Sulfonic Acid-based Covalent Organic Framework for the Rapid Determination Towards Fluoroquinolone Antibiotic Residues in Milk
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摘要: 为了拓展基于新型纳米材料的固相萃取技术在复杂食品基质中的应用，本文制备了磺酸基共价有机框架材料（TpPa-SO3H），将其作为固相萃取吸附剂，结合高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）用于牛奶中3种氟喹诺酮类（fluoroquinolones，FQs）抗生素的快速分析。通过机械研磨法快速制备磺酸基共价有机框架TpPa-SO3H，探究其作为新型高效固相萃取吸附剂在FQs抗生素检测方面的优势。通过系统研究吸附剂用量、样品溶液pH、吸附时间和解吸条件等因素，探究材料结构性能对固相萃取效率的影响以及方法重现性和定量分析能力。结果表明：TpPa-SO3H具有超大的比表面积和丰富的磺酸基功能位点，能够与FQs抗生素实现高效且选择性结合，通过优化，吸附时间为4.0 min时，萃取回收率为94.23%～98.68%，结果显著优于国家标准方法。基于TpPa-SO3H建立了固相萃取-HPLC快速分析牛奶中FQs抗生素的新方法，方法具有灵敏度高、抗干扰能力强、重复性好、简单、快速的优点，3种FQs抗生素的检出限为0.002～0.004 mg/kg，表明方法可用于实际样品中超痕量FQs抗生素的检测。综上所述，基于TpPa-SO3H构建的固相萃取-高效液相色谱法实现了牛奶中痕量FQs抗生素的快速、高灵敏、高选择性检测，具有重要的研究意义和良好的实际应用价值。Abstract: To expand the application of novel nanomaterial based solid phase extraction technology in complex food matrices, a sulfonic acid based covalent organic framework (TpPa-SO3H) was prepared as solid phase extraction adsorbents for the rapid analysis of three fluoroquinolones (FQs) antibiotics in milk by using high performance liquid chromatography (HPLC). TpPa-SO3H was rapidly prepared by mechanical grinding, and its merits as novel solid phase adsorbents with high efficiency were fully explored in the detection towards FQs antibiotics. The effect of adsorbent dosage, pH of sample solution, adsorption time and desorption conditions were investigated to determine the effect of nanomaterial structure and properties on the solid phase extraction efficiency and the reproducibility with quantitative analysis capacity of this method. The results showed that TpPa-SO3H possessed large specific surface area and abundant sulfonic acid functional sites, which could combine with FQs antibiotics efficiently and selectively. Under optimal operation conditions, the extraction recovery of three FQs antibiotic were in the range of 94.23%～98.68% within 4.0 min, which was significantly better than the national standard method. Thus a new high performance liquid chromatography (HPLC) method for the rapid analysis of FQs antibiotics in milk was established based on TpPa-SO3H solid phase extraction, and the method owned the advantages of high sensitivity, excellent anti-interference ability, good repeatability, simplicity and rapidity. The detection limit of the three FQs antibiotics were in the range of 0.002～0.004 mg/kg, indicating that the method could be used for the detection of ultra-trace FQs antibiotics in real samples. In conclusion, the solid phase extraction combined with HPLC based on TpPa-SO3H has realized the rapid detection of trace FQs antibiotics in milk with high sensitivity and selectivity, which indicating its great potential in scientific research and practical application.
