg，y吸光度值，Abs），R2=0.9992。
1.2.5 还原糖产量计算
(1) 式中：A0提取液中还原糖含量单位为mg；A1样品重量单位为g，0.9为矫正系数。
1.2.6 高固含量氨化预处理响应面优化试验
基于单因素实验优选的条件，选取了最优氨化剂浓度（A）、固含量（B）和氨化时间（C）三个因素，每个因素选取了3个水平按表1响应面水平设计表进行了响应面试验，以处理后玉米秸秆酶解的还原糖产量来考察各因素对处理效果的影响。
表 1 响应面水平设计Table 1. Response surface level design
水平因素 A氨化剂浓度（%） B固含量（%） C氨化时间（d） −1 10 40 9 0 15 50 11 1 20 60 13 1.2.7 微观形貌观察
参照张明珠等[23]的方法将样品用双面导电胶固定在铝台上，喷金。随后，在Regulus 5.0 kv 13.1 mm×2.00 k.SE（UL）条件下使用扫描电镜观察氨化处理后样品的表面微观结构。
1.2.8 傅里叶转换红外光谱（FTIR）测定
参照张立娟等[24]的方法并适当修改，采用KBr压片法，通过红外检测仪对氨化预处理后的样品在4000~400 cm−1的范围内进行扫描，分辨率为4 cm−1，扫描次数64，通过OMNIC软件分析峰的位置变化。
1.3 数据处理
实验分析数据计算三组平行实验的均值±标准差。还原糖产量与各组分之间的显著性通过Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析，采用Origin 2022软件做图。
2. 结果与分析
2.1 氨化预处理对玉米秸秆酶解产糖的影响
2.1.1 氨化剂浓度对玉米秸秆酶解产糖的影响
氨化剂浓度对玉米秸秆酶解产糖的影响由图1可知。玉米秸秆经三种不同氨化剂处理后，还原糖产量都有了一定程度的提高。以尿素为氨化剂时，随着尿素浓度增大，还原糖产量先增大后降低，当浓度为15%，还原糖产量达到最高为267.26mg/g，与未经氨化直接酶解秸相比还原糖产量提高41.3%。以碳酸铵为氨化剂时，还原糖产量先增大后趋于平稳，当碳酸铵浓度为15%时，还原糖产量达到最高为291.03 mg/g，与未经氨化直接酶解秸相比还原糖产量提高41.3%。以碳酸氢铵为氨化剂时，当碳酸氢铵浓度为15%时，还原糖产量达到最高为267.51 mg/g与未经氨化直接酶解秸秆相比还原糖产量提高29.88%。氨化处理可以破坏部分木质素和半纤维素之间的化学连接，这导致了纤维素消化率的增加，提高酶解产糖[20]，但进一步提高氨化剂浓度后，还原糖产量降低，推测由于氨化剂的浓度过高，纤维素和半纤维素组分被进一步破坏分解，导致还原糖产量降低[25]，所以选取氨化剂浓度为15%最佳氨化剂浓度进行下一步试验。
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2.1.2 固含量对玉米秸秆酶解产糖的影响
不同固含量对玉米秸秆酶解产糖的影响如图2所示，不同的氨化剂处理表现出不一样的变化趋势。随着固含量的增加经尿素处理后的酶解液还原糖产量先升高后下降，在固含量30%时，还原糖产量达到最高267.86 mg/g。经碳酸铵处理后的玉米秸秆的酶解液还原糖产量则随着固含量的增加先升高后降低，当固含量为50%时，还原糖产量达到最高281.54 mg/g。经碳酸氢铵处理后的玉米秸秆酶解液还原糖产量则随着固含量的增高呈现先升高后降低的趋势，当固含量为50%时，还原糖产量达到最高276.40mg/g。提高固含量，可增加玉米秸秆酶解液的还原糖产量，但过高的固含量会降低还原糖产量。高固含量可能会限制传热和传质效率，导致随后的酶解糖化过程效率降低[26]。固含量不仅是通过改性或解聚部分木质素来提高纤维素消化率的关键因素，而且可以保证氨的重复循环。在之前的研究中，氨水和碳酸铵处理的生物质固含量大多低于20%[27]，采用高固含量氨化预处理可以减少大型预处理设备的使用，降低水和能源的消耗[28]。因此选择50%为最佳固含量。
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图 2 固含量对玉米秸秆酶解产糖的影响Figure 2. Effect of solid content on sugar yield from enzymatic hydrolysis of corn stover2.1.3 氨化时间对玉米秸秆酶解产糖的影响
