Effect of Ursolic Acid Extracted from Hippophae rhamnoides L. on FXR Signaling Pathway in Liver of Rats with Alcoholic Liver Injury
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摘要: 目的：初步探讨沙棘熊果酸对酒精性肝损伤大鼠肝法尼醇X受体（Farnesoid X receptor, FXR）信号通路关键蛋白表达的影响。方法：6周龄SPF级SD大鼠随机分为4组，每组9只，分别为正常对照组、酒精模型组、熊果酸对照组和熊果酸+酒精组，干预时间为8周。采用苏木精-伊红（H&E）染色法观察大鼠肝组织病理学变化；测定大鼠血清中谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartateaminotransferase，AST）活力和血清总胆汁酸（Total bile acid，TBA）、肝脏甘油三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）含量；酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测血清细胞因子肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（Interleukin 1β，IL-1β）、白细胞介素10（Interleukin 10，IL-10）含量；免疫印迹法（Western blotting）测定大鼠肝FXR信号通路相关蛋白表达情况。结果：与正常对照组相比，酒精模型组大鼠肝脏存在大小不一的脂肪空泡和大量炎性细胞浸润；血清ALT、AST活力，TNF-ɑ、IL-1β水平，TBA含量和肝脏TG、TC含量均显著升高（P<0.05）、IL-10水平显著下降（P<0.05）。经熊果酸干预后，肝脏脂肪变性得到明显改善，炎性细胞浸润减少；血清ALT、AST活力，TNF-ɑ、IL-1β水平，TBA含量和肝脏TG含量均有不同程度的显著下降（P<0.05），IL-10水平显著提高（P<0.05）。Western blotting结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠肝脏FXR蛋白表达显著降低（P<0.05），CYP7A1和SREBP-1c蛋白表达均显著升高（P<0.05）；而经熊果酸干预后，FXR蛋白表达明显提高，CYP7A1及SREBP-1c蛋白表达明显下调，且差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论：沙棘熊果酸能够明显改善酒精诱导的肝脏损伤，其作用机制可能与上调肝FXR、抑制CYP7A1和SREBP-1c的蛋白表达，从而维胆汁酸稳态、调节脂质代谢有关。
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关键词:
- 沙棘熊果酸 /
- 酒精性肝损伤 /
- 肝法尼醇X受体（FXR） /
- 胆汁酸 /
- 脂质代谢
Abstract: Objective: To investigate the effect of ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on the expression of key proteins of hepatic farnesoid X receptor (FXR) signaling pathway in rats with alcoholic liver injury. Methods: The 6-week-old SPF SD rats were divided randomly into 4 groups: The normal control group, the alcohol model group, the ursolic acid control group and the ursolic acid+alcohol group, 9 mice in each group. The rats were administered by intragastric administration for eight consecutive weeks. The pathological changes of hepatic tissues in rats was observed by hematoxylin eosin (H&E) staining. The activities