Anti-fatigue Effects of Mulberry Anthocyanins in Mice
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摘要: 目的：研究桑葚花色苷对小鼠的抗疲劳作用，并探讨其抗疲劳机制。方法：经制备、分析后，评价桑葚花色苷样品抗氧化活性；将小鼠随机分为安静组、有氧运动组、模型组、低、中、高剂量组（桑葚花色苷剂量分别为100、200、400 mg/kg），进行负重游泳。连续灌胃4周后，检测小鼠的血乳酸（Lac）、血尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）等疲劳相关生化指标和氧化应激指标，评价桑葚花色苷的抗疲劳作用；并通过测定核因子E2相关因子（Nrf2）和血红素加氧酶1（HO-1）mRNA相对表达水平，初步探讨桑葚花色苷抗疲劳机制。结果：经过纯化、富集后，桑葚花色苷中活性成分含量升高，并显示出与维生素C相当的抗氧化能力。与模型组比较，低、中、高剂量桑葚花色苷可显著延长运动时间（P<0.05），提升运动耐力；中、高剂量桑葚花色苷显著降低小鼠血液中Lac和BUN含量、CK和LDH活性（P<0.05），提高了骨骼肌中SOD和GSH-Px活性，降低了ROS、MDA、8-OHdG含量（P<0.05），同时，Nrf2/HO-1 mRNA的表达显著（P<0.05）增加。结论：桑葚花色苷可通过调控Nrf2/HO-1信号途径，提高机体的抗氧化能力，以发挥抗疲劳作用。Abstract: Objective: To study the anti-fatigue effects of mulberry anthocyanins (AM) and discuss the mechanism in mice. Methods: After preparation and analysis, the the antioxidant activity AM was evaluated. The mice were randomly divided into the quiet group, the aerobic exercise group, the model group, the low, medium and high does groups (the AM dosage were 100, 200 and 400 mg/kg/d, respectively), and exhaustive swimming test were performed. After mouse were orally administered for 4 weeks, the fatigue-related biochemical indicators were measured to evaluate the anti-fatigue effect of AM, such as the levels of blood lactic acid (Lac), blood urea nitrogen (BUN) and malondialdehyde (MDA) the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px). Meanwhile, the anti-fatigue mechanism was explained by the relative expression levels of Nrf2 and HO-1 mRNA. Result: After enrichment and purification, the contents of active components in AM were increased, and showed the antioxidant capacity that equivalented to vitamin C. Compared with the model group, the low, medium and high does groups were significantly prolonged exhaustive swimming time (P<0.05), as well as the exercise capacity was increased. The medium and high does of AM significantly decreased the levels of Lac and BUN (P<0.05), the activities of LDH and CK (P<0.05) in rat blood, improved the activity of SOD and GSH-Px, as well as low-regulate the level of MDA, 8-OHdG and ROS (P<0.05) in muscle. Furthermore, AM significantly increased the expression levels of Nrf2/HO-1 mRNA in muscle (P<0.05). Conclusion: AM could improve the ability of the antioxidant capacity to exert anti fatigue effect through regulating Nrf2/HO-1 signaling pathway.