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喹诺酮类（fluoroquinolones，FQs）抗生素作为一类人工合成的广谱抗菌剂，具有广泛而优异的生物活性，可以有效预防动物疾病并促进其生长，在养殖业中得到了广泛的应用[1]。然而FQs抗生素可以通过在奶牛等动物体内蓄积进而转移至牛奶中，近年来食品安全监测和研究证实，在全国多个省份均出现奶制品中恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星等FQs抗生素超标的情况，奶制品质量安全问题日益突出。长期暴露在低浓度的喹诺酮类抗生素环境中，将破坏人体肠道微生物环境的稳定，造成免疫系统功能降低，直接威胁奶类消费者的身体健康[2-4]。因此建立牛奶中痕量FQs抗生素残留快速高效检测的新方法不仅对识别动物源食品中兽药残留安全风险具有重要价值，同时对有效开展动物源食品安全监测和风险评估也具有重要的意义。
目前，具有灵敏度高、专属性强等优势的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-7]和高效液相色谱质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[8-10]等方法已经成为牛奶中FQs抗生素残留检测的主要方法。然而牛奶中FQs抗生素残留浓度非常低，在ng/kg～μg/kg范围内，且牛奶自身组成成分复杂，通常需要在进行仪器分析之前对样品进行前处理，以去除背景干扰和富集痕量的FQs抗生素。FQs抗生素常用的样品前处理方法包括液液萃取、分散固相萃取和固相萃取等，其中固相萃取（solid phase extraction，SPE）由于具有高萃取回收率、操作简单、分离快速等优点近年来倍受关注，已经成为食品前处理技术研究的热点[11-15]。固相萃取的核心是具有优异性能的吸附剂，它直接影响固相萃取的萃取效率，然而目前固相萃取吸附剂如无机纳米材料、有机聚合物等材料普遍存在吸附性能低、吸附速度慢和抗干扰能力不足等问题，限制了固相萃取在食品前处理的应用，同时也严重影响了动物源食品中兽药残留快速检测技术的发展[16-17]。
共价有机框架材料（covalent organic frameworks，COFs）是近年来纳米材料与化学领域发现的最具潜力的新型有机晶体材料，具有大比表面积、高孔隙率、规则的孔隙结构、结构可设计和高稳定性等优势，有望成为高性能固相萃取用吸附材料的有力竞争者[18-22]。目前，COFs的合成方法主要有溶剂热合成法[23-24]、界面合成法[25]和机械研磨法[26]等，其中溶剂热合成法作为使用最广泛的合成方法制备合成了多种COFs材料，然而真空、高压的合成条件，微量的合成级别严重限制了COFs材料的实际应用，因此机械研磨法由于具有操作简便、绿色环保、适宜规模化生产等优点，成为COFs工业化最具潜力的合成技术之一。同时，COFs作为固相萃取的吸附剂也表现出优异的富集萃取性能，Xu等[27]制备了一种花状形态的COFs材料TAPA-TFPB-COFs并作为固相萃取吸附剂用于水和肉制品中喹诺酮类抗生素的富集。然而，由于材料缺少有效的功能基团，导致对喹诺酮类抗生素的吸附性能较差，影响了方法的可靠性和灵敏度。Wen等[28]设计合成了磺酸基功能化的COFs复合材料Fe3O4@COF（TpBD）@Au-MPS用于选择性富集肉制品中的喹诺酮类抗生素。虽然通过合成后修饰策略在提高COFs吸附性能方面表现良好，但是反应路线长，反应步骤复杂，吸附剂的制备过程非常繁琐，限制了材料的进一步实际应用。因此，快速简单制备具有明确功能基团的COFs固相萃取吸附剂，提高对喹诺酮类抗生素的吸附性能，仍然是食品中兽药残留快速检测领域的重要研究课题。
本研究针对奶制品安全监测和风险评估中存在的典型喹诺酮类抗生素，采用机械研磨法快速制备了磺酸基共价有机框架纳米材料（TpPa-SO3H）作为固相萃取吸附剂，并结合高效液相色谱法检测牛奶中的恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星等3种FQs抗生素。通过系统探究吸附剂用量、样品溶液pH、吸附时间和解吸条件等影响固相萃取效能的因素，优化确定最佳固相萃取条件，并进一步建立牛奶中痕量FQs抗生素快速、高效的检测方法，为开展牛奶中FQs抗生素残留快速筛查及风险评估提供有力的技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
甲醇中恩诺沙星标准溶液（enrofloxacin，ENR，100 μg/mL）、甲醇中环丙沙星标准溶液（ciprofloxacin，CIP，100 μg/mL）、甲醇中达氟沙星标准溶液（danofloxacin，DAN，100 μg/mL） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；1,3,5-三甲酰间苯三酚（Tp） 郑州阿尔法化工有限公司；2,5-二氨基苯磺酸（Pa-SO3H）、对甲基苯磺酸一水合物、乙醇、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、磷酸、盐酸、氢氧化钠 均为分析纯试剂，国药化学试剂有限公司；牛奶 当地超市和奶牛养殖户；实验用水为Milli-Q系统制备的超纯水 美国Millipore公司。