of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and the content of total bile acid (TBA) in serum, and the content of triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) in liver of rats were tested. The content of the serum cytokine including tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1β), and interleukin 10 (IL-10) was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of FXR signal pathway related proteins in liver tissue of rats was detected by Western blotting. Results: Compared with the normal control group, there were fat vacuoles of different sizes and a large number of inflammatory cells in the liver of the alcohol model group. The activities of ALT, AST, the levels of TNF-ɑ, IL-1β, the content of TBA in serum and the content of TG, TC in liver were increased significantly (P<0.05), and the level of IL-10 was decreased significantly (P<0.05). After the ursolic acid intervention, hepatic steatosis was improved significantly and inflammatory cell infiltration was decreased. The activities of ALT, AST, the levels of TNF-ɑ, IL-1β and the content of TBA in serum and the content of TG in liver were significantly decreased in different degrees (P<0.05), and the level of IL-10 was significantly increased (P<0.05). The Western blotting results showed that compared with the normal control group, the protein expression of FXR in the model group was decreased significantly (P<0.05), while the protein expression of CYP7A1 and SREBP-1c were increased significantly (P<0.05). After ursolic acid intervention, the protein expression of FXR expression was increased significantly, while the protein expression of CYP7A1 and SREBP-1c were decreased significantly, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion: The ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. can improve alcohol induced liver injury significantly, and its mechanism may be related to up regulating hepatic FXR, inhibiting the protein expression of CYP7A1 and SREBP-1c, thus regulating bile acid homeostasis and lipid metabolism. -
