Optimization of Formula of Lepista sordida and Yam Fungal Substance Beverage and Its Antioxidant Activity
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摘要: 为开发一款具有一定保健功效的菌质饮料，以花脸香蘑为发酵菌，以山药为发酵基质，借助生物发酵技术获得花脸香蘑山药菌质，以傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测菌质的质量，以菌质为原料，在单因素实验基础上，采用Box-Benhnken 响应面试验设计对饮料的配方进行优化，并检测其功能性成分含量和抗氧化活性。结果表明，所得的花脸香蘑山药菌质不仅具有山药的基本成分，还产生了新的功能性成分；其最佳配方为：花脸香蘑山药菌质添加量4.00%、木糖醇添加量4.11%、柠檬酸添加量0.75%、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）添加量0.24%，在该条件下，饮料呈亮褐色、酸甜可口、具有花脸香蘑山药菌质特有的香味、清澈透明，感官评分为88.7±0.40分；饮料中总黄酮含量为58.43±0.94 mg/L、总酚含量为45.77±0.43 mg/L；饮料对DPPH和羟自由基的最大清除率分别为73.46%和79.26%，表明该饮料具有一定的抗氧化活性。Abstract: Fungal substance derived from bio-fermentation technology of Lepista sordida with yam in order to develop a beverage with health benefits, the quality of the fungal substance was studied through fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), which was used as raw material, the beverage formulation was optimized by Box-Benhnken response surface experimental design on the basis of single factor experiment, the content of functional ingredients and antioxidant activity for the beverage were detected. The results showed that the obtained fungal substance not only had the basic components of yam, but also produced new functional components; the optimal formula was: 4.00% fungal substance, 4.11% xylitol, 0.75% citric acid, 0.24% carboxymethyl cellulose sodium (CMC-Na), the beverage was bright brown, sweet and sour, clear and transparent, with the unique aroma of the fungal substance, the sensory score was 88.7±0.40 points. The total flavonoids and phenolics were 58.43±0.94 and 45.77±0.43 mg/L. The maximum scavenging rates of the beverage to DPPH and hydroxyl radicals were 73.46% and 79.26%, which indicated that the beverage had certain antioxidant activity.
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Keywords:
- Lepista sordida /
- yam /
- fungal substance /
- FTIR /
- response surface method /
- beverage /
- antioxidant activity
