Research Progress of Beef Adulteration Identification Technology
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摘要: 牛肉因其营养价值高而成为消费者饮食中重要的组成之一，近年来，牛肉掺假的问题纷至沓来。随着分析技术的不断发展，鉴别牛肉掺假的质谱、酶联免疫、基因、传感器、光谱等技术也得到发展。质谱技术准确性高，适用于鉴别经过深加工后的牛肉或物种相近的牛肉，但设备昂贵；酶联免疫吸附技术成本低、特异性强，适用于鉴别肉类种类来源，但鉴别相近物种时结果易发生假阳性；基因技术中基因芯片技术检测速度快可大规模地检测牛肉样品，但存在芯片标准化等问题；传感器技术操作简单适用于牛肉品种判别但准确度低需与其他技术相结合提高其准确度；光谱技术检测快速，但需要复杂的数据作为支撑。综上，本文分析了目前牛肉掺假鉴别技术的原理及优缺点，旨在为牛肉掺假鉴别技术的发展提供参考。
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关键词:
- 牛肉 /
- 掺假 /
- 质谱技术 /
- 酶联免疫吸附(ELISA) /
- 光谱技术
Abstract: Beef has become one of the important components of consumers' diets due to its high nutritional value. In recent years, the problem of beef adulteration has been coming. With the development of analytical techniques, mass spectrometry, enzyme-linked immunoassay, genetic, sensor and spectroscopic techniques has been used to identify adulterated beef. Mass spectrometry has highly accurate and is used to identify beef after deep processing or similar species beef, but the equipment is expensive. Enzyme-linked immunosorbent assays has low cost and high specific and are used to identify the meat species, however, the results are prone to false positive when identifying similar species. Gene chip technology can be used to test beef samples fast and large-scale, but there has problems with standardization of gene chip. Sensor technology has been used to beef identification, and needs to be combined with other technologies because the detection precision is low. The spectroscopy technique is fast to detect, but requires complex data support. In conclusion, this paper analyzes the principles, advantages and disadvantages of beef adulteration identification technology, which is expected to provide reference for the development of beef adulteration identification technology. -
