Optimize the Instantaneous High Temperature Sterilization Process of Ilex kudingcha Based on Multiple Index Analysis
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摘要: 基于多指标优化苦丁茶冬青瞬时高温灭菌工艺参数。采用正交设计多指标综合加权评分法优化苦丁茶冬青瞬时高温灭菌工艺参数，以灭菌温度、灭菌时间、药材粒度为考察因素，以灭菌率、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH·）抗氧化活性IC50值、多酚类化合物含量为考察指标，采用直观及方差分析结果评价灭菌对3个考察指标的影响；采用指纹图谱技术对灭菌前后的样品进行评价。结果表明，灭菌温度是具有显著影响的因素（P<0.05），确定的最佳灭菌工艺条件为：灭菌温度160 ℃，灭菌时间10 s，粉碎粒度24目。瞬时高温灭菌对DPPH·抗氧化活性IC50值以及多酚类化合物含量均无显著影响（P>0.05）。按优化工艺灭菌后的3批样品微生物限度检查均符合药典规定；灭菌后3批样品的DPPH·抗氧化活性IC50值较灭菌前减少0.19，多酚类化合物含量较灭菌前增加约0.14%；灭菌前后3批样品的DPPH·抗氧化活性IC50值及多酚类化合物含量结果经t检验均无显著差异（P>0.05）；灭菌前后样品指纹图谱相似度>0.9。综上所述，瞬时高温灭菌对苦丁茶冬青质量无影响，为瞬时高温灭菌技术在苦丁茶冬青灭菌中的应用提供了实验依据。Abstract: To optimize the instantaneous high-temperature sterilization process parameters of Ilex kudingcha based on multiple indicators. The process parameters of instantaneous high-temperature sterilization of Ilex kudingcha were optimized by using the orthogonal design multi-index comprehensive weighted scoring method. Sterilization temperature, sterilization time, and particle size of herbs were used as the investigating factors, the sterilization rate, IC50 value of antioxidant activity of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH·), and polyphenolic content were used as indicators, visual and ANOVA results were used to evaluate the effect of sterilization on the three examined indicators. Fingerprint technology was used to evaluate the samples before and after sterilization. The results showed that sterilization temperature was a factor that had a significant impact (P<0.05), and the optimal sterilization process conditions were as follows: Sterilization temperature 160 ℃, sterilization time 10 s, grinding size 24 mesh. No significant effect of instantaneous high-temperature sterilization on IC50 values of DPPH· antioxidant activity and content of polyphenolic compounds (P>0.05). The microbiological limits of the three batches of samples sterilized by the optimized process were all in accordance with the provisions of pharmacopoeia. The IC50 values of DPPH· antioxidant activity of the three batches of samples after sterilization decreased by 0.19 and the polyphenolic content increased by about 0.14% compared to that before sterilization. The results of DPPH· antioxidant activity IC50 values and polyphenolic compounds content of the three batches of samples before and after sterilization were not significantly different by t-test (P>0.05). The similarity of sample fingerprint before and after sterilization was >0.9. In conclusion, instantaneous high temperature sterilization had no effect on the quality of Ilex kudingcha, which would provide experimental basis for the application of instantaneous high temperature sterilization technology in Ilex kudingcha sterilization.
