UPLC-Q/Orbitrap HRMS测定口服液中6种西地那非衍生物的不确定度分析

张申平; 侯超; 张妮; 杜茹芸; 周静; 刘洋

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022060278

UPLC-Q/Orbitrap HRMS测定口服液中6种西地那非衍生物的不确定度分析

上海市质量监督检验技术研究院，国家市场监管重点实验室（乳及乳制品检测与监控技术），上海 200233

基金项目: 上海市食品质量安全检测与评价专业技术服务平台（18DZ2292400）。

详细信息

作者简介:
张申平（1992−），男，博士，工程师，研究方向：高分辨质谱技术应用，E-mail：zhangsp1@sqi.org.cn

通讯作者:
杜茹芸（1982−），女，博士，正高级工程师，研究方向：食品化妆品安全检测研究，E-mail：dury@sqi.org.cn

中图分类号: TS207.3
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出版历程
- 收稿日期: 2022-06-27
- 网络出版日期: 2023-03-29
- 刊出日期: 2023-05-31

Uncertainty Evaluation for Determination of 6 Sildenafil Derivatives in Oral Liquid by UPLC-Q/Orbitrap HRMS

Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research, Key Laboratory of Milk and Dairy Products Detection and Monitoring Technology for State Market Regulation, Shanghai 200233, China

摘要

摘要: 为了保证高分辨质谱法测定壮阳类口服液中西地那非类似物的结果准确性和可靠性，对测定结果进行不确定度评定是十分必要的。本研究采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-Q/Orbitrap HRMS）测定口服液保健食品中6种西地那非衍生物的含量，依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》，建立数学模型，进行测量不确定度评定。当口服液中N-去甲基西地那非、去甲基硫代西地那非、二甲基西地那非、羟基硫代豪莫西地那非、硫代豪莫西地那非、硫代西地那非的含量为0.90、1.04、1.22、2.01、1.51、1.14 mg/kg时，扩展不确定度分别为0.07、0.09、0.10、0.16、0.13、0.09 mg/kg（k=2）。评定结果表明，不确定度主要来自UPLC-Q/Orbitrap HRMS仪器、标准溶液配制、回收率和随机效应。
- UPLC-Q/Orbitrap HRMS /
- 口服液 /
- 西地那非衍生物 /
- 不确定度 /
- 扩展不确定度
Abstract: In order to ensure the accuracy and reliability of high resolution mass spectrometry for the determination of sildenafil derivatives in aphrodisiac oral liquid, it is necessary to evaluate the uncertainty of the determination results. In this study, the content of 6 sildenafil derivatives in oral liquid health food was determined by ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole/electrostatic field Orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC-Q/Orbitrap HRMS). The mathematical model was established and the measurement uncertainty was evaluated according to JJF 1059.1-2012 “Evaluation and Expression of Measurement Uncertainty”. When the contents of N-demethyl sildenafil, dimethyl thiosildenafil, dimethyl sildenafil, hydroxythiocarmo sildenafil, thiocarmo sildenafil and thiosildenafil in oral solution were 0.90, 1.04, 1.22, 2.01, 1.51 and 1.14 mg/kg, the extended uncertainties were 0.07, 0.09, 0.10, 0.16, 0.13 and 0.09 mg/kg (k=2), respectively. The results show that the uncertainty mainly comes from UPLC-Q/Orbitrap HRMS, standard solution preparation, recovery and random effect.
- UPLC-Q/Orbitrap HRMS /
- oral liquid /
- sildenafil derivatives /
- uncertainty /
- the expanded uncertainty

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保健食品是对人们正常饮食的有益补充，但一些违法生产者为了达到产品宣称的保健功效，超量、超范围添加处方西药，给消费者健康带来隐患，其中以补肾壮阳类药物违法添加居多^[1-2]。西地那非属于磷酸二酯酶5型（phosphodiesterase type 5，PDE5）选择性抑制剂，具有扩张血管、改善血流的作用^[3-5]，在补肾壮阳类保健食品中检出频次较高。随着药物研发水平的提高，西地那非类似物的种类也日渐增多，主要有N-去甲基西地那非、去甲基硫代西地那非、二甲基西地那非、羟基硫代豪莫西地那非、硫代豪莫西地那非、硫代西地那非等^[6-7]。在日常检测工作中发现，大部分保健食品生产者避开了西地那非，转用其他类似物代替，因此迫切需要建立更加全面且有效的检测方法作为技术储备。目前保健食品中非法添加药物的测定主要是基于薄层色谱法^[8]、溶剂萃取法、QuEChERS法等结合液相色谱串联质谱仪^[9-10]、高效液相色谱-高分辨质谱仪^[11-14]的方法。其中UPLC-Q/Orbitrap HRMS法具有通量、分辨率和准确性高的特点，在保健食品非法添加药物的筛查及检测中有很好的应用前景^[15-17]。