牛肉的营养价值较高，蛋白质含量在20%左右，高于羊肉和猪肉，且脂肪含量较低，在10%左右[1]。其含有丰富的B族维生素、蛋白质、氨基酸以及矿物质[2]，具有有效提高机体抗病能力、增强记忆力、促进碳水化合物及脂肪代谢、补气养血等多重功效[3]，是中国居民主要肉类食品原料之一，深受人们的喜爱。2021 年全球牛肉产量为 5777.7 万t，消费量为 5599.4 万t，其中中国牛肉产量为 683.0 万t，消费量为981.0 万t，进口量为300.0 万t [4]，我国已成为牛肉进口大国，消费需求呈上涨趋势，价格也逐渐攀升，不法分子在利益的诱导下，对牛肉进行掺假，导致牛肉出现安全问题。
牛肉食品掺假类型包括：牛肉地理原产地标签不符、出售早期经过冷冻的牛肉[5]；牛肉及其制品中掺入价格低廉的鸡肉、猪肉[6]和老鼠肉[7]；发现销售的牛肉制品与产品标签不符并使用未进行申报的肉类代替牛肉[8]；发现使用粘合肉糜或切片肉制品的粘合剂[9]，严重影响了消费者的健康、破坏了市场秩序、影响社会和谐与安定[10-11]。
化学技术可以根据不同物种肉类间的差异性进行鉴别[12]，但牛肉中掺入肉制品的种类繁多，其理化性质和外观相似，传统鉴别方法已无法满足上述牛肉掺假检测[13]。因此，采用简单、无损、快速、灵敏的鉴别牛肉掺假技术，对保障牛肉食品的安全，维护消费者自身利益有重要意义。
本文综述了国内外掺假牛肉鉴别的质谱技术、酶联免疫试验、基因技术、传感器技术及光谱技术的原理（见图1）、应用进展，并对未来掺假牛肉的鉴别技术提出了展望，旨在为牛肉食品安全检测及掺假鉴别技术的应用前景提供参考。
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图 1 牛肉掺假鉴别技术原理图Figure 1. Schematic diagram of beef adulteration identification technology1. 质谱技术
质谱技术可以对不同物种的肉类、血液中所存在的不同蛋白种类、多肽、氨基酸序列进行特异性检测，检测速度快，准确度高[14]。本文中的质谱技术主要包括液相色谱-串联质谱技术（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和表面解吸常压化学电离（desorption atmospheric pressure chemical ionization，DAPCI）质谱技术（DAPCI-MS）。
1.1 液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）
LC-MS/MS是蛋白质组学与代谢组学相结合的技术[15]，具有高特异性和高灵敏度，主要利用物种特异性多肽鉴别物质掺假[16]，采用三重串联四级杆液质进行定量和定性分析可以避免检出限高、产生假阳性、加工过程中样品易分解等问题[17]，且多肽的稳定性高[18]于脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）链[19]，已应用于经过深加工的肉制品鉴别[20]，为牛肉的掺假鉴别提供新方法。通过图2可看出基于蛋白质组学的物种真实性鉴别流程[21]。
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康超娣等[22]利用LC-MS/MS技术实现了对牛肉制品中牛肉与猪肉、鸡肉的定量分析，构建了基于物种特异性多肽的相对定量方法，线性关系达0.99以上，最低可检测0.5%比例的牛肉、猪肉和鸡肉掺假。Kim等[23]运用了一维凝胶电泳法对牛肉、鸡肉、猪肉、鸭肉的肌浆蛋白和肌原纤维进行分析，发现肌钙蛋白I、烯醇化酶3、L-乳酸脱氢酶和磷酸三糖异构酶是区分哺乳动物和家禽类动物的主要物质，并对部分蛋白质进行LC-MS/MS分析，可以从新鲜牛肉和牛肉混合物中鉴别出牛肉，说明此技术可以进行特异性检测。张颖颖等[24]利用LC-MS/MS技术找到牛肉、鸡肉和猪肉的物种特异性多肽，并对牛肉中掺入的猪肉和鸡肉进行定性和定量分析，成功定量检测出0.5%的掺假牛肉，证明此方法的检测限低、灵敏度较高。张颖颖等[21]利用LC-MS/MS和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术对市售牛肉串真假进行比较，实验结果表明两者检测方法的检测结果一致，均检测出14%的牛肉串掺假，但LC-MS/MS技术准确性较高，实验操作更为简便。烤制、煮沸、烘焙等加工方式会导致肉制品蛋白变性，因此鉴定热稳定性肽具有重要意义。Wang等[25]运用超高效液相色谱-串联三重四级杆飞行时间质谱分析鉴定了猪肉、鸡肉、鸭肉、牛肉、羊肉生肉中的全蛋白和多肽，并结合多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）确认了34 个肽生物标记物，20 个热稳定肽标记物，以高度的特异性和选择性鉴别出熟牛肉。Zhang等[26]通过优化还原、烷基化、消解、纯化步骤将LC-MS/MS的前处理时间缩短至2.5 h，创建了方便、省时的样品制备方法。通过经过此样品制备的LC-MS/MS技术，可以筛选出牛、猪、羊等7种动物的35 种热稳定性肽标记物，鉴别出浓度为1.0%的牛肉掺假。