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花脸香蘑又称为紫花脸、紫晶蘑和花脸蘑等，从分类学上属于担子菌门、伞菌纲、口蘑科和香蘑属的一种真菌[1-3]。花脸香蘑中主要含有萜类、甾醇类、酮类、多糖类等有效成分[4-6]。研究发现，花脸香蘑不仅营养丰富，具有高蛋白、低脂肪的特点，还具有抗氧化、保肝护肝、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节等功效，是一种药用保健功效较大的食药兼用菌[7-10]。山药是薯蓣科草本植物薯蓣的块茎[11]，含有丰富的多糖、多酚和黄酮类化合物[12-14]，具有降血脂、降血糖、抗氧化、免疫调节、抗病毒等药用功效[15-17]，是药食同源食品原料[18]。
目前，有关花脸香蘑的研究主要集中在种质资源鉴定[19]、优良菌种选育[20]、驯化栽培[21]、药理药效探索[10]、植物生长调节[22]等基础研究方面，很少涉及利用花脸香蘑来开发新型保健食品。在山药类食品饮料的开发利用方面，主要涉及在食品饮料制备过程中添加山药粉末及其提取物[23-25]，对山药在开发功能型食品饮料方面的潜力挖掘不够[26]。
本研究基于庄毅等[27]提出的“双向发酵”的概念，利用药用真菌发酵药材，产生的药用菌质兼具二者药用保健功能[28]。在此基础上，李慧星等[29]利用灵芝、银耳、香菇、蛹虫草对山药进行“双向发酵”，获得的相关菌质含有丰富的黄酮、多酚、三萜等药用活性物质[30-31]。张文意等[32]开展槐耳菌板蓝根双向发酵，获得的槐耳板蓝根菌质兼具二者的药用功效，已经在临床上获得了应用。本研究以花脸香蘑为发酵菌，山药中的上品——铁棍山药为发酵基质，通过“双向发酵”，获得兼具二者保健功效的花脸香蘑山药菌质，借助FTIR检测菌质的质量，以该菌质为基础，添加调味剂，在单因素实验基础上，通过响应面试验设计，获得饮料的最佳配方，开发出一款色香味俱佳的花脸香蘑山药菌质饮料，通过总黄酮、总酚含量检测和抗氧化活性分析，进一步验证了该饮料潜在的保健价值，为该菌质饮料的进一步开发利用提供了理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
花脸香蘑（Lepista sordida） 采自大别山金刚台自然保护区（5～6月份采收，子实体7～8分成熟度），组分、纯化后，经过ITS分子鉴定；芦丁、没食子酸标品（纯度≥98%） 上海联硕生物科技有限公司；溴化钾（光谱纯） 天津中世沃克科技发展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、过氧化氢、甲醇、硫酸亚铁、水杨酸等（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1等（分析纯），木糖醇、柠檬酸、CMC-Na等（食品级） 北京博奥星生物技术有限责任公司；铁棍山药（河南焦作温县产）、土豆、玉米粉等 市售。
Tu-1810分光光度计 北京普析仪器设备公司；Spectrun100红外光谱仪 美国Perkin Elmer公司；XFS-280型高压灭菌锅 浙江新丰医疗公司；101-0型电热恒温鼓风干燥箱 上海梅香仪器公司；HH-S6型恒温水浴锅 金坛市国旺实验仪器公司；XFB-200型中药粉碎机 湖南中诚制药设备公司；SW-CJ-2D型超净工作台 上海申安医疗器械有限公司；GJB8-20型高压均质机 常州菌质设备公司；RE-3000A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SPX-70BE 型生化培养箱 上海力辰邦西仪器科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基的制备
花脸香蘑母种培养基[33]：土豆（去皮）200 g/L、玉米粉30 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、维生素B1 0.05 g/L、琼脂粉20 g/L，灭菌条件为121 ℃、0.12 MPa、30 min。
花脸香蘑液体培养基[33]：制备方法同母种培养基，去掉琼脂粉。
山药培养基：参考李慧星等[31]的方法制备山药培养基，以新鲜山药洗净、去皮，切成2～3 mm左右颗粒，40 ℃左右烘干至水分含量为10%左右。称取60 g左右的烘干山药颗粒，加入60 mL双蒸水，浸润2～3 h后，灭菌（121 ℃、0.12 MPa、30 min）备用。
1.2.2 样品的制备
花脸香蘑液体菌种的制备[33]：将经过分子鉴定后保存在冰箱中的花脸香蘑母种置于20 ℃左右的培养箱中，活化24 h，随后接种到斜面培养基上，25 ℃左右培养至菌丝体长满斜面后，接种于液体培养基上，静置24 h后，置于恒温摇床上，25 ℃、150 r/min培养5～6 d。
