Determination of 22 Free Amino Acids in Food for Special Medical Purposes by Ultra-performance Liquid Chromatography
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摘要: 本文建立了特殊医学用途配方食品中22种游离氨基酸的超高效液相色谱检测方法。样品中氨基酸用磺基水杨酸提取，以2,4二硝基氟苯（DNFB）为柱前衍生试剂，以乙腈水-甲酸铵为流动相梯度洗脱，HSS T3色谱柱高效分离，超高效液相-二极管阵列检测器检测，外标法定量。结果显示，22种氨基酸在2~100 µg/mL范围内线性关系良好（R2>0.99）。方法检出限（S/N≥3）为10 mg/100 g，定量限（S/N≥10）为25 mg/100 g，低、中、高三个加标水平的回收率在90.1%~109.1%，相对标准偏差为0.8%~6.9%。方法简单高效、准确度高、重复性好，适用于特殊医学用途配方食品中22种游离氨基酸的定性、定量分析，为保障特殊医学用途配方食品的质量安全提供技术支持。
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关键词:
- 特殊医学用途配方食品 /
- 游离氨基酸 /
- 柱前衍生 /
- 2,4二硝基氟苯 /
- 超高效液相色谱法
Abstract: A method was established to determine 22 free amino acids in food for special medical purposes by ultra-performance liquid chromatography. After extraction with sulfosalicylic acid and derivation with 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB), the samples were eluted with acetonitrile water-ammonium formate as mobile phase. Amino acids were separated by HSS T3 column and detected with diode-array detector by external standard method. Results showed that, the 22 amino acids were linear in the range of 2~100 µg/mL with correlation coefficients higher than 0.99. The limits of detection (S/N≥3) were 10 mg/100 g, and the limits of quantification (S/N≥10) were 25 mg/100 g. The recoveries were in the range of 90.1% and 109.1% with relative standard deviation (RSD) from 0.8% to 6.9%. This method was simple, efficient, accurate and reproducible. It was suitable for determination of 22 free amino acids in food for special medical purposes, which could provide technical support to ensure the quality and safety. -
特殊医学用途配方食品是为满足进食受限、消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态人群对营养素或膳食的特殊需求，而专门加工配制而成的配方食品，如氨基酸代谢障碍配方食品。氨基酸作为合成蛋白质的重要原料，因其分子量小、易吸收常成为特殊医学用途配方食品首选的营养添加剂，但若摄入不当，会影响人体的正常生命代谢[1]。2019年相关部门积极整顿了特殊医学用途配方食品行业乱象，被行业称为特殊医学用途配方食品发展元年，截至2020年，特殊医学用途配方食品已注册超过45款，建立和规范特殊医学用途配方食品中相关检验标准及方法意义重大。
GB 29922-2013[2]规定了22种可用于特殊医学用途配方食品中的氨基酸种类及含量，但GB 5009.124-2016[3]中分析的目标物仅限16种，未能覆盖胱氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、色氨酸和谷氨酰胺；卫生部公布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》中规定的L-羟脯氨酸属于非法添加氨基酸，但目前的检验标准SN/T 3929-2014[4]不包括特殊医学用途配方食品基质。国外报道的氨基酸检测对象大多为生物样品或普通食品，与种类繁多、基质复杂的特殊医学用途配方食品差别大，使得常规检测手段难以直接应用。国内针对特殊医学用途配方食品的已报导文献目前仅有6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）衍生法[5]，该方法限于GB 25596-2010[6]中的19种氨基酸，且方法对流动相pH要求极其严苛，适应性差。