在测定的过程中会存在很多不确定的因素，如取样、样品制备、标准物质选择、分析测量及数据处理等每一个环节，这些不确定的因素导致最终测量值均存在不能确定的部分，这些部分是与测量结果相联系的参数，表示被测量值的分散程度^[18-20]。检测实验室应分析测量不确定度对检测结果的贡献，评定每一项分量的测量不确定度。测定不确定度评定也是日常检验工作的重要技术组成部分，可以为进一步提高检测结果的准确性提供参考。高效液相色谱-高分辨质谱测定保健食品中非法添加药物时具有前处理简单、抗干扰能力强等优点，但鲜有对其不确定度的评价研究，为了保证壮阳类口服液中西地那非类似物测定结果的准确性和可靠性，对测定结果进行不确定度评定是十分必要的。本研究参照已经报道的色谱-质谱法测定目标化合物的不确定度评定方式^[21-23]和评定要点^[24-26]，采用UPLC-Q/Orbitrap HRMS法对壮阳类口服液中的西地那非类似物含量进行测定，依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》^[27]、JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》^[28]，对壮阳类口服液中非法添加的西地那非类似物进行不确定度分析与评定，确定各不确定度分量对实验结果的影响，为实验室检测结果的质量控制提供参考依据。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

N-去甲基西地那非（desmethyl sildenafil，纯度≥99.9%，浓度100.1 µg/mL）、去甲基硫代西地那非（desmethyl thiosildenafil，纯度≥99.9%，浓度100.0 µg/mL）、二甲基西地那非（dimethyl sildenafil，纯度≥99.8%，浓度99.6 µg/mL）、羟基硫代豪莫西地那非（hydroxythiohomo sildenafil，纯度≥98.5%，浓度98.8 µg/mL）、硫代豪莫西地那非（thiohomo sildenafil，纯度≥99.6%，浓度99.9 µg/mL）、硫代西地那非（thiosildenafil，纯度≥98.0%，浓度99.5 µg/mL）溶剂为甲醇　天津阿尔塔科技有限公司；甲醇、乙腈　色谱纯，美国Thermo公司；其他试剂　均为国产分析纯；试验用水　自制超纯水；口服液样品　上海市质量监督检验技术研究院抽检样品。

Thermo Q Exactive PLUS超高液相色谱-质谱联用系统（包括VANQUISH VF-P10-A液相系统及Orbitrap高分辨质谱）、Xcalibur 4.3软件用于质谱仪器控制及数据采集、TraceFinder 5.0软件用于数据分析　美国Thermo公司；MS204S电子天平　感量0.1 mg，德国Mettler Toledo公司；Centrifuge 5804离心机　德国Eppendorf公司；Reax Control涡旋振荡器　德国heidolph公司；Milli-Q超纯水器　美国Millipore公司；SK8300 GT超声波清洗器　上海科导超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

5 mg/L混合标准储备溶液：分别取6种标准溶液各250 µL于5 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至5 mL，于（−20±5）℃冰箱保存，临用前取出恢复至室温。系列标准溶液：分别取20、40、60、100、200 µL混合标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。

1.2.2 样品前处理

参照徐红斌等^[29]的实验方法，准确称量0.5 g样品置于15 mL具塞离心管中，加入10 mL 50%甲醇-水溶液，摇匀，25 ℃下超声15 min，于5000 r/min离心2 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜，取滤液即为供试品溶液。对于浓度超过标准曲线上限的待测液，需用50%甲醇-水适当稀释后再次测定。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 色谱条件

参照徐红斌等^[29]的仪器方法，色谱柱Thermo Hypersil Gold Vanquish色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 µm），柱温：25 ℃，流速：0.3 mL/min，进样量：5 μL。流动相及梯度洗脱程序见表1。

