Research Progress of Polyphenols in Reducing Lactoprotein Sensitization
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摘要: 牛乳蛋白过敏是主要由IgE介导的病理性免疫反应，在易感体质婴幼儿群体中有较高的发生风险。当前消除牛乳蛋白致敏性的技术手段包括热处理、高压处理、酶水解、糖基化修饰等，但这些方法可能会降低蛋白的营养功能价值、或产生不良风味。植物多酚作为一种来源广泛的植物次级代谢产物，具有抗衰老、抗菌、抗炎和抗氧化等多重生物学活性。多酚对蛋白质等大分子物质有显著的亲和作用，能通过共价和非共价结合方式有效降低不同食物蛋白的致敏性。本文主要阐述酚-蛋白互作关系对牛乳致敏性的影响及其相关作用机制，并提出研究设想，为新型低致敏乳制品的开发工作提供思路和理论参考。Abstract: Certain infants and children have relatively high risk of the onset of anaphylaxis when exposed to the foods containing cow milk protein. This pathogenic immunological process is mainly mediated by IgE. Currently, the chief methods eliminating the sensitization of milk protein include heat treatment, high pressure treatment, enzymatic hydrolysis, and glycosylation modification, etc. Based on different mechanisms, each technique has specific advantages, nevertheless, also accompanied with ineluctable shortcomings, such as reducing the nutritional value or generating odd flavors. As a type of secondary metabolites with wide botanical resources, polyphenols exhibit pleiotropic bioactivities involving anti-aging, antibiosis, anti-inflammation and antioxidation. It is well known that polyphenols have strong affinity to proteins via covalent or non-covalent binding, which is so-called 'polyphenol-protein interaction (PPI)'. Accumulating reports showed that phenolic compounds could reduce the immunoreactivity of diverse food allergens through PPI. This review summarizes and discusses the role of PPI on the desensitization of lactoproteins, and proposed some promising conceptions in the light of up-to-date researches, hoping to provide new ideas and theoretical foundations for the development of safe dairy products of low-sensitization.