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Keywords:
- mulberry /
- anthocyanins /
- anti-fatigue /
- antioxidant /
- oxidative stress
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随着经济水平的快速提升，社会竞争愈趋激烈，超长时间、高强度、大负荷的工作节奏使疲劳逐渐成为普遍的社会健康问题。疲劳是亚健康的主要表现之一，常伴随身体乏力、肌肉酸痛、内分泌紊乱、免疫力下降等症状，严重影响人们的工作效率和生活质量。诸多研究表明，疲劳的产生与体内积累过量的自由基，导致氧化和抗氧化系统失衡密切相关[1-2]。因此，诸多学者开发了多糖、多酚、黄酮等抗氧化成分，以清除体内自由基，减少机体氧化损伤，改善机体的生理机能，缓解机体疲劳[3]。从药食两用的桑葚资源挖掘开发安全性高、资源丰富、抗疲劳功效显著的产品，已逐渐成为当前国内学者的研究热点，如桑葚多糖[4]、桑椹果醋[5]、襄荷桑葚复合饮料[6]等。
桑葚（Mulberry），是桑科桑树（Morus alba Linn.）的聚花果，又名乌葚、桑果等；因口味酸甜可口，色泽鲜亮，有“民间圣果”的美誉，备受消费者的信赖与喜爱。桑葚中含丰富的花色苷、维生素、氨基酸、多糖等活性成分，具有极高的食用价值和营养价值[7-8]。作为中药资源入药历史悠久，桑葚收录于《唐本草》、《本草纲目》等中药典籍，具有滋阴补血、生津润燥的功效[9]。花色苷是桑葚中一类重要的多酚成分，常作为天然色素、营养成分、活性成分等功能因子，用于食品、化妆品和药品等，如矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷等[7]。因吡喃环存在未配对电子，花色苷具有超强的抗氧化活性[10]。同时，桑葚花色苷还可抗脂质氧化、抗衰老等，预防视疲劳、糖尿病、肥胖等[11-12]。因此，桑葚花色苷富有营养保健价值，极具抗疲劳的潜力。然而，桑葚极易腐败，易造成较大的资源浪费。在桑葚抗疲劳的报道中，关于桑葚花色苷抗疲劳作用的研究较少，其资源价值未被充分开发利用。本研究采用AB-8大孔树脂、HPLC分别制备、分析桑葚花色苷提取物，并通过研究桑葚花色苷体内外的抗氧化活性，以探讨桑葚花色苷抗疲劳的作用机制，为进一步开发桑葚资源及其营养保健价值提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
桑葚鲜果（Mulberry） 2019年5月购自湖北省武汉市江岸区水果批发市场，清洁级C57BL6J雄性小鼠 60只，7周，体重（20.8±1.03） g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2019-0008；小鼠分笼饲养，自由摄食和饮水，饲养温度22～24 ℃，相对湿度为40%～60%；乳酸（Lac）、尿素氮（BUN）、活性氧（ROS）试剂盒 南京建成生物工程有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）试剂盒 上海臻科生物科技有限公司；TRIzol试剂 北京百奥莱博科技有限公司；引物、实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒 杭州联科美讯生物医药技术有限公司；矢车菊素-3-O-葡萄糖（C3G，纯度≥98%）、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷（P3G，纯度≥98%）、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷（D3G，纯度≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯） 北京市通广精细化工公司；磷酸缓冲盐水溶液、蒸馏水 自制。
多功能酶标仪（Spectramax i3x）、高速冷冻离心机（Sorvall ST16R）、流式细胞仪（Attune NxT） 赛默飞世尔科技有限公司；高效液相色谱仪（Agilent 1260） 安捷伦科技有限公司；电子精密天平（New Classic ME） 瑞士梅特勒-托利多集团；电泳槽（Mini-PROTEAN® Tetra） 伯乐生命医学产品有限公司；实验室超纯水机（Direct-Q3） 美国默克集团；超净台（SW-CJ-2FD） 上海涵今仪器仪表有限公司；实验室超低温冰箱（DW-HL340） 中科美菱低温科技股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 桑葚花色苷馏分制备
