Optimization of Mica Processing Method Based on Atomic Force Microscopy to Study the Molecular Structure of Xanthan Gum
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摘要: 原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）成像常用于研究多糖分子结构，然而针对阴离子多糖，现有的制样方法较难在小范围观察区获得其清晰的单分子束结构图片。因此，本文以黄原胶为阴离子多糖代表，从不改变多糖本身结构、提升成像质量角度出发，对多糖样品浓度，云母片不同金属离子盐种类、浓度和处理时间等AFM制样方法进行了优化。结果表明，在空白云母片上，黄原胶浓度1~5 μg/mL时可观测到多糖单分子束结构，但在15 μm×15 μm扫描范围内可观测的分子束较少。通过对云母片进行处理优化，最佳处理条件选定在0.5 mmol/L的CaCl2溶液处理2 min或2 mmol/L CaCl2溶液处理0.5 min。在此条件下，当黄原胶浓度为5 μg/mL时，在3 μm×3 μm观测范围内，处理后云母片上的黄原胶分子束数量及成像质量相比空白云母片显著提升，且其单分子束高度与分子结构并未发生改变。此外，通过提高云母片干燥温度可以获取更均匀的黄原胶分子结构图片。本研究可为其他阴离子多糖AFM成像的样品制备提供可借鉴的方法参考。
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关键词:
- 黄原胶 /
- 原子力显微镜(AFM) /
- 多糖分子束 /
- 成像 /
- 制样方法
Abstract: Atomic Force Microscopy imaging is generally used for investigating the molecular structure of polysaccharides. However, for ionic polysaccharides, it is still difficult to obtain clear images with monolayer structure under the limited observation region based on the reported sample treatment methods. Taking xanthan gum as the typical ionic polysaccharide, in order to improve the image quality without changing the structure of polysaccharide, the sample preparation procedures were optimized, including sample concentration, variety and concentration of salt ions, and treatment time. The results showed that monolayer structure of xanthan was observed on clear mica when xanthan concentration was 1~5 μg/mL. However, the observed monolayer structure became much less when the observation region was 15 μm×15 μm. Then, the mica was treated and the treatment conditions were optimized. The optimized treatment conditions were selected as 2 min treatment by using 0.5 mmol/L calcium chloride solution or 0.5 min treatment by using 2 mmol/L calcium chloride solution. Under this condition, the molecular structure of 5 μg/mL xanthan gum was observed. The results illustrated that the number of monolayer xanthan gum molecular chains greatly increased within the observation region of 3 μm×3 μm, as compared with that on the untreated