肝脏是机体重要的代谢器官，是酒精代谢的主要场所，因此也成为肝脏损伤的主要靶器官。研究证实，长期和/或大量的酒精摄入会造成酒精性肝损伤[1]。在一项长期饮酒的死亡病例研究中发现，49.5%的人出现了肝脏脂肪变性，34.4%的人发展为酒精性肝炎，16.1%的人成为肝硬化[2]。由此可见，酒精引起的肝脏损伤已经严重威胁到人类身体健康。而目前，对于酒精引起的肝损伤的治疗还没有特效药物。近年来，植物化学物因其低毒副作用、多种生物学功能表现，多途径、多靶点作用优势而备受关注[3]。因此，寻找一种天然药用成分来预防或治疗酒精性肝损伤成为研究的热点。
沙棘属于胡颓子科，别名醋柳、黑刺、酸刺等，是国家卫生健康委员会公布的药食同源植物。沙棘富含的萜类化合物、黄酮类、多糖、维生素类等生物活性成分，具有降压、降脂、抗氧化、抗炎等多种活性功能[4]。熊果酸是沙棘中第一个被发现的天然的五环三萜类化合物，具有抗炎、抗氧化、保护肝脏、抗癌等多种生物学效应[5-7]。据文献报道，沙棘果皮中熊果酸含量高达1.187 mg/g[8]，沙棘果实中熊果酸含量达0.219%[9]。因此，沙棘可作为熊果酸的重要来源。目前，国内外多数学者仅关注于沙棘中总黄酮提取物对于酒精性肝损伤改善作用研究[10-11]，但对沙棘中熊果酸改善酒精性肝损伤的研究并不多见。课题组前期从沙棘中提取出熊果酸（纯度93.8%），并对其进行了一系列保肝作用研究，发现补充熊果酸能够有效改善大鼠酒精性肝损伤，表现为减少内毒素和促炎因子的产生和释放，减少调节肝细胞凋亡关键蛋白过表达，抑制肝细胞的异常凋亡等[12-13]。
现有研究发现，法尼醇X受体（Farnesoid X receptor，FXR）在肝脏和肠道中都呈现高表达，且与酒精性肝损伤的发生发展密切相关[14]。利用敲除FXR基因的小鼠研究发现[15]，饮酒后小鼠更容易出现血清转氨酶升高、脂代谢和胆汁酸代谢紊乱等情况，主要表现为血清ALT、AST的显著增高、肝脏脂质过氧化物的增加以及调节胆汁酸动态平衡相关基因表达的下降，这也说明了FXR在酒精性肝损伤中的重要地位。既往有学者在天然三萜类化合物的生物学筛选实验中发现，熊果酸能够激活胆汁酸受体FXR[16]。熊果酸还可以通过上调FXR的表达来改善大鼠胆汁淤积[17]。近年来也有学者进行了细胞实验，发现熊果酸作用于沉默FXR的HepG2细胞24 h后，FXR mRNA和蛋白的表达都有显著提高[18]。但沙棘熊果酸能否通过调控肝FXR信号通路来改善酒精性肝损伤尚未有报道。
基于现有研究的局限性及课题组的前期研究成果，本研究以沙棘熊果酸为研究对象，通过大鼠酒精性肝损伤模型，观察大鼠肝组织病理学变化、肝功能酶学指标、血清细胞因子、脂质代谢和胆汁酸稳态相关指标以及肝FXR信号通路关键蛋白表达等多层次指标，分析沙棘熊果酸对酒精性肝损伤的保护作用，为今后该类植物活性成分的开发利用提供实验基础和理论依据，也为沙棘的开发利用提供了新途径，同时为酒精性肝损伤的防治提供了新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
沙棘果 内蒙古呼和浩特市和林县境内野生沙棘林（采收时间：2019年10月）；SD大鼠36只 SPF级，雄性6周龄，体重200～250 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0010；伦理委员会实验编号：包医伦审2018第（018）号；无水乙醇 西陇科学股份有限公司；玉米油 山东鲁花集团有限公司；ALT、AST、TBA、TG、TC试剂盒 南京建成生物工程研究所；TNF-α ELISA试剂盒 武汉华美生物工程有限公司；IL-Iβ、IL-10 ELISA试剂盒 武汉云克隆科技股份有限公司；裂解缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；FXR抗体 Abcam公司；CYP7A1和SREBP-1C抗体 BIOSS公司；ECL发光试剂盒、山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗 北京中杉金桥公司；PVDF膜 Millipore公司。
TDZ4-WS自动平衡台式离心机 长沙湘仪离心机有限公司；BX43光学显微镜 日本Olympus公司；Tissue-prp-01组织研磨仪 上海净信实业发展有限公司；Synergy HT/SIAFRTI酶标仪 BioTek美国伯腾仪器有限公司；DYCZ-24DN电泳仪 北京六一公司；WSE-4040半干转膜仪系统 ATTO公司；ChemiDoc超高灵敏度免染型化学发光成像系统 美国BIO-RAD公司。
1.2 实验方法
1.2.1 沙棘熊果酸的提取