调研文献发现，现有检测氨基酸的方法有茚三酮柱后衍生-氨基酸分析仪检测[7]、衍生化反应-液相色谱仪检测[8-11]、液相色谱-串联质谱法[12-15]等，氨基酸分析仪检测目标物局限性强，仪器专用，实验室普及率低；液相色谱-质谱仪器本身价格昂贵，常采用的消除基质效应方式-同位素内标法[12]也进一步提高了检测成本。本文拟采用液相色谱法检测22种游离氨基酸。基于氨基酸本身没有紫外吸收，需经过衍生化反应引入生色基团后进行检测。据报道，用于柱前衍生的试剂有6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）[16]、邻苯二甲醛（OPA）[17]、异硫氰苯酯（PITC）[18-20]、9-芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）[21-22]、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）[23]、2,4二硝基氟苯（DNFB）[24-26]等。其中，AQC与氨基酸反应快，副产物少，但是衍生试剂价格昂贵；OPA主要与一级氨基酸反应，不能与二级氨基酸直接反应；PITC衍生过程需去除多余的衍生试剂，且痕量的PITC会缩短分析柱的寿命；FMOC-Cl形成的衍生产物需萃取，且与组氨酸形成衍生物不稳定，影响定量；Dansyl-Cl易生成多级衍生产物；DNFB衍生技术虽然已有文献或资料报道，但与普通液相色谱联合检测也存在缺陷，如衍生反应时间长；使用5 μm色谱柱[24-26]柱效低，分析时间长；流动相采用N,N二甲基甲酰胺[24]、三乙胺[25]或者磷酸盐[26]，对环境、色谱柱、仪器均不友好等。
本研究针对GB 29922-2013规定的所有氨基酸（色氨酸除外，因其具发色基团，可用紫外检测器直接测定）和非法添加的L-羟脯氨酸，建立了DNFB衍生特殊医学用途配方食品中22种游离氨基酸的超高效液相色谱法，方法简单高效、试剂绿色环保，填补了GB 29922-2013中检测方法缺失的空白，检测范围扩增了L-羟脯氨酸。方法为特殊医学用途配方食品企业质量控制提供技术支持，为行业发展提供技术保障。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（lle）、亮氨酸（Leu）、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）标准品 纯度均≥99%，Dr.EhrenstorferGmbH公司；L-羟脯氨酸（L-Hyp）、瓜氨酸（Cit）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）标准品 纯度均≥99%，Bepure公司；甘氨酸（Gly） 纯度≥99%，中国计量科学研究院；天冬酰胺（Asn）、鸟氨酸（Orn） 标准品 纯度≥99%，上海安谱实验科技股份有限公司；牛磺酸（Tau）标准品 纯度≥99.8%，Sigma-Aldrich公司；ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACCQ-TAG ULTRA C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美国Waters公司；甲醇、乙腈 均为色谱纯，美国Fisher公司；盐酸、乙酸、氢氧化钠、甲酸铵、磺基水杨酸、亚铁氰化钾、乙酸锌、碳酸钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；2,4二硝基氟苯（DNFB） 阿法埃莎-中国化学有限公司；实验用特殊医学用途配方食品：氨基酸配方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方、氨基酸代谢障碍配方 均为市售；PTFE微孔滤膜 0.22 µm，上海安谱科学仪器有限公司。
ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪 配备Waters二极管阵列检测器，美国Waters公司；AB204-S型电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；SB-800DTD型超声波清洗器 中国宁波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷冻离心机 德国Sigma公司；Milli-Q超纯水制备器 美国MILLIPORE公司；MS3涡旋混合器 德国IKA公司。
1.2 标准溶液的配制
1.2.1 标准储备液
分别称取10 mg（精确至0.1 mg）氨基酸标准品，于25 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液分别定容至刻度，配制成浓度均为0.4 mg/mL的标准储备液，0~4 ℃避光保存。