花脸香蘑山药菌质的制备[31]：无菌状态下，吸取培养好的花脸香蘑液体菌丝球3 mL，均匀接种于灭菌冷却后的山药培养基上，黑暗状态下，25 ℃、培养至发满菌后，打开光源（800～1000 lux），转色培养6～7 d，至菌质整体呈现淡紫色。
花脸香蘑山药菌质粉的制备：取出转色完成后的花脸香蘑山药菌质，40 ℃左右烘干，粉碎后过100目筛，置于密封袋中，于冰箱中保存备用。
1.2.3 菌质的FTIR测定
参考李慧星等[31]的方法进行FTIR测定，取1 mg样品在60 ℃干燥至恒重，过100目筛后，与100 mg溴化钾粉末混合均匀，以用溴化钾压片法制备样品，在波数4000～400 cm−1范围内扫描分析，4 cm−1分辨率，叠加扫描16次。
1.2.4 花脸香蘑山药菌质饮料的制备工艺
花脸香蘑山药菌质粉→浸提→调配→均质→灭菌→灌装→质量检验
操作要点：
花脸香蘑山药菌质浸提液的制备：按照菌质:水1:15（g/mL）的比例，80 ℃浸提3 h，减压过滤，取滤液，滤渣加入等体积的水再浸提3 h后过滤，合并两次滤液得菌质浸提液。
调配：用不同的花脸香蘑山药菌质添加量、不同配比的木糖醇、柠檬酸和CMC-Na调配该饮料的风味，通过单因素实验、响应面试验，借助感官评价标准确定该饮料的最佳配方。
均质、灭菌、灌装：参考陈战永和王思浦等[34-35]的方法。
1.2.5 花脸香蘑山药菌质饮料配方工艺优化
1.2.5.1 单因素实验
以花脸香蘑山药菌质添加量3%、木糖醇添加量3%、柠檬酸添加量0.7%、CMC-Na添加量0.3%为固定调配参数，以感官评分为指标，进行单因素实验，考察花脸香蘑山药菌质（1%、2%、3%、4%、5%）、木糖醇（1%、2%、3%、4%、5%）、柠檬酸（0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%）、CMC-Na（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）添加量对花脸香蘑山药菌质饮料感官品质的影响。每一种配方做三次感官评定，取平均值，保留小数点后一位。
1.2.5.2 响应面试验
在单因素实验的基础上，以花脸香蘑山药菌质添加量（A）、木糖醇添加量（B）、柠檬酸添加量（C）、CMC-Na添加量（D）为自变量，以感官评分为响应值，借助Design Expert 8.06软件进行Box-Behnken实验设计，设计4因素3水平响应面试验，具体因素和水平见表1所示。
表 1 响应面优化试验因素水平Table 1. Factors and levels of response surface optimization test水平 A（%） B（%） C（%） D（%） −1 2 3 0.5 0.1 0 3 4 0.7 0.2 1 4 5 0.9 0.3 1.2.6 饮料相关质量指标检测
1.2.6.1 感官指标
按照药用菌饮料的感官评价标准[36]，邀请10名食品专业人员（男女比例为6:4）按照表2中的评分标准，逐项对调配后的饮料进行感官质量综合评分。
表 2 花脸香蘑山药菌质饮料感官评价标准Table 2. Sensory evaluation standard of Lepista sordida yam fungi substance beverage指标 等级 评价标准 分数（分） 色泽（20分） 一级 呈亮褐色，色泽均匀，有光泽 15～20 二级 色泽较深或者较浅，较为均匀，有光泽 8～14 三级 色泽很深或者很浅，不均匀，无光泽 0～7 组织状态（20分） 一级 清澈，无沉淀，无杂质 15～20 二级 较为清澈，少量沉淀和杂质 8～14 三级 浑浊，有大量杂质 0～7 香气（30分） 一级 有菌质特有香味，香气明显 21～30 二级 有菌质特有香味，香气不明显 11～20 三级 有异味 0～10 风味（30分） 一级 酸甜可口，风味协调 21～30 二级 酸甜适中，风味不协调 11～20 三级 太酸或者太甜，异味明显 0～10 1.2.6.2 微生物指标
参照GB/T 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物检验 大肠杆菌计数》检测该花脸香蘑山药菌质饮料中总大肠杆菌菌数[37]。参照GB/T 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物检验 菌落总数测定》检验该菌质饮料中的菌落总数[38]。
1.2.6.3 功能性成分检测
利用分光光度法对花脸香蘑山药菌质饮料中的总黄酮和总酚的含量进行测定。