2695高效液相色谱仪（配备荧光检测器） Waters公司；BT25S电子天平 赛多利斯有限公司；ME204E电子天平 梅特勒-托利多公司；KQ-500DB超声仪 昆山市超声仪器有限公司；DHG-9070A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；TENSOR 27红外光谱仪、D8 Advance A25粉末X射线衍射仪 德国Bruker公司；Hitachi SU8010冷场发射扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；ASAP 2020M比表面积及孔隙度分析仪 美国Micromeritics公司。
1.2 实验方法
1.2.1 TpPa-SO3H的合成
参考报道文献改进制备方法[29]，具体步骤如下：将2.5 mmol（475.5 mg）对甲苯磺酸一水合物放入研钵中，然后添加2,5-二氨基苯磺酸（Pa-SO3H）0.45 mmol（84.7 mg）将反应混合物彻底研磨5 min。然后添加0.3 mmol（63 mg）的1,3,5-三甲酰间苯三酚（Tp）到混合物中继续研磨10 min，直到颜色加深。然后将100 μL（5.5 mmol）水滴加到混合物中继续研磨5 min，混合物的颜色进一步加深。将混合物转移到玻璃小瓶中，在170 ℃加热10 min，得到深红色粉末。将深红色粉末冷却至室温，用水彻底洗去过量的对甲苯磺酸。然后将粉末用N,N-二甲基甲酰胺、乙醇和四氢呋喃洗涤3次，90 ℃减压干燥过夜。
1.2.2 TpPa-SO3H结构表征分析
1.2.2.1 X射线粉末衍射分析
将TpPa-SO3H粉末研细，装入空槽中，用载玻片压平后置于粉末X射线衍射仪（XRD）下进行分析，扫描速度5°/min，扫描范围为2°~40°。
1.2.2.2 红外光谱分析
采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析TpPa-SO3H化学结构组成。通过KBr压片法制备TpPa-SO3H待测样品，光谱扫描范围为400~4000 cm−1，分辨率为2.0 cm−1。
1.2.2.3 扫描电镜分析
将TpPa-SO3H分散在无水乙醇溶液中，滴加在硅片上，干燥后使用Hitachi SU8010冷场发射扫描电子显微镜分析TpPa-SO3H微观结构。分辨率1.3 nm@1.0 kV，1.0 nm@15 kV；加速电压：0.5～30 kV；电子枪：冷阴级场发射电子枪。
1.2.2.4 比表面积分析
将TpPa-SO3H样品在150 ℃真空下脱气12 h，在77 K下测量氮吸附和解吸等温线，使用比表面积（BET）模型评估比表面积。
1.2.3 固相萃取
1.2.3.1 TpPa-SO3H固相萃取步骤
取2 mL聚丙烯管，将多孔聚乙烯筛板装入管底，将10 mg TpPa-SO3H加入聚丙烯管中，通过多次轻敲管壁使填料密实，将另一片多孔聚乙烯筛板装入管中，压实填料使上下表面平齐，制成10 mg/2 mL固相萃取小柱，依次用2 mL甲醇和2 mL水活化，备用。称取牛奶1.00 g于10 mL离心管中，调节pH至7，加4 mL乙腈涡旋混匀，中速振荡5 min，10000 r/min，离心5 min，收集上清液，残渣加4 mL乙腈，重复提取1次，合并上清液，混匀，以2.0 mL/min速度过柱，再用2 mL 0.5 mol/L盐酸溶液作为洗脱液洗脱富集在吸附材料上的FQs抗生素，抽干，收集洗脱液，加0.5 mol/L氢氧化钠溶液调节洗脱液至中性，加乙腈定容至5 mL，经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。
1.2.3.2 TpPa-SO3H固相萃取条件优化
a. 吸附剂用量优化：分别取5、10、15 mg TpPa-SO3H置于2 mL聚丙烯管，制成5 mg/2 mL、10 mg/2 mL、15 mg/2 mL的固相萃取小柱，分别按照1.2.3.1的条件进行样品固相萃取和HPLC分析，计算回收率，作为评价萃取性能的关键参数。
b. 提取液pH优化：称取牛奶1.00 g于10 mL离心管中，用6 mol/L磷酸溶液或6 mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3、5、7、9、11，加乙腈4 mL涡旋混匀，中速振荡5 min，10000 r/min，离心5 min，收集上清液，残渣加乙腈4 mL，重复提取1次，合并上清液，混匀备用，按1.2.3.1测定回收率。