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苦丁茶（Ilex kudingcha C.J. Tseng）为冬青科冬青属乔木植物，是药、饮兼用之名贵珍品[1-2]，主要含有三萜及其苷类、咖啡酰奎宁酸类、黄酮类等多种有效成分[3-8]。苦丁茶冬青中的多酚不同于传统意义上的茶多酚，主要以咖啡酰奎宁酸类化合物为主，占多酚总量的95%，其次是黄酮类化合物。现代药理研究表明，苦丁茶冬青具有抗氧化、降血糖、降血脂等功效[9-15]。苦丁茶冬青作为直饮茶，其微生物水平直接关乎饮用者的健康安全。茶叶在生长、采摘、加工、运输及仓储过程中存在潜在的真菌污染[16-18]，给使用者健康造成严重威胁。苦丁茶灭菌时必须结合其有效成分及活性等综合因素选择灭菌方法[19-20]，尤其是对真菌（霉菌、酵母菌）的有效杀灭要重点考虑，同时灭菌对其多酚类化合物含量及抗氧化活性的影响也值得关注。有关苦丁茶冬青灭菌工艺方面的研究，尤其是对其灭菌后质量的研究还未见报道。
目前实际生产采用的灭菌方式有干热灭菌、湿热灭菌、环氧乙烷灭菌、钴60辐照灭菌、乙醇蒸汽灭菌等[21]，这些方式均存在不同程度的缺点和问题，干热灭菌破坏药物的有效成分，影响疗效；湿热灭菌后药物板结成块，影响使用；环氧乙烷有机溶剂残留；钴60辐照放射性残留；乙醇蒸汽能耗大、时间长，影响经济效益[22]。瞬时高温灭菌（High Temperature Short Time，HTST）是利用直接蒸汽或热交换器，使食品、药品等在150~180 ℃温度下保持几秒至十几秒灭菌，因其灭菌时间短，能够更大限度的保持粉粒有效成分，无环境污染，在中药产品及食品灭菌中具有良好的应用前景。尚海宾等[23]研究表明，瞬时高温灭菌在达到灭菌效果的同时对黄芩质量无影响，但其只是以黄芩苷单一质量标准作为评价，并未从多个角度进行全方位评价，有关瞬时高温灭菌工艺优化方面的研究还未见报道。
本研究以苦丁茶冬青干燥叶为原料，采用瞬时高温灭菌技术，以正交设计多指标综合评分法优化苦丁茶冬青瞬时高温灭菌工艺参数，选取灭菌率、DPPH·抗氧化活性IC50值和多酚类化合物含量作为考察指标，多维度评价瞬时高温灭菌工艺对苦丁茶冬青质量的影响，以期为瞬时高温灭菌技术在食品及药品领域更广泛的应用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
苦丁茶冬青干燥叶 购自海南省澄迈万昌苦丁茶场，经吉林省中医药科学院南敏伦研究员鉴定为鉴定为冬青科冬青属苦丁茶冬青；新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸、咖啡酸、异槲皮素、对羟基肉桂酸 HPLC>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司；芦丁 HPLC>91.9%，中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈 色谱纯，美国TEDIA公司；磷酸 色谱纯，吉林省军区化工厂；DPPH·试剂 纯度≥98.5%，上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂 均分析纯。
WS-FMD15过热蒸汽瞬时灭菌系统 长春钻智制药有限公司；LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；BT25S型十万分之一电子天平 德国赛多利斯科学仪器有限公司；UV-1801紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；KQ-500E超声清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；FW177型高速万能粉碎机 北京市永光明医疗仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 灭菌样品制备
取苦丁茶冬青，粉碎成24、50、80目的颗粒备用，采用PE自封袋分装成9袋，每袋200 g，按照正交因素水平表对9袋样品进行瞬时高温灭菌，用无菌采样袋分装灭菌后的样品。
1.2.2 瞬时高温灭菌工艺优化
采用正交试验法，根据瞬时高温灭菌的实践经验及设备的控制范围及前期预实验经验，选取灭菌温度（A）、灭菌时间（B）和粉碎粒度（C）为考察因素，每个因素设定3个水平，因素水平见表1。以微生物限度、DPPH·抗氧化活性IC50值及多酚类化合物含量为考察指标，综合评分法确定苦丁茶冬青瞬时高温灭菌工艺参数。
表 1 正交试验因素水平设计Table 1. Factor level design of orthogonal experiment编号 A灭菌温度（℃） B灭菌时间（s） C粉碎粒度（目） 1 150 5 24 2 160 7 50 3 170 10 80 1.2.3 微生物限度检查