mica. Meanwhile, the treatment of mica could keep the height and morphology of monolayer structure of xanthan gum. In addition, the images of monolayer structure with more homogenous distribution could be obtained by increasing the drying temperature for mica. This study could provide an experimental reference for the sample preparation of other anionic polysaccharide in AFM imaging. -
多糖是一类具有复杂结构的生物聚合物，在细胞识别、信号转导和生物发育等方面发挥着重要的生理作用[1-2]。同时因具有良好的增稠、乳化、稳定和凝胶的应用特性，被广泛应用于食品、化妆品、畜禽养殖和制药等领域[3-7]。研究表明，多糖的理化特性和生物活性往往与其结构具有紧密的联系，以往的多糖结构研究主要集中在分子链的单糖组成和糖苷键的连接方式等基础理论研究，而表征多糖的分子链形态和空间结构形成才是探究多糖高级结构与性质之间关系的重要依据[8]。因此寻求直观可靠的表征手段对多糖分子束空间结构进行探究，对阐明多糖性质，进而扩宽应用领域具有重要意义[9]。
原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）是近十几年发展起来的研究生物大分子形态和构象的强大显微镜技术，是目前获取多糖结构信息最通用的检测技术之一，具有纳米级分辨率[10-11]。与其他显微技术相比，AFM技术的样品制备相对简单，同时成像过程中免去了真空条件和重金属染色对样品的破坏，能以最小的损伤呈现样品的原始状态提高代表性[12]。由此，AFM技术被广泛用于多糖的结构表征中，如聚糖、黄原胶、卡拉胶、木葡聚糖、果胶、阿拉伯木聚糖、裂叶聚糖、淀粉等[13]。然而，AFM成像分析中，为保持多糖样品的原始状态，对制样环境和操作手法要求较高。已报道的多糖样品制备方法都是参考性质相似，甚至不相似的样品，不具有针对性[11,13]。多糖分子结构的观察多采用轻敲模式，并使用亲水性较高的云母片作为样品衬底，但是新鲜剥开的云母表面会立即带负电荷，阴离子多糖沉积在刚切割的云母上时，由于负电互斥而固定不足，导致观察视野内多糖分子链数量不足，成像效果差[14-15]。因此，正确的制样处理方法研究对多糖后续的AFM成像至关重要。
多糖AFM分析中，采用合适的方法将多糖分子吸附到基底上是实现理想分子状态的一个关键因素，而样品的浓度、样品表面的水层、多糖的溶剂、在云母片表面沉积的加样方法等也是影响成像重要的因素[14,16]。对于多糖AFM成像，测试样品的浓度通常在0.1~10 μg/mL，单分子或者分子的分散情况则通过进一步稀释实现。此外，吸附在多糖和云母上的水层能够维持多糖的结构，过厚则容易降低AFM的分辨率，而使用温和方法如改变多糖沉积时云母片的温度，从云母片中蒸发掉多余的水，能够保持多糖初始生理结构[10-11,13]。阴离子多糖则通过添加带电离子钙盐和镁盐、一些化学药剂与表面活性剂等改变云母表面带电情况实现多糖链的固定和沉积[11, 17]。但此方法通常需要进一步优化，如邵丽等[10]将云母片使用20 mmol/L的Mg2+处理2 min后观测10 ng/mL阴离子胞外多糖结构，发现在如此低的多糖浓度下，其AFM成像仍然发生了聚集。可见，云母片离子处理（包括离子类型、处理浓度、处理时间）与多糖浓度之间的关系对多糖AFM原始生理结构成像存在较大的影响。因此，通过多因素条件优化和处理方法改善，获得普适性更高的基本技术和关键因素，可以提高原子力显微镜在阴离子多糖结构中的应用质量。
自然界中，天然存在的仅甲壳素为碱性多糖，大多为酸性多糖即阴离子多糖[18]。如黄原胶（Xanthan gum，XG）是以玉米淀粉、蔗糖等为主要原料在甘蓝黑腐病野油菜黄单胞菌发酵产生的一种高黏度水溶性胞外酸性杂多糖[19-20]。本实验选择黄原胶为阴离子多糖代表，从不改变多糖本身结构性质角度出发，通过改变多糖样品浓度，云母片不同金属离子盐种类、盐处理浓度和处理时间进行云母片表面带电处理，改变云母片处理温度对多糖AFM成像样品制备方法进行优化，以期为其他阴离子多糖的AFM成像样品制备提供可借鉴的方法参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
黄原胶（美国药典级） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CaCl2、MgCl2、ZnCl2、AlCl3均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司；RTESP-300探针 美国布鲁克仪器有限公司；云母片 海德创业（北京）生物科技有限公司；双面胶（3M） 北京安立通科技有限公司。