将桑葚鲜果清洗除杂后，加入4倍体积的60%乙醇溶液（含0.05%醋酸）提取，碾碎成浆液，过滤，得滤液；滤液7000 r/min离心10 min，取上清液，冻干，作桑葚粗提物（冻干粉）备用；取冻干粉加水溶解，配制成100 mg/mL水溶液，作桑葚溶液（MY）冷藏备用。将AB-8大孔树脂（2.6 cm×60 cm）活化，垂直装柱，径高比为1:15，备用；桑葚溶液（MY）上样，静置30 min；随后依次用3倍柱体积水、40%、60%、80%乙醇依次洗脱，流速3 BV/h，每瓶20 mL收集洗脱液，备用[7,13]。
分别精密称取适量的C3G、P3G、D3G标准品，配制成混合标品溶液，各成分浓度为1.0 mg/mL；精密吸取不同体积的混合标品溶液，梯度稀释，制备不同浓度混合标品溶液（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）进行HPLC分析，绘制C3G、P3G、D3G浓度与吸收峰面积的标准曲线回归方程。
HPLC测定桑葚花色苷色谱条件[14]：Kromasil 100-5C18色谱柱（5 μm, 250×4.6 mm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脱程序为0~5 min 93%→90% A，5~10 min 90%→80% A，10~15 min 80%→75% A，15~20 min 75%→65%%，20～25 min 65%→65% A，25～30 min 65%→60% A，30～32 min 60%→92% A，32～35 min 92%→92% A；流速、柱温、进样量分别设置为1.0 mL/min、25 ℃、525 nm和10 μL。
通过上述HPLC色谱条件，分析桑葚洗脱液中花色苷（C3G、P3G、D3G）含量，合并馏分，浓缩、冷冻干燥，获得桑葚花色苷提取物，用于小鼠实验。
1.2.2 抗氧化活性测定
采用DPPH自由基清除率法[15]，取1.2.1项下纯化前后的桑葚花色苷提取物，配制成水溶液，维生素C作为阳性药物组，浓度设置为10 μg/mL，分析各提取物抗氧化活性。
1.2.3 实验动物分组、给药与饲养
小鼠（60只）经适应性饲养后，随机分为安静组、有氧运动组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，共6组，每组10只。低、中、高剂量组小鼠用桑葚花色苷馏分灌胃给药，根据课题组前期预实验结果，剂量分别设置为100、200、400 mg/kg，其它组小鼠灌胃等体积的生理盐水。
安静组小鼠正常饲养；有氧运动组小鼠每天游泳10 min，随即吸干皮肤水分正常饲养；模型组和低、中、高剂量组小鼠每天进行负重游泳运动力竭实验，饲养周期4周。本实验通过湖北中医药大学伦理委员会审批（批号：HUCMS202111089），实验操作符合国家制定的实验动物管理和使用指南。
1.2.4 负重游泳力竭实验
在给药30 min后，模型组和低、中、高剂量组小鼠尾部系上5%体质量的铅丝，依次放入游泳箱（水深30 cm、水温24±2 ℃）中进行负重游泳实验。当小鼠头部沉浸入水10 s，无法浮出水面，即为小鼠力竭时间。每间隔1周，记录小鼠负重游泳力竭时间[16]。
1.2.5 小鼠血清及组织样本收集
在末次训练结束30 min后，采用2%戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，摘眼球取血，置于抗凝管中7000 r/min离心10 min，得上清液，储藏备用。
颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠腿部骨骼肌，用4 ℃生理盐水漂洗，吸水纸吸干表面水分，置于−80 ℃冰箱中冻存，储藏备用。
1.2.6 血清生化指标测定
取上述血清，参照各试剂盒说明书，测定血清中Lac、BUN的含量，LDH、CK的酶活力。
1.2.7 小鼠骨骼肌氧化应激指标测定
取上述骨骼肌，参照各试剂盒说明书，测定骨骼肌中ROS和MDA、8-OHdG含量、SOD和GSH-Px的酶活力。
1.2.8 小鼠骨骼肌mRNA相对表达水平测定
取适量骨骼肌组织匀浆碾碎后，采用TRIZOL法提取骨骼肌组织总RNA[17]。通过紫外-分光光度测定OD260/OD280比值（1.8～2.0），确定总RNA浓度。随后按照反转录试剂盒说明书进行逆转录，以其cDNA产物测定Nrf2和HO-1 mRNA转录表达水平（表1）。选取β-actin作为内参，以Nrf2和HO-1 mRNA与β-actin表达含量比值作为该因子相对表达水平。
