骨胶原蛋白肽纳滤脱盐工艺优化及其对产品整体感官品质的提升作用

李瑞林; 郭玉杰; 刘济千; 张春晖; 高宏伟

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022070068

骨胶原蛋白肽纳滤脱盐工艺优化及其对产品整体感官品质的提升作用

李瑞林^{1, 2,},
郭玉杰^2, ,,
刘济千²,
张春晖^2, ,,
高宏伟³

1.
宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏银川 750021
2.
中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193
3.
新疆泰昆集团有限责任公司，新疆昌吉 831100

基金项目: 中国博士后科学基金项目（2021M693902）；十四五国家重点研发计划（2021YFD2100804）；国家农业科技创新工程项目（CAAS-ASTIP-2022-IFST）。

详细信息

作者简介:
李瑞林（1998−），男，硕士研究生，研究方向：畜产品加工，E-mail：lrl225@outlook.com

通讯作者:
郭玉杰（1989−）（ORCID：0000−0001−7725−6969），男，博士，助理研究员，研究方向：畜产品加工利用，E-mail：guoyujie@caas.cn

张春晖（1971−）（ORCID：0000−0002−1411−4047），男，博士，研究员，研究方向：肉品科学，E-mail：dr_zch@163.com

中图分类号: ;TS251.94
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出版历程
- 收稿日期: 2022-07-07
- 网络出版日期: 2023-03-20
- 刊出日期: 2023-05-14

Optimization of Nanofiltration Desalination Process of Bone Collagen Peptide and Its Effect on Improving the Overall Sensory Quality of Products

1.
School of Food & Wine, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
2.
Institute of Agricultural Products Processing, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Comprehensive Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Ministry of Agriculture and Villages, Beijing 100193, China
3.
Xinjiang Tycoon Group Co., Ltd., Changji 831100, China

摘要

摘要: 为了降低骨胶原蛋白肽灰分含量，并提升骨胶原蛋白肽产品的品质。本文采用纳滤脱盐的方法对灰分进行脱除，通过设计响应面试验对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐工艺参数进行优化，并分析纳滤膜处理后样品的理化指标、氨基酸含量、分子量分布、各元素的含量及感官评分的变化。结果表明，骨胶原蛋白肽最优脱盐工艺条件为样品浓度5%，循环次数7次，压力0.5 MPa，此时脱盐率为65.89%±1.25%；纳滤膜处理后样品品质明显提升，但氨基酸含量变化不大；通过分子量分布的测定，发现纳滤脱盐对分子量分布变化影响较小，样品分子量小于3000 Da的组分占比97%，符合食品安全国家标准GB 31645-2018骨胶原蛋白肽的规定；利用ICP-MS对脱盐前后的各元素含量变化进行分析，发现样品中各元素含量均有不同程度的减少，Na、K、P、Mg、Ca等元素含量显著减少（P<0.05）；通过感官评价发现经纳滤脱盐的样品颜色变化不大，清澈度提升，咸味明显减弱，整体可接受度提升。本研究将为生产高品质骨胶原蛋白肽产品提供技术支撑。
- 骨胶原蛋白肽 /
- 纳滤 /
- 脱盐 /
- 蛋白得率 /
- 灰分含量 /
- 感官品质
Abstract: To reduce the ash content of bone collagen peptide and improve the quality of bone collagen peptide products. In this paper, the method of nanofiltration desalination was used to remove ash. The process parameters for nanofiltration desalination of bone collagen peptides were optimized through design response tests. The changes in physical and chemical indicators, amino acid content, molecular weight distribution, content of various elements, and sensory scores of samples treated with nanofiltration membranes were analyzed. Results showed that, the optimal desalination process conditions were sample concentration of 5%, cycle times of 7 times and pressure of 0.5 MPa. Under this condition, the desalination rate was 65.89%±1.25%. After nanofiltration membrane treatment, the quality of the sample was significantly improved, but the amino acid content did not change much. Through the measurement of molecular weight distribution, it was found that nanofiltration desalination had little impact on the change of molecular weight distribution, the components with molecular weight less than 3000 Da accounted for 97%, which was in line with the provisions of the national food safety standard GB 31645-2018 bone collagen peptides. ICP-MS was used to analyze the changes in the content of various elements before and after desalination, and it was found that the content of various elements in the sample decreased to varying degrees, the content of Na, K, P, Mg, Ca decreased significantly (P<0.05). Through sensory evaluation, it was found that the color of the samples did not change while the clarity increased, the saltiness decreased significantly, the overall acceptability increased. This study would provide technical support for the production of high-quality bone collagen peptide products.
- bone collagen peptide /
- nanofiltration /
- desalting /
- protein yield /
- ash content /
- sensory quality