c. 吸附时间优化：调节样品通过固相萃取小柱的速度，以控制吸附时间分别为1、2、3、4和5 min，其余条件按1.2.3.1进行样品固相萃取和HPLC分析，计算回收率。
d. 洗脱溶剂种类选择：按1.2.3.1条件进行样品固相萃取，其中洗脱剂的种类分别更换为乙酸乙酯、乙醇、甲醇、0.5 mol/L盐酸溶液和0.5 mol/L氢氧化钠溶液，计算回收率以选择最佳洗脱溶剂。
e. 洗脱溶剂体积优化：按1.2.3.1条件进行样品固相萃取，其中0.5 mol/L盐酸溶液洗脱剂的体积分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，计算回收率以选择最佳的洗脱溶剂体积。
1.2.3.3 HLB固相萃取柱固相萃取步骤
取HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL），依次用甲醇6 mL和水6 mL活化，备用。称取牛奶1.00 g于10 mL离心管中，调节pH至7，加乙腈4 mL涡旋混匀，中速振荡5 min，10000 r/min，离心5 min，收集上清液，残渣加乙腈4 mL，重复提取1次，合并上清液，混匀，以0.8 mL/min速度过柱，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用6 mL甲醇以0.5 mL/min洗脱并收集滤液，加甲醇定容至10 mL，经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。
1.2.4 混合标准工作溶液制备
精密量取恩诺沙星标准溶液、环丙沙星标准溶液、达氟沙星标准溶液各1 mL，置于100 mL量瓶中，加乙腈至刻度，作为混合标准溶液。分别精密量取混合标准溶液适量，配成含恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星分别为0.005、0.010、0.050、0.100、0.500 mg/L的系列混合标准工作溶液，供HPLC检测。
1.2.5 液相色谱条件
色谱柱：Welch XtimateTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液-乙腈（85+15），等度洗脱；流速1.5 mL/min；检测波长：激发波长280 nm，发射波长450 nm；柱温：30 ℃；进样量为20 μL；采集时间为10 min。
1.2.6 定性定量方法
以相同实验条件下样品溶液检出与标准品溶液相对保留时间一致的色谱峰进行定性。定量方法采用外标法，以溶液浓度为横坐标，对应测得的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，再将样品的峰面积带入标准曲线中计算目标成分的含量。
1.2.7 方法学考察
1.2.7.1 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液（0.05 mg/L）按1.2.5项液相色谱条件，连续进样6次，计算精密度。
1.2.7.2 稳定性试验
取同一提取液，在0、1、2、4、8、12、24 h时分别按照1.2.5项条件进样测定，计算RSD。
1.2.7.3 加样回收率试验
精密称取同批次样品1.00 g，分别加入浓度为0.05 mg/L的标准品溶液0.1、0.2、0.4 mL，按照1.2.3项方法制备供试品溶液，再按照1.2.5项液相色谱条件测定，计算加样回收率和RSD。
1.3 数据处理
通过Waters 2695高效液相色谱仪配套的Empower色谱处理软件完成数据采集处理。结果统计为3次平行测定结果，结果以平均值表示。数据利用SPSS 19.0进行统计分析，使用Origin 8.5软件对数据进行图谱绘制。
2. 结果与分析
2.1 TpPa-SO3H材料表征
2.1.1 晶体分析
COFs材料结晶性直接关系到材料中功能基团的均匀分布，进一步影响吸附剂材料的吸附性能。利用粉末X射线衍射（XRD）分析TpPa-SO3H的晶体结构。如图1所示，TpPa-SO3H在4.8º处出现非常强的衍射峰，该衍射峰对应于晶体的（100）晶面，结果显示机械研磨法快速制备了高结晶度的磺酸基COF材料TpPa-SO3H[30]，其空间结构中具有规则的纳米通道，有利于FQs抗生素的快速传质和结合。
2.1.2 化学结构分析
利用红外光谱（IR）表征材料的化学结构，TpPa-SO3H的红外光谱如图2所示，在1576 cm−1处出现C=C特征吸收峰和在1231 cm−1处新生成C-N键特征吸收峰，表明酮式互变异构体的形成[31]，在1005 cm−1处的吸收峰表明了COF结构中阴离子位点-SO3H的存在。结果表明机械研磨法快速制备了具有稳定的高密度活性位点的磺酸基COF材料。
2.1.3 空间结构分析