1.2 表面解吸常压化学电离质谱技术（DAPCI-MS）
DAPCI-MS技术是可以通过电晕放电的形式产生初级试剂离子，作用在待测肉样品中，使肉样品中的待测分子解吸、离子化的一种方法[27]，仪器装置示意图见图3[28]。此方法无需使用解吸溶剂，因此可以达到对样品无污染、无破坏处理的目的，且还具有操作时间短、分析速度快等优点[29]。
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李倩等[30]建立了100 ms的LTQ-XL型线性离子阱质谱仪全谱扫描时间，30~50 ms的碰撞解离时间，以期快速获取牛肉、猪肉、鸭肉、羊肉以及自制假羊肉指纹图谱的DAPCI-MS技术，并通过主成分分析（principal component analysis，PCA）发现五种肉类的指纹图谱之间均存在区别，可以将牛肉和其他肉类进行区分，为后续掺假牛肉鉴别提供新方法和思路。
质谱技术鉴别牛肉掺假，准确度高、不受外界因素干扰，尤其对经过深加工的牛肉制品以及物种相近的品种有独特优势[19]，但仪器成本高、DAPCI-MS技术电离源难以普及、技术人员要求高，不适用于基层检测。
2. 酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附试验（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）技术最早出现于20世纪70年代，具有操作方法简单、适用范围广、成本低等优点[31]，且可以检测复杂混合物。ELISA有两种检测形式，一种简单的检测形式，间接ELISA技术，将抗原固定到固体表面，酶结合抗原后仍保持酶活性和免疫活性，可以通过肉眼看出溶液颜色的变化从而判断免疫反应是否进行[32]，颜色的深浅与待测抗体的量成正比，原理示意图见图4[33]；另外一种检测形式是双抗体夹心ELISA技术，将特异性抗体和固相载体结合形成固相抗体，随后和待检血清中相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后加入酶标记抗体，与免疫复合物中的抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显现颜色，判断抗原含量[12]，原理示意图见图5[33]。可以通过物种的蛋白质定量和定性分析物种特异性抗原[34]鉴别肉类的品种，因此在动物源性食品成分鉴别方面得到了广泛的应用[35]。
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Kang’ethe等[36]运用间接ELISA技术检测出牛肉和马肉的种属特异性抗体，鉴别出牛肉中所掺入的马肉。Dincer等[37]使用间接ELISA技术检测出牛肉等生肉样品中特定的白蛋白，可鉴别牛肉中掺杂5%的猪肉或绵羊肉，但检测经过腌制和烹饪后的肉样时，由于部分蛋白质失活，导致检测信号值降低70%~74%，降低了检测肉类物种来源的能力。因此，对于商业化的试剂盒应制备针对热稳定蛋白的抗体，来实现对经过热加工牛肉制品的掺假检测。Kreuz等[38]利用夹心ELISA技术，将牛的骨钙素（组织特异性靶蛋白）作为识别抗原，对加热到145 ℃的样品进行检测，发现掺入0.1%（W/W）的牛肉时，就可被检测出。
此技术灵敏度高、成本低、能提供定性结果[39]，适用于一般企业进行牛肉鉴别检测，但抗原抗体识别过程中特异性较强，如果蛋白质失活变性，会导致抗原-抗体无法有效识别[40-41]。
3. 基因技术
DNA是物种的主要遗传物质，存在于绝大多数动物的细胞中，其含量和蛋白质相比更为丰富[42]，可以用做物种鉴别方法。
3.1 PCR技术
PCR技术，是在靶基因设计特异性引物，用引物扩增出目的片段的技术[43]，是我国肉骨粉中牛源性成分的出入境检验的标准方法[44]。在鉴别牛肉时，PCR将线粒体DNA作为鉴别时的目标基因[12]，通常一个个体上只存在一个等位基因[45]。