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牛乳是现今婴幼儿的主要营养来源，富含众多的基础营养和功能因子，如必需氨基酸和生物活性肽等，在婴幼儿的生长发育中发挥了重要作用[1]。但牛乳也被联合国粮农组织（FAO）列为八大过敏食品之一，牛乳蛋白过敏（CMPA）在婴幼儿群体中的发生率约为2%~5%[2]。较为典型的CMPA是由IgE介导的速发型超敏反应，会引发呕吐、腹痛、腹泻、荨麻疹、甚至是过敏性休克[3]等临床症状。世界过敏学会、美国过敏和临床免疫学杂志、中华医学会儿科学分会、欧洲儿科胃肠肝病和营养学会分别发布了有关过敏风险食品（包括牛奶）的诊治指南[4-5]。日常生活中，为降低过敏体质婴幼儿CMPA的发生风险，除了考虑使用豆基食品替代乳基配方食品，还可以通过后天诱导使人体对乳蛋白产生免疫耐受[6]。更为便捷地，则是对牛奶原料进行脱敏处理，即采用人为改性（物理、化学）的方法将蛋白表位予以消除或破坏。目前主要的技术手段包括加热[7]、高压[8]、酶解[9]、糖基化[10]等。这些加工方法基于不同的作用原理可有效降低牛乳蛋白的致敏性，但也可能带来一些负面影响，例如降低牛乳蛋白的营养价值、改变功能特性、产生不良风味物质[11]。因此，还需要进行更多的创新性尝试，在保障牛乳食用安全性的同时，尽可能保留/提升其天然风味与品质。
近年来，将天然产物应用于脱敏技术的文献报道开始出现，其中较为常见的是多酚类物质。作为一种来源广泛的植物次级代谢物，多酚可以发挥抗衰老[12]、抗菌[13]、抗炎和抗氧化[14]等各种生物学作用。另外，多酚与蛋白质等大分子之间易发生加合反应[15]，这些共价或非共价结合能够改变蛋白的空间构象、理化性质，进而改变蛋白原有的功能属性（水合特性、表面特性、胶凝特性等）、消化性以及抗原性。前期试验发现，酚类化合物可以显著降低花生、虾、大豆等过敏原的体内外致敏性[16-18]。本文聚焦CMPA的相关研究，系统性地论述酚-蛋白互作对牛乳致敏性的影响及其潜在作用机制，为建立高效、安全和健康的牛奶脱敏技术提供新的思路和理论参考。
1. 牛乳蛋白过敏的发生机制
CMPA是致敏原蛋白氨基酸序列一级结构上的抗原表位（线性表位和构象表位，图1）与特异性抗体结合后所激发的一系列免疫反应[19]。牛乳中最主要的过敏原是α-酪蛋白（α-CN）、α-乳白蛋白（α-LA）、β-乳球蛋白（β-LG）[20]。其中β-LG致敏性最大，约有82%的CMPA患者对β-LG过敏[21]，其IgE抗原表位主要分布在氨基酸1~8位、25~40位、41~60位、102~124位、149~162位[22]。
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CMPA的发生有两大免疫学机制，即由IgE介导和非IgE介导[24]。前者属于I型超敏反应，是CMPA的常见临床类型（图2）。在一项流行性病学调查中，1368个食物过敏患者中有1073人对牛奶过敏，其中经诊断归于IgE型的有807人[25]。该过程大致可分为两个阶段：首先是致敏阶段。当机体首次接触牛乳过敏原时，牛乳过敏原中的T细胞表位经树突状细胞加工处理后与组织相容性复合体（MHC II）分子结合形成复合物（p-MHC II），然后被T细胞受体（TCR）识别，并刺激初始T0细胞分化成Th2细胞。另外，过敏原表面的B细胞表位被B细胞识别，同时Th2细胞产生特征性细胞因子IL-4、IL-13。两者共同促进B细胞增殖、分化成浆细胞，并产生大量特异性IgE抗体。IgE抗体（Fc端）与肥大细胞、嗜酸/碱性粒细胞表面的FcεRΙ受体结合，使细胞处于基础致敏状态；然后是激发阶段。当机体再次接触牛乳过敏原时，其过敏原表位与致敏细胞表面的IgE抗体结合（Fab端），促使细胞脱颗粒，并释放组胺、白三烯等介质。这些物质可引起血管扩张、通透性增强，伴随出现瘙痒、肿痛等症状，导致机体一系列的过敏反应。关于非IgE型CMPA的发生过程则更为复杂多变，可能由特异性IgG或非抗体依赖性的迟发超敏反应（即TDTH细胞）等因素所介导[26-27]。