表 1 Nrf2、HO-1和β-actin的引物序列Table 1. Primer sequence of Nrf2, HO-1 and β-actin基因 引物序列 （5'-3'） 方向 长度 （bp） Tm（℃） β-actin GATGAGATTGGCATGGCTTT Forward 20 53 CACCTTCACCGTTCCAGTTT Reverse 20 55 Nrf2 ACATGGAGCAAGTTTGGCAG Forward 20 55 TGGAGAGGATGCTGCTGAAA Reverse 20 55 HO-1 GAAATCATCCCTTGCACGCC Forward 20 57 CCTGAGAGGTCACCCAGGTA Reverse 20 60 1.3 数据处理
每组实验重复3次，结果用（ˉx±s）表示，采用SPSS 19.0软件对实验数据进行单因素方差分析，比较组间差异，并使用Origin 9.0绘图。P<0.05认为具有显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 桑葚花色苷的制备与分析
C3G、P3G、D3G是桑葚主要的抗氧化活性成分，极具抗疲劳潜力[2,7,17]。对纯化前后桑葚提取物中C3G、P3G、D3G的含量及其抗氧化活性进行了分析，C3G、P3G、D3G的标准曲线如表2所示，其HPLC图谱如图1所示。经大孔树脂分离纯化后，桑葚花色苷中杂质峰明显较少或降低，其C3G、P3G、D3G含量分别为9.1%、20.9%、7.6%。与桑葚粗提物比较，纯化后桑葚花色苷中C3G、P3G、D3G的含量分别增加了193.5%、190.3%、171.4%。DPPH自由基清除实验表明，桑葚粗提物、纯化后桑葚花色苷、维生素C的DPPH自由基清除率分别为46.1%、88.4%、90.6%。桑葚花色苷具有良好的抗氧化活性，远优于桑葚粗提物的抗氧化活性。可能原因是，在花色苷提取过程中，大量的蛋白质、氨基酸、多糖等杂质成分亦被提取，降低了桑葚粗提物中花色苷的含量，从而影响了花色苷的抗氧化活性[18]。因此，通过高效的精制方式处理桑葚粗提物以减少杂质，提升花色苷的含量，以增强其抗氧化活性，是挖掘桑葚花色苷抗疲劳潜力的必要步骤。
表 2 C3G、P3G、D3G含量测定的标准曲线方程与含量Table 2. Standard curve equation and the content of C3G, P3G, D3G化合物 线性回归
曲线方程决定系数
（R2）线性范围
（mg/mL）含量（%） 纯化前 纯化后 矢车菊素-3-
葡萄糖苷Y=402936x−
155670.9993 0.05~0.8 3.1 9.1 飞燕草素-3-
葡萄糖苷Y=307431x−
108190.9996 0.05~0.8 7.2 20.9 天竺葵素-3-
葡萄糖苷Y=292114x−
108610.9985 0.05~0.8 2.8 7.6 注：x、Y分别为目标成分浓度（mg/mL）、峰面积。 ![]()
图 1 桑葚花色苷提取物色谱图注：标准品（A）、桑葚粗提物（B）与纯化后桑葚花色苷（C）。Figure 1. HPLC chromatogram of mulberry anthocyanin extract2.2 桑葚花色苷对小鼠负重游泳时间的影响
过量运动后，机体能量供应和代谢能力不足，出现身体乏力、肌肉酸痛等疲劳症状，使得机体运动能力、耐力下降等。负重游泳实验常用于评价食品药品的抗疲劳作用，力竭运动时间的长短客观、直接的反映了运动能力[19-20]。由表3可知，模型组小鼠的游泳力竭时间呈现先增加后逐渐降低的趋势。第1周小鼠适量的运动，增强了机体运动能力与忍耐力，从而延长了游泳力竭时间。然而，第2周开始，小鼠游泳的运动量倍增，超过了身体负荷，从而产生疲劳导致力竭时间降低。在末次给药后，低、中、高剂量组小鼠的游泳力竭时间分别为13.85±1.23、15.91±1.15、19.48±1.04 min。与模型组比较，低、中、高剂量组小鼠的游泳力竭时间分别延长了94.5%、125.6%、176.3%（P<0.05），且与桑葚花色苷存在剂量依赖关系。同桑葚多糖抗疲劳研究的结果一致[4]，上述研究结果表明了桑葚花色苷作为桑葚的重要活性成分，可有效提高小鼠的运动耐力，延长小鼠运动时间，具有显著的抗疲劳作用。