Rajapaksha等[46]以水牛肉线粒体细胞色素b（cytochrome b，cytb）基因为模板，建立了鉴别水牛肉、牛肉及其他肉类的PCR检测方法，发现水牛DNA中有一条242 bp的条带，在指定的反应条件下，水牛肉DNA不与牛肉DNA发生交叉反应，且此技术较为灵敏，可鉴别屠宰10 d、干的或经过热加工的水牛肉。Piknova等[47]采用cytb的线粒体基因序列为导向进行PCR试验，检测出牛肉中掺入的猪肉，检测限为0.05%。侯东军等[48]以cytb基因组为模板，建立了检测牛肉中掺入猪肉的PCR检测方法，成功鉴别出牛肉中所掺入的2%、4%和6%的猪肉。Ulca等[49]利用PCR试剂盒可成功鉴定出生或经过热加工后的牛肉，对于牛肉混合制品最低可检测出低于0.1%的猪肉添加量。吴周林等[50]建立了以牦牛线粒体12S rRNA基因为特异性引物鉴别牦牛肉干的PCR方法，对四川地区所销售的7种牛肉干进行检测，成功检测出牦牛肉干，检出率为100%。但Musto等[51]发现，PCR技术对于经过微波加热的肉类易发生DNA降解，此技术不适用于微波加热后的掺假牛肉鉴别。
3.2 多重PCR技术
多重PCR技术（multiplex polymerase chain reaction，mPCR）将多种引物同时在同一个PCR体系中进行扩增，最终根据有无产物进行相关检测[52]。
李杰等[53]以牛线粒体基因为模板设计特异性引物，建立了快速鉴定牛肉掺假的mPCR方法，检测限为9.8×101 fg/μL，可对市场所销售的牛肉制品进行掺假鉴定。Qin等[54]利用mPCR技术鉴别出牛肉中掺入的羊肉和鸭肉，灵敏度为0.005 ng，并检测出生牛肉和经过热加工处理后的牛肉混合物，检测限为1%。刘婉婉[55]利用mPCR技术，构建了牛及其他物种的8重检测体系，检测限值达到0.05 ng/μL，检测限值较低可用于市场商业掺假牛肉制品的鉴定。Lee 等[56]应用 mPCR 的方法在牦牛 12S rRNA 区域发现特定位点，由于黄牛、水牛和牦牛同属于牛科，很难从基因上将其分别，但利用此技术即使反应物中混合了少量的线粒体DNA，也可将牦牛与黄牛、水牛进行区分，且使用真实肉类样本的特异性达99%。
3.3 PCR-RFLP技术
PCR-限制性片段长度多态性方法（polymerase chain reaction-restrition fragment length polymophism，PCR-RFLP）利用基因组非编码重复序列而设计的品种特异性的杂交探针，对于分析线粒体DNA具有特别的优势[57]。通过使用一对通用引物并且和几种限制性酶进行相应的结合可以更好地鉴别出不同肉类品种[58]。
高琳等[59]建立了线粒体DNA中cytb区段的保守序列为目的基因的PCR-RFLP检测方法，鉴别出生牛肉、生猪肉、生羊肉及其肉制品中牛源性成分，采用扩增子Alu限制性酶切产生的片段差异可区分牛肉和猪肉及其肉制品。Girish等[60]建立了以线粒体12S rRNA基因为目的基因的PCR-RFLP方法鉴别水牛肉和牛肉，成功将水牛肉和牛肉进行区分，但扩增PCR产物数量和目标DNA数量存在差异，此方法在同种属掺假肉样中并不太适用。Kumar等[61]以线粒体cytb为目的基因，采用PCR-RFLP技术，通过Alu1和Taq1限制性内切酶对609 bp PCR扩增子进行限制性内切酶消化，成功鉴别出牛肉和水牛肉。
3.4 实时荧光PCR技术
实时荧光PCR技术（real-time fluorescent quantitative PCR，Real-Time PCR）在不需要借助电泳的条件下可以实现高灵敏度的检测[62-63]，根据荧光模式的不同，分为荧光探针法和荧光染料法，其中应用最多的荧光探针法原理示意图见图6[64]。Real-Time PCR技术已成为我国GB/T 38164-2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》[65]及地方DB15/T 2025-2020《牛和猪源性成分同步检测方法实时荧光PCR法》[34]肉类检测的标准检测方法。