总黄酮含量的测定参考郭欣慰等[39]的方法，称取芦丁标品11.2 mg，加入60%的乙醇溶解，定容到100 mL，分别配制成不同浓度梯度的芦丁标准溶液，加入显色反应试剂后，在510 nm波长下测定吸光度，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线，获得回归方程y=3.8259x+0.0553（R2=0.9982）。取1 mL制备好的饮料于10 mL具塞试管中，按照芦丁标准品的配制方法，于510 nm波长下测定吸光度，重复三次取平均值。将其代入标准曲线方程式中计算出饮料中黄酮浓度（mg/mL），最后换算成mg/L。
总酚含量的测定参考林倩等[40]的方法，准确称取10 mg没食子酸标品，加水定容至100 mL，分别配制成不同浓度梯度带的没食子酸标准溶液，分别加入福林酚反应相关试剂，在720 nm波长下测定吸光度，以没食子酸浓度（mg/L）为横坐标，吸光度为纵坐标，建立标准曲线，获得回归方程y=0.0964x−0.0176（R2=0.9958）。取1 mL制备好的饮料于10 mL具塞试管中，按照没食子酸标准品的配制方法，于720 nm波长下测定吸光度，重复测定3次，取平均值。将其代入标准曲线方程式中计算出饮料中总酚浓度（mg/L）。
1.2.7 饮料抗氧化活性检测
DPPH自由基清除率测定方法见参考文献[41]，用梯度稀释法将饮料样品液和阳性对照样品VC分别配制质量浓度梯度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 、10.0 mg/mL的待测样品，取样品液2 mL于试管中，加入2 mL（0.2 mmol/L）DPPH 乙醇溶液，混匀，在25 ℃水浴锅中反应20 min，以无水乙醇为空白对照，517 nm处测定吸光度值记为A1；用无水乙醇代替样品液，在517 nm处测定吸光度值记为A0；用无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，在517 nm处测定吸光度值记为A2。重复测定3次，取平均值，DPPH自由基清除率计算公式如下：
DPPH自由基清除率(%)=(A0−(A1−A2))/A0×100 羟自由基清除率测定方法见参考文献[42]，将饮料样品液和阳性对照样品VC分别配制不同质量浓度梯度的待测样品，取样品液2 mL于试管中，分别加入6 mmol/L H2O2溶液和6 mmol/L FeSO4溶液各2 mL，摇匀后静置10 min，再加入6 mmol/L水杨酸溶液2 mL，摇匀后再37 ℃水浴锅中保温1 h，以蒸馏水为空白对照，于510 nm处测定吸光度值记为A1，用蒸馏水代替样品液，在510 nm处测定吸光度值记为A0，用蒸馏水代替水杨酸溶液，在510 nm处测定吸光度值记为A2。重复测定3次，取平均值，羟自由基清除率计算公式如下：
羟自由基清除率(%)=(A0−(A1−A2))/A0×100 1.3 数据处理
本试验设3次重复，数据以平均值±标准差表示；数据采用Excel 2007、Design-Expert 8.06进行数据处理和作图；采用SPSS 26进行显著性分析，以P<0.05为显著性的检验标准。
2. 结果与分析
2.1 菌质和山药的FTIR分析结果
由图1可知，菌质和山药的峰图比较相似，说明经过花脸香蘑转化后的菌质主要成分依然是山药，花脸香蘑生物转化过程中山药没有腐败变质，这对后续以菌质为基础开发饮料具有重要意义。但是，山药和菌质在500~1000 cm−1、1250~2500 cm−1之间有差异。500~1000 cm−1范围的峰主要由多糖、皂苷中的糖苷键振动引起[31]，比较两者的峰图发现，菌质中产生了更多的峰，推测是由于花脸香蘑的转化作用，导致菌质中产生了更多种类的皂苷类物质引起的[43]。1250~1500 cm−1范围的峰主要由C-O键伸缩振动引起，该区域是酚类物质主要吸收区域[44]，比较山药和菌质的相对吸收强度可知，山药经过花脸香蘑的生物转化后合成了更多的酚类物质。1500~2000 cm−1区域的峰主要是由于C=O键伸缩振动引起，该区域是醛类和酮类的特征吸收区域[45]，通过比较该区域山药和菌质的相对吸收强度发现，经过花脸香蘑的生物转化后，产生更多的酮类物质。2000~2500 cm−1区域的峰主要是由C≡N键伸缩振动引起，该区域是腈类物质特征吸收区域[46]，通过比较峰图发现，山药在该区域有特征峰，而菌质没有，说明经过花脸香蘑的生物转化，山药本身含有的腈类物质被转化。通过对菌质和山药的FTIR分析发现，经过花脸香蘑转化后的菌质，除了保留了山药中的基本成分外，还产生了更多功能性成分如皂苷类、黄酮类和酚类物质。因此，以菌质为主要原料开发的饮料将具有较好的保健功效。
2.2 单因素实验结果
2.2.1 菌质添加量对饮料感官品质的影响
由图2可知，随着花脸香蘑山药菌质添加量的增加，饮料的感官得分先逐渐上升，分析原因是在一定的浓度范围内，随着菌质浓度的增加，对饮料的色香味方面产生了积极的影响，导致感官评分上升。当菌质添加量达到3%时，饮料的感官评分达到最大值83.6分。随着菌质添加量的继续增加，饮料的感官评分逐渐降低，分析原因可能是过量的菌质对饮料的澄清度和色泽产生了不利的影响，导致饮料感官评分的下降[47]。因此，在后续的响应面优化实验中菌质添加量选择3%为宜。