氨化时间对玉米秸秆酶解产糖的影响由图3可知。随着氨化时间的增加经尿素处理后的酶解液还原糖产量先升高后降低，在氨化7 d时还原糖产量最高为266.06 mg/g。随着氨化时间的增加经碳酸铵处理后的酶解液还原糖产量先升高后降低，在氨化11 d时还原糖产量最高为288.87 mg/g。经碳酸氢铵处理后的玉米秸秆酶解液还原糖产量则随着氨化时间的增加呈现先升高后降低的趋势，在氨化7 d时还原糖产量最高为280.34 mg/g。适当延长氨化时间，可提高玉米秸秆还原糖产量，但过长的氨化时间会降低玉米秸秆产量，可能是由于木质素降解时形成了糠醛、酚类等产物[29]。所以选取氨化时间为11 d最佳氨化时间进行下一步试验。
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图 3 氨化时间对玉米秸秆酶解产糖的影响Figure 3. Effect of ammoniation time on sugar yield from enzymatic hydrolysis of corn stover2.2 高固含量氨化预处理响应面优化试验
由2.1可知，玉米秸秆经15%碳酸铵，在固含量50%的条件下处理11 d后酶解产糖量最高，根据以上单因素优化的实验参数进行响应面优化试验，响应面优化试验见表3。
表 2 响应面优化试验结果Table 2. Results of response surface optimization test实验号 A B C 还原糖产量（mg/g） 1 1 0 1 279.29±0.89 2 −1 1 0 279.99±1.22 3 1 −1 0 256.29±2.41 4 0 1 −1 267.46±1.49 5 0 0 0 310.21±2.43 6 0 −1 1 280.31±4.23 7 0 0 0 305.67±4.98 8 0 0 0 310.85±3.14 9 −1 0 −1 268.01±1.89 10 0 1 1 311.26±3.89 11 0 −1 −1 280.89±2.76 12 −1 −1 0 289.84±3.28 13 0 0 0 308.77±3.12 14 1 0 −1 255.01±0.98 15 1 1 0 304.94±4.76 16 −1 0 1 290.11±0.39 17 0 0 0 306.12±4.12 按照表3实验结果，以还原糖产量（Y）为因变量，氨化剂浓度（A）、固含量（B）和氨化时间（C）为自变量，进行回归拟合，得到方程为：
Y=308.32−4.05A+7.04B+11.2C+14.62AB+0.55AC+11.09BC+11A2−6.84B2−16.50C2
回归方程的方差分析见表4。
表 3 回归方程方差分析Table 3. Analysis of variance of regression equation方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 5974.63 9 663.85 42.69 <0.0001** A 131.38 1 131.38 8.45 0.0228* B 396.49 1 396.49 25.5 0.0015** C 1003.52 1 1003.52 64.54 <0.0001** AB 855.56 1 855.56 55.02 0.0001** AC 1.19 1 1.19 0.076 0.7902 BC 492.40 1 492.4 31.67 0.0008** A2 1475.06 1 1475.06 94.86 <0.0001** B2 197.11 1 197.11 12.68 0.0092** C2 1416.59 1 1416.59 73.74 <0.0001** 残差 108.85 7 15.55 失拟项 86.81 3 28.94 5.25 0.0715 纯误差 22.04 4 5.51 总误差 6083.47 16 注：**表示差异极显著（P<0.01）；*表示差异显著（P<0.05）。 由表4可知，在还原糖产量回归模型P<0.0001，表示差异极显著，失拟项P=0.0715>0.05，失拟项差异不显著；由F值可知，3个因素影响大小关系为C>B>A；一次项B、C、交互项AB、BC及二次项A2、B2、C2对还原糖产量的影响极显著（P<0.01）；一次项AD对结果影响显著，交互项AC对结果影响不显著；方差分析表明该模型不存在失拟因素，拟合程度好，可用于分析高固含量氨化预处理玉米秸秆的还原糖产量。