表 1 梯度洗脱程序

Table 1. Gradient elution program

时间（min）	流速（mL/min）	A：0.1%甲酸/水（%）	B：0.1%甲酸/乙腈（%）
0	0.3	90	10
2	0.3	90	10
8	0.3	10	90
10	0.3	10	90
11	0.3	90	10
14	0.3	90	10

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1.2.3.2 质谱条件

离子源：可加热电喷雾离子源（HESI）；离子源温度：325 ℃；喷雾电压：3.50 kV（正模式）；透镜电压：50.0 V；鞘气流速：40 arb；辅助气流速：10 arb；辅助气温度：350 ℃；扫描模式：Full MS-ddMS²；采集范围：100.0~1000.0 m/z；一级质谱分辨率为70000 FWHM；自动增益控制目标离子数（AGC target）：1×10⁶；C-trap最大注入时间：200 ms；二级质谱分辨率17500 FWHM；C-trap最大容量（AGC target）：2×10⁵；C-trap最大注入时间：60 ms；归一化碰撞能（NCE）：20%/40%/60%；动态排除：8.0 s。表2列出了6种西地那非衍生物的分子式、保留时间、母离子、碎片离子精确质量数等信息。

表 2 6种西地那非衍生物的质谱参数

Table 2. Mass spectrometry parameters of 6 sildenafil derivatives

化合物	分子式	保留时间（min）	母离子（m/z）	碎片离子（m/z）	加合方式
N-去甲基西地那非	C₂₁H₂₈N₆O₄S	5.94	461.19626	283.11868^*，255.12376	[M+H]⁺
去甲基硫代西地那非	C₂₁H₂₈N₆O₃S₂	6.69	477.17288	299.09586^*，315.09033	[M+H]⁺
二甲基西地那非	C₂₃H₃₂N₆O₄S	6.05	489.22803	283.1192^*，344.14856	[M+H]⁺
羟基硫代豪莫西地那非	C₂₃H₃₂N₆O₄S₂	6.65	521.19958	299.09589^*，327.12759	[M+H]⁺
硫代豪莫西地那非	C₂₃H₃₂N₆O₃S₂	6.81	505.20401	299.09607^*，113.10741	[M+H]⁺
硫代西地那非	C₂₂H₃₀N₆O₃S₂	6.72	491.18918	341.14389^*，407.12027	[M+H]⁺
注：*为定量离子。

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1.2.4 含量计算

根据壮阳类口服液中西地那非衍生物的测定方法，待测物在样品中的含量计算公式为：

$\mathrm{X}=\frac{\mathrm{c}\times \mathrm{V}}{\mathrm{m}}\times 10$

式中：X为样品中西地那非衍生物的含量，mg/kg；c为外标标准曲线得到的供试品溶液浓度，µg/L；V为供试品溶液定容体积，mL；m为样品称样量，g。

1.3 数据处理

采用TraceFinder 5.0软件进行数据处理，绘制标准曲线，计算样品中目标物的含量，利用Excel计算平均值和标准偏差，相应的公式用Microsoft公式编辑器编辑。

2. 结果与分析

2.1 不确定度的主要来源

在1.2.3的仪器条件下，6种西地那非衍生物的分离度好、峰形规整、质谱响应高，定量离子的提取离子色谱图如图1所示。结合数据模型和整个实验操作过程，测定结果的A类不确定度包括：a.标准曲线拟合引入的不确定度；b.回收率的不确定度，方法前处理过程复杂，步骤较多，采用样品添加回收对样品处理过程的不确定度进行评定；c.随机效应的不确定度，即称量的重复性、体积的重复性、液相色谱-串联质谱仪的重复性等引入的不确定度等。B类不确定度包括：a.样品浓度测定值的不确定度，包括标准物质纯度、标准溶液配制和高效液相色谱-串联质谱仪等的不确定度；b.样品质量的不确定度，主要是天平的校准的不确定度；c.定容体积的不确定度。详见图2。

图 1 6种西地那非衍生物定量离子的提取离子色谱图

注：a：N-去甲基西地那非；b：去甲基硫代西地那非；c：二甲基西地那非；d：羟基硫代豪莫西地那非；e：硫代豪莫西地那非；f：硫代西地那非。

Figure 1. The extracted ion chromatogram of quantitative ions of six sildenafil derivatives

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图 2 口服液中西地那非衍生物测定不确定度来源分析

Figure 2. Analysis of source of uncertainty in sildenafil derivatives of oral liquid