2. 牛乳蛋白的脱敏方法
控制CMPA的方法包括：不摄入和接触含有牛乳蛋白的食品；弱化或阻断基础致敏条件（即降低乳蛋白的免疫原性，在第一阶段中减少特异性IgE的释放量）；以及防止过敏介质的产生（即降低乳蛋白的抗原性，在第二阶段使过敏原不能与特异性IgE结合）。
由于过敏体质具有一定的遗传和基因决定性，因此在实践中更普遍采用针对乳蛋白的人工脱敏技术，通过破坏/改变构象或线性表位以消减牛乳蛋白的致敏性[29]。例如，高温、超高压处理改变了牛乳蛋白的空间结构（展开、聚集），同时引发自身或与其他成分之间的交联[30-31]。而酶解则会切割肽段序列来达到破坏线性表位的效果[32]。类似地，微生物发酵过程中产生的蛋白酶将牛乳蛋白水解，破坏其抗原表位[33]。有关糖基化、聚乙二醇等侧链修饰的方法，目的是在表位上形成复合体结构，阻断蛋白与特异性IgE的结合[34-35]。此外，婴幼儿时期CMPA发生率高（较之成年人）的另一原因在于其胃肠道消化能力较弱，部分牛乳蛋白能够以完整形式进入肠腔，直接暴露给免疫细胞表面；而某些加工方式则可以提高乳蛋白的内源消化性，使之得到更好的分解释放（成为短肽和氨基酸），从而降低乳蛋白的致敏性。以上处理方法的作用原理有所不同，也各有优缺点。单一技术可能达不到最优效果（消减蛋白的致敏性、并保留营养功能特性），有时会考虑将多种方法的优点结合起来，即采取联用技术（如酶解联合糖基化处理[36]、微波辅助酶解[37]等）实现对牛乳致敏性的消减或消除。
近年来，关于植物多酚与蛋白相互作用（polyphenol-protein interaction, PPI）的话题已成为食品学科领域中的研究热点。已有大量文献阐述了酚类物质与蛋白之间形成非共价或共价键的机理（及推测），在此文中不再赘述。越来越多的研究者将PPI过程应用于消减蛋白的致敏性方面并取得了良好效果。
3. 植物多酚对牛乳蛋白致敏性的影响与机制
归纳现有研究报道，多酚对牛乳蛋白致敏性的消减作用机制包括：屏蔽蛋白过敏表位、改变蛋白空间结构以及影响蛋白消化性等方面（图3）。由于酚类物质的种类和结构不同，其与蛋白的作用方式各异。因此，在消减乳蛋白致敏性的过程中，这些机制原因可能同时存在，或者由其中一个因素占据主导作用。
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图 3 植物多酚与乳蛋白的互作结合并消减蛋白致敏性的主要作用机制注：（A）酚对蛋白表位的屏蔽；（B）酚对蛋白构象的影响；（C）酚对蛋白内源消化性的改变。Figure 3. Roles of PPI in reducing allergenicity of milk proteins3.1 对过敏表位的屏蔽作用
Wu等[38]和吴序栎[39]通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定发现，β-LG蛋白的抗原性（即与IgG抗体、IgE抗体的结合力）在被儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表没食子儿茶素（EGC）共价螯合后显著降低。对蛋白进行结构表征，发现上述3种多酚并没有强烈改变β-LG的天然构象，共价加合物基本保留了对视黄醇的载荷能力。因此，认为β-LG致敏性的降低可能不是由结构变化所引起。类似地，Wu等[40]通过蛋白质印迹分析（Western blotting）和ELISA发现，两种多酚（EGCG、绿原酸）与β-LG的偶联降低了β-LG蛋白的抗原性。当结合多酚后，β-LG的游离氨基、硫醇和酪氨酸残基含量均有所减少，而这些残基部分包含于IgE的抗原表位之中（1Leu-8Lys，25Ala-40Arg，41Val-60Lys和102Tyr-124Val）。因此，作者推测多酚与β-LG氨基酸残基的（共价）结合掩盖了表位，在β-LG与 IgE 抗体之间形成了空间位阻。