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2.2.2 木糖醇添加量对饮料感官品质的影响
由图3可知，随着木糖醇添加量的增加，饮料的感官评分先逐渐上升，分析可能是随着木糖醇浓度增加，饮料甜味口感越来越明显，导致其感官评分上升，当木糖醇添加量达到4%时，饮料的感官评分达到最大值83.8分。随着添加量的继续增加，饮料的感官评分逐渐降低，分析可能是由于木糖醇添加量过大，造成饮料过甜，导致整体口感出现酸甜失衡，进而导致感官评分降低。因此，在后续响应面优化试验中木糖醇的添加量选择4%为宜。
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图 3 木糖醇添加量对饮料感官品质的影响Figure 3. Effect of the amount of xylitol added on the sensory quality of beverage2.2.3 柠檬酸添加量对饮料感官品质的影响
由图4可知，随着柠檬酸添加量的增加，饮料的感官评分开始上升，分析原因是随着饮料中酸度的增加，饮料更加地酸甜适口，感官品质更佳，当柠檬酸添加量达到0.7%时，饮料的感官评分达到最大值82.7分。随着柠檬酸添加量的继续增加，饮料的酸味开始逐渐占据主导，饮料的酸碱度也开始发生变化，对饮料的整体口感造成了影响，导致饮料的感官评分开始下降。因此，在后续的响应面优化试验中，柠檬酸添加量选择0.7%为宜。
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图 4 柠檬酸添加量对饮料感官品质的影响Figure 4. Effect of the amount of citric acid added on the sensory quality of beverage2.2.4 CMC-Na添加量对饮料感官品质的影响
由图5可知，随着CMC-Na添加量的增加，饮料的感官评分开始上升，分析原因是饮料的澄清度随着CMC-Na添加量的增加而提高，当CMC-Na添加量达到0.2%时，饮料的感官评分达到最大值85.1分。随着CMC-Na添加量的继续增加，饮料的感官评分开始逐渐下降，分析原因是CMC-Na添加量过多，直接影响了饮料的组织状态和色泽，间接影响了饮料的香气和风味，导致饮料感官评分降低明显。因此，在后续的响应面优化试验中，CMC-Na添加量选择0.2%为宜。
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图 5 CMC-Na添加量对饮料感官品质的影响Figure 5. Effect of the amount of CMC-Na added on the sensory quality of beverage2.3 响应面试验结果
根据单因素实验结果，采用响应面法对花脸香蘑山药菌质添加量（A）、木糖醇添加量（B）、柠檬酸添加量（C）、CMC-Na添加量（D）进行响应面优化试验，建立4因素3水平试验设计方案，响应值设置为感官评分，具体见表3。
表 3 响应面分析方案及试验结果Table 3. Response surface design arrangement and corresponding experimental result试验号 A 菌质
添加量B 木糖醇
添加量C 柠檬酸
添加量D CMC-Na
添加量感官评分（分） 1 −1 0 1 0 84.3 2 −1 1 0 0 85.7 3 −1 −1 0 0 76.4 4 1 0 −1 0 80.5 5 0 0 −1 1 78.2 6 −1 0 −1 0 77.8 7 1 1 0 0 86.2 8 0 0 1 −1 77.8 9 1 0 0 −1 80.8 10 0 1 1 0 84.8 11 −1 0 0 −1 79.4 12 0 1 0 1 85.5 13 0 0 −1 −1 78.3 14 0 −1 0 1 79.4 15 0 0 1 1 86.4 16 0 1 −1 0 78.2 17 1 −1 0 0 85.3 18 0 −1 0 −1 74.6 19 1 0 1 0 84.5 20 1 0 0 1 85.2 21 −1 0 0 1 81.4 22 0 0 0 0 88.2 23 0 0 0 0 88.5 24 0 −1 1 0 76.9 25 0 0 0 0 88.3 26 0 0 0 0 89.8 27 0 0 0 0 89.2 28 0 1 0 −1 79.5 29 0 −1 −1 0 76.3 运用Design-Expert 8.06软件对表3中的试验结果进行多元回归拟合，建立二次多项式回归模型。获得不同因素对饮料感官评分的回归方程：Y=88.80+1.46A+2.58B+2.12C+2.14D−2.10AB−0.63AC+0.60AD+1.50BC+0.30BD+2.18CD−1.94A2−4.27B2−4.88C2−4.56D2。对回归模型进行方差分析，结果见表4。