取灭菌前后样品10 g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL混匀即为1:10供试液，依次进行10、100、1000倍系列稀释。需氧菌总数、霉菌和酵母菌、大肠埃希菌和沙门菌及耐胆盐革兰阴性菌总数的检测按照2020年版《中国药典》四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法[24]，并计算灭菌率[25]。
样品菌总数=样品细菌总数+霉菌及酵母菌总数 灭菌率=(未灭菌样品菌总数−灭菌样品菌总数)/未灭菌样品菌总数×100 1.2.4 DPPH·抗氧化活性测定
参照文献[26-29]的方法并加以改进，制成药材质量浓度为3.6、3.0、2.4、1.8 g/L（药材） 的浓度系列的苦丁茶冬青70%乙醇溶液，在紫外-可见分光光度计517 nm波长下分别测定空白样品溶液、对照样品溶液及供试品溶液吸光度，计算自由基清除率。以样品浓度为横坐标，自由基清除率为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，得出IC50（mg/mL）值。
DPPH⋅自由基清除率(%)=[1−(A样品−A样品对照)/A对照]×100 1.2.5 高效液相色谱法（HPLC）测定灭菌前后10种多酚类化合物的含量
1.2.5.1 对照品溶液的制备
精密称定10种多酚对照品各5 mg，置于10 mL的量瓶中，用70%乙醇溶解，稀释至刻度，混匀备用。
1.2.5.2 供试品溶液的制备
分别称取灭菌前后苦丁茶冬青1 g，各置于50 mL量瓶中，加70%乙醇定容，40 KHz超声提取65 min，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
1.2.5.3 色谱条件
色谱柱为Agilent色谱柱（HC-C18，4.6 mm×250 mm）；流动相为0.2%磷酸乙腈（A）−0.2%磷酸水（B）；二元梯度洗脱条件：0~6 min，87%B；6~16 min，85% B；16~30 min，70%B。总流速为1.0 mL/min；柱温40 ℃，检测波长320 nm，进样量5 μL[29]。
1.2.5.4 多酚类化合物含量测定
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，测定即得。按公式计算含量。
多酚类化合物含量(%)=A样A对×C对×V对V供×V供定W供×1000×100 式中：A：峰面积；C对：对照品浓度（mg/mL）；V供：供试品进样体积（μL）；V对：对照品进样体积（μL）；V供定：供试品定容体积（mL）；W供：供试品称量（g）。
1.2.6 正交试验分析方法
按照L9（34）正交设计表的条件进行试验，分别测定计算样品灭菌率、DPPH·抗氧化活性IC50值以及多酚类化合物的含量。采用综合加权评分法评价灭菌工艺[30-31]，权衡各指标对工艺的贡献，设定指标A1（灭菌率）的权重为35%，指标B2（DPPH·抗氧化活性IC50值）的权重为35%，指标C3（多酚类化合物含量）的权重为30%，以综合指标进行方差分析。
计算综合评分= Ai/Amax×0.35+Bi/Bmax×0.35+Ci/Cmax×0.30，以综合评分值进行直观分析。
1.2.7 HPLC指纹图谱的建立
指纹图谱及对照指纹图谱的采集[26]，按最佳灭菌工艺条件处理10个不同批次样品，按“1.2.5”项下对照品、供试品溶液制备方法及色谱条件操作分析，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）处理，得HPLC指纹图谱。
1.3 数据处理
实验数据采用Latin软件进行正交分析，采用SPSSAU软件进行CRITIC权重计算，采用SPSS22.0软件进行方差分析及t检验，P<0.05表示具有显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 正交试验多酚类化合物含量测定
9组正交试验瞬时高温灭菌的苦丁茶冬青多酚类化合物含量结果如表2。