MM8原子力显微镜 美国布鲁克仪器有限公司；Direvt-u8超纯水仪 美国Millipore公司；101-3AB电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；磁力搅拌器 上海予英仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 不同浓度多糖溶液的AFM样品制备
准确称取5 mg黄原胶，使用超纯水溶解后配制成100 μg/mL的多糖溶液。将配制好的多糖溶液置于磁力搅拌器上搅拌8 h使多糖溶解完全，随后使用超纯水稀释配制1、5、10 μg/mL的黄原胶溶液[11]。使用双面胶剥开平整云母片后，取上述多糖溶液5 μL滴加至云母表面，置于室温25±3 ℃干燥器2 h后待测。
1.2.2 不同离子处理云母片对多糖AFM观测效果的影响
1.2.2.1 不同价态离子处理云母片对多糖AFM观测效果的影响
为增加云母片表面电荷，参照文献报道方法，选择二价Ca2+和三价Al3+对云母片进行处理[10,21]。分别配制2 mmol/L的CaCl2、AlCl3溶液，取5 μL离子溶液滴加至新鲜剥开云母片表面，静置2 min后使用超纯水冲洗10次置于室温干燥器干燥。随后取上述1 μg/mL多糖溶液5 μL分别滴加至不同离子处理后的云母表面，滴加同体积的多糖至未经离子处理的云母片为对照，置于室温25±3 ℃干燥器自然干燥2 h后待测。
1.2.2.2 不同二价离子处理云母片对多糖AFM观测效果的影响
结合1.2.2测试结果与文献报道[21]，对云母片不同二价离子处理进行筛选。选择Ca2+、Zn2+、Mg2+二价对云母片进行处理[10,21]。参照1.2.1方法进行样品制备。
1.2.3 钙离子处理云母片对多糖AFM观测效果的影响
在1.2.2节测试结果的基础上，分别对钙离子不同处理浓度与不同处理时间进行优化。
1.2.3.1 不同钙离子浓度处理云母片对多糖AFM观测效果的影响
分别配制0.5、2、4 mmol/L的CaCl2溶液，取5 μL离子溶液滴加至新鲜剥开云母片表面，静置2 min后使用超纯水冲洗10次置于室温干燥器干燥。随后取上述5 μg/mL多糖溶液5 μL分别滴加至0.5、2、4 mmol/L的Ca2+处理后的云母表面，滴加同体积的多糖至未经离子处理的云母片为对照，置于室温25±3 ℃干燥器自然干燥2 h后待测。
1.2.3.2 不同钙离子处理时间处理云母片对多糖AFM观测效果的影响
取上述配制的2 mmol/L的CaCl2溶液5 μL滴加至新鲜剥开云母片表面分别处理0.5、2和4 min，使用超纯水冲洗10次置于室温干燥器干燥。随后取上述5 μg/mL多糖溶液5 μL分别滴加至Ca2+不同处理时间的云母表面，滴加同体积的多糖至未经离子处理的云母片为对照，置于室温25±3 ℃干燥器自然干燥2 h后待测。
1.2.4 不同干燥温度与钙离子处理对多糖观测效果的影响
取上述配制的1 μg/mL的黄原胶溶液滴加至新鲜剥开的云母片后，依据参考文献，分别置于室温25±3 ℃干燥器自然干燥2 h、45 ℃烘箱中干燥2 h、2 mmol/L Ca2+离子处理2 min后置于45 ℃烘箱中干燥2 h后待测[22]。
1.3 AFM观测条件与数据分析
AFM观测参数：采用125 μmⅹ125 μm扫描管，轻敲模式，RTESP-300硅探针无涂层，共振频率f0：300 kHz，弹性系数k：40 N/m，扫描速率设置1 Hz。在温度，湿度50%下进行AFM观测。观测得到图像采用布鲁克Nanoscope Version9.0软件进行分析，AFM图像经2nd Flat处理后选择Section功能对所选区域进行多糖分子高度计算[10, 23]。测得的数据使用单因素方差分析（ANOVA）中Turkey’s方法来比较均值和差异性分析（P<0.05，差异显著）。所有统计分析均由IBM SPSS Statistics版本20.0进行处理。
2. 结果与分析
2.1 不同多糖浓度对其AFM成像的影响
多糖浓度不仅影响其在云母片表面沉积的量，而且对其结构构象具有较大影响。浓度低至一定浓度时，可以观测单个分子或单分子束，浓度增加至一定程度后，容易形成胶束甚至是团聚体[24]。黄原胶的不同浓度AFM图像与分子高度如图1与表1所示，当浓度1 μg/mL时，15 μm×15 μm扫描范围内仅一条分子束，其构象呈现短的单纤维状链（图1A）；浓度增加至5 μg/mL时，分子束增加并存在交缠，高度增加至0.784±0.142 nm（图1B）；而10 μg/mL时，分子束数量、长度、高度显著增加，分子束出现弯曲与分子束聚集（图1C中1，2，3处），有利于AFM成像观测。研究表明，黄原胶分子结构主链是由重复的葡萄糖单元通过β-（1-4）糖苷键连接形成，侧链是带负电荷的三糖β-（1-3）-D-甘露糖-（1-4）-β-D-葡糖醛酸-（1-2）-α-D-甘露糖，其在溶液中的结构状态主要包括紧密双螺旋结构、扩展双螺旋结构与扩展单螺旋结构[25]。由图1观测的黄原胶分子束高度推测，浓度较低时，黄原胶分子构象呈现的是扩展单螺旋结构，浓度大于5 μg/mL时，分子束高度约为原来的2倍，呈现的是双螺旋结构，黄原胶稀溶液的这种有序双螺旋结构与研究报道的结果是一致[26-27]。