表 3 桑葚花色苷对小鼠负重游泳时间的影响Table 3. Effect of mulberry anthocyanin on the loading swimming time of mice组别 负重游泳时间（min） 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周 安静组 − − − − − 有氧运动组 − − − − − 模型组 8.61±0.41 9.43±0.57 7.22±0.82 7.19±0.94 7.05±1.36 低剂量组 8.59±0.38 10.56±0.41 12.27±0.77 12.8±0.91 13.85±1.23# 中剂量组 8.62±0.36 11.88±0.59 13.85±0.84 15.1±0.94 15.91±1.15# 高剂量组 8.51±0.42 13.22±0.78 16.1±0.97 18.85±1.02 19.48±1.04# 注：与模型组比较，#代表差异显著，P<0.05。 2.3 桑葚花色苷对能量代谢的影响
Lac、BUN分别是糖、蛋白质代谢的产物，其水平的高低反应机体糖类、蛋白质的消耗程度，客观体现疲劳积累程度[21]。由图2可知，与安静组比较，有氧运动组小鼠血清中Lac、BUN含量无显著性差异（P>0.05）。与有氧运动组比较，模型组小鼠血清中Lac、BUN含量分别显著升高了102.3%、64.6%（P<0.05）。在正常的情况下，机体内的Lac、BUN均处于动态平衡的状态。有氧运动过程中，肌肉组织的糖原、蛋白质等物质代谢加快，以补充机体能量的消耗。Lac、BUN的生成速率小于其分解或排出的速率。因此，有氧运动组小鼠体内的Lac、BUN水平较低，未产生相关的疲劳症状。然而，当运动过度时，体内糖和蛋白质分解迅速加快。同时，机体处于缺氧状态，大量的Lac、BUN无法分解，堆积于体内，破坏体内酸碱平衡，从而使得模型组小鼠体内Lac、BUN浓度迅速升高，产生疲劳症状[22]。
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低、中、高剂量组小鼠的清中Lac、BUN浓度依次降低，与桑葚花色苷存在剂量依赖关系。与模型组比较，低剂量组Lac和BUN浓度无显著性差异（P>0.05）；中、高剂量组Lac浓度分别显著降低了18.8%、35.3%（P<0.05），BUN浓度分别显著降低了28.9%、36.4%（P<0.05）。高剂量组BUN浓度与有氧运动组无显著性差异（P>0.05）。上述研究与百香果、胡萝卜花色苷抗疲劳的研究结果一致[23-24]，可能由于低剂量的桑葚花色苷总量太低，而花色苷结构不稳定，导致机体吸收的桑葚花色苷较少，无法发挥显著的功效[25]。随着剂量的增加，桑奢花色苷逐渐被吸收，减少了运动中糖类和蛋白质分解，使得Lac、BUN浓度降低。因此，桑葚花色苷可改善体内糖类、蛋白质和氨基酸的分解代谢，减少代谢产物的堆积，发挥抗疲劳作用。
2.4 桑葚花色苷对运动损伤的影响
LDH是糖酵解的关键酶，催化乳酸氧化成丙酮酸。CK是促进能量代谢的酶，与细胞内能量运转密切相关。LDH、CK常存在于肌肉组织中，其活性作为运动损伤程度的指标，反映机体对运动负荷的适应能力[23]。由图3可知，与安静对照组比较，有氧运动组小鼠血清中CK和LDH活性无显著性差异（P>0.05）。与有氧运动组比较，模型组小鼠血清中CK和LDH活性显著升高了26.9%、42.2%（P<0.05）。有氧运动的强度较低，机体的负荷较小，不易造成运动损伤。当过度运动时，对骨骼肌造成了损伤，使得细胞膜通透性增强，LDH和CK易渗透至血液中，并大量的积累。因此，有氧运动组小鼠血清中LDH和CK活力较低，模型组小鼠血清中CK和LDH活性则快速升高[25]。
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图 3 桑葚花色苷对小鼠血清中LDH和CK活力的影响Figure 3. Effect of mulberry anthocyanin on the activity of LDH and CK in serum of mice低、中、高剂量组小鼠的清中CK和LDH活性均依次降低，与桑葚花色苷存在剂量依赖关系。与模型组比较，中、高剂量组LDH活性分别显著降低了21.2%、28.9%，CK活性分别显著降低了22.9%、28.2%（P<0.05）。高剂量组LDH、CK活性与有氧运动组无显著性差异（P>0.05）。机体疲劳、运动损伤等与氧化应激密切相关，通过抗氧化、抗炎、抗凋亡等方式可改善氧化应激，减轻氧化损伤，预防疲劳[26]。桑葚花色苷具有良好的体内外抗氧化活性，有助于改善机体氧化应激能力，预防心血管疾病、保护视网膜、保护神经细胞等[27]。因此，剂量组肌肉组织损伤减轻，细胞膜通透性降低，渗透至血液中LDH和CK的活性降低。综合上述结果表明，桑葚花色苷可能是通过改善机体氧化应激能力，从而预防运动损伤，发挥抗疲劳的作用。