材料的空间结构直接关系到多孔材料的吸附性能。利用扫描电镜（SEM）对TpPa-SO3H微观形貌进行表征。如图3所示，TpPa-SO3H表现为随机形状的多孔纳米聚集体。图4显示了TpPa-SO3H材料氮气吸附-解吸等温线，利用Brunauer-Emmett-Teller（BET）模型计算比表面积高达248 m2/g，表明材料具有丰富的纳米孔道结构，高比表面积和均匀分布的磺酸基团提供大量且有效的吸附位点与FQs抗生素快速发生相互作用，提高了对FQs抗生素的亲和力[32]。
2.2 固相萃取条件的优化
2.2.1 TpPa-SO3H的用量
由于TpPa-SO3H具有大比表面积，高密度且均匀分布的磺酸活性位点，可以通过静电吸引和氢键与FQs抗生素的吡嗪环实现有效作用，实现对FQs抗生素的高效吸附。选用5、10、15 mg的TpPa-SO3H，按照1.2.3.1项下的方法制备固相萃取小柱，研究TpPa-SO3H用量对萃取性能的影响。由图5可知，当吸附剂用量达到10 mg时，提取液中ENR、CIP、DAN（10 μg/kg）的回收率为97.3%、96.9%、98.1%，均超过96%。当继续增加达到15 mg，三种FQs抗生素的回收率均超过99%。结果表明，随着吸附剂用量的增大回收率也随之增大。综合考虑萃取性能和成本，本研究选取TpPa-SO3H最佳用量为10 mg。
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图 5 不同TpPa-SO3H用量的3种FQs抗生素回收率Figure 5. Recoveries of three FQs antibiotics with different TpPa-SO3H dosage2.2.2 提取液pH
pH不仅影响目标分子的存在形态，同时影响吸附材料中带电功能基团的电荷密度和类型。在样品提取液pH3～11范围内考察对FQs抗生素的萃取性能。如图6所示，TpPa-SO3H在pH5～9范围内对FQs抗生素回收率超过90%，FQs抗生素的回收率随pH的增加而增加，在pH约为7时，回收率达到最大值。当pH<6.3时，溶液中FQs抗生素主要以阳离子形态存在，当pH超过6.3后，溶液中FQs抗生素主要以两性状态存在[33]。上述结果表明，TpPa-SO3H与FQs抗生素之间的作用主要来自于静电吸引。因此，本研究样品提取液最佳pH为7。
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图 6 不同提取液pH的3种FQs抗生素回收率Figure 6. Recoveries of three FQs antibiotics with different extract pH2.2.3 吸附时间
吸附时间影响FQs抗生素在样品提取液和TpPa-SO3H材料之间的分配，是影响萃取效率的关键指标之一。如图7所示，考察了待吸附样品提取液8 mL，吸附时间为1、2、3、4和5 min时对萃取效率的影响。随着吸附时间的增加，回收率明显提高，当吸附时间达到4 min，回收率超过96%，之后随着时间的继续增加，回收率变化较小。快速的萃取性能表明大比表面积和高密度的功能位点有利于实现FQs抗生素与吸附材料的快速、高效结合。因此，本研究选择4.0 min为最佳吸附时间。
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图 7 不同吸附时间的3种FQs抗生素回收率Figure 7. Recoveries of three FQs antibiotics with different adsorption time2.2.4 洗脱溶剂种类的选择
不同类型溶剂对吸附在TpPa-SO3H材料上的FQs抗生素洗脱能力不同，本研究选择乙酸乙酯、乙醇、甲醇、0.5 mol/L盐酸溶液和0.5 mol/L氢氧化钠溶液等溶剂对洗脱溶剂类型进行考察。5种洗脱溶剂洗脱3种FQs抗生素的能力如图8所示，3种FQs抗生素的回收率分别为乙酸乙酯23.2%~27.1%，乙醇45.7%~50.4%，甲醇54.2%~58.5%，0.5 mol/L盐酸溶液97.6%~99.2%，0.5 mol/L氢氧化钠溶液97.3%~99.1%。结果显示，0.5 mol/L盐酸溶液和0.5 mol/L氢氧化钠溶液对FQs抗生素洗脱能力较强，考虑到希夫碱类COF材料耐酸性更强，因此，本研究选择0.5 mol/L盐酸溶液为最佳洗脱溶剂。
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图 8 不同洗脱溶剂的3种FQs抗生素回收率Figure 8. Recoveries of three FQs antibiotics with different elution solvents2.2.5 洗脱溶剂体积