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2.2 由标准物质引入的不确定度

2.2.1 标准物质纯度引入的不确定度

西地那非衍生物的纯度（p）和扩展不确定度（U_p）见表3，根据标准物质证书，包含因子k=2时，在95%置信区间上扩展不确定度U_p=0.5%，以矩形分布计算，由N-去甲基西地那非标准物质纯度引入的相对不确定度为：

表 3 标准物质的纯度及不确定度

Table 3. Purity and uncertainty of standard materials

标准物质	纯度（%）	扩展不确定度U_p（%）	包含因子k	标准不确定度（%）	相对标准不确定度（%）
N-去甲基西地那非	99.9	0.5	2	0.25	0.00250
去甲基硫代西地那非	99.9	0.5	2	0.25	0.00250
二甲基西地那非	99.8	0.5	2	0.25	0.00250
羟基硫代豪莫西地那非	98.5	0.5	2	0.25	0.00254
硫代豪莫西地那非	99.6	0.5	2	0.25	0.00251
硫代西地那非	98.0	0.5	2	0.25	0.00255

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${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}(\mathrm{s}\mathrm{t}\mathrm{d})=\frac{{\mathrm{U}}_{\mathrm{p}}/\mathrm{k}}{\mathrm{p}}=0.00250$

2.2.2 标准物质定容引入的不确定度

2.2.2.1 由移液器校准引入

依据移液器校准证书得到标称容量，1000 µL最大允差为±10.0 µL，按三角分布计算，由移液器校准引入的相对标准不确定度为：

${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}({\mathrm{V}}_{5-1})=\frac{10}{\sqrt{6}\times 1000}=0.00408$

2.2.2.2 由容量瓶校准引入

标准JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》中规定5 mL容量瓶（A）级容量允差为±0.020 mL，以三角分布计算，包含因子k=6，则由容量瓶允差引入的相对不确定度为：

${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}({\mathrm{V}}_{5-2})=\frac{0.02}{\sqrt{6}\times 5}=0.00163$

2.2.2.3 由温度波动引入

标准JJG 209-2010《体积管检定规程》中规定20 ℃时甲醇的体积膨胀系数为1.2×10⁻³ ℃⁻¹，玻璃的体积膨胀可忽略不计，实验环境温度波动控制在20±5 ℃，按均匀分布计算，由温度波动引入的相对不确定度为：

${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}({\mathrm{V}}_{5-3})=\frac{1.2\times {10}^{-3}}{\sqrt{3}}=0.00069$

配制5 mL混合标准溶液引入的相对不确定度为：

$\begin{split} {\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}({\mathrm{V}}_{5})& =\sqrt{{{5\times \mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}({\mathrm{V}}_{5-1})}^{2}+{{\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}({\mathrm{V}}_{5-2})}^{2}+6\times {{\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}({\mathrm{V}}_{5-3})}^{2}}/5\\ & =0.00188 \end{split}$

2.2.3 配制系列标准工作曲线溶液引入的相对不确定度

配制标准工作溶液与1.2.1同理，使用200 µL移液器5次，10 mL容量瓶5次，所用的量器相对不确定度见表4。依据计量检定规程^[30-31]和表4中的数据计算，由N-去甲基西地那非标准工作溶液的配制引入的相对不确定度为：

表 4 标准溶液稀释过程中由量器引入的相对不确定度

Table 4. Relative uncertainty introduced by instruments during standard solution dilution

量器规格（次数）	最大允差	标准不确定度	单次相对标准不确定度
200 µL移液器（5次）	±3.0 µL	\setlength{\voffset}{0.5pt} $\dfrac{3.0}{\sqrt{6}}$	\setlength{\voffset}{0.5pt} $\dfrac{3.0}{200\times \sqrt{6}}=0.00612$
1000 µL移液器（6次）	±10.0 µL	$\dfrac{10.0}{\sqrt{6}}$	$\dfrac{10.0}{1000\times \sqrt{6}}=0.00408$
5 mL A级容量瓶（1次）	±0.020 mL	$\dfrac{0.020}{\sqrt{6}}$	$\dfrac{0.020}{5\times \sqrt{6}}=0.00163$
10 mL A级容量瓶（5次）	±0.020 mL	$\dfrac{0.020}{\sqrt{6}}$	$\dfrac{0.020}{10\times \sqrt{6}}=0.000816$