1.2.2 标准工作溶液
将标准储备液用3.5%磺基水杨酸溶液逐级稀释，配成各组分浓度为2、10、20、50、100 µg/mL的混合标准工作溶液。
1.3 样品前处理
提取：样品混匀后称取0.2 g（精确至0.0001 g）于50 mL聚丙烯具塞离心管中，准确加入25 mL 3.5%磺基水杨酸溶液，涡旋1 min，超声15 min。8000 r/min离心5 min，取上清液待衍生。
衍生：分别取标准工作溶液和样品提取液200 μL至15 mL离心管，加入0.5 mol/L碳酸氢钠（pH9.0）200 μL，涡旋混匀后加入400 μL 1% DNFB衍生液，混匀后放入60 ℃水浴振荡暗反应10 min，取出放至室温，加入0.05 mol/L磷酸二氢钾（pH7.0）3 mL，涡旋混匀。过0.22 μm滤膜后，供超高效液相色谱-二极管阵列检测器测定。
1.4 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：50%乙腈水（A）和50 mmol/L甲酸铵溶液（pH5.0）（B）。检测波长：360 nm；流速：0.3 mL/min。柱温：55 ℃；进样量：3 µL。梯度洗脱程序（A）：0～6 min：12%～18%，6～10 min：18%～50%，10～28 min：50%～90%，28.1~33 min：100%保持，33.1～40 min：12%保持。
1.5 数据处理
通过与仪器配套的Empower 3色谱数据处理系统进行数据采集与处理，Origin 8.0进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 色谱条件的优化
氨基酸目标物极性强，在色谱柱上保留弱，需衍生后测定。碱性条件下，衍生化试剂DNFB与末端氨基酸反应，脱去一份子HF，生成具有紫外吸收的DNP肽（图1）。由于DNP肽的极性相近，色谱保留行为相似，且副产物易产生干扰，使得色谱分离难度增加。为此，本文对色谱柱和流动相条件进行详细考察。
2.1.1 色谱柱的选择
常规液相色谱柱粒径大、分析效率低，为实现22种氨基酸的有效分离，本文选用柱效高、粒径小超高效液相色谱柱。采用1.4流动相条件，比较ACQUITY UPLC BEH Shield RP18、ACCQ-TAG ULTRA C18和ACQUITY UPLC HSS T3三种色谱柱的分离效果发现，Asn与试剂峰R1在保留时间上很接近，对色谱柱的分离能力要求极高。Shield RP18和ULTRA C18的粒径小（1.7 μm），理论柱效高，但不能有效分离出Asn，Asn被试剂峰R1覆盖，无法检测；HSS T3（1.8 μm）属100%水性流动相兼容的C18色谱柱，专门用来保留和分离极性水溶性好的有机小分子。图2为HSS T3柱分析目标物的色谱图（a、b、c分别为标准溶液、代表性样品、样品加标的谱图），Asn保留时间位于试剂峰R1之后，且与邻近Ser有效分离；除此之外，特殊医学用途配方食品中常添加的类氨基酸成分[5]Tau可同时被DNFB衍生，Tau与邻近目标物的分离度同样影响着目标氨基酸的准确定量，图2a可以看出，HSS T3柱能同时满足22氨基酸和Tau的有效分离。
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图 2 T3柱分离22种氨基酸的色谱图注：1-Asp；2-Glu；3-L-Hpy；4-Asn-；5-Ser；6-Gln；7-Gly；8-Cit；9-Arg；10-Thr；11-Ala；12-Pro；13-Val；14-Met；15-Cys；16-Ile；17-Leu；18-His；19-Phe；20-Orn；21-Lys；22-Lyr；0-Tau（类氨基酸，非本文目标物）；R-试剂峰；a：标准溶液；b：样品；c：加标样品。Figure 2. Chromatograms of 22 amino acids separated by T3 column2.1.2 流动相的选择
现有文献报道的用于分离DNP肽的流动相-水相常用磷酸盐缓冲液，其中需加入三乙胺等离子对试剂，配制过程复杂、使用过程中易析出且对色谱柱、仪器均不友好。本文尝试使用溶解性好的甲酸铵作为水相分析DNP肽，一方面简化了配制流动相的繁杂性，降低了检测成本；另一方面该试剂对环境友好也有利于仪器或色谱柱寿命的延长。研究发现，乙腈水&甲酸铵的流动相体系中有机相-乙腈浓度对目标物的分离度尤其敏感，因此对有机相进一步考察。
有机相-乙腈水作为强洗脱溶剂，其浓度直接影响洗脱速度，进而影响化合物的分离度，其中Ala、Pro两峰、Ile、Leu、His三峰的分离是难点（图3）。当乙腈浓度为100%时，目标峰被洗脱太快，集中分布在色谱图前端，Ala、Pro分离度好，但Ile、Leu、His三峰明显分不开；当乙腈浓度为40%时，洗脱速度变慢，分析效率低，同时水相甲酸铵盐被稀释，浓度降低，致使末端Leu、His分离度差；当乙腈浓度为60%时，目标氨基酸分布相对均匀，但Ile、Leu、His三峰仍分不开；当乙腈浓度为50%时（图2a），Ala、Pro两峰分离度稍差（定量为Ala、Pro之和），可以通过光谱图辅助定性，其他20种氨基酸分离效果满意。因此，本文选择50%的乙腈水作为有机相，50%乙腈水&50 mmol/L甲酸铵溶液为最终流动相体系。