表 2 正交试验苦丁茶冬青10种多酚类化合物含量（%）Table 2. Content of ten polyphenolic compounds of Ilex kudingcha by orthogonal test (%)指标 1号 2号 3号 4号 5号 6号 7号 8号 9号 新绿原酸 0.23 0.22 0.18 0.22 0.26 0.26 0.23 0.23 0.25 绿原酸 1.32 1.16 1.13 1.22 1.33 1.33 1.30 1.32 1.29 隐绿原酸 0.36 0.25 0.22 0.25 0.34 0.34 0.33 0.35 0.31 咖啡酸 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 对羟基肉桂酸 0.17 0.14 0.00 0.23 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 芦丁 0.01 0.00 0.08 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 异槲皮素 0.03 0.05 0.02 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 异绿原酸B 0.12 0.11 0.14 0.12 0.13 0.16 0.12 0.13 0.13 异绿原酸A 0.40 0.35 0.35 0.42 0.41 0.40 0.40 0.38 0.40 异绿原酸C 0.27 0.22 0.27 0.02 0.25 0.29 0.25 0.27 0.27 总含量 2.92 2.52 2.40 2.54 2.98 3.04 2.90 2.95 2.92 2.2 正交试验结果及分析
正交试验方差分析及直观分析结果见表3、表4。综合评分直观分析表明，各因素作用主次顺序为A>C>B，方差分析表明灭菌温度是显著影响的因素，因k2、k3数值一样，故灭菌温度选择160、170 ℃均可，结合正交表中灭菌率结果及综合评分结果，确定最佳提取工艺为A2B3C1，即灭菌温度为160 ℃，灭菌时间为10 s，粉碎粒度为24目。灭菌率、DPPH·抗氧化活性IC50值以及多酚类化合物含量分别的直观分析以及方差分析结果表明，灭菌温度对灭菌率具有显著影响，其他因素对灭菌率无显著影响，灭菌温度、灭菌时间及粉碎粒度对DPPH·抗氧化活性IC50值以及多酚类化合物含量均无显著性影响。以每种化合物含量作为考察变量，进行方差分析，结果表明灭菌对10种多酚类化合物含量均无显著影响（P>0.05），与总含量作为考察变量结果一致。
表 3 瞬时高温灭菌工艺 L9（34）正交试验设计及结果Table 3. Orthogonal test design and results of instantaneous high temperature sterilization process L9(34)实验号 A B C D（空白） 灭菌率（%） DPPH·抗氧化活性IC50（mg/mL） 总多酚含量（%） 综合评分 1 1 1 1 1 66.31 8.02 2.92 0.876 2 1 2 2 2 69.96 7.45 2.52 0.824 3 1 3 3 3 77.45 7.24 2.40 0.830 4 2 1 2 3 87.74 7.17 2.54 0.878 5 2 2 3 1 90.17 6.54 2.98 0.902 6 2 3 1 2 91.91 7.35 3.04 0.950 7 3 1 3 2 88.37 6.88 2.90 0.903 8 3 2 1 3 97.72 6.47 2.92 0.921 9 3 3 2 1 91.27 6.62 2.95 0.907 灭菌率（%） k1 69.467 78.900 80.930 81.567 k2 81.933 82.907 83.067 79.073 k3 93.153 82.747 80.557 83.913 R 23.686 4.007 2.510 4.840 DPPH·IC50值 k1 7.570 7.357 7.280 7.060 k2 7.020 6.820 7.080 7.227 k3 6.657 7.070 6.887 6.960 R 0.913 0.537 0.393 0.267 总多酚含量（%） k1 2.613 2.787 2.960 2.950 k2 2.853 2.807 2.670 2.820 k3 2.923 2.797 2.760 2.620 R 0.310 0.020 0.290 0.330 综合评分 k1 0.843 0.886 0.916 0.895 k2 0.910 0.882 0.870 0.892 k3 0.910 0.896 0.878 0.876 R 0.067 0.014 0.046 0.019 表 4 瞬时高温灭菌工艺正交试验方差分析Table 4. Variance analysis of orthogonal test of instantaneous high temperature sterilization process因素 离均差平方和 自由度 均方 F值 显著性 灭菌率（%） A 842.364 2 421.182 137.691 P<0.05 B 37.408 2 18.704 6.115 P>0.05 C 40.036 2 20.018 6.544 