HTML全文

我国是肉类生产和消费的大国，2021年肉类产量达8887万吨。畜禽骨作为肉品加工产业的重要副产物，年产量约有1700万吨，居世界首位^[1]。畜禽骨中含有骨胶原蛋白、骨多糖和骨矿物质等多种营养物质，开发利用潜力巨大。如何对畜禽骨资源进行高值化加工，对于提高其附加值具有重要的意义。近年来，随着功能性骨源食品产业兴起，以畜禽骨为原料开发具有特定生物活性的功能性产品受到科研和产业界的广泛关注。骨胶原蛋白肽凭借其良好的生物相容性、可生物可利用性和功能活性，广泛应用于普通食品、保健食品和特殊医学食品等领域^[2-3]。陈永凯等^[4]以牦牛骨为原料制备的牦牛骨胶原蛋白肽GK-22具有促成骨细胞增殖活性。魏洁琼等^[5]利用酶法制备牛骨胶原蛋白肽，并对其抗氧化活性进行研究，结果表明抗氧化性与质量浓度呈计量-效应关系。目前对于畜禽骨蛋白肽的研究集中在优化酶解工艺，在畜禽骨的酶解过程中会因调节酸碱度而引入大量盐分，且畜禽骨本身富含矿物元素，使骨胶原蛋白肽产品中盐含量较高，影响骨胶原蛋白肽的营养品质以及口感。因此，在骨胶原蛋白肽工业化加工过程中有必要对其进行脱盐处理，但目前尚未见相关研究报道。

目前常见的脱盐方法包括电渗析法、离子交换法、膜过滤法等^[6]。膜过滤技术可以将物料高效、精确地分离，被广泛的应用于工业生产当中^[7-8]。膜过滤分离技术根据推动力的不同分为两类，一类以电力为推动力，另一类以压力为推动力。以压力为推动力的膜分离过程分为：微滤、超滤、纳滤和反渗透^[9]。纳滤膜具有低压力，对盐具有高度选择性等特点，可以将低分子量的可溶性有机物进行截留^[8,10]，在食品工业中具有重要作用。鉏晓艳等^[11]用纳滤膜对酶解后草鱼鱼鳞蛋白肽进行分段，脱除其中的苦味肽。李福后等^[12]利用纳滤对南极磷虾蛋白肽进行脱盐，结果显示通过纳滤膜过滤可以很好的去除南极磷虾蛋白肽中的灰分，脱盐率达到86.35%±2.11%。

本研究以工业化制备的骨胶原蛋白肽为原料，采用纳滤方法进行脱盐研究，通过单因素实验、响应面试验设计优化脱盐工艺条件，获得骨胶原蛋白肽最佳脱盐工艺；分析纳滤脱盐前后理化指标、氨基酸组成、分子量分布、元素含量变化，探究纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽产品品质的影响；对纳滤处理前后样品进行感官评价，研究产品感官品质的变化，以期为骨胶原蛋白肽为原料的高附加值的产品研发提供参考。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

骨胶原蛋白肽　由新疆泰昆集团有限责任公司提供；BCA试剂盒　北京索莱宝科技有限公司；AccQ·Tag 氨基酸试剂包　美国Waters公司。

CEM-MARS 密闭微波消解仪　济南捷岛分析仪器有限公司；7700X 电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）　安捷伦公司；HPLC1260-Ⅱ高效液相色谱仪　美国 Agilent 公司；Lindberg/blue 马弗炉　Thermo Fisher；有机膜分离设备　山东博纳生物科技基团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 纳滤脱盐

参考Roman等^[13]的方法，略有修改。以水-热提取的骨胶原蛋白肽为原料，抽滤去除溶液中的不溶性杂质，收集滤液进行试验。用去离子水对膜分离设备进行冲洗，冲洗完毕后打开放料阀排出冲洗液。加入经抽滤得到的料液1 L，使其在系统内循环3 min，调节压力到试验压力，收集滤出液，当滤出液体积达到500 mL，向料液桶中加入等体积去离子水使总体积恢复至1 L，根据实验要求重复这一步骤，试验结束后收集浓缩液，喷雾干燥得到脱盐肽粉。

1.2.2 单因素实验

以灰分含量（%）和蛋白得率（%）为考察指标，参考预实验结果，分别考察样品浓度（3%、4%、5%、6%、7%）、循环次数（4、5、6、7、8次）、压力（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 MPa）对各指标的影响。

考察单一因素影响时，其他因素的固定水平为：样品浓度5%，循环次数5次，压力0.4 MPa。

1.2.3 响应面试验设计

根据单因素实验的结果，用Box-Behnken Design中心组合设计原理，以样品浓度、循环次数、纳滤压力为考察因素，利用熵权法对灰分含量、蛋白得率进行客观赋值，以综合评分为响应值，建立模型，筛选出最佳脱盐条件。利用软件Design-Expert 12进行响应面试验设计，因素水平如表1所示。