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$\begin{split} {\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}} (\mathrm{V})& =\sqrt{5\times {0.00612}^{2}+5\times {0.000816}^{2}+10\times {0.00069}^{2}}\\ & =0.01398 \end{split}$

2.3 由标准曲线引入的不确定度

仍然以N-去甲基西地那非为例，对5个标准工作曲线溶液分别进行3次测定，计算平均值，以峰面积（y）和标准浓度（c，µg/L）按照最小二乘法进行拟合，结果见表5。拟合曲线求待测样品中去甲基西地那非平均浓度c产生的标准不确定度为：

表 5 最小二乘法拟合标准曲线

Table 5. Standard curve data by fitting least square curve

标准曲线浓度c（µg/L）	平均峰面积y	线性回归方程	线性相关系数r
5	4421764	y=872031c+331764	1
10	8835701
50	44072074
100	88264579
200	174355919

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${\mathrm{u}}_{\left(\mathrm{c}\right)}=\frac{\mathrm{s}\left(\mathrm{A}\right)}{\mathrm{a}}\sqrt{\frac{1}{\mathrm{N}}+\frac{1}{\mathrm{n}}+\frac{{\left(\mathrm{c}-\bar{\mathrm{C}}\right)}^{2}}{\displaystyle\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{n}}{({\mathrm{C}}_{\mathrm{i}}-\bar{\mathrm{C}})}^{2}}}$

$\mathrm{s}\left(\mathrm{A}\right)=\sqrt{\frac{1}{\mathrm{n}-2}\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{n}}{\left[{\mathrm{A}}_{\mathrm{i}}-\left(\mathrm{a}{\mathrm{C}}_{\mathrm{i}}+\mathrm{b}\right)\right]}^{2}}$

式中：s（A）：标准溶液峰面积的标准偏差；c：样品溶液的质量浓度，c=45.00 µg/L； $\bar{\mathrm{C}}$ ：标准系列溶液的平均浓度， $\bar{\mathrm{C}}$ =42 µg/L；A_i：对应的峰面积；a：线性回归方程的斜率，a=872031；C_i：标准系列溶液浓度；b：标准曲线截距；N：样品平行测定的次数，N=2；n：标准溶液测定次数，n=3×5=15。

计算得到u_（_c）=0.21653。

相对标准不确定度为：

${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{c}\right)=\frac{{\mathrm{u}}_{\left(\mathrm{c}\right)}}{\mathrm{c}}=\frac{0.21653}{45.0}=0.00481$

2.4 样品称量引入的相对不确定度

实验使用的万分之一天平根据标准JJG 1036-2008《电子天平检定规程》中规定的最大允差为±0.0005 g，称样量为0.5 g，称量两次（一次去皮，一次称样）以矩形分布计算，由天平允差引入的相对不确定度为： ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{m}\right)=\sqrt{2\times \left(\dfrac{0.0005}{0.5\times \sqrt{3}}\right)^{2}}=0.00082$ 。查该台天平的检定证书，其分辨力为0.0001 g，半宽为0.00005 g，按矩形分布计算，由天平分辨力引入的相对不确定度小于天平允差引入相对不确定度的十分之一，该值可忽略。

2.5 UPLC-Q/Orbitrap HRMS仪器的相对不确定度

查询UPLC-Q/Orbitrap HRMS仪器的校准证书，仪器的相对扩展不确定度为7.0%（k=2），则由UPLC-Q/Orbitrap HRMS仪器引入的相对不确定度 ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{M}\mathrm{S}\right)=$ 0.035。

2.6 回收率的不确定度 ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{R}\right)$

对加标浓度为1.0 mg/kg的口服液样品进行平行6次测定，N-去甲基西地那非的平均回收率为90.2%，标准偏差为1.95，相对不确定度 ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{R}\right)= \dfrac{\mathrm{S}\left(\mathrm{R}\right)}{\sqrt{6}\times \bar{\mathrm{R}}}=0.00881$ 。

用t检验对回收率进行显著性检验， $\mathrm{t}= \dfrac{\left|100{\text%}-\bar{\mathrm{R}}\right|}{\mathrm{S}\left(\mathrm{R}\right)}$ ，取P=0.95，查t值表，t_{（0.05，5）}=2.571，即当t值大于2.571时， $\bar{\mathrm{R}}$ 与100%有显著性差异，回收率因子f_rec必须在计算公式中采用修正结果，否则 $\bar{\mathrm{R}}$ 与100%无显著性差异，不需要进行结果修正。计算加标样品中N-去甲基西地那非、去甲基硫代西地那非、二甲基西地那非、羟基硫代豪莫西地那非、硫代豪莫西地那非、硫代西地那非的t值分别为1.75、2.31、0.56、1.97、3.39、1.11，可见硫代豪莫西地那非需要采用回收率因子校正，其余5种化合物不需要校正。