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Dooley等[66]通过实时TaqMan荧光探针PCR检测技术，检测出牛肉、猪肉、羊肉的混合样品，检测灵敏度低于0.1%。Lubis等[67]建立了一种基于ZEMTM探针的新型实时荧光PCR技术，可检测1 pg/μL的猪肉DNA，且理论上可鉴别牛肉中0.001%的猪肉掺假。曾少灵等[68]根据线粒体cytb为基因序列，采用多重实时荧光PCR技术，检测出100%的牛源性成分，适用于牛羊源性成分检测，且检测效率相对于国标提高了3倍，灵敏度提高了10倍。刘睿茜等[69]筛选出当雄高山牦牛的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位点，建立基于SNP位点的多重实时荧光PCR技术，成功在5个不同地区的牦牛肉中鉴别出当雄高山牦牛肉。陈晓宇等[70]运用Real-Time PCR技术对市售的牛肉及其制品进行掺假检测，发现餐饮店样品中掺入非牛肉成分最多，超市产品较少，因此，此技术可为相关基层检测机构提供便利。
3.5 基因芯片技术
基因芯片是指将探针DNA按照特定的顺序固定于玻璃载体，将待测样品的核酸分子经过标记与载体上DNA探针按照碱基配对的原理同时进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，检测信号强度通过数据分析获得分子数量[71]，技术流程示意图见图7[71]。
石丰运[72]将线粒体DNA 16S rRNA基因作为目标基因，设计了4条特异性基因芯片检测探针及2条质控探针，成功鉴别出牛源性成分，灵敏度达10 pg。朱业培等[73]选择线粒体DNA基因和cytb基因作为目标基因，设计了6条鉴别探针，可快速准确地鉴别牛源性成分，灵敏度为0.5 pg。赵睿骁等[74]利用PCR-膜芯片技术，提取纯化黄牛、牦牛、水牛、真犏牛及假犏牛DNA，利用多重PCR技术测试膜芯片的准确度，成功鉴别出牦牛肉和普通牛肉，灵敏度为0.1 ng，膜芯片特异性强无交叉反应。PCR-膜芯片技术可以对多种动物源性成分进行鉴定，检测结果快速且准确[72]，但现阶段部分芯片还处于研发阶段、价格较贵、标准化还没进行统一[71]，对牛肉掺假鉴别有所限制。
基因技术具有较好的灵敏性和特异性，其中基因芯片技术适合大量样品的高通量检测，准确性高、自动化程度高，适合检测机构用于掺假牛肉检测，但基因技术还存在一定的问题，如分析时间长，试验结果重复困难，样品易受DNA污染而发生降解从而干扰检测结果[75]，芯片标准化问题，检测成本高，需要具有牢固知识的专业型人才进行操作[71]，PCR-RFLP技术不能进行定量检测，因此未来应大力开发基因芯片技术，为牛肉掺假鉴别提供快速、简便的检测方法。
4. 传感器技术
传感器技术是将需要检测的肉类样本的特异性成分变成电子设备，可以识别物理和化学的信号，通过信号来鉴别牛肉样品[76]，原理示意图见图8。对于牛肉的掺假鉴别，本文中的传感器技术主要讲述电子鼻技术和电子舌技术。
4.1 电子鼻技术
电子鼻指将生物的嗅觉模式转移到电子设备系统，通过对牛肉所散发的气味进行分析和检测[77]，主要由气敏传感器阵列、信号处理系统和模式识别系统组成[78]。
董福凯等[79]建立了一种利用PEN3型电子鼻鉴别假牛肉卷的方法，结合PCA和线性判别分析（linear discriminantanalysis，LDA）建立识别模型，发现电子鼻反映出假牛肉卷中挥发性物质，从而成功鉴别出假牛肉卷中的猪肉和鸭肉。周秀丽等[80]运用PEN3型便携式电子鼻结合PCA和LDA，可以区分加入不同比例的鸡肉、鸡皮及猪肉的牛胸肉馅，且LDA图中的数据分布呈现出线性规律，效果好于PCA。Han等[81]将PEN3电子鼻、LDA和极限学习机算法（extreme learning machine，ELM）相结合，鉴别出纯牛肉和不同比例猪肉混合所形成的掺假牛肉，ELM识别率优于LDA，达91.27%。在此基础上建立了反向传播神经网络（back propagation-artificial neural network，BP-ANN）模型预测牛肉中混合猪肉的含量，所建模型的相关系数为0.85。贾洪峰等[82]建立了一种FOX4000电子鼻鉴别牦牛肉和牛肉的方法，采用PCA、判别因子分析（discriminant factor analysis，DFA）、偏最小二乘分析（partial least squares，PLS）方法建立识别模型，对数据进行分析，发现利用此模型可以鉴别不同部位的牦牛肉和牛肉。许文娟等[83]利用PEN3型电子鼻结合PCA方法，发现不同掺假比例的牛肉在传感器上响应规律不同，成功鉴别出牛肉中掺入5%~80%的猪肉。
4.2 电子舌技术
电子舌和电子鼻相似，通过模仿哺乳动物的味觉反应相关信息。主要由进样器、味敏传感器阵列、信号处理仪器以及模式识别仪器组成[84]。