表 1 响应面试验因素水平表

Table 1. Response surface experiment factors and levels

水平	A	B	C
水平	样品浓度（%）	循环次数（次）	纳滤压力（MPa）
−1	4	6	0.4
0	5	7	0.5
1	6	8	0.6

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1.2.4 蛋白得率测定

利用BCA试剂盒对蛋白含量进行测定，蛋白得率按式（1）进行计算：

蛋 白 得 率

$\mathrm{蛋}\mathrm{白}\mathrm{得}\mathrm{率}\left(\text{%}\right)=\frac{{\mathrm{P}}_{1}\times{\mathrm{m}}_{1}}{{\mathrm{P}}_{0}\times{\mathrm{m}}_{0}}$

(1)

式中，P₁为脱盐后测得的样品蛋白含量，%；m₁为喷雾干燥所得样品质量，g；P₀为脱盐前样品的蛋白含量，%；m₀为处理前样品质量，g；

1.2.5 灰分测定

按照GB 5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》^[14]中的测定方法测定灰分含量。

1.2.6 氨基酸组成测定

精确称量100 mg骨胶原蛋白肽样品，溶于10 mL的6 mol/L HCl中，氮吹3 min使氮气完全充入水解管中，将水解管密封后放入110 ℃烘箱水解24 h。用定性滤纸进行过滤，滤液用4 mol/L KOH调pH至6.0，然后用去离子水定容至50 mL，取1 mL用0.45 μm滤膜过滤，用高效液相色谱进行氨基酸组成分析。

1.2.7 分子量分布测定

参照叶孟亮^[15]使用的高效液相色谱法测定骨胶原蛋白肽分子量分布。采用安捷伦HPLC1260-Ⅱ系统（Agilent Technologies Inc., California, USA）测定骨胶原蛋白肽分子量分布。TSK gel G4 SWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm）；柱温40 ℃；流动相:乙腈溶液:超纯水:三氟乙酸=450:550:1；等梯度洗脱；流速：0.5 mL/min；进样体积：10 μL，在波长为214 nm处测定响应值。以甘氨酰肌氨酸（146.15 Da）、Gly-Gly-Tyr-Arg（451 Da）、杆菌肽（1421 Da）、抑肽酶（6495 Da）、细胞色素C（12384 Da）为标准品，分子量校准曲线（y=−0.1622x+6.1169，R²=0.989）。

1.2.8 电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）

参照Mi等^[16]的方法并稍作改进，称取0.25 g左右样品于消解罐中，加入6 mL硝酸预消解1 h加入2 mL双氧水，上机进行微波消解，微波消解后定容到100 mL左右，上机检测。自动进样器参数：样品快速提升：2 mL/min（速度0.5 r/s） 40 s；分析前稳定：速度0.4 r/s 30 s；多元素同时分析：速度0.1 r/s。定量分析模式：He气模式，单位质量数采集点数为3，数据采集重复次数为3次，积分时间As为1 s，Se、Cd为2 s，Pb为3 s，其它元素为0.3 s。质谱仪的具体工作参数：射频功率为1600 W，载气流速为1.0 L/min，蠕动泵流速为0.1 r/s，雾化室温度为2 ℃，氧化物指标为0.45%，双电荷指标为1.01%。

1.2.9 感官评定

取2 g试样置于洁净的烧杯中，用200 mL温开水配制成1%的溶液，在自然光下观察色泽，有无沉淀，品其滋味。参照胶原蛋白肽国标^[17]中对骨胶原蛋白肽产品的感官要求，设计感官评价表（表2）对纳滤脱盐前后骨胶原蛋白肽样品的感官品质进行评分。

表 2 感官评价标准表

Table 2. Sensory evaluation standard table

感官特性	特征描述	评分	权重（%）
色泽	黄色	0~5	10
	淡黄色	6~8
	无色或微黄色	9~10
清澈度	溶液浑浊	0~5	20
清澈度	溶液清澈	6~10	20
气味	有异味	0~5	20
气味	无异味	6~10	20
滋味	咸味重	0~5	20
	咸味中等	6~8
	无咸味	9~10
整体可接受度	不可接受	0~5	30
整体可接受度	可接受	6~10	30

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1.3 数据处理

所有数据均为3次重复试验平均值±标准差。响应面优化分析及方差分析利用Design Expert 12软件。图片由OriginPro 2021软件绘制。采用熵权法^[18]对指标进行客观赋值，以蛋白得率以及灰分含量的综合评分为评价指标进行响应面数据分析。首先对数据进行标准化处理，方法采用极差法，两个影响指标中蛋白得率为正向指标，利用式（2）进行计算，灰分含量为负向指标，利用式（3）进行计算，根据式（4）计算得到标准化数据Y_ij，再根据式（5）进行计算得到信息熵E_j，根据式（6）计算得到各指标的权重系数W_j。本次研究中m=17，n=2，即有17种处理，和2个评价指标。