洗脱液体积对洗脱效率、目标物的富集和避免杂质干扰等具有重要影响。本实验选用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的0.5 mol/L盐酸溶液淋洗，3种FQs抗生素回收率见图9，0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL洗脱液的回收率分别为73.0%~76.0%、83.0%~87.0%、89.4%~92.0%、97.6~99.0%和98.6~99.4%。当洗脱体积达到2.0 mL，回收率均超过97%。继续增加洗脱液体积，回收率变化较小，但是溶液中杂质有增加的趋势。因此，本实验选择2.0 mL为最佳的洗脱体积。
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图 9 不同体积洗脱溶剂的3种FQs抗生素回收率Figure 9. Recoveries of three FQs antibiotics with different volume elution solvents2.3 与商品化材料比较
HLB固相萃取柱以N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物为固定相，是目前FQs抗生素固相萃取最常用的商品化固相萃取柱，如GB/T 21312-2007、GB 31658.17-2021均采用HLB或性能相当的固相萃取柱进行样品净化和FQs抗生素的富集。TpPa-SO3H固相萃取柱（10 mg/2 mL）与HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL）分别按照1.2.3.1和1.2.3.3步骤，使用ENR、CIP、DAN添加浓度为10 μg/kg的牛奶样品进行萃取效果的比较，并以吸附时间、洗脱时间和回收率作为关键指标。如表1所示，TpPa-SO3H固相萃取柱对三种喹诺酮类抗生素的回收率均大于96%，明显优于商品化HLB固相萃取柱的回收率，表明TpPa-SO3H材料对FQs抗生素具有强大的选择性结合能力，同时TpPa-SO3H固相萃取柱吸附与洗脱时间相对于HLB固相萃取柱分别减少了60%和83%，表明TpPa-SO3H固相萃取柱具有更快速的萃取过程，有助于实现牛奶中氟喹诺酮类抗生素的快速检测。此外，TpPa-SO3H材料合成方法简单，与商品化材料相比固相萃取吸附剂用量更少，更有利于材料在牛奶等动物源食品中喹诺酮类抗生素残留快速检测的实际应用。
表 1 TpPa-SO3H与商品化材料的萃取效果比较Table 1. Comparison of extraction effect of TpPa-SO3H and commercialized materials材料 化合物 吸附时间（min） 洗脱时间（min） 回收率（%） TpPa-SO3H ENR 4.0 2.0 96.61 CIP 4.0 2.0 96.78 DAN 4.0 2.0 98.37 HLB ENR 10.0 12.0 85.34 CIP 10.0 12.0 83.81 DAN 10.0 12.0 87.31 2.4 方法学验证
2.4.1 标准工作曲线、线性范围、检出限及定量限
恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星标准溶液浓度分别为0.005、0.010、0.050、0.100、0.500 mg/L，按1.2.5项色谱条件进行测定并绘制标准曲线。结果如表2所示：达氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的质量浓度在0.005～0.500 mg/L范围内与峰面积具有良好的线性关系，3种FQs抗生素的检出限分别为0.003、0.004、0.002 mg/kg（LOD，S/N=3），定量限分别为0.010、0.013、0.007 mg/kg（LOQ，S/N=10），相对GB 29692-2013食品安全国家标准 牛奶中喹诺酮类药物多残留的测定高效液相色谱法（恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星的检出限为0.025 mg/kg；恩诺沙星、环丙沙星的定量限为0.050 mg/kg，达氟沙星的定量限为0.007 mg/kg），3种FQs抗生素的检出限提高了约10倍，恩诺沙星、环丙沙星的定量限提高了约4倍。表明TpPa-SO3H由于具有优异的选择性富集能力，显著提高了方法的灵敏度，该方法可以破解基层食品检测机构及企业由于缺少液相色谱-质谱/质谱联用设备，不能对产品进行有效控制的技术难题。
表 2 3种FQs抗生素的线性参数、检出限和定量限Table 2. Linearity parameters, detection limits and quantitative limits of three FQs antibiotics化合物 线性范围（mg/L） 线性方程 决定系数（R2） 检出限（mg/kg） 定量限（mg/kg） ENR 0.005～0.500 Y=4.719×107X+5.702×104 0.999 0.003 0.010 CIP 0.005～0.500 Y=2.641×107X+3.249×104 0.999 0.004 0.013 DAN 0.005～0.500 Y=2.401×108X+4.518×104 0.999 0.002 0.007 2.4.2 精密度、稳定性与加样回收率