黄珏等[85]建立了一种α-ASTREE系统的电子舌对进口牛肉进行分析的方法，发现在酸味（SRS）、咸味（STS）、甜味（SWS）和复合味（GPS 2）传感器上存在区别，通过近红外光谱处理后的数据进行PCA和典则判别分析（canonical discriminant analysis，CDA），可以对不同产地的牛肉进行区分，区分率为100%，有利于对我国进口牛肉的质量安全进行检测。Zhang等[86]利用TS-5000Z电子舌结合PCA分析方法，测定不同样品中的粗蛋白、脂肪等化学组成及酸味、咸味等风味组成，可以快速鉴别出和牛、安格斯牛和西门塔尔牛。
传感器技术可以对牛肉进行快速、简单的鉴别[87]，对操作者的要求较低，适合用于大量样品检测，但实验结果的重复性不高、需要大量数据做支撑、若牛肉制品中成分复杂，还需与其他技术相结合从而提高其准确率。
5. 光谱技术
光谱技术是通过分析肉样品在不同的波长下所产生的光谱差异进行掺假鉴别[88]。本文中的光谱技术主要介绍近红外光谱技术、拉曼光谱技术、高光谱成像技术。
5.1 近红外光谱技术（NIR）
近红外光谱技术（near-infrared spectroscopy，NIR）原理是指在波长750~2500 nm之间，波数范围在12000~4000 cm−1之间，存在于可见光和中红外区之间的电磁波，其记录的为分子中单个化学键的基础频率振动中的倍频和合频吸收，主要是含有氢基团X-H（=C、N、O、S）[89]。光谱对不同的物种成分（如水、蛋白质、脂类）具有特异性[88]，结合化学计量学方法从复杂数据中提取特征信息，从而进行定性分析，且检测速度快、样品制备过程简单[90]，因此可以通过此方法鉴别掺假牛肉，近红外采集系统的基本组成见图9[91]。
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白京等[92]建立了NIR结合化学计量学法鉴别不同肥肉占比的解冻牛肉汉堡中掺入猪肉的定性模型及定量模型，结果表明，牛肉汉堡中掺假猪肉试验中偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）适用于定性检测，正确率达100%，偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）算法适用于定量检测。Rady等[93]建立了牛肉沫中掺入植物源性蛋白的可见NIR结合PLSR模型，对牛肉沫真假鉴别准确率达100%，为NIR技术鉴别加工牛肉制品提供方法。冷拓[94]通过NIR技术、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术结合判别分析（discriminant analysis，DA）、PLS和支持向量机回归（support vector machine regression，SVR）化学计量学方法，建立了基于NIR和NMR技术的牛肉掺假模型，成功鉴别出纯牛肉和掺假牛肉，且掺假牛肉的三元体系准确率达90.2%，二元体系鉴别达100%。张丽华等[95]通过NIR、多元散射校正（Multiplicative scatter correction，MSC）、标准正态变量变换（Standard normal variate transformation，SNV）、5点平滑处理和一阶导数（first derivative，1 stder）处理等方法对牛肉中掺入的鸭肉进行预处理后，建立支持向量机（nu-SVM）模型，可成功鉴别出牛里脊肉中掺入的鸭肉，正确判别率达94.00%。通过检测不同动物肌肉中的脂肪和水分含量的红外反射光谱可鉴别不同的牛肉样品[96]。Morsy等[97]建立了一种可见-NIR鉴别新鲜和冷冻牛肉掺假方法，所建PLSR模型鉴别出新鲜牛肉中掺入猪肉。
5.2 拉曼光谱技术
拉曼光谱技术是基于印度物理学家Raman发现的拉曼散射效应[98]，是以分子转动和振动信息为基础，可以用来鉴别不同物种结构的分析方法[99]，具有检测快速、良好的信噪比不重叠、远距离在线分析检测、实时检测和无损检测[91]等优点，产生过程示意图见图10[99]。