${\mathrm{R}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}\mathrm{^*}=\frac{{\mathrm{R}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}-{\mathrm{R}}_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}{{\mathrm{R}}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-{\mathrm{R}}_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}$

(2)

${\mathrm{R}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}\mathrm{^*}=\frac{{\mathrm{R}}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-{\mathrm{R}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}}{{\mathrm{R}}_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-{\mathrm{R}}_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}$

(3)

${\mathrm{Y}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}=\frac{{\mathrm{R}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}\mathrm{^*}}{{\displaystyle\sum }_{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{m}}{\mathrm{R}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}\mathrm{^*}}$

(4)

${\mathrm{E}}_{\mathrm{j}}=-\frac{1}{\mathrm{ln}\mathrm{m}}{\sum }_{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{m}}{\mathrm{Y}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}\mathrm{ln}{\mathrm{Y}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}$

(5)

${\mathrm{W}}_{\mathrm{j}}=\frac{1-{\mathrm{E}}_{\mathrm{j}}}{{\displaystyle\sum }_{\mathrm{j}=1}^{\mathrm{n}}(1-{\mathrm{e}}_{\mathrm{j}})}$

(6)

式中R_ij^*为标准值；R_ij为第i个处理，第j个指标的值；R_min为第j个指标的最小值；R_max为最大值；E_j为第j个指标的信息熵；W_j为第j个指标的权重系数，表示各指标所占的权重。

2. 结果与分析

2.1 骨胶原蛋白肽纳滤脱盐单因素实验

2.1.1 样品浓度对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐效果的影响

不同浓度的骨胶原蛋白肽溶液经膜分离脱盐处理后对灰分含量和蛋白得率的影响如图1所示，随着样品浓度的增加，样品中灰分含量呈先下降后升高的趋势；当样品浓度为5%时，灰分含量最低2.71%±0.03%，明显低于其他实验组；之后随着样品浓度的上升，灰分含量也随之上升。产生该现象的原因可能是当样品浓度较低时，溶质与纳滤膜之间的作用力较小，导致脱盐效果不理想，而当样品浓度较高时，随着被截留的溶质浓度的不断增加，而导致膜的透过通量下降，影响了脱盐的效果^[19]。样品蛋白得率呈现出先下降后升高的趋势，但各实验组的蛋白得率都比较高，可以达到良好的回收率，因此选择样品浓度5%进行后续试验。

图 1 不同浓度骨胶原蛋白肽溶液对灰分含量和蛋白得率的影响

Figure 1. Effects of different concentrations of collagen peptide solution on ash content and protein yield

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2.1.2 循环次数对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐效果的影响

循环次数对脱盐效果的影响如图2所示，随着循环次数的增加，样品中灰分含量逐渐降低，而后趋于稳定；蛋白得率随着循环次数的增加呈先上升后下降的趋势，在循环次数为7次时，蛋白得率最高94.17%±1.21%，而后降低，产生该现象可能的原因是，在浓缩的过程中产生了浓差极化现象，导致蛋白的损失^[20]。因此选择循环次数7次进行后续试验。

图 2 不同循环次数对骨胶原蛋白肽灰分含量和蛋白得率的影响

Figure 2. Effects of different cycles times on ash content and protein yield of collagen peptide

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2.1.3 压力对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐效果的影响

压力对脱盐效果的影响如图3所示，随着压力的增加，样品灰分含量逐渐下降而后趋于稳定。可能的原因是随着压力的升高，膜的水通量提高^[21]，而使脱盐效果有一定的提高；同时由于外加压力增加，膜结构不断被压实，使膜自身的阻力变大，使得对盐离子的截留率有所提高；而随着压力的继续升高，膜结构不再发生变化，截留率增加变缓并趋于稳定^[22]；样品蛋白得率趋势呈先增加后减小的趋势，蛋白得率在0.5 MPa时达到最高，为94.39%±1.09%。因此，选择压力0.5 MPa进行后续试验。

图 3 不同压力对骨胶原蛋白肽灰分含量和蛋白得率的影响

Figure 3. Effect of different nanofiltration pressure on ash content and protein yield of collagen peptide

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2.2 骨胶原蛋白肽纳滤脱盐响应面试验

2.2.1 响应面试验设计结果

根据单因素实验的结果，设计三因素三水平响应面试验，响应面设计方案及响应值结果如表3所示。得到的二次方程模型为：Y=62.01+0.0181A+0.9017B+0.1959C+0.4770AB+0.1656AC+0.9191BC−1.06A²−2.75B²−1.29C²。根据回归线方程绘制出各因素与响应值间的3D空间曲线图（图4）。曲面越复杂和陡峭，各因素对响应值的影响就越显著，如图4所示，AB、BC交互作用对骨胶原蛋白肽脱盐综合评分的影响均显著。