2.7 随机效应的不确定度

参考范广宇等^[32]的报道，随机效应的不确定度包括称量、定容等过程中随机效应不确定度的加和。对同一加标样品平行进行6次测定，以N-去甲基西地那非为例，相对不确定度为 ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{A}\right)=0.00666$ 。

2.8 合成标准不确定度

由上述各相对不确定度分量合成的相对标准不确定度为：

$\begin{split} {\mathrm{U}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{X}\right)& =\sqrt{\begin{array}{c}{{\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{s}\mathrm{t}\mathrm{d}\right)}^{2}+{{\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left({\mathrm{V}}_{5}\right)}^{2}+{{\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{V}\right)}^{2}+{{\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{c}\right)}^{2}+\\ {{\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{m}\right)}^{2}+{{\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{M}\mathrm{S}\right)}^{2}{{+\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{R}\right)}^{2}+{{\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{A}\right)}^{2}\end{array}}\\ & =0.04106 \end{split}$

2.9 相对扩展不确定度

取包含因子k=2（置信概率为95%），UPLC-Q/Orbitrap HRMS法测定口服液中N-去甲基西地那非的相对扩展不确定度为： ${\mathrm{U}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}=\mathrm{k}\times {\mathrm{U}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{X}\right)=0.08213$ 。

2.10 扩展不确定度

扩展不确定度U以N-去甲基西地那非的实测值与其相对扩展不确定度U_rel计算：U=0.90×0.08213=0.07。

2.11 测试结果表示

用UPLC-Q/Orbitrap HRMS法测定口服液中6种西地那非衍生物的含量，结果见表6，各相对不确定度分量值如图3所示。以N-去甲基西地那非为例，测试结果为：X=（0.90±0.07）mg/kg，k=2。该结果与谢柏艳等^[33]利用液相色谱-串联质谱法测定保健食品中西地那非不确定度的结果相近（（0.927±0.06）mg/kg，k=2），说明UPLC-Q/Orbitrap HRMS法在不确定度评定实验中的可靠性可与液相色谱-串联质谱法相媲美，有利于UPLC-Q/Orbitrap HRMS法在不确定度评定工作中的进一步应用。

表 6 不确定度分量汇总及6种西地那非衍生物测定不确定度评定结果

Table 6. Summary of each uncertainty component and uncertainty evaluation result for determination of six sildenafil derivatives

不确定度分量	N-去甲基西地那非	去甲基硫代西地那非	二甲基西地那非	羟基硫代豪莫西地那非	硫代豪莫西地那非	硫代西地那非
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{s}\mathrm{t}\mathrm{d}\right)$	0.00250	0.00250	0.00250	0.00254	0.00251	0.00255
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left({\mathrm{V}}_{5}\right)$	0.00188
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{V}\right)$	0.01398
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{c}\right)$	0.00481	0.00445	0.00837	0.00669	0.00441	0.00343
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{m}\right)$	0.00082
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{M}\mathrm{S}\right)$	0.035
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{R}\right)$	0.00881	0.01445	0.00837	0.00969	0.01041	0.00343
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{A}\right)$	0.00666	0.00840	0.00587	0.00669	0.01441	0.00531
合成相对不确定度	0.03970	0.04159	0.04007	0.04018	0.04203	0.03851
实测值（mg/kg）	0.90	1.04	1.22	2.01	1.51	1.14
扩展不确定度U（k=2，mg/kg）	0.07	0.09	0.10	0.16	0.13	0.09
测定结果（k=2，mg/kg）	0.90±0.07	1.04±0.09	1.22±0.10	2.01±0.16	1.51±0.13	1.14±0.09