2.5 桑葚花色苷对氧化因子的影响
ROS是一类有超强氧化性的自由基，易攻击细胞膜、脂质、蛋白质和DNA等，导致氧化应激损伤。因此，通过抑制ROS的产生或积累，可改善氧化应激损伤，有利于缓解疲劳[16]。由图4可知，与安静组比较，有氧运动组、模型组小鼠骨骼肌ROS含量显著升高（P<0.05）。在运动过程中，肌肉组织的血流量增加，以满足机体的氧气消耗，会伴随大量自由基的产生与清除。然而，当过度运动时，机体抗氧化和氧化系统失衡，从而使得模型组小鼠体内ROS大量堆积而显著升高（P<0.05），导致肌肉组织稳态紊乱，造成氧化应激损伤和疲劳[16]。
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图 4 桑葚花色苷对小鼠骨骼肌中ROS含量的影响Figure 4. Effect of mulberry anthocyanin on the content of ROS in skeletal muscle of mice低、中、高剂量组小鼠的骨骼肌ROS含量依次降低，与桑葚花色苷存在剂量依赖关系。与模型组比较，低、中、高剂量组ROS含量分别降低了20.6%、43.3%、54.4%，且存在显著性差异（P<0.05）。高剂量组ROS含量与有氧运动组无显著性差异（P>0.05）。诸多桑葚花色苷抗氧化活性研究结果表明，桑葚花色苷可清除自由基，具有良好的抗氧化效果[9,28]。综合上述结果表明，桑葚花色苷作为抗氧剂，可抑制体内ROS氧化因子的产生或积累，改善氧化应激，发挥抗疲劳的作用。
2.6 桑葚花色苷对氧化应激的影响
SOD和GSH-Px是机体内重要的酶系抗氧化剂和自由基清清除剂，可催化自由基转化为过氧化氢，阻断自由基引发的组织损伤，从而发挥抗氧化功能[29]。MDA、8-OHdG作为体内氧化能力的标志物，是脂质、DNA分别与自由基反应的产物[29]。由图5可知，与安静组小鼠相比，有氧运动组小鼠骨骼肌SOD和GSH-Px活性、MDA和8-OHdG含量无显著性差异（P>0.05）。与有氧运动组比较，模型组小鼠骨骼肌SOD、GSH-Px活性显著降低（P<0.05），MDA和8-OHdG含量显著升高（P<0.05）。在运动过程中，机体内产生并堆积了大量的自由基，同时调节体内抗氧化体系活性，以改善机体的氧化应激能力，保护细胞组织[30]。因此，有氧运动组小鼠SOD、GSH-Px活性显著升高，MDA、8-OHdG含量基本不变。然而，过度运动破坏了模型组小鼠体内氧化平衡体系，消耗大量的SOD、GSH-Px抗氧剂，使其活性降低。另外，大量自由基在体内堆积，使得脂质、DNA过氧化反应增加，对机体造成氧化应激损伤，模型组小鼠MDA、8-OHdG含量升高[30]。
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图 5 桑葚花色苷对小鼠骨骼肌中SOD和GSH-Px活性、MDA和8-OHdG含量的影响Figure 5. Effect of mulberry anthocyanin on the activity of SOD and GSH-Px, the content of MDA and 8-OHdG in skeletal muscle of mice低、中、高剂量组小鼠的骨骼肌SOD、GSH-Px活性依次升高，MDA和8-OHdG含量依次降低，且与桑葚花色苷存在剂量依赖关系。与模型组比较，高剂量组小鼠SOD、GSH-Px活性显著升高了27.8%、51.4%（P<0.05）；中、高剂量组MDA含量分别显著降低了26.3%、40.1%，8-OHdG含量分别显著降低了23.6%、52.5%（P<0.05）。高剂量组MDA和8-OHdG含量与有氧运动组无显著性差异（P>0.05）。上述研究结果与百香果、胡萝卜花色苷抗疲劳的研究结果一致[23-24]，桑葚花色苷作为良好的抗氧剂，有助于清除体内自由基，阻止MDA和8-OHdG的生成，减小细胞氧化损伤程度，发挥抗疲劳作用[25]。同时，随着桑葚花色苷剂量的增加，SOD和GSH-Px的消耗减少，维护了机体的稳态平衡。因此，桑葚花色苷可通过清除自由基，减少脂质过氧化和DNA损伤，提高骨骼肌SOD、GSH-Px抗氧化活性，改善机体氧化应激损伤，发挥抗疲劳的作用。
2.7 桑葚花色苷对小鼠骨骼肌Nrf2和HO-1相对表达水平的影响