表 3 响应面试验结果

Table 3. Results of response surface experiment

实验号	A	B	C	蛋白得率（%）	灰分含量（%）	综合评分
1	6	8	0.5	89.13	2.83	57.86
2	5	7	0.5	95.37	2.65	61.77
3	5	8	0.4	87.17	2.66	56.54
4	5	7	0.5	96.71	2.68	62.63
5	6	7	0.4	90.51	2.65	58.67
6	5	7	0.5	96.15	2.7	62.28
7	4	8	0.5	86.58	2.63	56.16
8	5	7	0.5	95.54	2.68	61.89
9	4	6	0.5	91.74	2.81	59.51
10	5	6	0.4	91.87	2.79	59.59
11	5	6	0.6	88.65	2.85	57.56
12	6	7	0.6	92.55	2.67	59.98
13	4	7	0.6	93.13	2.59	60.32
14	4	7	0.4	92.14	2.55	59.67
15	6	6	0.5	91.32	2.97	59.30
16	5	8	0.6	89.71	2.73	58.19
17	5	7	0.5	94.91	2.66	61.48

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根据表4可知该模型P<0.01，说明所建骨胶原蛋白肽脱盐的回归方程模型极为显著，失拟度P=0.11051>0.05不显著，说明模型具有合理性。说明该模型可以很好地预测试验结果。由表4中A、B、C的F值大小可以推断出各因素对骨胶原蛋白肽样品品质的影响顺序为B>C>A，即循环次数>压力>样品浓度。其中循环次数对样品品质影响极显著（P<0.01），压力的影响显著（P<0.05）。循环次数及压力的二次项对样品品质的影响极显著（P<0.01），样品浓度的二次项对样品品质的影响显著（P<0.05）。得到的最优脱盐工艺条件组合为样品浓度4.97%，循环次数6.84次，压力0.5016 MPa，其预测蛋白得率为96.15%，灰分含量为2.68%，综合得分为62.086。由于试验条件的限制，最终选取样品浓度为5%，循环次数7次，压力0.5 MPa作为试验条件，经验证试验后测得样品蛋白得率为96.03%，灰分含量为2.61%，综合得分为62.17，与预测值相近，表明模型拟合度较高，研究所确定的工艺可行度高。

表 4 响应面回归模型方差分析

Table 4. Response surface regression model ANOVA

来源	平方和SS	自由度df	均方MS	F值	P值	显著性
模型	58.68648	9	6.520721	14.1691	0.001037	显著
A	0.002617	1	0.002617	0.005686	0.942002
B	6.504943	1	6.504943	14.13481	0.007078	**
C	0.307025	1	0.307025	0.667145	0.440956	*
AB	0.91029	1	0.91029	1.978001	0.202409	*
AC	0.10964	1	0.10964	0.23824	0.640397
BC	3.378664	1	3.378664	7.341616	0.030219	*
A²	4.701829	1	4.701829	10.21676	0.015142	*
B²	31.7807	1	31.7807	69.05738	7.14E-05	**
C²	7.051764	1	7.051764	15.32302	0.00579	**
残差	3.22145	7	0.460207
失拟度	2.401913	3	0.800638	3.907753	0.11051	不显著
纯误差	0.819538	4	0.204884
总和	61.90794	16
注：表示P<0.05；*表示P<0.01。

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图 4 各因素交互作用对骨胶原蛋白肽脱盐综合评分的影响

Figure 4. Effects of interaction of various factors on the comprehensive score of bone collagen peptide desalination

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2.3 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽理化特性的影响

对脱盐前后样品理化特性进行分析，经纳滤脱盐后样品蛋白含量提高，由86.17%±1.20%提高至93.03%±1.52%，灰分含量由7.68%±0.43%下降至2.62%±0.51%，脱盐率可达到65.89%±1.25%，脱盐效果较好。综上所述，纳滤脱盐处理对样品品质的提升具有重要的意义。

为了探究纳滤脱盐处理对骨胶原蛋白肽的氨基酸含量的影响，利用高效液相色谱对纳滤脱盐前后样品的氨基酸含量进行了测定，测定结果如图5所示。骨胶原蛋白肽样品中含有除色氨酸（Trp）以外的17种氨基酸，且在骨胶原蛋白肽样品中甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）等含量较高，其中甘氨酸含量最高为21.33 mg/g，与刘同方等^[23]的研究结果一致。在纳滤脱盐前后，样品氨基酸含量差距不大，说明纳滤膜过滤不会对样品的氨基酸含量产生影响，罗蓓蓓^[24]利用纳滤膜浓缩虾青素，结果表明纳滤膜浓缩可以更好地保留其活性成分，由此推测纳滤膜过滤处理过程条件较温和，并不会对蛋白性质产生影响。