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图 1 不同浓度黄原胶溶液的AFM图注：A，1 μg/mL；B，5 μg/mL；C，10 μg/mL；扫描范围15 μm×15 μm。Figure 1. AFM images of xanthan gum at different concentrations表 1 不同浓度下黄原胶溶液的分子垂直高度Table 1. Molecule vertical height of xanthan gum at different concentrations2.2 不同价态离子处理云母片对多糖溶液AFM成像的影响
新鲜剥离的云母片带负电，阴离子多糖及中性多糖由于样品固定不牢固容易引起AFM成像难、分辨率低等问题，而使用正离子中和云母片上电荷可能是改善成像的有效途径。云母片经二价和三价正离子处理后黄原胶的AFM成像与分子高度如图2与表2所示。由2.1结果可知，对于较稀浓度（1 μg/mL）多糖样品，未经处理的云母片即使在较大扫描范围也很难观测到多糖结构，仅一条单分子束（图2A），经过钙离子处理2 min后的云母片上分子束结构增多（图2B），而经过相同时间铝离子处理后观测到多糖分子束增多的同时，分子结构发生了较明显的卷曲和团聚作用（图2C）。此外，由于离子盐吸附能力较强、清洗不够等因素使其在云母片上存在附着，背景呈现较多的盐渍，背景高度图像不平整。从多糖图像高度可以看到，经过钙离子与铝离子处理后，在红线测量的区域内分子束高度没有显著性差异。然而，相较于二价的钙离子，三价的铝离子可以显著促进黄原胶分子的凝胶化，影响多糖的AFM成像质量，这也与报道的结果相一致[28-29]。可见，云母片经铝离子处理后黄原胶AFM图像呈现较大面积的团聚现象，其原始生理结构发生变化，而Ca2+处理则能更好保持多糖生理结构，成像效果更好。
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图 2 云母片经不同价态离子处理后黄原胶溶液的AFM图注：A，空白；B，Ca2+；C，Al3+；扫描范围3 μm×3 μm。Figure 2. AFM images of xanthan gum on mica with different valence ions表 2 云母片经不同价态离子处理后黄原胶溶液的分子垂直高度Table 2. Molecule vertical height of xanthan gum on mica with different valence ions不同价态盐离子 分子链垂直高度（nm） 空白 0.459±0.000a Ca2+ 0.751±0.272a Al3+ 0.760±0.080a 2.3 不同二价离子处理云母片对多糖溶液AFM成像的影响
为进一步优化二价金属离子的种类选择，将云母片用不同二价正离子处理后进行黄原胶溶液的AFM成像，结果如图3与表3所示。图3显示，未经处理的云母片上仅观测到3条多糖单分子束，并出现部分缠结结构（图3A）。当云母片经钙离子处理2 min后，分子束结构增多，分子缠结结构增加（图3B）。镁离子处理后，虽然仅观测到一条多糖分子束，但其发生了明显的团聚作用，分子束显著增大（图3C）。而经过锌离子处理后，多糖分子束之间则发生交互作用，形成了网络结构（图3D）。此外，与结果2.2相同，经过盐离子处理后多糖AFM图像背景容易出现盐渍与背景高度图像不平整等情况。通过分析多糖图像的高度情况可知，云母片经过钙离子与锌离子处理后，在红线测量的区域内分子束高度与对照组没有显著性差异，而经过镁离子处理后，多糖分子束高度增加至空白组近3倍。与其他二价离子相比，镁离子更能显著促进黄原胶分子团聚，这也与报道的结果相一致[1,28]。通过比较，发现云母片经Ca2+处理能更好保持多糖生理结构，成像效果更好。
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图 3 云母片经不同二价离子处理后黄原胶溶液的AFM图注：A，空白；B，Ca2+；C，Mg2+；D，Zn2+；扫描范围2 μm×2 μm。Figure 3. AFM images of xanthan gum on mica with different divalent ions表 3 云母片经不同二价离子处理后黄原胶溶液的分子垂直高度Table 3. Molecule vertical height of xanthan gum on mica with different divalent ions不同二价盐离子（mmol/L） 分子链垂直高度（nm） 空白 0.592±0.080b Ca2+ 0.721±0.410b Mg2+ 1.727±0.267a Zn2+ 0.755±0.192b 2.4 不同浓度钙离子处理云母片对多糖溶液的AFM成像的影响