P>0.05 误差 6.118 2 3.059 DPPH· IC50值 A 1.269 2 0.063 7.372 P>0.05 B 0.508 2 0.254 2.950 P>0.05 C 0.169 2 0.084 0.981 P>0.05 误差 0.172 2 0.086 总多酚含量（%） A 0.159 2 0.079 3.366 P>0.05 B 0.105 2 0.052 2.226 P>0.05 C 0.251 2 0.125 5.324 P>0.05 误差 0.047 2 0.024 综合评分 A 0.009 2 0.004 20.751 P<0.05 B 0.003 2 0.001 6.443 P>0.05 C 0.004 2 0.002 8.713 P>0.05 误差 0.000 2 0.000 注：F0.05 （2,2）=19.00，F0.01 （2,2）=99.00。 2.3 最佳工艺参数验证
为验证优选工艺，以最佳灭菌工艺条件处理3批苦丁茶冬青样品，进行微生物限度检测、测定计算DPPH·抗氧化活性IC50值及多酚类化合物含量，结果见表5、表6。灭菌前后样品结果经t检验均无显著性差异（P>0.05），结果见表7，样品抗氧化活性与多酚类化合物含量均未发生明显变化，微生物限度均处于合格水平，符合药典规定，表明该工艺合理可行，具有可操作性。
表 5 灭菌前后微生物限度考察Table 5. Microbial limits before and after sterilization序号 需氧菌（CFU/g） 霉菌和
酵母菌（CFU/g）大肠埃希菌 耐胆盐革兰
阴性菌（CFU/g）沙门菌 1 1.0×103 8.0×101 未检出 <10 未检出 2 1.4×103 7.0×101 未检出 <10 未检出 3 1.1×103 8.0×101 未检出 <10 未检出 未灭菌 2.0×106 8.0×102 未检出 <10 未检出 表 6 最佳工艺验证结果Table 6. Optimal process verification results序号 灭菌前DPPH·
抗氧化活性IC50值灭菌后DPPH·
抗氧化活性IC50值灭菌前多酚类
化合物含量（%）灭菌后多酚类
化合物含量（%）1 6.63 6.42 4.71 4.83 2 7.15 7.07 4.53 4.64 3 7.21 6.93 4.25 4.43 表 7 灭菌前后DPPH·抗氧化活性IC50值及多酚类化合物含量结果分析Table 7. Analysis of IC50 value of DPPH· antioxidant activity and content of polyphenolic compounds before and after sterilization灭菌前后 平均值 SD F P t 自由度 DPPH·IC50值 灭菌前 6.9967 0.31896 假定等方差 0.018 0.899 0.704 4 灭菌后 6.8067 0.34210 10种多酚总含量 灭菌前 4.4967 0.23180 假定等方差 0.098 0.770 -0.77 4 灭菌后 4.6333 0.20008 2.4 苦丁茶冬青灭菌前后指纹图谱
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》建立优化后最佳工艺灭菌后（S1~S10）、灭菌前（S11）批样品指纹图谱。以未灭菌样品（S11）作为参照图谱，利用中位数法进行多点校正、自动匹配（时间窗宽度为0.10），共标定了12个共有峰，作为苦丁茶冬青指纹图谱的特征峰，生成对照图谱R，即共有模式图，见图1。将灭菌前后的样品指纹图谱与对照图谱进行比较，分别计算灭菌前后样品指纹图谱的相似度，结果均大于0.9，表明灭菌前后苦丁茶冬青的图谱整体相貌相同，化学组成一致性良好，质量稳定。
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图 1 苦丁茶冬青的HPLC指纹图谱及对照指纹图谱注：1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.咖啡酸；5.对羟基肉桂酸；6.芦丁；7.异槲皮素；10.异绿原酸B；11.异绿原酸A；12.异绿原酸C；R：对照图谱；S1~S10：灭菌后样品；S11：未灭菌样品。Figure 1. HPLC fingerprint and control fingerprint of Ilex kudingcha3. 结论与讨论