图 5 脱盐前后骨胶原蛋白肽理化指标

Figure 5. Comparison of physicochemical parameters of bone collagen peptide before and after desalination

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2.4 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽分子量分布的影响

本研究通过高效液相色谱法对脱盐前后骨胶原蛋白肽的分子量分布进行分析，脱盐后的骨胶原蛋白肽分子量分布与脱盐前差异不大。说明纳滤膜过滤不会影响骨胶原蛋白肽的分子量分布，表明纳滤膜过滤脱盐可能是通过物理截留的方法将样品中灰分脱除，并不会影响样品品质。食品安全国家标准^[17]要求胶原蛋白肽产品分子量分布小于10000 Da的组分占比应≥90%，由图6可知骨胶原蛋白肽的分子量主要集中在3 kDa以下，占总量的96.8%，符合国标对胶原蛋白肽分子量分布的要求。骨胶原蛋白肽产品分子量的大小与其利用效率以及生物活性都有着密切的联系，余小月等^[25]文章中提到，相对分子质量小于1 kDa的胶原蛋白无需分解就可被人体直接吸收，且平均相对分子质等量1和3 kDa的吸收速率远大于20 kDa的胶原蛋白；贾伟^[26]发现骨胶原蛋白肽可以通过上调成骨细胞中碱性磷酸酶表达水平来促进成骨细胞增殖分化，且1 kDa以下的肽效果更好；蔡路昀等^[27]利用酶解、超滤将草鱼鱼皮进行肽进行酶解分段，结果表明小于3 kDa的组分具有最强的抗氧化性。本研究中经纳滤脱盐后得到的骨胶原蛋白肽产品分子量小于3 kDa的组分占97%，小于1 kDa的组分占61.9%。根据相关文献可知，小分子量的胶原蛋白肽可能具有更强的生物活性，对于本研究中胶原蛋白肽的生物活性还需进一步研究。

图 6 脱盐前后骨胶原蛋白肽分子量分布

Figure 6. Molecular weight distribution of bone collagen peptide before and after desalination

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2.5 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽元素含量的影响

通过ICP-MS对脱盐前后样品的元素含量进行分析，得到的结果如表5所示。共检测了24种元素，检出元素22种，包括常量元素5种：钠（Na）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg），以及其他微量元素，其中汞（Hg）、铬（Cd）两种元素未检出；纳滤脱盐后各元素含量都有所下降，其中Na、P、K、Mg、Ca三种元素含量显著减少（P<0.05）。产生该现象的原因可能是Na、P、K等元素以离子形式存在于骨胶原蛋白肽溶液中更容易脱除。Zhang等^[28]在骨胶原蛋白肽溶液中加入CaCl₂，在60 ℃下反应，得到骨胶原蛋白肽钙螯合物，由于牛骨中含有大量的无机钙，在骨胶原蛋白肽生产的过程中，部分钙离子可能以螯合的形式与骨胶原蛋白肽结合，通过纳滤膜过滤的方式更难将其去除。

表 5 脱盐前后骨胶原蛋白肽元素含量（mg/kg）

Table 5. Element composition of bone collagen peptide powder before and after desalination (mg/kg)

元素种类	脱盐前	脱盐后	元素种类	脱盐前	脱盐后
B	6.60±0.20^a	1.76±0.64^b	Cu	0.28±0.28^a	0.12±0.01^a
Na	12171.28±191.47^a	4557.44±3.36^b	Zn	1.93±0.01^a	1.11±0.10^a
Mg	714.32±10.81^a	340.65±0.40^b	As	0.17±0.02^a	0.02±0.00^a
Al	8.95±0.73^a	4.65±0.39^b	Se	0.24±0.24^a	0.02±0.01^a
K	3561.36±98.42^a	489.75±7.10^b	Sr	44.22±0.03^a	4.72±0.19^b
Ca	2609.93±24.09^a	1770.14±12.40^b	Mo	0.35±0.06^a	0.17±0.01^a
P	3513.60±77.69^a	1211.12±17.12^b	Cd	ND	ND
Cr	0.08±0.01^a	0.07±0.01^a	Sn	2.97±0.09^a	2.80±0.01^a
Mn	7.23±0.05^a	5.72±0.01^b	Ba	2.33±0.01^a	0.41±0.01^b
Fe	21.34±0.07^a	21.21±0.07^a	Hg	ND	ND
Co	0.21±0.01^a	0.09±0.01^a	Pb	0.15±0.01^a	0.08±0.03^a
注：ND表示未检出；不同的小写字母表示有显著性差异（P<0.05）。