由上述实验结果可知，通过添加钙离子处理可以中和新鲜剥离云母片上的负电荷，有效提高多糖在云母片上的固定效果。然而，云母片表面离子处理不仅影响其表面所带电荷的多少，同时对多糖分子AFM成像结构、成像背景存在较大的影响，这与钙离子处理的浓度与处理时间是密切相关的。图4与表4显示了5 μg/mL黄原胶在经不同钙离子浓度处理2 min后的云母片的AFM成像与分子高度。如图所示，在红线测量的区域内，对照组中黄原胶分子为单束纤维状（图4A），云母片经0.5 mmol/L钙离子处理后，多糖分子束间发生一定的团聚作用，并形成了相互交缠的双螺旋局部网络结构，分子束高度显著增加（图4B）。钙离子处理浓度增至2 mmol/L时，黄原胶双螺旋分子束出现溶胀现象，形成了规律的双螺旋全网状结构，其原始生理结构发生变化，分子高度增加到最大（图4C）。而钙离子处理浓度增至4 mmol/L时，黄原胶双螺旋全网状结构更加紧凑，分子高度小幅度降低（图4D）。XG的分子束上存在大量的游离羧基，可以与钙离子等金属离子螯合，形成网络结构，改变其初始生理结构，而当云母片上钙离子浓度提升，完全中和黄原胶侧链上羧基所带电荷后，可以抑制侧链间的静电相互作用，从而导致其分子粘度降低的情况[30-31]。为此，对于5 μg/mL黄原胶溶液，为保持其原始生理结构成像，设定离子处理2 min时，云母片钙离子浓度控制在0.5 mmol/L内较好。
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图 4 云母片经不同钙离子浓度处理后黄原胶溶液的AFM图注：A，空白；B，0.5 mmol/L；C，2 mmol/L；D，4 mmol/L；扫描范围3 μm×3 μm。Figure 4. AFM images of xanthan gum on mica treated with different Ca2+ concentration表 4 云母片经不同钙离子浓度处理后黄原胶溶液的分子垂直高度Table 4. Molecule vertical height of xanthan gum on mica treated with different Ca2+ concentrationsCa2+不同处理浓度（mmol/L） 分子链垂直高度（nm） 空白 0.436±0.218b 0.5 0.819±0.224a 2 0.898±0.444a 4 0.772±0.190a 2.5 云母片钙离子处理时间对多糖溶液的AFM成像的影响
除钙离子处理浓度外，钙离子处理时间也同样影响云母片上吸附的电荷的多少。5 μg/mL黄原胶溶液在经2 mmol/L钙离子处理处理不同时间的云母片上的AFM成像与分子高度如图5与表5所示，处理0.5 min后，云母片上吸附的黄原胶分子数量和分子束长度均显著增加，在红线测量的区域内分子束高度略有增加，分子结构未发生明显变化（图5B）。随着钙离子浓度处理时间延长，2 min后与上述同浓度钙离子处理后相同，黄原胶分子形成了规律的双螺旋全网状结构，所测区域内分子束平均高度增大（图5C）；4 min时，黄原胶全网状结构更加紧凑（图5D）。从AFM成像与所选区域分子高度可以看出，当云母片钙离子处理时间大于0.5 min时，多糖成像中盐的背景增加，背景高度显著增大，对多糖高度测定存在一定的影响。由此可见，对于5 μg/mL黄原胶溶液，为不改变黄原胶生理结构成像，云母片经2 mmol/L钙离子处理时间应该控制在0.5 min内。
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图 5 云母片经钙离子处理不同时间黄原胶溶液的AFM图注：A，空白；B，0.5 min；C，2 min；D，4 min；扫描范围3 μm×3 μm。Figure 5. AFM images of xanthan gum on mica treated with Ca2+at different time表 5 云母片经钙离子处理不同时间黄原胶溶液的分子垂直高度Table 5. Molecule vertical height of xanthan gum on mica treated with Ca2+at different timeCa2+不同处理时间（min） 分子链垂直高度（nm） 0 0.436±0.218a 0.5 0.570±0.339a 2 0.744±0.298a 4 0.656±0.482a 2.6 钙离子与不同干燥温度处理云母片对多糖溶液的AFM成像的影响