Pu等[41]分别构建了6种类黄酮（EGCG、根皮素、柚皮素、杨梅黄酮、山奈酚、槲皮素）与β-LG蛋白的非共价反应体系。分子对接结果表明，黄酮类化合物可与β-折叠和β-转角中的部分表位区域结合，屏蔽或破坏表位以降低蛋白的抗原性。Pessato等[42]使用EGCG和咖啡酸（CA）结合乳清分离蛋白（WPI），发现两种复合物WPI-CA和WPI-EGCG均表现出比WPI更低的IgE结合力，并且EGCG对WPI过敏反应的抑制作用较之CA更强。这可能是由于EGCG分子量大于CA（458 Da>180 Da），在抗原表位上能够形成更大的空间位阻。基于前人的研究，多酚与蛋白可发生共价/非共价结合，多酚附着在乳蛋白表面，通过掩盖牛乳蛋白的过敏表位达到消减致敏性的目的。可以采用分子对接模拟预测或实际检测酚与氨基酸的互作结合位点，并结合查询乳蛋白的数据库表位信息，来判断此种作用方式是否存在。
3.2 对构象表位的改变
Pu等[41]发现6种类黄酮对β-LG抗原性的消减效果依次为：EGCG>根皮素>柚皮素>杨梅黄酮>山奈酚>槲皮素。不同酚类除了对β-LG表位的遮蔽性有所区别（与结合位点、多酚结构有关），对蛋白空间构象也会有不同影响。圆二色光谱结果显示，6种类黄酮的结合均使β-LG蛋白的α-螺旋和β-折叠含量下降、无规则卷曲含量增加。并且β-LG的抗原性与α-螺旋相对含量紧密相关，表明构象表位更有可能位于α-螺旋结构内。其中，根皮素对β-LG α-螺旋的消减作用最为明显（49.5%→8.2%），而其对β-LG致敏性的抑制力仅次于EGCG。陆玉琴[43]也证实了绿原酸可以改变β-LG的构象表位。根据圆二色光谱和傅里叶变换红外光谱的分析结果，与天然β-LG相比，加合物的二级结构发生了某些改变（α-螺旋和β-折叠含量下降，无规则卷曲含量增加、酰胺I带和酰胺II带在峰位置都发生了移动）。推测可能是因为蛋白质整体结构的变化导致内部构象表位被影响，最终使IgE的结合力降低。与屏蔽蛋白表位并形成空间位阻有所不同，酚类改变构象表位是另一种可能存在的作用方式。通过检测乳蛋白在结合酚物质后的结构特征与序列排布，并对比蛋白原有的（表位）序列信息，可以大致判断出构象表位（变化）是否与乳蛋白致敏性（下降）存在因果关联。
3.3 对蛋白内源消化性的改变
胃肠消化本身也是对食物抗原性消减和破坏的过程。一般判断乳蛋白是否具有过敏原性，一者是与母乳成分进行对比（序列和结构相似性、相对含量），二者是检测该种蛋白的可消化性[44]。牛乳的β-LG蛋白在人母乳中含量甚微，同时具有较高的消化抗性，所以更容易被机体免疫系统识别并由此激发免疫反应。基于酶解的脱敏技术本质上就是辅助预消化的步骤，其他间接提高乳蛋白内源消化性的策略方法也会有类似的效果。例如，Tantoush等[45]研究了酸樱桃酚类物质在漆酶促发的β-LG交联反应中发挥的作用。与天然β-LG和漆酶单一处理的β-LG相比，漆酶/多酚共处理的β-LG在15 min后大部分被胃肠消化酶分解。通过细胞模型试验，发现该种复合交联物使嗜碱性粒细胞脱颗粒的能力显著降低。陆玉琴[43]采用三（羟甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）分析β-LG+EGCG/绿原酸共价加合物的胃肠消化性，发现酚类物质可以显著提高蛋白的体外消化率。并且，加合物消化产物的IgE结合能力要弱于天然β-LG。郝明皓[46]研究3种多酚（茶黄素、绿原酸、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷）与β-LG的相互作用。对比天然β-LG，3种酚-蛋白加合物的消化率均有所增加（20.5%→27.9%、25.8%、31.6%），而加合物的致敏性却呈现降低趋势。Xu等[47]在使用绿原酸共价耦合WPI时也有类似的发现。多酚改变乳蛋白的消化性体现在“消化率”和“消化产物的组成（与含量）”，而两者又与乳蛋白在体内的致敏性（力）密切相关。因此，有必要将消化特性纳入相关机制研究的考察范畴之内。
4. 酚鳌合技术与其他脱敏方式的对比