沙棘果实经过清洗、离心取汁后，得到果汁、沙棘籽和沙棘果皮。沙棘果皮经脱脂、超临界CO2萃取、离心后取上清液，测定上清液中目标产物熊果酸的含量，干燥后即得粗提取物；萃取条件为：萃取温度25 ℃、萃取压力25 MPa、携带剂（该携带剂为无水乙醇）100 mL、乙醇体积分数90%，目标提取物即熊果酸和齐墩果酸浸出率为276 mg/100 g；利用反相高效液相色谱法将熊果酸和齐墩果酸分离，具体如下：色谱柱：Nova-Pack型C18柱（150 mm×3.9 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-水-醋酸铵（65:20:15:0.5）；检测波长：210 nm；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。外标法定量分析，熊果酸和齐墩果酸理论塔板数均大于10000，两组分分离度大于1.5。熊果酸经内蒙古科技大学通过紫外光谱、红外光谱、高效液相色谱、核磁共振等技术检测鉴定得到熊果酸，分子式为C30H48O3，相对分子质量为456.68，含量93.8%[19-20]。
1.2.2 分组及给药
实验大鼠适应性喂养1周后，根据随机数字表法进行完全随机分组，分为4组，每组9只。具体干预措施如下：正常对照组（A组），每日给予生理盐水灌胃（前2周：8 mL/kg·bw·d，后6周：12 mL/kg·bw·d）；酒精模型组（B组），给予体积分数为50%的酒精灌胃（前2周：8 mL/kg·bw·d，后6周：12 mL/kg·bw·d）[21-22]；熊果酸对照组（C组），给予熊果酸灌胃（150 mg/kg·bw·d，溶于0.2%玉米油）[12, 21]；熊果酸+酒精组（D组），先给予熊果酸灌胃（150 mg/kg·bw·d，溶于0.2%玉米油），1 h 后再给予酒精（酒精剂量同B组）。实验持续8周。实验期间，大鼠自由摄水摄食，每周称重，动物房室温20～25 ℃，相对湿度为40%～60%，昼夜周期为12 h/12 h。末次灌胃后，禁食不禁水12 h，称重并采用0.3%戊巴比妥钠麻醉处死，腹主动脉取血，分离血清，留取肝脏，−80 °C保存供进一步研究。
1.2.3 大鼠肝脏组织病理学观察
将实验大鼠相同部位肝组织剪成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，于4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，组织切片，HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织的病理学变化。
1.2.4 大鼠血清转氨酶活性的测定
血清中ALT、AST严格按照试剂盒说明书要求，在510 nm波长下于酶标仪检测并读取吸光度后求得相应的ALT、AST活力单位。
1.2.5 大鼠血清细胞因子含量的测定
ELISA法测定大鼠血清细胞因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-10含量，严格按试剂盒说明书要求进行。
1.2.6 大鼠血清总胆汁酸、肝脏TG、TC含量的测定
严格按照试剂盒要求，对血清中TBA在405 nm波长下，于酶标仪进行检测并读取吸光度后计算TBA含量。
肝脏TG、TC含量测定：按照试剂说明书制备10%肝匀浆。取新鲜肝组织100 mg，在预冷生理盐水中漂洗，拭去多余水分，用眼科小剪剪碎后，加入900 μL无水乙醇和适量磁珠，在组织研磨机匀浆2 min，经2500 r/min离心10 min后，提取上清液待测。检测步骤严格按照试剂说明书要求，对肝组织TG、TC在510 nm波长下，于酶标仪检测并读取吸光度后分别计算TG、TC含量。
1.2.7 大鼠肝组织蛋白表达量测定
每组大鼠6只用于蛋白含量测定。取50 mg大鼠肝组织，剪碎后于组织研磨机研磨，加入500 μL 放射免疫沉淀法裂解缓冲液（Radio immunoprecipitation assay，RIPA），充分混匀，4 ℃冰箱过夜裂解。4 ℃下，12000 r/min离心10 min，取上清测定蛋白浓度。加入4×蛋白质上样缓冲液，轻轻混合，95 ℃变性10 min。将样品轻轻加至凝胶孔中进行电泳。凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至PVDF膜上，然后分别用非标记一抗FXR（1:1000）、CYP7A1（1:800）、SREBP-1c（1:500）及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。
蛋白相对表达量=样品蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值
1.3 数据处理
采用SPSS20.0软件进行数据处理分析，数据结果均以均数±标准差（