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图 3 有机相比例对22种DNP肽分离度的影响注：11-Ala；12-Pro；13-Val；14-Met；15-Cys；16-Ile；17-Leu；18-His；19-Phe；20-Orn；21-Lys；22-Lyr；0-Tau；R：试剂峰。Figure 3. Effect of organic phase ratio on the separation degree of 22 amino acid derivatives2.1.3 特征吸收光谱定性讨论
二极管阵列检测器全波长同时采集数据的特点，赋予了其光谱比对的功能，衍生后生成的DNP肽的紫外吸收光谱形状类似，但是一级与二级氨基酸衍生后形成的DNP肽光谱特征差异明显。一级或二级氨基酸是针对氨基中N的配位状态来说的，一级氨基酸的氨基为伯氨基，二级的氨基为仲氨基，如Pro、L-Hpy。图4看出，一级氨基酸衍生产物光谱图最大吸收集中在360±3 nm处，而二级氨基酸（Pro、L-Hpy）的最大吸收移至385 nm左右。特征紫外吸收波长可辅助定性一级氨基酸和二级氨基酸，为后续推断更多化合物的结构与性质推断提供参考价值。
2.2 前处理条件考察
2.2.1 提取条件的考察
特殊医学用途配方食品基质复杂，含有麦芽糊精、蛋白质、脂肪及维生素等各类小分子成分，为防止蛋白水解为氨基酸，游离态氨基酸需要在沉淀蛋白前提下提取，本文基于氨基酸配方食品考察了三种前处理方式：3.5%磺基水杨酸（E1）、亚铁氰化钾-乙酸锌（E2）和80%乙腈（E3），三种提取液均具有沉淀蛋白作用。
图5柱状图比较发现，E1的提取效率明显高（其中L-Hyp、Glu、Asn、Cit、Orn均未检出）。E2和E3虽能较好地沉淀滤液，但是氨基酸含量出现不同程度的偏低现象，可能是二者在沉淀或者聚集过程中带走了部分氨基酸。进一步考察E1的回收率，发现其对22种氨基酸的回收率均满意。推测原因，E1一方面通过提高离子强度，使蛋白质的溶解度降低，从而沉淀蛋白；另一方面通过提高溶液酸度，使氨基酸的溶解度增加，从而能高效提取氨基酸。综上，本实验选择3.5%磺基水杨酸的提取方式。
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图 5 提取条件的考察注：E1、E2、E3柱状图代表3种提取条件的提取效率；E1曲线图代表3.5%磺基水杨酸的回收率。Figure 5. Examination of extraction conditions2.2.2 衍生条件的考察
衍生条件是否充分、副产物干扰等因素都会影响目标氨基酸的准确定量，因此，本文对衍生条件进行详细考察及优化。根据特殊医学用途配方食品中游离氨基酸的含量范围，本着衍生剂过量且不干扰定量的原则，研究选用100 µg/mL混合标准溶液考察衍生试剂的最佳用量，通过考察DNFB的不同用量（0.1%、0.5%、1%、2%）对氨基酸响应的差异来衡量衍生效果。结果（图6）表明，DNFB含量与衍生反应呈正相关。当DNFB含量为0.1%时，目标峰响应明显低，衍生不充分；当含量为0.5%时，仅6种（Ser、Gln、His、Orn、Lys、Lyr）氨基酸响应低；当含量增至1%时，各氨基酸响应不再增加；当含量增至2%时，衍生试剂的峰宽增大，反而干扰附近氨基酸的准确定量，检测成本也随之增加。综合考虑，选择1%含量的DNFB作为衍生试剂。
据相关文献报道[16-18]，衍生条件有30、60 min恒温，衍生时间较长。本文比较不同衍生时间（0、10、20、30 min），在60 ℃水浴振荡条件下的反应，记录氨基酸含量的变化发现，衍生时间为0 min时，无目标衍生产物，衍生10、20、30 min后，衍生产物的响应基本一致，随着时间的延长，响应无明显变化，说明60 ℃水浴振荡条件下衍生10 min即反应完全。
2.3 方法学评价
2.3.1 线性范围、检出限和定量限
将系列标准工作溶液（2、10、20、50、100 µg/mL）由低到高依次测定，以每种氨基酸峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，µg/mL）为横坐标绘制标准曲线。结果显示，22种氨基酸在2～100 µg/mL范围内，线性回归方程及相关系数如表1所示。采用部分水解配方作为空白基质加标的方法，以信噪比S/N=3得到检出限（LOD）为10 mg/100 g，以信噪比S/N=10得到定量限（LOQ）为25 mg/100 g。
表 1 22种氨基酸线性回归方程及相关系数Table 1. Linear regression equations and correlation coefficients of 22 amino acids化合物 线性回归方程 决定系数