为验证实验的可靠性，对仪器的精密度、稳定性和加样回收率进行进样测定，结果如表3所示，3种喹诺酮类抗生素的精密度RSD为0.32%、0.54%和0.68%，表明方法具有良好的精密度；3种喹诺酮类抗生素的稳定性RSD为0.76%、0.67%和0.84%，表明提取液在24 h内具有良好稳定性；加样样品回收率在94.23%～98.68%之间，表明固相萃取材料TpPa-SO3H对FQs抗生素具有优异的选择性吸附能力，可以有效去除复杂基质的干扰，实现对牛奶中痕量FQs抗生素的选择性富集，进一步表明基于TpPa-SO3H固相萃取的应用有效提高了HPLC方法的灵敏度和抗干扰能力，适用于实际牛奶样品中痕量FQs抗生素的检测，为食品安全风险的早期发现与评估提供了全新的方法。
表 3 3种FQs抗生素的精密度、稳定性和加样回收率（n=6）Table 3. Precision, repeatability and sample recovery of three FQs antibiotics (n=6)化合物 精密度RSD（%） 稳定性RSD（%） 加标质量浓度（μg/kg） 回收率（%） RSD（%） ENR 0.32 0.76 5 94.23 0.45 10 96.57 0.35 20 97.36 0.65 CIP 0.54 0.67 5 94.84 0.64 10 96.72 0.73 20 98.68 0.43 DAN 0.68 0.84 5 95.30 0.39 10 97.86 0.52 20 98.25 0.48 2.5 样品的测定
为了验证上述结果的实用性和普适性，本研究共收集12份牛奶样品，分别包括市面上售卖的牛奶（1～6号，其中1号样品为方法学研究用样品）和养殖户的牛奶（7～12号），按照上述方法进行测定，样品、标准品、加标样品典型HPLC图谱见图10~图12，结果显示12批样品均未检出，说明奶牛养殖户能够合理使用兽药进行疾病预防，牛奶生产企业能够对产品进行有效的质量控制，进一步表明当地市场的牛奶喹诺酮类抗生素兽药残留风险相对较低。
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图 10 FQs抗生素阴性的牛奶样品溶液HPLC色谱图Figure 10. HPLC chromatogram of FQs antibiotic-negative milk sample solution![]()
图 11 3种FQs抗生素的对照溶液HPLC色谱图注：1：环丙沙星；2：达氟沙星；3：恩诺沙星，图12同。Figure 11. HPLC chromatogram of the control solutions of three FQs antibiotics![]()
图 12 3种FQs抗生素加标的牛奶样品溶液HPLC色谱图Figure 12. HPLC chromatogram of milk sample solution spiked with three FQs antibiotics3. 结论
以机械研磨法制备了共价有机框架材料TpPa-SO3H并作为固相萃取吸附剂，对牛奶中恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星进行快速、高效富集，并进一步结合高效液相色谱实现对3种FQs抗生素进行快速、高灵敏分析。TpPa-SO3H具有超大比表面积和高密度的磺酸功能基团，有利于FQs抗生素的快速传质和有效结合，明显提升了固相萃取性能，进一步提升了牛奶中FQs抗生素检测的灵敏度和效率。结果表明TpPa-SO3H材料相对于商业化固相萃取材料能更有效去除复杂干扰基质，快速、高效吸附FQs抗生素，实现了FQs抗生素的快速、灵敏检测。3种FQs抗生素的线性浓度范围为0.005～0.500 mg/L，相关系数均为0.999。检出限为0.002～0.004 mg/kg，实际牛奶样品的加标回收率为94.23%～98.68%，方法检出限低、重复性好，同时具有简单、快速、绿色环保的优势，适用于牛奶中氟喹诺酮类抗生素的快速测定，在缺少高端检测设备的食品生产企业具有良好的应用前景。
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图 5 不同TpPa-SO3H用量的3种FQs抗生素回收率
Figure 5. Recoveries of three FQs antibiotics with different TpPa-SO3H dosage
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图 6 不同提取液pH的3种FQs抗生素回收率