ˉx ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较采用LSD-t法，检验水准α=0.05。2. 结果与分析
2.1 沙棘熊果酸对酒精性肝损伤大鼠肝脏病理结构的影响
如图1，正常对照组与熊果酸对照组肝组织在镜下表现为肝小叶结构较为完整、边界较清晰，肝细胞均匀分布、无脂滴出现。酒精模型组大鼠肝小叶边界模糊，可见大量大小不一、边界清晰的脂肪空泡和大量炎性细胞浸润，此时说明建模成功。与酒精模型组相比，熊果酸+酒精组可见肝小叶边界开始逐渐变清晰、脂肪空泡和炎性细胞的数量明显减少，肝脏损伤程度减轻。由肝脏病理学结果可以看出，给予熊果酸干预后，可以有效减轻因酒精引起的肝脏脂肪变性和炎症反应。
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图 1 沙棘熊果酸对各组大鼠肝组织病理结构的影响（HE，400×）注：A：正常对照组；B：酒精模型组；C：熊果酸对照组；D：熊果酸+酒精组。Figure 1. Effects of ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on the pathological structure of liver tissue of rats in each groups (HE, 400×)2.2 沙棘熊果酸对酒精性肝损伤大鼠血清转氨酶活性的影响
血清转氨酶ALT、AST是肝功能常规临床检测指标，转氨酶活性升高能够反映肝脏的受损程度。位于胞浆中的ALT和位于线粒体中的AST在肝细胞损伤或死亡后从受损的肝细胞释放入血液，此时血中ALT和AST活性均升高[23]。由表1可知，与正常对照组相比，酒精模型组大鼠血清中ALT和AST活力都显著升高（P<0.05），而熊果酸对照组上述指标并无明显变化。与模型组相比，熊果酸+酒精组大鼠血清中ALT和AST活力均显著降低（P<0.05）。以上数据分析可知，酒精的摄入使得大鼠肝细胞受到损伤，ALT、AST异常升高，而熊果酸干预后酒精性肝损伤大鼠血清转氨酶活性呈现出明显的下降，提示适量的熊果酸摄入可有效改善大鼠肝脏功能，减轻酒精对肝脏的损伤。
表 1 沙棘熊果酸对各组大鼠ALT和AST活性的影响（ˉx ±s，n=9）Table 1. Effects of the ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on ALT and AST of rats in each group (ˉx ±s，n=9)2.3 沙棘熊果酸对酒精性肝损伤大鼠血清细胞因子含量的影响
炎症是肝脏发生损伤具有代表性的反应，炎症细胞因子及其异常代谢在酒精性肝损伤的发生发展中起着重要作用[24]。既往的研究已证实[25]，酒精的摄入会导致炎性因子失衡，引发炎症级联反应，最终造成肝脏损伤。如表2所示，熊果酸对照组和正常对照组相比，血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平并无差异（P>0.05）。与正常对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α和IL-1β含量都显著升高，IL-10水平显著下降（P<0.05）。而经熊果酸干预后，TNF-α和IL-1β含量不同程度地下调，差异具有统计学意义（P<0.05）；且IL-10水平在熊果酸干预后明显提升。酒精的暴露使得促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β）水平升高，抑炎细胞因子（IL-10）降低。同时，从实验结果可知，经熊果酸干预可明显抑制因酒精所致的TNF-α、IL-1β水平升高和IL-10水平的降低。以上结果表明，沙棘熊果酸可有效改善酒精性肝脏损伤，表现为减少肝脏炎症反应。
表 2 沙棘熊果酸对各组大鼠血清细胞因子含量的影响（ˉx ±s，n=9）Table 2. Effects of the ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on serum cytokines of rats in each group (ˉx ±s, n=9)组别 TNF-α （pg/mL） IL-1β（pg/mL） IL-10（pg/mL） 正常对照组 12.92±0.89 18.82±0.64 52.89±6.33 酒精模型组 14.07±1.24* 26.02±1.33* 46.05±2.13* 熊果酸对照组 12.36±0.22# 19.00±0.81# 48.52±5.58 熊果酸+酒精组 12.60±0.21# 19.79±0.88# 54.87±4.23# 2.4 沙棘熊果酸对酒精性肝损伤大鼠血清总胆汁酸、肝脏TG、TC含量的影响