图4显示因素两两交互的影响，因素间交互作用的强弱可由等高线反映出来，等高线越趋近于椭圆形则两因素之间交互作用越强烈，反之越弱。由图4可以看出，氨化剂浓度与高固含量交互作用最强，其次是高固含量与氨化时间，而氨化剂浓度与氨化时间交互作用最弱。模型预测最优条件为：最佳条件为以碳酸铵为氨化剂，氨化剂浓度为20 %，固含量为50 %，氨化时间为11 d。在此条件下，还原糖产量最高为314.18 mg/mL。为进一步确氨化预处理可以显著提高玉米秸秆的酶解产糖量的可靠性与可行性，以其为条件进行扩大性试验验证，经测量还原糖产量为312.67 mg/mL，模型预测值基本一致，表明模型有效可靠。
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图 4 各因素交互作用对高固含量氨化预处理玉米秸秆还原糖产量的响应面和等高线图。Figure 4. Response surface and contour plots of the interaction of various factors on reducing sugar yield of corn stover pretreated with ammoniation with high solid content.2.3 高固含量氨化预处理对玉米秸秆微观形貌的影响
通过扫描电镜分析高固含量氨化预处理对玉米秸秆微观形貌的影响，结果如图5所示。未处理的玉米秸秆（图5a）表面结构比较紧密有序，限制了纤维素酶对纤维素的可及性。玉米秸秆经碳酸铵预处理后（图5b），表面变得疏松粗糙，且部分具有微孔，比表面积增加，更有利于纤维素酶的作用。Kim等[30]将稻草进行碳酸铵预处理后，表面光滑、连续的稻秆出现了非均质层，通过孔隙结构的表征发现预处理提高了稻秆的比表面积、孔体积和孔径。Kim等[31]认为这是由于碳酸铵预处理产生了拉力，将稻草破碎成更碎裂的小块组织，从而提高了酶的可及性。
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图 5 高固含量氨化预处理玉米秸秆的扫描电镜微观图（20.0 μm）注：a.原料；b.高固含量氨化预处理。Figure 5. Scanning electron micrographs of corn stover pretreated with high solids ammonia (20.0 μm)2.4 高固含量氨化预处理对玉米秸秆FTIR的影响
玉米秸秆的FTIR如图6所示。氨化预处理后吸收峰的位置有所变化，在1513、1405和898 cm−1附近发现峰的偏移，其中1513 cm−1处是木质素苯环的骨架伸缩振动，在1405 cm−1处形成了-NH+4的N-H变形振动吸收峰，898 cm−1附近是纤维素产生的C-H增强峰，这些峰的位置变化表明氨化预处理导致秸秆中纤维素和木质素成分发生了一定的降解[32]。2920 cm−1代表甲基的伸缩振动，在木质素结结构中，苯甲烷是木质素的基本组成单元，其峰值降低一定程度上代表木质素结构的破坏[33]。1650 cm−1代表C=C或C=O伸缩振动，是由木质素中芳环骨架振动引起的，其峰值降低一定程度上代表木质素结构的破坏[34]。赵超[35]在液氨处理玉米秸秆的傅里叶转换红外光谱中得到了类似的结果，预处理后底物的纤维结构特性明显，木质素的分子结构受到破坏，这与前面的微观结构结果是一致的。
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图 6 高固含量氨化预处理玉米秸秆的红外光谱Figure 6. FTIR of corn stover pretreated with high solids ammonia3. 结论
本文以还原糖产量为指标对氨化剂种类、氨化浓度、固含量和氨化时间进行单因素实验，并通过响应面实验确定氨化预处理的最佳条件。玉米秸秆在以碳酸铵为氨化剂，浓度20%，固含量50%的条件下氨化11 d，还原糖产量为312.67 mg/g，与原料相比提高了51.80%。玉米秸秆经碳酸铵高固含量氨化预处理后，木质素和纤维素的结构发生变化，秸秆表面变得粗糙疏松，增加了与纤维素酶的接触表面积，促进了酶解效率。采用碳酸铵在近室温下高固含量氨化预处理可以显著提高玉米秸秆的酶解产糖量，具有操作简单、成本低、可连续大规模处理的优点。因此，这种方法有潜力作为木质纤维素生物质预处理的实用技术。
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图 2 固含量对玉米秸秆酶解产糖的影响
Figure 2. Effect of solid content on sugar yield from enzymatic hydrolysis of corn stover