核因子E2相关因子2（Nrf2）可激活下游多个抗氧化因子和GSH氧化还原系统，是增强细胞抗氧化应激作用的调节因子，参与细胞物质与能量代谢、细胞氧化应激等，有助于缓解机体疲劳[30]。血红素氧合酶1（HO-1）是抗炎、抗氧化、具有神经保护作用的诱导酶，作为抗氧化因子，在抗氧化损伤中具有重要的作用[31]。因此，Nrf2、HO-1是重要的抗疲劳分子靶点。由图6可知，与安静组比较，有氧运动组小鼠骨骼肌Nrf2和HO-1 mRNA相对表达水平无显著性差异（P>0.05）。与有氧运动组比较，模型组小鼠骨骼肌Nrf2和HO-1 mRNA相对表达水平显著降低（P<0.05）。在非运动状态下，Nrf2常与其负调节因子Keap1形成二聚体，从而抑制Nrf2的表达。然而，在运动过程中，机体产生了大量的ROS，使得Keap1结构加速解偶联，从而刺激Nrf2的转移和表达，激活下游HO-1相关的抗氧化应答过程，以清除ROS。Nrf2和HO-1表达的调节作用存在一定剂量效应，过度运动使机体抗氧化和氧化体系失衡；过量的ROS加剧了细胞损伤或凋亡，一定程度抑制了Nrf2和HO-1 mRNA的表达[32]。因此，模型组小鼠Nrf2、HO-1mRNA相对表达水平降低。
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图 6 桑葚花色苷对小鼠骨骼肌Nrf2和HO-1 mRNA相对表达水平的影响Figure 6. Effect of mulberry anthocyanin on the relative expression levels of Nrf2 and HO-1 mRNA in skeletal muscle of mice低、中、高剂量组小鼠骨骼肌Nrf2和HO-1 mRNA相对表达水平含量依次升高，与桑葚花色苷存在剂量依赖关系。与模型组比较，低、中、高剂量组Nrf2 mRNA相对表达水平分别显著升高了73.3%、84.4%、113.3%（P<0.05），HO-1 mRNA分别显著升高了29.5%、50.1%、61.4%（P<0.05）。可能原因是，体内ROS刺激了Nrf2的转移和表达，激活了下游HO-1相关的抗氧化应答过程。同时，桑葚花色苷作为良好的抗氧剂，有助于清除体内自由基，减少细胞的氧化损伤，保护了细胞[25]。因此，剂量组小鼠Nrf2、HO-1 mRNA相对表达水平升高。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷可通过激活Nrf2/HO-1信号通路保护ROS介导的细胞损伤[33]；蓝莓花青素可通过调节Nrf2/HO-1信号传导改善视网膜氧化应激和炎症[34]；花青素作为抗氧剂，通过PI3K/Akt/Nrf2/HO-1途径降低HT22细胞中神经毒性而保护神经细胞[35]。诸多研究表明花色苷可通过激活Nrf2/HO-1信号通路，增加Nrf2和HO-1蛋白表达，增强细胞抗氧化应激的能力，以保护细胞。综合上述研究结果表明，桑葚花色苷可通过促进Nrf2/HO-1的表达，增强机体抗氧化作用，改善氧化应激能力，发挥抗疲劳的作用机制。
3. 结论
经过大孔树脂纯化后，桑葚花色苷中C3G、P3G、D3G含量达到9.1%、20.9%、7.6%，显示出良好的抗氧化活性。随着给药时间的增加，桑葚花色苷表现出良好的抗疲劳作用。在末次给药后，与模型组比较，低、中、高剂量组小鼠的游泳力竭时间分别延长了94.5%、125.6%、176.3%（P<0.05）。血清和骨骼肌生化指标分析显示，桑葚花色苷可改善体内物质和能量代谢，减少Lac、BUN等代谢物的堆积，降低LDH、CK活性；并通过清除自由基，提高SOD和GSH-Px的活力，减少脂质过氧化和DNA损伤，改善机体氧化应激损伤，提升运动耐力，从而发挥抗疲劳作用。其中，高剂量组BUN浓度、LDH和CK活性、MDA和8-OHdG含量，与有氧运动组无显著性差异（P>0.05）。Nrf2/HO-1 mRNA表达的增加，表明桑葚花色苷可通过调控Nrf2/HO-1信号通路，改善氧化应激能力，增强机体抗氧化作用，以发挥抗疲劳的作用机制。以上研究初步确定了桑葚花色苷具有良好的抗疲劳作用，与其抗氧化能力、调控Nrf2/HO-1信号通路的作用机制密切相关，为进一步深度开发桑葚资源及其应用提供了理论依据。然而，高纯度桑葚花色苷单体的抗疲劳能力、具体的作用蛋白靶点仍需探索。
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图 1 桑葚花色苷提取物色谱图
注：标准品（A）、桑葚粗提物（B）与纯化后桑葚花色苷（C）。
Figure 1. HPLC chromatogram of mulberry anthocyanin extract
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图 3 桑葚花色苷对小鼠血清中LDH和CK活力的影响