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2.6 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽感官品质的影响

从色泽、清澈度、气味、口感和整体可接受度对纳滤脱盐前后骨胶原蛋白肽溶液感官品质进行评价，结果如图7所示。纳滤脱盐对样品的色泽和气味影响不大，处理前后骨胶原蛋白肽溶液颜色都呈淡黄色，气味无明显变化；纳滤脱盐后样品清澈度明显改善，未经脱盐处理前的样品溶液略浑浊且有少量沉淀，经脱盐处理后样品溶液清澈透明无沉淀；未经处理的样品有轻微咸味，整体口感柔和无异味。经脱盐处理后样品咸味完全消失，整体口感无明显改变；经脱盐处理后，受试者整体可接受度显著提高。感官评价的结果说明纳滤脱盐对样品感官品质有明显提高。

图 7 脱盐前后骨胶原蛋白肽感官评价结果

Figure 7. Sensory evaluation results of bone collagen peptide before and after desalination

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3. 结论

本实验通过单因素实验和响应面试验，确定了最佳纳滤脱盐工艺条件为：样品浓度5%，循环次数7次，压力0.5 MPa，经验证试验后测得样品蛋白得率为96.03%，灰分含量为2.61%，综合得分为62.17，模型拟合度较高，具有实际应用价值。通过对纳滤脱盐处理前后的样品理化指标、氨基酸组成、分子量分布、元素含量和感官属性进行分析，可知经纳滤脱盐处理后的样品品质明显提升，蛋白含量升高，灰分含量降低，且各项指标均符合食品安全国家标准胶原蛋白肽的相关规定。纳滤脱盐处理后的样品感官品质得到改善，清澈度明显提升，咸味完全消失，整体可接受度提升。本研究为高品质骨胶原蛋白肽产品开发提供技术支撑，也对其它胶原蛋白肽产品的工业化加工具有重要借鉴意义。

图 1 不同浓度骨胶原蛋白肽溶液对灰分含量和蛋白得率的影响

Figure 1. Effects of different concentrations of collagen peptide solution on ash content and protein yield

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图 2 不同循环次数对骨胶原蛋白肽灰分含量和蛋白得率的影响

Figure 2. Effects of different cycles times on ash content and protein yield of collagen peptide

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图 3 不同压力对骨胶原蛋白肽灰分含量和蛋白得率的影响

Figure 3. Effect of different nanofiltration pressure on ash content and protein yield of collagen peptide

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图 4 各因素交互作用对骨胶原蛋白肽脱盐综合评分的影响

Figure 4. Effects of interaction of various factors on the comprehensive score of bone collagen peptide desalination

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图 5 脱盐前后骨胶原蛋白肽理化指标

Figure 5. Comparison of physicochemical parameters of bone collagen peptide before and after desalination

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图 6 脱盐前后骨胶原蛋白肽分子量分布

Figure 6. Molecular weight distribution of bone collagen peptide before and after desalination

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图 7 脱盐前后骨胶原蛋白肽感官评价结果

Figure 7. Sensory evaluation results of bone collagen peptide before and after desalination

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表 1 响应面试验因素水平表

Table 1 Response surface experiment factors and levels

水平	A	B	C
水平	样品浓度（%）	循环次数（次）	纳滤压力（MPa）
−1	4	6	0.4
0	5	7	0.5
1	6	8	0.6

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表 2 感官评价标准表

Table 2 Sensory evaluation standard table

感官特性	特征描述	评分	权重（%）
色泽	黄色	0~5	10
	淡黄色	6~8
	无色或微黄色	9~10
清澈度	溶液浑浊	0~5	20
清澈度	溶液清澈	6~10	20
气味	有异味	0~5	20
气味	无异味	6~10	20
滋味	咸味重	0~5	20
	咸味中等	6~8
	无咸味	9~10
整体可接受度	不可接受	0~5	30
整体可接受度	可接受	6~10	30

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表 3 响应面试验结果

Table 3 Results of response surface experiment

实验号	A	B	C	蛋白得率（%）	灰分含量（%）	综合评分
1	6	8	0.5	89.13	2.83	57.86
2	5	7	0.5	95.37	2.65	61.77
3	5	8	0.4	87.17	2.66	56.54
4	5	7	0.5	96.71	2.68	62.63
5	6	7	0.4	90.51	2.65	58.67
6	5	7	0.5	96.15	2.7	62.28
7	4	8	0.5	86.58	2.63	56.16
8	5	7	0.5	95.54	2.68	61.89
9	4	6	0.5	91.74	2.81	59.51
10	5	6	0.4	91.87	2.79	59.59
11	5	6	0.6	88.65	2.85	57.56
12	6	7	0.6	92.55	2.67	59.98
13	4	7	0.6	93.13	2.59	60.32
14	4	7	0.4	92.14	2.55	59.67
15	6	6	0.5	91.32	2.97	59.30
16	5	8	0.6	89.71	2.73	58.19
17	5	7	0.5	94.91	2.66	61.48