Figure 6. Recoveries of three FQs antibiotics with different extract pH
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图 7 不同吸附时间的3种FQs抗生素回收率
Figure 7. Recoveries of three FQs antibiotics with different adsorption time
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图 8 不同洗脱溶剂的3种FQs抗生素回收率
Figure 8. Recoveries of three FQs antibiotics with different elution solvents
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图 9 不同体积洗脱溶剂的3种FQs抗生素回收率
Figure 9. Recoveries of three FQs antibiotics with different volume elution solvents
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图 10 FQs抗生素阴性的牛奶样品溶液HPLC色谱图
Figure 10. HPLC chromatogram of FQs antibiotic-negative milk sample solution
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图 11 3种FQs抗生素的对照溶液HPLC色谱图
注：1：环丙沙星；2：达氟沙星；3：恩诺沙星，图12同。
Figure 11. HPLC chromatogram of the control solutions of three FQs antibiotics
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图 12 3种FQs抗生素加标的牛奶样品溶液HPLC色谱图
Figure 12. HPLC chromatogram of milk sample solution spiked with three FQs antibiotics
表 1 TpPa-SO3H与商品化材料的萃取效果比较
Table 1 Comparison of extraction effect of TpPa-SO3H and commercialized materials
材料 化合物 吸附时间（min） 洗脱时间（min） 回收率（%） TpPa-SO3H ENR 4.0 2.0 96.61 CIP 4.0 2.0 96.78 DAN 4.0 2.0 98.37 HLB ENR 10.0 12.0 85.34 CIP 10.0 12.0 83.81 DAN 10.0 12.0 87.31 
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表 2 3种FQs抗生素的线性参数、检出限和定量限
Table 2 Linearity parameters, detection limits and quantitative limits of three FQs antibiotics
化合物 线性范围（mg/L） 线性方程 决定系数（R2） 检出限（mg/kg） 定量限（mg/kg） ENR 0.005～0.500 Y=4.719×107X+5.702×104 0.999 0.003 0.010 CIP 0.005～0.500 Y=2.641×107X+3.249×104 0.999 0.004 0.013 DAN 0.005～0.500 Y=2.401×108X+4.518×104 0.999 0.002 0.007
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表 3 3种FQs抗生素的精密度、稳定性和加样回收率（n=6）
Table 3 Precision, repeatability and sample recovery of three FQs antibiotics (n=6)
化合物 精密度RSD（%） 稳定性RSD（%） 加标质量浓度（μg/kg） 回收率（%） RSD（%） ENR 0.32 0.76 5 94.23 0.45 10 96.57 0.35 20 97.36 0.65 CIP 0.54 0.67 5 94.84 0.64 10 96.72 0.73 20 98.68 0.43 DAN 0.68 0.84 5 95.30 0.39 10 97.86 0.52 20 98.25 0.48
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