表 4 方差分析Table 4. Variance analysis来源 偏差
平方和自由度 均分
平方和F值 P值 显著性 模型 559.78 14 39.38 27.98 <0.0001 ** A 菌质添加量 22.52 1 25.52 17.86 0.0008 ** B 木糖醇添加量 88.08 1 88.08 56.05 <0.0001 ** C 柠檬酸添加量 53.76 1 53.76 37.63 <0.0001 ** D CMC-Na添加量 55.04 1 55.04 38.52 <0.0001 ** AB 17.64 1 17.64 12.35 0.0034 ** AC 1.56 1 1.56 1.09 0.3134 AD 1.44 1 1.44 1.01 0.3325 BC 9.00 1 9.00 6.30 0.0250 * BD 0.36 1 0.36 0.25 0.6235 CD 18.92 1 18.92 13.24 0.0027 ** A2 24.35 1 24.35 17.04 0.0010 ** B2 118.54 1 118.54 82.96 <0.0001 ** C2 154.16 1 154.16 107.89 <0.0001 ** D2 135.03 1 135.03 94.50 <0.0001 ** 残差 20.00 14 1.43 失拟项 18.14 10 1.81 3.90 0.1007 不显著 纯误差 1.86 4 0.47 总和 579.75 28 注：“*”表示差异显著（0.01<P<0.05）；“**”表示差异极显著（P<0.01）。 由表4可知，回归模型显著，失拟项不显著，说明建立的回归模型相对比较可靠。模型的决定系数R2=0.9655, 校正决定系数为R2adj=0.9310，变异系数为（coefficient of variation, CV）=1.45%，这说明该模型能够解释93.10%响应值的变化。分析各因素显著性可知，设置的4个因素都对饮料的感官品质具有极显著（P<0.01）的影响，根据表4中方差分析的结果可知，对饮料感官评分影响大小的因素依次是木糖醇添加量>CMC-Na添加量>柠檬酸添加量>花脸香蘑山药菌质添加量。同时，交互项BC对饮料的感官评分影响显著（P<0.05），交互项AB、CD对饮料感官评分影响极显著（P<0.01），具体见图6。二次项A2、B2、C2、D2对饮料的感官评分影响都极显著（P<0.01）。通过响应面分析得知，饮料的最佳配方为花脸香蘑山药菌质4.00%、木糖醇添加量4.11%、柠檬酸添加量0.75%、CMC-Na添加量0.24%，在该条件下，获得的饮料感官评分理论最大值为89.0352。
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图 6 各因素交互作用对饮料感官评分影响显著的响应面图Figure 6. Response surface diagram showing the significant effect of the interaction of various factors on the sensory score of beverages2.4 最佳工艺条件验证试验
按照回归模型最佳配方（花脸香蘑山药菌质添加量4.00%、木糖醇添加量4.11%、柠檬酸添加量0.75%、CMC-Na添加量0.24%），选择同一批评价员与评价方法，做三次重复试验，获得的饮料感官评价平均值为88.7±0.40分，跟预测值（89.0352）相比，误差相对较小，这说明模型的相对拟合度较好，预测相对准确。
2.5 饮料的质量检测结果
2.5.1 饮料的感官评价结果
按照响应面试验获得的最佳配方调配出的花脸香蘑山药菌质饮料，呈亮褐色，有独特的花脸香蘑山药菌质的香味，口感细腻柔和，酸甜协调，透明度较好。
2.5.2 饮料的微生物指标检测结果
按照相关国家标准[37-38]对制备好的饮料进行检测，具体结果见表5，从表中结果可知，该饮料微生物检测指标符合相关国家标准。
表 5 微生物指标检测结果Table 5. Detection results of microbial indexes检测指标 含量 国标限量值 大肠菌群数（CFU/mL） <0.05 1 总菌落数（CFU/mL） ≦10 100 2.5.3 饮料中功能性成分检测结果