Zhao等[100]利用拉曼光谱检测牛肉汉堡中牛肉掺杂内脏，在900~1800 cm−1处产生指纹图谱，利用PCA分析牛肉汉堡中的特殊蛋白质和脂质化学结构有关的特性波长从而鉴别真实和掺假牛肉汉堡样品，并建立PLS-DA和软独立建模分析（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）模型，发现掺假牛肉的判别准确率高于90%。红肉指在烹饪前色泽为红色的肉，主要为牛肉、羊肉等哺乳动物的肉。消费者购买红肉时主要通过色泽等感官评价进行分析，但哺乳动物肉色泽都呈现红色，很难将其区分，因此构建标准化的质量无损检测方法具有重要意义。Robert等[101]使用拉曼光谱仪鉴别牛肉、鹿肉和羊肉，并建立PLS-DA和SVM模型结合PCA进行分析，发现线性和非线性SVM模型灵敏度分别达到87%和90%以上，特异性在88%以上，PLS-DA法准确率大于80%，为鉴别红肉提供新方法。Biasio等[102]运用显微拉曼光谱技术结合PCA、LDA分析，可以有效地鉴别出牛肉、羊肉、马肉。Zając等[103]利用傅里叶变换拉曼光谱技术依据氨基酸特征光谱之间良好拟合性鉴别牛肉中掺入不同含量的马肉，在480、829、856、879和937 cm−1氨基酸谱带鉴别出牛肉中掺入的马肉。Boyacı等[104]利用拉曼光谱技术结合PCA建立了一种快速鉴别牛肉中掺入马肉的模型，在波数为200～2000 cm−1区分牛肉和马肉纯脂肪，并对49份牛肉和马肉样品进行来源分析，利用模型30 s鉴别出牛肉中掺入不同含量的马肉。
5.3 高光谱成像技术（HSI）
高光谱成像技术（hyperspectral imaging，HSI）是将光谱和成像技术相结合所得到的一种新型技术，可以同时取得所测样品的光谱信息和图像[105]，包括外部属性（如样品形状和大小）和内部属性（如化学组成）[106]，高光谱成像技术系统示意图见图11[91]。此方法具有快速检测、样品前处理简单、成本较低、应用广[107]、无损检测[108]等优点。
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Kamruzzaman等[109]利用波长在400~1000 nm的近红外高光谱成像技术建立PLSR模型，通过图像处理技术可以定量、可视化地鉴别出碎牛肉中掺入的鸡肉。Ropodi等[110]通过多光谱成像结合数据分析的方法，鉴别出牛肉中掺假的马肉，判别正确率达90%。Liu等[111]利用波长为405~970 nm的多谱线成像技术建立PLSR预测模型，将预测方程转化为可直观看到的水分分布图，由此鉴别出注水牛肉。王彩霞等[112]利用可见/近红外高光谱成像技术结合全波段和运用竞争性自适应重加权算法（competitive adaptive reweighted sampling，CARS）、连续投影算法（successive projections algorithm，SPA）和无信息变量消除算法（uninformative variable elimination，UVE）得到的特征波长进行PLS-DA、K最近邻法（k-nearest neighbor，KNN）和径向基函数（radial basis function，RBF）-支持向量机（RBF-SVM）分析，最终得到14 个特征波长，其中基于CARS法提取的特征波长所建立的RBF-SVM模型校正集正确率达100%，可以对荷斯坦奶牛、秦川牛和西门塔尔牛的品种进行无损鉴别。
光谱技术虽然能快速、无损地鉴别掺假牛肉样品，但是需要结合准确的数据模型为依托，耗费大量资金；模型的稳定性也容易受到外界环境和仪器因素的影响[113]。
6. 牛肉掺假鉴别技术对比分析
质谱技术、酶联免疫吸附试验、基因技术、传感器技术及光谱技术在牛肉食品中的应用广泛，但均各有两面性（表1），因此根据不同样品选择合适的鉴别技术尤为重要。
表 1 牛肉掺假鉴别技术优缺点及应用Table 1. Advantages and disadvantages of beef adulteration identification technology and its application检测技术 优点 缺点 应用 表面解吸常压化学电离质谱 无需前处理、检测快速、无化学污染 电离源难获取 鉴别肉类样品[27] 液相色谱-质谱联用 操作简单、准确性高、多肽稳定性强 设备昂贵、数据分析复杂、需要高水平人员 鉴别深加工肉制品[114] 酶联免疫吸附 灵敏度高、特异性强、成本低 蛋白质易发生变性，相近物种易产生假阳性 肉类种类来源鉴定[115] PCR 灵敏度高、特异性强 操作繁琐、微波加热肉制品容易造成DNA降解 加工肉品和产品的鉴别[116] 多重PCR 高灵敏度、特异性强、可同时分析多种样品 对样品DNA的纯度要求较高 熟肉和加工肉类[12] PCR-RFLP 灵敏度高、特异性强 分析时间长、定量检测有限制 品种鉴定[71] 实时荧光PCR 灵敏度高、特异性强、可定量分析 专业的操作人员 新鲜肉样品、肉加工品[116]及熟肉鉴定[12] 基因芯片 操作简单、检测速度快、大规模分析检测样品 部分芯片仍在研发、成本高、芯片标准化 鉴别肉类种属[73] 电子鼻 检测快速、简单、操作要求低 重复性低、需要与其他方法结合提高其准确度 肉制品产地判别、品种判别[117] 电子舌 近红外光谱 检测快速、非接触式 复杂的数据作为支撑、模型的稳定性易受外界因素干扰 肉中掺伪比例、来源[78] 拉曼光谱 小样品量、非接触的、检测快速 有潜力根据肌原纤维和结缔组织蛋白