（R2）Asp Y=1.708878e+003X−7.160395e+002 0.9984 Glu Y=1.565137e+003X+6.428316e+002 0.9997 L-Hyp Y=1.922419e+003X−1.649680e+002 0.9994 Asn Y=1.699338e+003X+2.475664e+002 0.9999 Ser Y=1.641198e+003X+1.222909e+002 0.9998 Gln Y=1.552204e+003X−8.413360e+002 0.9986 Gly Y=1.639792e+003X+1.033586e+002 0.9999 Cit Y=1.074429e+003X+3.671412e+002 0.9958 Arg Y=1.672074e+003X+1.735269e+002 0.9998 Thr Y=1.686861e+003X+4.566290e+002 0.9998 Ala+Pro Y=1.288069e+003X+3.513061e+002 0.9999 Val Y=1.689239e+003X+4.548071e+002 0.9999 Met Y=1.501528e+003X−6.406490e+002 0.9991 Cys Y=1.479431e+003X+1.628040e+002 0.9999 Ile Y=1.721529e+003X+7.216248e+002 0.9999 Leu Y=1.711149e+003X+6.272788e+002 0.9999 His Y=2.124532e+003X−1.404751e+002 0.9998 Phe Y=1.501713e+003X+3.245993e+002 0.9999 Orn Y=1.261322e+003X−7.980346e+002 0.9959 Lys Y=2.559017e+003X−2.071023e+003 0.9996 Lyr Y=1.130975e+003X−1.850230e+003 0.9995 2.4 回收率及精密度
实验采取某氨基酸配方特殊医学用途配方食品进行回收率试验，添加含量为50、250和500 mg/100 g三水平的标准溶液，每个水平平行测定6次，得到方法的回收率及精密度，结果见表2。结果显示，回收率在90.1%~109.1%之间，相对标准偏差为0.8%~6.9%。
表 2 22种游离氨基酸回收率与精密度结果（n=6）Table 2. Recovery and precision results of 22 free amino acids (n=6)化合物 添加量
（mg/100 g）平均回收率（%） 精密度（%） Asp 50 95.6 6.1 250 90.1 4.2 500 101.8 2.1 Glu 50 109.1 5.5 250 106.5 6.2 500 108.0 5.4 50 92.9 5.2 L-Hyp 250 99.4 2.9 500 103.2 3.2 Asn 50 105.9 1.8 250 107.4 4.0 500 101.1 4.3 Ser 50 99.5 5.8 250 105.4 5.0 500 105.1 4.1 Gln 50 107.7 3.9 250 98.5 6.1 500 109.1 5.1 Gly 50 99.2 6.6 250 104.5 4.2 500 96.8 0.8 Cit 50 99.5 6.9 250 102.8 5.9 500 106.9 3.8 Arg 50 100.3 6.5 250 101.9 4.3 500 108.3 1.9 Thr 50 97.1 2.7 250 98.3 5.6 500 109.1 2.1 Ala+Pro 50 101.1 1.6 250 98.9 5.6 500 107.1 5.0 Val 50 105.3 4.1 250 102.9 5.9 500 101.5 4.8 Met 50 100.5 4.1 250 98.0 5.1 500 103.8 2.3 Cys 50 99.1 2.0 250 94.4 5.5 500 98.5 4.2 Ile 50 101.8 3.5 250 97.8 6.2 500 103.6 5.2 Leu 50 99.1 2.1 250 109.1 4.6 500 105.3 2.2 His 50 97.5 2.2 250 91.9 5.9 500 107.2 3.8 Phe 50 105.2 3.2 250 93.1 6.0 500 104.4 4.4 Orn 50 107.2 2.9 250 98.5 6.8 500 99.0 4.9 Lys 50 99.4 4.4 250 91.1 4.5 500 99.5 3.2 Lyr 50 90.9 5.4 250 90.7 4.3 500 98.8 4.9 2.5 实际样品的测定
运用本方法对市售部分水解配方（F1）、深度水解配方（F2）、氨基酸配方（F3）和氨基酸代谢障碍配方（F4）特殊医学用途配方食品中22种游离氨基酸进行测定，结果显示四种配方均未检出可能非法添加的L-羟脯氨酸；部分水解配方未检出其他21种游离氨基酸；深度水解配方未检出Gln、Cit和Orn；氨基酸配方未检出Glu、Asn、Cit和Orn；氨基酸代谢障碍配方未检出Glu、Asn、Cit、Phe和Orn，其他检出成分含量见表3。结果表明，部分水解配方不含游离氨基酸，深度水解配方、氨基酸配方和氨基酸代谢障碍配方中含有大量游离氨基酸，氨基酸配方和氨基酸代谢障碍配方中检出的氨基酸种类与配料表相符。