酚螯合技术和其他脱敏方式在原理上具有一定的相似性。相比这些方法的若干不足或短板，例如热处理会导致牛乳蛋白变性、营养损失；糖基化可能会带来不良的颜色变化和风味；酶解容易产生苦味、异味，口感、乳化性变差；发酵条件不易控，不便用来做乳粉长期贮藏，等等，多酚也有其自身的一些优点。首先，PPI过程在大多数食品体系中可以自发完成。若能对反应方式、程度加以干预，则酚类物质可以温和地与乳蛋白结合，不会严重破坏蛋白的空间结构或导致变性，这对于热稳定性较低的乳清蛋白尤为重要。另外，虽然深度水解乳粉能够最大可能地避免CMPA的发生，但蛋白（肽）的活性功能并非氨基酸所能完全取代[48-49]。乳蛋白作为游离酚的良好载体，适宜的PPI还可以提高蛋白的抗氧化活力和乳化性，同时提高酚在胃肠消化过程中稳定性。因此，多酚在相对保留乳蛋白特征价值、不额外衍生副产物、脱敏的实操性等方面具有一定的优势（表1）。
表 1 不同脱敏技术的特点与比较Table 1. Comparison of different desensitization methods技术方法 作用原理 特点评价 酚鳌合技术与该方法的相似性 酚鳌合技术相比于该方法的潜在优势 热处理 引起表位的变化，例如碎片化、掩蔽和暴露，
使其构象表位被破坏[7,31,50]操作简单 改变空间结构和表位特征 对耐热性差的乳清蛋白[7,51]保护性较好，
不会导致蛋白变性糖基化 多以美拉德反应形式发生，改变蛋白质分子结构，对致敏表位进行
修饰[10,34,52]克服酶解产生的苦味 掩盖致敏表位 美拉德反应影响牛乳的感官性（导致褐变），且有潜在的毒副作用[53-54]；相比而言，
多酚更加绿色安全[55]超高压
处理影响蛋白质分子中的非共价相互作用，
如氢键、离子键和疏水键，
并影响蛋白质的二级和三级结构[8,56]可以抑制微生物生长、延长货架期，对天然风味保留较好 影响蛋白质结构，
改变构象表位酚螯合技术操作简便、安全，
无需高昂设备，节约成本酶解 蛋白质构象表位塌陷，线性表位被切割[9,32,57] 效率高、
专一性强间接提高蛋白的内源消化性 酚-蛋白加合物不会产生明显苦味，还可能
提高蛋白的乳化性[58]、抗氧化能力[59]发酵 诱导蛋白质构象发生变化，
微生物释放的酶类
能够分解乳蛋白[33,60]口感风味好，一般需低温储藏 间接提高蛋白的内源消化性 反应时间短、条件易控制，易于常温储存，
更适合被加工为乳粉、乳蛋白原料5. 研究展望
基于多酚鳌合技术的低致敏乳粉（及乳制品）的研发策略，是分别制备低敏性乳蛋白原料，然后再复配组合。目前相关的应用基础研究主要是围绕β-LG蛋白展开，而对酪蛋白和α-乳白蛋白的报道则相对较少。据统计，大约65%的CMPA人群对酪蛋白过敏，而对α-乳白蛋白过敏的约有51%[61]。另有调查报告显示，少数大龄儿童的CMPA更多是源于对酪蛋白的过敏[62]。因此，也有必要开展这两种乳蛋白的试验研究。此外，PPI在乳蛋白脱敏技术中的数据与理论基础并不充足，不同研究者对酚的选择存在随意性，试验结果差异大。在机理层面，尚缺乏酚消减乳蛋白过敏原性的关键性实证。对此，还有大量的科学问题有待解释和解决。
5.1 摸索PPI消减牛乳蛋白致敏性的最佳反应条件
现今不同文献关于PPI的构建方法大相径庭。PPI的反应方式和结果会受到酚种类、酚与蛋白的浓度配比、环境pH与温度、以及盐离子浓度等多因素的影响。而在酚对乳蛋白脱敏的相关研究中，少有试验针对以上条件进行筛选优化。此外，酚对乳蛋白的其他属性（营养、功能、感官）也可能会有所影响。例如，Wang等[58]发现，EGCG可以显著降低α-乳白蛋白的液滴尺寸，改善α-乳白蛋白的乳化性；Jiang等[63]采用绿原酸将乳清蛋白和酪蛋白的溶解度分别提高了15.1%和18.2%。相反，Prigent 等[64]利用原花青素与α-乳白蛋白相互作用，导致蛋白的溶解度下降了18%~21%；某些酚类物质还可能会降低蛋白的生物利用度。因此，从实际生产角度出发，需要在乳蛋白脱敏与保留其天然性之间寻找平衡。
5.2 探究PPI消减牛乳蛋白致敏性的具体作用机制