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表 4 响应面回归模型方差分析

Table 4 Response surface regression model ANOVA

来源	平方和SS	自由度df	均方MS	F值	P值	显著性
模型	58.68648	9	6.520721	14.1691	0.001037	显著
A	0.002617	1	0.002617	0.005686	0.942002
B	6.504943	1	6.504943	14.13481	0.007078	**
C	0.307025	1	0.307025	0.667145	0.440956	*
AB	0.91029	1	0.91029	1.978001	0.202409	*
AC	0.10964	1	0.10964	0.23824	0.640397
BC	3.378664	1	3.378664	7.341616	0.030219	*
A²	4.701829	1	4.701829	10.21676	0.015142	*
B²	31.7807	1	31.7807	69.05738	7.14E-05	**
C²	7.051764	1	7.051764	15.32302	0.00579	**
残差	3.22145	7	0.460207
失拟度	2.401913	3	0.800638	3.907753	0.11051	不显著
纯误差	0.819538	4	0.204884
总和	61.90794	16
注：表示P<0.05；*表示P<0.01。

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表 5 脱盐前后骨胶原蛋白肽元素含量（mg/kg）

Table 5 Element composition of bone collagen peptide powder before and after desalination (mg/kg)

元素种类	脱盐前	脱盐后	元素种类	脱盐前	脱盐后
B	6.60±0.20^a	1.76±0.64^b	Cu	0.28±0.28^a	0.12±0.01^a
Na	12171.28±191.47^a	4557.44±3.36^b	Zn	1.93±0.01^a	1.11±0.10^a
Mg	714.32±10.81^a	340.65±0.40^b	As	0.17±0.02^a	0.02±0.00^a
Al	8.95±0.73^a	4.65±0.39^b	Se	0.24±0.24^a	0.02±0.01^a
K	3561.36±98.42^a	489.75±7.10^b	Sr	44.22±0.03^a	4.72±0.19^b
Ca	2609.93±24.09^a	1770.14±12.40^b	Mo	0.35±0.06^a	0.17±0.01^a
P	3513.60±77.69^a	1211.12±17.12^b	Cd	ND	ND
Cr	0.08±0.01^a	0.07±0.01^a	Sn	2.97±0.09^a	2.80±0.01^a
Mn	7.23±0.05^a	5.72±0.01^b	Ba	2.33±0.01^a	0.41±0.01^b
Fe	21.34±0.07^a	21.21±0.07^a	Hg	ND	ND
Co	0.21±0.01^a	0.09±0.01^a	Pb	0.15±0.01^a	0.08±0.03^a
注：ND表示未检出；不同的小写字母表示有显著性差异（P<0.05）。

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施引文献(5)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 纳滤脱盐
1.2.2 单因素实验
1.2.3 响应面试验设计
1.2.4 蛋白得率测定
1.2.5 灰分测定
1.2.6 氨基酸组成测定
1.2.7 分子量分布测定
1.2.8 电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）
1.2.9 感官评定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 骨胶原蛋白肽纳滤脱盐单因素实验
2.1.1 样品浓度对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐效果的影响
2.1.2 循环次数对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐效果的影响
2.1.3 压力对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐效果的影响
2.2 骨胶原蛋白肽纳滤脱盐响应面试验
2.2.1 响应面试验设计结果
2.3 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽理化特性的影响
2.4 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽分子量分布的影响
2.5 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽元素含量的影响
2.6 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽感官品质的影响
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 纳滤脱盐
1.2.2 单因素实验
1.2.3 响应面试验设计
1.2.4 蛋白得率测定
1.2.5 灰分测定
1.2.6 氨基酸组成测定
1.2.7 分子量分布测定
1.2.8 电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）
1.2.9 感官评定
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 骨胶原蛋白肽纳滤脱盐单因素实验
2.1.1 样品浓度对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐效果的影响
2.1.2 循环次数对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐效果的影响
2.1.3 压力对骨胶原蛋白肽纳滤脱盐效果的影响
2.2 骨胶原蛋白肽纳滤脱盐响应面试验
2.2.1 响应面试验设计结果
2.3 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽理化特性的影响
2.4 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽分子量分布的影响
2.5 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽元素含量的影响
2.6 纳滤脱盐对骨胶原蛋白肽感官品质的影响
3. 结论

参考文献(28)

施引文献

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骨胶原蛋白肽纳滤脱盐工艺优化及其对产品整体感官品质的提升作用

作者简介: 李瑞林（1998−），男，硕士研究生，研究方向：畜产品加工，E-mail：lrl225@outlook.com

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