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图 3 氨化时间对玉米秸秆酶解产糖的影响
Figure 3. Effect of ammoniation time on sugar yield from enzymatic hydrolysis of corn stover
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图 4 各因素交互作用对高固含量氨化预处理玉米秸秆还原糖产量的响应面和等高线图。
Figure 4. Response surface and contour plots of the interaction of various factors on reducing sugar yield of corn stover pretreated with ammoniation with high solid content.
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图 5 高固含量氨化预处理玉米秸秆的扫描电镜微观图（20.0 μm）
注：a.原料；b.高固含量氨化预处理。
Figure 5. Scanning electron micrographs of corn stover pretreated with high solids ammonia (20.0 μm)
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图 6 高固含量氨化预处理玉米秸秆的红外光谱
Figure 6. FTIR of corn stover pretreated with high solids ammonia
表 1 响应面水平设计
Table 1 Response surface level design
水平因素 A氨化剂浓度（%） B固含量（%） C氨化时间（d） −1 10 40 9 0 15 50 11 1 20 60 13 
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表 2 响应面优化试验结果
Table 2 Results of response surface optimization test
实验号 A B C 还原糖产量（mg/g） 1 1 0 1 279.29±0.89 2 −1 1 0 279.99±1.22 3 1 −1 0 256.29±2.41 4 0 1 −1 267.46±1.49 5 0 0 0 310.21±2.43 6 0 −1 1 280.31±4.23 7 0 0 0 305.67±4.98 8 0 0 0 310.85±3.14 9 −1 0 −1 268.01±1.89 10 0 1 1 311.26±3.89 11 0 −1 −1 280.89±2.76 12 −1 −1 0 289.84±3.28 13 0 0 0 308.77±3.12 14 1 0 −1 255.01±0.98 15 1 1 0 304.94±4.76 16 −1 0 1 290.11±0.39 17 0 0 0 306.12±4.12
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表 3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 5974.63 9 663.85 42.69 <0.0001** A 131.38 1 131.38 8.45 0.0228* B 396.49 1 396.49 25.5 0.0015** C 1003.52 1 1003.52 64.54 <0.0001** AB 855.56 1 855.56 55.02 0.0001** AC 1.19 1 1.19 0.076 0.7902 BC 492.40 1 492.4 31.67 0.0008** A2 1475.06 1 1475.06 94.86 <0.0001** B2 197.11 1 197.11 12.68 0.0092** C2 1416.59 1 1416.59 73.74 <0.0001** 残差 108.85 7 15.55 失拟项 86.81 3 28.94 5.25 0.0715 纯误差 22.04 4 5.51 总误差 6083.47 16 注：**表示差异极显著（P<0.01）；*表示差异显著（P<0.05）。
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