经检测，花脸香蘑山药菌质饮料中总黄酮的含量为59.43±0.94 mg/L，总酚的含量为45.77±0.43 mg/L，通过对饮料中功能性成分的含量检测，为饮料的后续开发利用奠定了基础。
2.5.4 饮料的抗氧化检测结果
由图7可知，当饮料浓度在0.25～6 mg/mL时，随着浓度的增加，饮料对DPPH自由基的清除率明显上升，当饮料浓度超过6 mg/mL后，其对DPPH自由基清除率明显放缓，当浓度达到10 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率达到73.46%，说明花脸香蘑山药菌质饮料对DPPH自由基具有一定的清除作用，通过SPSS软件计算得到饮料对DPPH自由基的IC50值为2.92 mg/mL。
由图8中试验结果可知，当饮料浓度在0.25～4 mg/mL时，饮料对羟自由基的清除率随浓度的增加而上升明显，当饮料浓度超过4 mg/mL后，其对羟自由基的清除率明显放缓，当饮料浓度达到10 mg/mL时，饮料对羟自由基的清除率达到79.26%，这说明花脸香蘑山药菌质饮料对羟自由基也具有一定的清除作用，通过SPSS软件计算得到饮料对羟自由基的IC50值为2.28 mg/mL。
通过综合图7和图8中的数据可以看出，花脸香蘑山药菌质饮料具有一定的抗氧化功效，通过比较IC50值大小，表明饮料对羟自由基的清除率要略微高于对DPPH自由基的清除率，这与连俊辉[48]的研究结果具有一定的一致性。
3. 结论
经过试验研究发现，以花脸香蘑为发酵菌，以山药为发酵基质，经过双向固态生物发酵成功获得花脸香蘑山药菌质。经过FTIR检测得知，经过转化的山药，除了保留了山药中的基本成分外，还产生了新的功能性成分。经过单因素实验和响应面试验，确定了花脸香蘑山药菌质饮料的最佳配方为花脸香蘑山药菌质添加量4.00%、木糖醇添加量4.11%、柠檬酸添加量0.75%、CMC-Na添加量0.24%。通过感官评价和微生物指标检测，在该条件下获得的饮料呈亮褐色、酸甜适口，透明度好，微生物指标符合相关标准。饮料中总黄酮的含量为59.43±0.94 mg/L，总酚的含量为45.77±0.43 mg/L，该饮料对DPPH自由基和羟自由基具有一定的清除能力。本研究借助FTIR检测技术对菌质质量进行检测，初步验证了菌质饮料的体外抗氧化功效，对菌质类饮料后续的开发利用具有一定的参考价值。后续，将以功能性成分含量为指标，进一步优化菌质的制备工艺，提高菌质的质量。除此之外，通过模式动物试验进一步验证菌质饮料的潜在保健功效，以期为菌质类饮料的后续开发利用提供参考。
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图 3 木糖醇添加量对饮料感官品质的影响
Figure 3. Effect of the amount of xylitol added on the sensory quality of beverage
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图 4 柠檬酸添加量对饮料感官品质的影响
Figure 4. Effect of the amount of citric acid added on the sensory quality of beverage
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图 5 CMC-Na添加量对饮料感官品质的影响
Figure 5. Effect of the amount of CMC-Na added on the sensory quality of beverage
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图 6 各因素交互作用对饮料感官评分影响显著的响应面图
Figure 6. Response surface diagram showing the significant effect of the interaction of various factors on the sensory score of beverages
表 1 响应面优化试验因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface optimization test
水平 A（%） B（%） C（%） D（%） −1 2 3 0.5 0.1 0 3 4 0.7 0.2 1 4 5 0.9 0.3 
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表 2 花脸香蘑山药菌质饮料感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standard of Lepista sordida yam fungi substance beverage