瞬时高温灭菌能有效降低苦丁茶冬青的微生物水平，直观及方差分析结果表明，灭菌温度对样品中微生物的水平具有显著影响，灭菌温度越高，样品微生物水平越低，而灭菌温度的变化对DPPH·抗氧化活性和多酚类化合物含量无影响；灭菌后样品与灭菌前比较，DPPH·抗氧化实验IC50值平均减少0.19，多酚类化合物含量平均增加0.14%，可能与灭菌后水分减少0.2%，从而使有效成分相对含量增加有关。尚海宾等[23]研究也表明瞬时高温灭菌对同属于多酚类化合物的黄芩苷含量无影响，灭菌后样品中黄芩苷含量比灭菌前平均增加0.1%，灭菌后样品水分含量比灭菌前平均减少约0.1%，这与本研究结果一致。指纹图谱标定12个共有峰，确认了10种化合物，其他两个化合物尚需采用质谱等手段进一步确认，确认的10种化合物单体抗氧化活性实验也需进一步研究。
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图 1 苦丁茶冬青的HPLC指纹图谱及对照指纹图谱
注：1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.咖啡酸；5.对羟基肉桂酸；6.芦丁；7.异槲皮素；10.异绿原酸B；11.异绿原酸A；12.异绿原酸C；R：对照图谱；S1~S10：灭菌后样品；S11：未灭菌样品。
Figure 1. HPLC fingerprint and control fingerprint of Ilex kudingcha
表 1 正交试验因素水平设计
Table 1 Factor level design of orthogonal experiment
编号 A灭菌温度（℃） B灭菌时间（s） C粉碎粒度（目） 1 150 5 24 2 160 7 50 3 170 10 80 
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表 2 正交试验苦丁茶冬青10种多酚类化合物含量（%）
Table 2 Content of ten polyphenolic compounds of Ilex kudingcha by orthogonal test (%)
指标 1号 2号 3号 4号 5号 6号 7号 8号 9号 新绿原酸 0.23 0.22 0.18 0.22 0.26 0.26 0.23 0.23 0.25 绿原酸 1.32 1.16 1.13 1.22 1.33 1.33 1.30 1.32 1.29 隐绿原酸 0.36 0.25 0.22 0.25 0.34 0.34 0.33 0.35 0.31 咖啡酸 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 对羟基肉桂酸 0.17 0.14 0.00 0.23 0.21 0.21 0.21 0.21 0.21 芦丁 0.01 0.00 0.08 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 异槲皮素 0.03 0.05 0.02 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 异绿原酸B 0.12 0.11 0.14 0.12 0.13 0.16 0.12 0.13 0.13 异绿原酸A 0.40 0.35 0.35 0.42 0.41 0.40 0.40 0.38 0.40 异绿原酸C 0.27 0.22 0.27 0.02 0.25 0.29 0.25 0.27 0.27 总含量 2.92 2.52 2.40 2.54 2.98 3.04 2.90 2.95 2.92
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表 3 瞬时高温灭菌工艺 L9（34）正交试验设计及结果
Table 3 Orthogonal test design and results of instantaneous high temperature sterilization process L9(34)
实验号 A B C D（空白） 灭菌率（%） DPPH·抗氧化活性IC50（mg/mL） 总多酚含量（%） 综合评分 1 1 1 1 1 66.31 8.02 2.92 0.876 2 1 2 2 2 69.96 7.45 2.52 0.824 3 1 3 3 3 77.45 7.24 2.40 0.830 4 2 1 2 3 87.74 7.17 2.54 0.878 5 2 2 3 1 90.17 6.54 2.98 0.902 6 2 3 1 2 91.91 7.35 3.04 0.950 7 3 1 3 2 88.37 6.88 2.90 0.903 8 3 2 1 3 97.72 6.47 2.92 0.921 9 3 3 2 1 91.27 6.62 2.95 0.907 灭菌率（%） k1 69.467 78.900 80.930 81.567 k2 81.933 82.907 83.067 79.073 k3 93.153 82.747 80.557 