表 3 特殊医学用途配方食品中22 FAAs含量Table 3. Content of 22 FAAs in special medical formula foods化合物 F1（g/100 g） F2（g/100 g） F3（g/100 g） F4（g/100 g） Asp ND 0.158 1.302 1.196 Glu ND 0.826 ND ND L-Hyp ND ND ND ND Asn ND 0.910 ND ND Ser ND 0.502 0.791 0.621 Gln ND ND 1.150 1.215 Gly ND 0.102 0.453 0.226 Cit ND ND ND ND Arg ND 0.645 0.667 0.402 Thr ND 0.527 0.828 0.495 Ala+Pro ND 0.332 1.221 0.699 Val ND 0.767 1.273 0.527 Met ND 0.412 0.291 0.143 Cys ND 0.516 0.812 0.411 Ile ND 0.680 0.889 0.546 Leu ND 0.856 1.025 0.662 His ND 0.294 0.459 0.221 Phe ND 0.680 0.671 ND Orn ND ND ND ND Lys ND 1.149 0.882 0.592 Lyr ND 0.151 0.528 0.331 注：ND表示未检出。 3. 结论
本文建立了特殊医学用途配方食品中22种游离氨基酸的检测方法，方法详细考察了提取、衍生及色谱条件，发展了分离DNP肽的绿色色谱条件，缩短了衍生时间、提高了检测效率。22种氨基酸在2~100 µg/mL范围内线性关系良好（R2>0.99），检出限为10 mg/100 g，定量限为25 mg/100 g，加标回收率为90.1%~109.1%，相对标准偏差为0.8%~6.9%。方法针对特殊医学配方食品基质，采用磺基水杨酸沉淀蛋白、去除干扰杂质；选用超高液相色谱法提高检测效率、降低成本；首次使用乙腈水-甲酸铵流动相条件分离DNP肽，完成了22种氨基酸的准确定量，并且对可能添加的类氨基酸成分-牛磺酸实现了有效分离。本方法为特殊医学用途配方食品中氨基酸检测标准的建立提供了技术支持，为医用食品行业的健康发展提供技术保障。
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图 2 T3柱分离22种氨基酸的色谱图
注：1-Asp；2-Glu；3-L-Hpy；4-Asn-；5-Ser；6-Gln；7-Gly；8-Cit；9-Arg；10-Thr；11-Ala；12-Pro；13-Val；14-Met；15-Cys；16-Ile；17-Leu；18-His；19-Phe；20-Orn；21-Lys；22-Lyr；0-Tau（类氨基酸，非本文目标物）；R-试剂峰；a：标准溶液；b：样品；c：加标样品。
Figure 2. Chromatograms of 22 amino acids separated by T3 column
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图 3 有机相比例对22种DNP肽分离度的影响
注：11-Ala；12-Pro；13-Val；14-Met；15-Cys；16-Ile；17-Leu；18-His；19-Phe；20-Orn；21-Lys；22-Lyr；0-Tau；R：试剂峰。
Figure 3. Effect of organic phase ratio on the separation degree of 22 amino acid derivatives
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图 5 提取条件的考察
注：E1、E2、E3柱状图代表3种提取条件的提取效率；E1曲线图代表3.5%磺基水杨酸的回收率。
Figure 5. Examination of extraction conditions
表 1 22种氨基酸线性回归方程及相关系数
Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 22 amino acids
化合物 线性回归方程 决定系数
（R2）Asp Y=1.708878e+003X−7.160395e+002 0.9984 Glu Y=1.565137e+003X+6.428316e+002 0.9997 L-Hyp Y=1.922419e+003X−1.649680e+002 0.9994 Asn Y=1.699338e+003X+2.475664e+002 0.9999 Ser Y=1.641198e+003X+1.222909e+002 0.9998 Gln Y=1.552204e+003X−8.413360e+002 0.9986 Gly Y=1.639792e+003X+1.033586e+002 0.9999 Cit Y=1.074429e+003X+3.671412e+002 0.9958 Arg Y=1.672074e+003X+1.735269e+002 0.9998 Thr Y=1.686861e+003X+4.566290e+002 0.9998 Ala+Pro Y=1.288069e+003X+3.513061e+002 