指标 等级 评价标准 分数（分） 色泽（20分） 一级 呈亮褐色，色泽均匀，有光泽 15～20 二级 色泽较深或者较浅，较为均匀，有光泽 8～14 三级 色泽很深或者很浅，不均匀，无光泽 0～7 组织状态（20分） 一级 清澈，无沉淀，无杂质 15～20 二级 较为清澈，少量沉淀和杂质 8～14 三级 浑浊，有大量杂质 0～7 香气（30分） 一级 有菌质特有香味，香气明显 21～30 二级 有菌质特有香味，香气不明显 11～20 三级 有异味 0～10 风味（30分） 一级 酸甜可口，风味协调 21～30 二级 酸甜适中，风味不协调 11～20 三级 太酸或者太甜，异味明显 0～10
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表 3 响应面分析方案及试验结果
Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental result
试验号 A 菌质
添加量B 木糖醇
添加量C 柠檬酸
添加量D CMC-Na
添加量感官评分（分） 1 −1 0 1 0 84.3 2 −1 1 0 0 85.7 3 −1 −1 0 0 76.4 4 1 0 −1 0 80.5 5 0 0 −1 1 78.2 6 −1 0 −1 0 77.8 7 1 1 0 0 86.2 8 0 0 1 −1 77.8 9 1 0 0 −1 80.8 10 0 1 1 0 84.8 11 −1 0 0 −1 79.4 12 0 1 0 1 85.5 13 0 0 −1 −1 78.3 14 0 −1 0 1 79.4 15 0 0 1 1 86.4 16 0 1 −1 0 78.2 17 1 −1 0 0 85.3 18 0 −1 0 −1 74.6 19 1 0 1 0 84.5 20 1 0 0 1 85.2 21 −1 0 0 1 81.4 22 0 0 0 0 88.2 23 0 0 0 0 88.5 24 0 −1 1 0 76.9 25 0 0 0 0 88.3 26 0 0 0 0 89.8 27 0 0 0 0 89.2 28 0 1 0 −1 79.5 29 0 −1 −1 0 76.3
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表 4 方差分析
Table 4 Variance analysis
来源 偏差
平方和自由度 均分
平方和F值 P值 显著性 模型 559.78 14 39.38 27.98 <0.0001 ** A 菌质添加量 22.52 1 25.52 17.86 0.0008 ** B 木糖醇添加量 88.08 1 88.08 56.05 <0.0001 ** C 柠檬酸添加量 53.76 1 53.76 37.63 <0.0001 ** D CMC-Na添加量 55.04 1 55.04 38.52 <0.0001 ** AB 17.64 1 17.64 12.35 0.0034 ** AC 1.56 1 1.56 1.09 0.3134 AD 1.44 1 1.44 1.01 0.3325 BC 9.00 1 9.00 6.30 0.0250 * BD 0.36 1 0.36 0.25 0.6235 CD 18.92 1 18.92 13.24 0.0027 ** A2 24.35 1 24.35 17.04 0.0010 ** B2 118.54 1 118.54 82.96 <0.0001 ** C2 154.16 1 154.16 107.89 <0.0001 ** D2 135.03 1 135.03 94.50 <0.0001 ** 残差 20.00 14 1.43 失拟项 18.14 10 1.81 3.90 0.1007 不显著 纯误差 1.86 4 0.47 总和 579.75 28 注：“*”表示差异显著（0.01<P<0.05）；“**”表示差异极显著（P<0.01）。
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表 5 微生物指标检测结果
Table 5 Detection results of microbial indexes
检测指标 含量 国标限量值 大肠菌群数（CFU/mL） <0.05 1 总菌落数（CFU/mL） ≦10 100
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百度学术
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