83.913 R 23.686 4.007 2.510 4.840 DPPH·IC50值 k1 7.570 7.357 7.280 7.060 k2 7.020 6.820 7.080 7.227 k3 6.657 7.070 6.887 6.960 R 0.913 0.537 0.393 0.267 总多酚含量（%） k1 2.613 2.787 2.960 2.950 k2 2.853 2.807 2.670 2.820 k3 2.923 2.797 2.760 2.620 R 0.310 0.020 0.290 0.330 综合评分 k1 0.843 0.886 0.916 0.895 k2 0.910 0.882 0.870 0.892 k3 0.910 0.896 0.878 0.876 R 0.067 0.014 0.046 0.019
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表 4 瞬时高温灭菌工艺正交试验方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal test of instantaneous high temperature sterilization process
因素 离均差平方和 自由度 均方 F值 显著性 灭菌率（%） A 842.364 2 421.182 137.691 P<0.05 B 37.408 2 18.704 6.115 P>0.05 C 40.036 2 20.018 6.544 P>0.05 误差 6.118 2 3.059 DPPH· IC50值 A 1.269 2 0.063 7.372 P>0.05 B 0.508 2 0.254 2.950 P>0.05 C 0.169 2 0.084 0.981 P>0.05 误差 0.172 2 0.086 总多酚含量（%） A 0.159 2 0.079 3.366 P>0.05 B 0.105 2 0.052 2.226 P>0.05 C 0.251 2 0.125 5.324 P>0.05 误差 0.047 2 0.024 综合评分 A 0.009 2 0.004 20.751 P<0.05 B 0.003 2 0.001 6.443 P>0.05 C 0.004 2 0.002 8.713 P>0.05 误差 0.000 2 0.000 注：F0.05 （2,2）=19.00，F0.01 （2,2）=99.00。
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表 5 灭菌前后微生物限度考察
Table 5 Microbial limits before and after sterilization
序号 需氧菌（CFU/g） 霉菌和
酵母菌（CFU/g）大肠埃希菌 耐胆盐革兰
阴性菌（CFU/g）沙门菌 1 1.0×103 8.0×101 未检出 <10 未检出 2 1.4×103 7.0×101 未检出 <10 未检出 3 1.1×103 8.0×101 未检出 <10 未检出 未灭菌 2.0×106 8.0×102 未检出 <10 未检出
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表 6 最佳工艺验证结果
Table 6 Optimal process verification results
序号 灭菌前DPPH·
抗氧化活性IC50值灭菌后DPPH·
抗氧化活性IC50值灭菌前多酚类
化合物含量（%）灭菌后多酚类
化合物含量（%）1 6.63 6.42 4.71 4.83 2 7.15 7.07 4.53 4.64 3 7.21 6.93 4.25 4.43
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表 7 灭菌前后DPPH·抗氧化活性IC50值及多酚类化合物含量结果分析
Table 7 Analysis of IC50 value of DPPH· antioxidant activity and content of polyphenolic compounds before and after sterilization
灭菌前后 平均值 SD F P t 自由度 DPPH·IC50值 灭菌前 6.9967 0.31896 假定等方差 0.018 0.899 0.704 4 灭菌后 6.8067 0.34210 10种多酚总含量 灭菌前 4.4967 0.23180 假定等方差 0.098 0.770 -0.77 4 灭菌后 4.6333 0.20008
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