对于大多数AFM固体样品制备，云母片中的水层能够维持多糖的结构，但太厚，尖端与水层之间的毛细管里以及尖端与样品之间的年弹力会降低AFM的分辨率。需要使用温和方法从云母片中蒸发掉多余的水分使样品固定[11]。图6和表6中显示了1 μg/mL黄原胶溶液滴加在未处理的云母片与经2 mmol/L钙离子处理2 min的云母片表面置于不同温度干燥后的AFM图像与分子高度。由图可知，多糖样品置于25 ℃干燥时，分子束间中没有交联作用（图6A），而45 ℃干燥时多糖分子束在云母表面分布更均匀，分子见出现一定的交联作用（图6B），所测区域范围内分子束高度显著增加，而多糖滴加钙离子处理后的云母片表面置于45 ℃干燥后多糖结构存在一定交互作用，分子高度轻微降低，但盐处理后图像背景盐渍残留较明显（图6C）。这与Kirby等报道的将较难制样的甜菜果胶样品置于45 ℃干燥时获得更加均匀分布的AFM图的结果相同[22]。在干燥过程中样品可能容易通过分子结合作用产生凝聚或交联作用，即干燥伪影现象，因而图像中的单个分子不一定能够代表真实样品中分散的单分子[11,13]。通过钙离子处理云母片适当增加滴加样品后云母片的干燥温度，提高云母片中水层的挥发速度，对于改善多糖样品AFM成像的分散性具有一定的促进作用，但需适当增加离子处理后的清洗次数，减少图像中盐的残留（图6B）。
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图 6 云母片不同干燥温度下黄原胶溶液的AFM图注：A，空白+25 ℃；B，空白+45 ℃；C, 2 mmol/L Ca2+处理2 min+45 ℃；扫描范围3 μm×3 μm。Figure 6. AFM images of xanthan gum on mica at different drying temperature表 6 云母片不同干燥温度下黄原胶溶液的分子垂直高度Table 6. Molecule vertical height of xanthan gum on mica at different drying temperatures不同处理 分子链垂直高度（nm） 空白+25 ℃ 0.611±0.139b 空白+45 ℃ 0.940±0.242a Ca2+处理2 min+45 ℃ 0.832±0.120ab 3. 结论
本文针对阴离子多糖溶液AFM成像进行了样品浓度、云母片表面离子处理类型、离子处理浓度、处理时间以及云母片干燥温度的样品制备方法优化。实验结果显示，空白云母片上黄原胶样品浓度需适当提高，在1~5 μg/mL时可以观测到多糖单分子束结构，但15 μm×15 μm扫描范围内可观测的分子束较少；多糖较低溶液下（1~5 μg/mL），与其他二价离子与三价离子相比，云母片经0.5~2 mmol/L钙离子处理2~0.5 min后置于45 ℃下干燥能够在不改变多糖成像中分子高度、保持多糖生理结构情况下，有效增加观测的多糖分子束数量，获得更均匀、高质量的AFM成像，对于其他阴离子多糖AFM成像制样中具有一定的参考意义。然而，关于云母片钙离子浓度、处理时间与干燥温度因素之间的相互作用关系仍有待于进一步的实验设计优化。通过AFM成像方法的多因素条件优化和样品处理改善，提高AFM在多糖结构分析中的结果质量，可为AFM在多糖分子结构探索中的制样方法学研究提供技术参考。
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图 1 不同浓度黄原胶溶液的AFM图
注：A，1 μg/mL；B，5 μg/mL；C，10 μg/mL；扫描范围15 μm×15 μm。
Figure 1. AFM images of xanthan gum at different concentrations
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图 2 云母片经不同价态离子处理后黄原胶溶液的AFM图
注：A，空白；B，Ca2+；C，Al3+；扫描范围3 μm×3 μm。
Figure 2. AFM images of xanthan gum on mica with different valence ions
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图 3 云母片经不同二价离子处理后黄原胶溶液的AFM图
注：A，空白；B，Ca2+；C，Mg2+；D，Zn2+；扫描范围2 μm×2 μm。
Figure 3. AFM images of xanthan gum on mica with different divalent ions
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图 4 云母片经不同钙离子浓度处理后黄原胶溶液的AFM图
注：A，空白；B，0.5 mmol/L；C，2 mmol/L；D，4 mmol/L；扫描范围3 μm×3 μm。