如前所述，无论是酚的共价或非共价加合作用，大多是基于对表位的屏蔽、构象改变或影响内源消化性这3个方面来降低乳蛋白的过敏性。但不同酚化合物的结构（官能团数量）、分子量和亲/疏水性差别较大，给不同试验数据之间的横向比较造成了一定困难，也不宜判断是哪种因素占据主导作用。目前，大部分文献研究采用软件模拟预测来鉴别多酚在乳蛋白中的结合位点，而缺乏实证。X射线衍射（XRD）、核磁共振（NMR）和高分辨质谱（UPLC-MS/MS）等技术都可以精准识别酚的鳌合位置[65]。通过查询、比对过敏原数据库（例如IUIS Allergen Nomenclature）中的表位信息，能够更加明确多酚对蛋白抗原性的消减方式。此外，酚-蛋白加合物在胃肠消化环境中是一个（部分）酚解离后又重新与肽段结合的动态过程，一些中长肽仍具有CMPA的抗原性。加合物的消化产物是否会再次暴露表位（能否被多酚覆盖），也需要被进一步解析。
5.3 植物多酚与其他处理方法的联用
参考前人的方法联用技术，未来可以尝试将多酚与其他处理方式搭配组合，探究其对牛乳蛋白致敏性的影响（考察多种消减技术之间的协同作用、以及对某些方法弊端的弥补效果）。例如，酶解会暴露某些疏水氨基酸而衍生苦味肽，降低乳粉的口感；过度水解还会将一些活性内源肽段彻底切割，使其丧失某些特定有益的功能作用。考虑到多酚的结合有可能会改变肽酶的切割位点，酚本身对消化酶的活力也会有一定影响[66-67]，可以预测：酚-蛋白加合物的（商品酶）酶解产物（序列、丰度）将会与单一的酶解处理结果有所不同。虽已有相关的文献报道[68-69]，但在乳蛋白脱敏方面却鲜有提及。这些交叉技术将可能在今后有很大的创新机会与发展空间。
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图 3 植物多酚与乳蛋白的互作结合并消减蛋白致敏性的主要作用机制
注：（A）酚对蛋白表位的屏蔽；（B）酚对蛋白构象的影响；（C）酚对蛋白内源消化性的改变。
Figure 3. Roles of PPI in reducing allergenicity of milk proteins
表 1 不同脱敏技术的特点与比较
Table 1 Comparison of different desensitization methods
技术方法 作用原理 特点评价 酚鳌合技术与该方法的相似性 酚鳌合技术相比于该方法的潜在优势 热处理 引起表位的变化，例如碎片化、掩蔽和暴露，
使其构象表位被破坏[7,31,50]操作简单 改变空间结构和表位特征 对耐热性差的乳清蛋白[7,51]保护性较好，
不会导致蛋白变性糖基化 多以美拉德反应形式发生，改变蛋白质分子结构，对致敏表位进行
修饰[10,34,52]克服酶解产生的苦味 掩盖致敏表位 美拉德反应影响牛乳的感官性（导致褐变），且有潜在的毒副作用[53-54]；相比而言，
多酚更加绿色安全[55]超高压
处理影响蛋白质分子中的非共价相互作用，
如氢键、离子键和疏水键，
并影响蛋白质的二级和三级结构[8,56]可以抑制微生物生长、延长货架期，对天然风味保留较好 影响蛋白质结构，
改变构象表位酚螯合技术操作简便、安全，
无需高昂设备，节约成本酶解 蛋白质构象表位塌陷，线性表位被切割[9,32,57] 效率高、
专一性强间接提高蛋白的内源消化性 酚-蛋白加合物不会产生明显苦味，还可能
提高蛋白的乳化性[58]、抗氧化能力[59]发酵 诱导蛋白质构象发生变化，
微生物释放的酶类
能够分解乳蛋白[33,60]口感风味好，一般需低温储藏 间接提高蛋白的内源消化性 反应时间短、条件易控制，易于常温储存，
更适合被加工为乳粉、乳蛋白原料
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1. 任章成，郭泽美，李乐，袁莹. 植物多酚生物活性研究进展. 现代食品. 2023(22): 108-110 . 
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