确定肉类和肉制品的游离锌[8]高光谱成像 前处理简单、无损、成本低 鉴别牛肉品种[112] 7. 结论与展望
由于牛肉掺假的复杂性，产地来源的多变性以及可掺入种类的多样性，使牛肉的掺假鉴别具有一定挑战性。当前鉴别牛肉掺假技术具有双面性，基于蛋白质组学的质谱技术具有高灵敏度和准确度，适用于鉴别经过深加工后的掺假牛肉，但仪器价格高，电离源难以普及。当检测机构需要进行现场检测牛源性成分时，基于特异性抗原的ELISA技术更合适，但其蛋白质易发生变性，导致抗原-抗体无法有效识别，影响检测结果。由于每个物种都具有独特的DNA序列，因此基于DNA的基因技术具有高特异性和敏感性，适合鉴别新鲜或经过深加工的掺假牛肉，但常规PCR技术鉴别经过微波或加工后的牛肉，可能会发生样品降解，从而改变PCR扩增的结果。基因芯片技术检测速度快、可大规模地分析检测样品。与其他检测技术相比，基于气味和味觉的传感器技术可快速、低成本检测，适合判别牛肉品种和产地，但电子舌技术检测准确度较低。基于不同波长的光谱技术，可对牛肉样品进行无损检测，适合鉴别牛肉来源和掺假比例，但需要有准确的数据模型做支撑且模型通用性不强，数据稳定性易受外界环境影响。
综上所述，鉴别基于蛋白质、特异性抗原、DNA的质谱、ELISA和基因技术经过高温加工后的牛肉及其制品或区分类似物种如牦牛和黄牛时，识别标记物尤为重要，直接决定了方法的准确性，对此未来可选用具有高度物种特异性的N-糖基化作为标记物，可将此标记物应用到基因芯片中，为牛肉的掺假鉴别提供快速、高特异性、能区分相似物种的方法；同时还需建立牛肉各产品模型数据库并开发有效算法，便于快速在线分析，高效提取有效数据，优化传感器和光谱处理技术；并通过优化各技术条件，研发小型、快速、准确的鉴别牛肉掺假技术和便携设备，是食品安全检测领域的共同追求。
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图 1 牛肉掺假鉴别技术原理图
Figure 1. Schematic diagram of beef adulteration identification technology
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表 1 牛肉掺假鉴别技术优缺点及应用
Table 1 Advantages and disadvantages of beef adulteration identification technology and its application
检测技术 优点 缺点 应用 表面解吸常压化学电离质谱 无需前处理、检测快速、无化学污染 电离源难获取 鉴别肉类样品[27] 液相色谱-质谱联用 操作简单、准确性高、多肽稳定性强 设备昂贵、数据分析复杂、需要高水平人员 鉴别深加工肉制品[114] 酶联免疫吸附 灵敏度高、特异性强、成本低 蛋白质易发生变性，相近物种易产生假阳性 肉类种类来源鉴定[115] PCR 灵敏度高、特异性强 操作繁琐、微波加热肉制品容易造成DNA降解 加工肉品和产品的鉴别[116] 多重PCR 高灵敏度、特异性强、可同时分析多种样品 对样品DNA的纯度要求较高 熟肉和加工肉类[12] PCR-RFLP 灵敏度高、特异性强 分析时间长、定量检测有限制 品种鉴定[71] 实时荧光PCR 灵敏度高、特异性强、可定量分析 专业的操作人员 新鲜肉样品、肉加工品[116]及熟肉鉴定[12] 基因芯片 操作简单、检测速度快、大规模分析检测样品 部分芯片仍在研发、成本高、芯片标准化 鉴别肉类种属[73] 电子鼻 检测快速、简单、操作要求低 重复性低、需要与其他方法结合提高其准确度 肉制品产地判别、品种判别[117] 电子舌 近红外光谱 检测快速、非接触式 复杂的数据作为支撑、模型的稳定性易受外界因素干扰 肉中掺伪比例、来源[78] 拉曼光谱 小样品量、非接触的、检测快速 有潜力根据肌原纤维和结缔组织蛋白
确定肉类和肉制品的游离锌[8]高光谱成像 前处理简单、无损、成本低 鉴别牛肉品种[112] 
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