0.9999 Val Y=1.689239e+003X+4.548071e+002 0.9999 Met Y=1.501528e+003X−6.406490e+002 0.9991 Cys Y=1.479431e+003X+1.628040e+002 0.9999 Ile Y=1.721529e+003X+7.216248e+002 0.9999 Leu Y=1.711149e+003X+6.272788e+002 0.9999 His Y=2.124532e+003X−1.404751e+002 0.9998 Phe Y=1.501713e+003X+3.245993e+002 0.9999 Orn Y=1.261322e+003X−7.980346e+002 0.9959 Lys Y=2.559017e+003X−2.071023e+003 0.9996 Lyr Y=1.130975e+003X−1.850230e+003 0.9995 
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表 2 22种游离氨基酸回收率与精密度结果（n=6）
Table 2 Recovery and precision results of 22 free amino acids (n=6)
化合物 添加量
（mg/100 g）平均回收率（%） 精密度（%） Asp 50 95.6 6.1 250 90.1 4.2 500 101.8 2.1 Glu 50 109.1 5.5 250 106.5 6.2 500 108.0 5.4 50 92.9 5.2 L-Hyp 250 99.4 2.9 500 103.2 3.2 Asn 50 105.9 1.8 250 107.4 4.0 500 101.1 4.3 Ser 50 99.5 5.8 250 105.4 5.0 500 105.1 4.1 Gln 50 107.7 3.9 250 98.5 6.1 500 109.1 5.1 Gly 50 99.2 6.6 250 104.5 4.2 500 96.8 0.8 Cit 50 99.5 6.9 250 102.8 5.9 500 106.9 3.8 Arg 50 100.3 6.5 250 101.9 4.3 500 108.3 1.9 Thr 50 97.1 2.7 250 98.3 5.6 500 109.1 2.1 Ala+Pro 50 101.1 1.6 250 98.9 5.6 500 107.1 5.0 Val 50 105.3 4.1 250 102.9 5.9 500 101.5 4.8 Met 50 100.5 4.1 250 98.0 5.1 500 103.8 2.3 Cys 50 99.1 2.0 250 94.4 5.5 500 98.5 4.2 Ile 50 101.8 3.5 250 97.8 6.2 500 103.6 5.2 Leu 50 99.1 2.1 250 109.1 4.6 500 105.3 2.2 His 50 97.5 2.2 250 91.9 5.9 500 107.2 3.8 Phe 50 105.2 3.2 250 93.1 6.0 500 104.4 4.4 Orn 50 107.2 2.9 250 98.5 6.8 500 99.0 4.9 Lys 50 99.4 4.4 250 91.1 4.5 500 99.5 3.2 Lyr 50 90.9 5.4 250 90.7 4.3 500 98.8 4.9
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表 3 特殊医学用途配方食品中22 FAAs含量
Table 3 Content of 22 FAAs in special medical formula foods
化合物 F1（g/100 g） F2（g/100 g） F3（g/100 g） F4（g/100 g） Asp ND 0.158 1.302 1.196 Glu ND 0.826 ND ND L-Hyp ND ND ND ND Asn ND 0.910 ND ND Ser ND 0.502 0.791 0.621 Gln ND ND 1.150 1.215 Gly ND 0.102 0.453 0.226 Cit ND ND ND ND Arg ND 0.645 0.667 0.402 Thr ND 0.527 0.828 0.495 Ala+Pro ND 0.332 1.221 0.699 Val ND 0.767 1.273 0.527 Met ND 0.412 0.291 0.143 Cys ND 0.516 0.812 0.411 Ile ND 0.680 0.889 0.546 Leu ND 0.856 1.025 0.662 His ND 0.294 0.459 0.221 Phe ND 0.680 0.671 ND Orn ND ND ND ND Lys ND 1.149 0.882 0.592 Lyr ND 0.151 0.528 0.331 注：ND表示未检出。
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