Figure 4. AFM images of xanthan gum on mica treated with different Ca2+ concentration
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图 5 云母片经钙离子处理不同时间黄原胶溶液的AFM图
注：A，空白；B，0.5 min；C，2 min；D，4 min；扫描范围3 μm×3 μm。
Figure 5. AFM images of xanthan gum on mica treated with Ca2+at different time
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图 6 云母片不同干燥温度下黄原胶溶液的AFM图
注：A，空白+25 ℃；B，空白+45 ℃；C, 2 mmol/L Ca2+处理2 min+45 ℃；扫描范围3 μm×3 μm。
Figure 6. AFM images of xanthan gum on mica at different drying temperature
表 1 不同浓度下黄原胶溶液的分子垂直高度
Table 1 Molecule vertical height of xanthan gum at different concentrations
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表 2 云母片经不同价态离子处理后黄原胶溶液的分子垂直高度
Table 2 Molecule vertical height of xanthan gum on mica with different valence ions
不同价态盐离子 分子链垂直高度（nm） 空白 0.459±0.000a Ca2+ 0.751±0.272a Al3+ 0.760±0.080a
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表 3 云母片经不同二价离子处理后黄原胶溶液的分子垂直高度
Table 3 Molecule vertical height of xanthan gum on mica with different divalent ions
不同二价盐离子（mmol/L） 分子链垂直高度（nm） 空白 0.592±0.080b Ca2+ 0.721±0.410b Mg2+ 1.727±0.267a Zn2+ 0.755±0.192b
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表 4 云母片经不同钙离子浓度处理后黄原胶溶液的分子垂直高度
Table 4 Molecule vertical height of xanthan gum on mica treated with different Ca2+ concentrations
Ca2+不同处理浓度（mmol/L） 分子链垂直高度（nm） 空白 0.436±0.218b 0.5 0.819±0.224a 2 0.898±0.444a 4 0.772±0.190a
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表 5 云母片经钙离子处理不同时间黄原胶溶液的分子垂直高度
Table 5 Molecule vertical height of xanthan gum on mica treated with Ca2+at different time
Ca2+不同处理时间（min） 分子链垂直高度（nm） 0 0.436±0.218a 0.5 0.570±0.339a 2 0.744±0.298a 4 0.656±0.482a
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表 6 云母片不同干燥温度下黄原胶溶液的分子垂直高度
Table 6 Molecule vertical height of xanthan gum on mica at different drying temperatures
不同处理 分子链垂直高度（nm） 空白+25 ℃ 0.611±0.139b 空白+45 ℃ 0.940±0.242a Ca2+处理2 min+45 ℃ 0.832±0.120ab
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1. 陈士国，张唯希，朱凯，侯志强，叶兴乾. 食源性碳水化合物结构解析新技术前沿与展望. 中国食品学报. 2024(09): 1-17 . 
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