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图 3 口服液中6种西地那非衍生物的不确定度分量

Figure 3. Uncertainty components of six sildenafil derivatives in oral liquid

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3. 结论

本研究建立了壮阳类口服液保健食品中6种西地那非衍生物的测量不确定度评定方法，通过分析不确定度分量来源计算各分量值，得出了扩展不确定度及检测结果报告。排名前四位的不确定度分量依次是UPLC-Q/Orbitrap HRMS仪器( ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{M}\mathrm{S}\right)$ )、标准溶液配制( ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{V}\right)$ )、回收率( ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{R}\right)$ )、随机效应( ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{A}\right)$ )，分量值依次为0.035、0.01398、0.00343~0.01445、0.00531~0.01441，提示研究人员在日常检测过程中应当注意标准溶液的配制且保持仪器的良好状况，同时规范实验人员操作，通过各方面的控制，可进一步提高检测结果的可靠性，降低质量安全风险。

图 1 6种西地那非衍生物定量离子的提取离子色谱图

注：a：N-去甲基西地那非；b：去甲基硫代西地那非；c：二甲基西地那非；d：羟基硫代豪莫西地那非；e：硫代豪莫西地那非；f：硫代西地那非。

Figure 1. The extracted ion chromatogram of quantitative ions of six sildenafil derivatives

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图 2 口服液中西地那非衍生物测定不确定度来源分析

Figure 2. Analysis of source of uncertainty in sildenafil derivatives of oral liquid

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图 3 口服液中6种西地那非衍生物的不确定度分量

Figure 3. Uncertainty components of six sildenafil derivatives in oral liquid

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表 1 梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution program

时间（min）	流速（mL/min）	A：0.1%甲酸/水（%）	B：0.1%甲酸/乙腈（%）
0	0.3	90	10
2	0.3	90	10
8	0.3	10	90
10	0.3	10	90
11	0.3	90	10
14	0.3	90	10

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表 2 6种西地那非衍生物的质谱参数

Table 2 Mass spectrometry parameters of 6 sildenafil derivatives

化合物	分子式	保留时间（min）	母离子（m/z）	碎片离子（m/z）	加合方式
N-去甲基西地那非	C₂₁H₂₈N₆O₄S	5.94	461.19626	283.11868^*，255.12376	[M+H]⁺
去甲基硫代西地那非	C₂₁H₂₈N₆O₃S₂	6.69	477.17288	299.09586^*，315.09033	[M+H]⁺
二甲基西地那非	C₂₃H₃₂N₆O₄S	6.05	489.22803	283.1192^*，344.14856	[M+H]⁺
羟基硫代豪莫西地那非	C₂₃H₃₂N₆O₄S₂	6.65	521.19958	299.09589^*，327.12759	[M+H]⁺
硫代豪莫西地那非	C₂₃H₃₂N₆O₃S₂	6.81	505.20401	299.09607^*，113.10741	[M+H]⁺
硫代西地那非	C₂₂H₃₀N₆O₃S₂	6.72	491.18918	341.14389^*，407.12027	[M+H]⁺
注：*为定量离子。

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表 3 标准物质的纯度及不确定度

Table 3 Purity and uncertainty of standard materials

标准物质	纯度（%）	扩展不确定度U_p（%）	包含因子k	标准不确定度（%）	相对标准不确定度（%）
N-去甲基西地那非	99.9	0.5	2	0.25	0.00250
去甲基硫代西地那非	99.9	0.5	2	0.25	0.00250
二甲基西地那非	99.8	0.5	2	0.25	0.00250
羟基硫代豪莫西地那非	98.5	0.5	2	0.25	0.00254
硫代豪莫西地那非	99.6	0.5	2	0.25	0.00251
硫代西地那非	98.0	0.5	2	0.25	0.00255

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表 4 标准溶液稀释过程中由量器引入的相对不确定度

Table 4 Relative uncertainty introduced by instruments during standard solution dilution

量器规格（次数）	最大允差	标准不确定度	单次相对标准不确定度
200 µL移液器（5次）	±3.0 µL	\setlength{\voffset}{0.5pt} $\dfrac{3.0}{\sqrt{6}}$	\setlength{\voffset}{0.5pt} $\dfrac{3.0}{200\times \sqrt{6}}=0.00612$
1000 µL移液器（6次）	±10.0 µL	$\dfrac{10.0}{\sqrt{6}}$	$\dfrac{10.0}{1000\times \sqrt{6}}=0.00408$
5 mL A级容量瓶（1次）	±0.020 mL	$\dfrac{0.020}{\sqrt{6}}$	$\dfrac{0.020}{5\times \sqrt{6}}=0.00163$
10 mL A级容量瓶（5次）	±0.020 mL	$\dfrac{0.020}{\sqrt{6}}$	$\dfrac{0.020}{10\times \sqrt{6}}=0.000816$