Figure 3. Effect of mulberry anthocyanin on the activity of LDH and CK in serum of mice
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图 4 桑葚花色苷对小鼠骨骼肌中ROS含量的影响
Figure 4. Effect of mulberry anthocyanin on the content of ROS in skeletal muscle of mice
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图 5 桑葚花色苷对小鼠骨骼肌中SOD和GSH-Px活性、MDA和8-OHdG含量的影响
Figure 5. Effect of mulberry anthocyanin on the activity of SOD and GSH-Px, the content of MDA and 8-OHdG in skeletal muscle of mice
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图 6 桑葚花色苷对小鼠骨骼肌Nrf2和HO-1 mRNA相对表达水平的影响
Figure 6. Effect of mulberry anthocyanin on the relative expression levels of Nrf2 and HO-1 mRNA in skeletal muscle of mice
表 1 Nrf2、HO-1和β-actin的引物序列
Table 1 Primer sequence of Nrf2, HO-1 and β-actin
基因 引物序列 （5'-3'） 方向 长度 （bp） Tm（℃） β-actin GATGAGATTGGCATGGCTTT Forward 20 53 CACCTTCACCGTTCCAGTTT Reverse 20 55 Nrf2 ACATGGAGCAAGTTTGGCAG Forward 20 55 TGGAGAGGATGCTGCTGAAA Reverse 20 55 HO-1 GAAATCATCCCTTGCACGCC Forward 20 57 CCTGAGAGGTCACCCAGGTA Reverse 20 60 
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表 2 C3G、P3G、D3G含量测定的标准曲线方程与含量
Table 2 Standard curve equation and the content of C3G, P3G, D3G
化合物 线性回归
曲线方程决定系数
（R2）线性范围
（mg/mL）含量（%） 纯化前 纯化后 矢车菊素-3-
葡萄糖苷Y=402936x−
155670.9993 0.05~0.8 3.1 9.1 飞燕草素-3-
葡萄糖苷Y=307431x−
108190.9996 0.05~0.8 7.2 20.9 天竺葵素-3-
葡萄糖苷Y=292114x−
108610.9985 0.05~0.8 2.8 7.6 注：x、Y分别为目标成分浓度（mg/mL）、峰面积。
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表 3 桑葚花色苷对小鼠负重游泳时间的影响
Table 3 Effect of mulberry anthocyanin on the loading swimming time of mice
组别 负重游泳时间（min） 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周 安静组 − − − − − 有氧运动组 − − − − − 模型组 8.61±0.41 9.43±0.57 7.22±0.82 7.19±0.94 7.05±1.36 低剂量组 8.59±0.38 10.56±0.41 12.27±0.77 12.8±0.91 13.85±1.23# 中剂量组 8.62±0.36 11.88±0.59 13.85±0.84 15.1±0.94 15.91±1.15# 高剂量组 8.51±0.42 13.22±0.78 16.1±0.97 18.85±1.02 19.48±1.04# 注：与模型组比较，#代表差异显著，P<0.05。
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