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表 5 最小二乘法拟合标准曲线

Table 5 Standard curve data by fitting least square curve

标准曲线浓度c（µg/L）	平均峰面积y	线性回归方程	线性相关系数r
5	4421764	y=872031c+331764	1
10	8835701
50	44072074
100	88264579
200	174355919

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表 6 不确定度分量汇总及6种西地那非衍生物测定不确定度评定结果

Table 6 Summary of each uncertainty component and uncertainty evaluation result for determination of six sildenafil derivatives

不确定度分量	N-去甲基西地那非	去甲基硫代西地那非	二甲基西地那非	羟基硫代豪莫西地那非	硫代豪莫西地那非	硫代西地那非
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{s}\mathrm{t}\mathrm{d}\right)$	0.00250	0.00250	0.00250	0.00254	0.00251	0.00255
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left({\mathrm{V}}_{5}\right)$	0.00188
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{V}\right)$	0.01398
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{c}\right)$	0.00481	0.00445	0.00837	0.00669	0.00441	0.00343
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{m}\right)$	0.00082
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{M}\mathrm{S}\right)$	0.035
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{R}\right)$	0.00881	0.01445	0.00837	0.00969	0.01041	0.00343
${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{A}\right)$	0.00666	0.00840	0.00587	0.00669	0.01441	0.00531
合成相对不确定度	0.03970	0.04159	0.04007	0.04018	0.04203	0.03851
实测值（mg/kg）	0.90	1.04	1.22	2.01	1.51	1.14
扩展不确定度U（k=2，mg/kg）	0.07	0.09	0.10	0.16	0.13	0.09
测定结果（k=2，mg/kg）	0.90±0.07	1.04±0.09	1.22±0.10	2.01±0.16	1.51±0.13	1.14±0.09

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液配制
1.2.2 样品前处理
1.2.3 仪器条件
1.2.3.1 色谱条件
1.2.3.2 质谱条件
1.2.4 含量计算
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 不确定度的主要来源
2.2 由标准物质引入的不确定度
2.2.1 标准物质纯度引入的不确定度
2.2.2 标准物质定容引入的不确定度
2.2.2.1 由移液器校准引入
2.2.2.2 由容量瓶校准引入
2.2.2.3 由温度波动引入
2.2.3 配制系列标准工作曲线溶液引入的相对不确定度
2.3 由标准曲线引入的不确定度
2.4 样品称量引入的相对不确定度
2.5 UPLC-Q/Orbitrap HRMS仪器的相对不确定度
2.6 回收率的不确定度 ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{R}\right)$
2.7 随机效应的不确定度
2.8 合成标准不确定度
2.9 相对扩展不确定度
2.10 扩展不确定度
2.11 测试结果表示
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液配制
1.2.2 样品前处理
1.2.3 仪器条件
1.2.3.1 色谱条件
1.2.3.2 质谱条件
1.2.4 含量计算
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 不确定度的主要来源
2.2 由标准物质引入的不确定度
2.2.1 标准物质纯度引入的不确定度
2.2.2 标准物质定容引入的不确定度
2.2.2.1 由移液器校准引入
2.2.2.2 由容量瓶校准引入
2.2.2.3 由温度波动引入
2.2.3 配制系列标准工作曲线溶液引入的相对不确定度
2.3 由标准曲线引入的不确定度
2.4 样品称量引入的相对不确定度
2.5 UPLC-Q/Orbitrap HRMS仪器的相对不确定度
2.6 回收率的不确定度 ${\mathrm{u}}_{\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\left(\mathrm{R}\right)$
2.7 随机效应的不确定度
2.8 合成标准不确定度
2.9 相对扩展不确定度
2.10 扩展不确定度
2.11 测试结果表示
3. 结论

参考文献(33)

施引文献

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UPLC-Q/Orbitrap HRMS测定口服液中6种西地那非衍生物的不确定度分析

作者简介: 张申平（1992−），男，博士，工程师，研究方向：高分辨质谱技术应用，E-mail：zhangsp1@sqi.org.cn

通讯作者: 杜茹芸（1982−），女，博士，正高级工程师，研究方向：食品化妆品安全检测研究，E-mail：dury@sqi.org.cn

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