TBA是肝病诊断的重要参考指标之一，受损的肝细胞无法控制胆汁酸的代谢，胆汁酸向血液中的反流不断增加，诱发TBA水平升高[26]。当机体摄入过量酒精时，由于肝细胞能够摄取的胆汁酸减少，导致释放入血的胆汁酸增加，由此破坏了胆汁酸的稳态[27]。此外，酒精暴露还会影响到肝脏的正常脂质代谢，表现为TG和TC在肝脏的蓄积[28-30]。由表3可知，相比于正常对照组，模型组大鼠TBA含量显著升高，且肝脏脂质代谢异常，表现为肝脏TG和TC含量显著提升（P<0.05）。但与模型组相比，熊果酸+酒精组TBA显著降低（P<0.05），肝脏TG含量显著下降（P<0.05）；肝脏TC含量虽然有数值上的下降，但差异没有统计学意义（P>0.05）。同时可见，熊果酸对照组各项指标与正常对照组相比，并无显著变化（P>0.05）。以上结果说明，沙棘熊果酸能够抑制酒精引起的大鼠TBA的异常增高和大鼠肝脏TG、TC的沉积，能够维持大鼠胆汁酸和脂质代谢稳态，从而达到保肝护肝的目的。
表 3 沙棘熊果酸对各组大鼠血清TBA、肝组织TG、TC含量的影响（ˉx ±s，n=9）Table 3. Effects of the ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on TBA in serum, TG and TC in liver of rats in each group (ˉx ±s，n=9)组别 TBA（μmol/L） TG（μmol/g） TC（μmol/g） 正常对照组 10.15±0.73 5.34±1.09 5.50±0.15 酒精模型组 14.16±0.48* 11.20±2.28* 6.67±0.75* 熊果酸对照组 11.65±2.33# 5.10±0.54# 6.05±0.54 熊果酸+酒精组 11.82±0.67*# 6.72±1.95# 6.49±0.18* 2.5 沙棘熊果酸对各组大鼠肝FXR信号通路关键蛋白的影响
酒精的摄入会抑制肝FXR，从而对其下游蛋白产生影响[31]。为了探究沙棘熊果酸对肝FXR信号通路的影响，本研究检测了其通路关键蛋白表达情况。如图2所示，与正常对照组相比，酒精模型组大鼠肝组织FXR蛋白表达水平显著降低（P<0.05），CYP7A1和SREBP-1c表达显著上调（P<0.05）。与正常对照组相比，熊果酸对照组大鼠肝组织中FXR、CYP7A1和SREBP-1c表达水平无显著变化（P>0.05）。但相对于模型组，熊果酸+酒精组和熊果酸对照组均显著上调了肝组织FXR的表达（P<0.05），抑制了CYP7A1和SREBP-1c的表达（P<0.05）。与熊果酸对照组相比，熊果酸+酒精组FXR表达虽然显著降低（P<0.05），但显著高于酒精模型组（P<0.05）。结果表明，沙棘熊果酸的干预能够影响肝FXR信号通路相关蛋白的表达，从而改善大鼠胆汁酸稳态和肝脏脂质代谢。
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图 2 沙棘熊果酸对各组大鼠肝组织FXR、CYP7A1和SREBP-1c蛋白表达量的影响（ˉx ±s，n=6）注：*表示与正常对照组，P<0.05；#表示与酒精模型组比较，P<0.05；&表示与熊果酸对照组比较，P<0.05；A：正常对照组；B：酒精模型组；C：熊果酸对照组；D：熊果酸+酒精组。Figure 2. The effect of the ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on the expression of FXR, CYP7A1 and SREBP-1c protein in liver tissue of rats in each group (ˉx ±s，n=6)3. 讨论
本实验采用酒精灌胃建立大鼠酒精性肝损伤模型，发现大鼠在过量酒精暴露后，血清转氨酶活性升高、肝脏组织出现脂肪变性、炎症反应、胆汁酸代谢紊乱和脂质沉积等，这与国内外其他学者研究结果相一致[32-34]。沙棘熊果酸的干预可明显改善酒精所致的大鼠肝脏损伤，表现为抑制血清ALT、AST活力、减轻肝脏脂肪变性和炎症反应，与课题组前期的研究结果一致[12-13]。在本研究中还发现，沙棘熊果酸可能通过调节肝FXR信号通路关键蛋白的表达来维持胆汁酸稳态、调节脂质代谢，进而改善酒精诱导的肝脏损伤。
现有的研究已证实，酒精性肝损伤常常会伴随着胆汁酸和脂质代谢紊乱。而FXR是一种配体依赖性转录因子，又称为胆汁酸受体，是胆汁酸稳态和肠肝循环的关键调节因子，其高表达于肝脏、肠道等组织，是胆汁酸的天然配体[35]。现已被证明在维持胆汁酸稳态、调节脂质代谢、减缓肝脏炎症反应等方面有着重要作用[36-38]。
在肝脏中，FXR主要通过调控胆汁酸的合成、转运、代谢等来发挥维持胆汁酸稳态的作用。胆固醇7α-羟化酶（Cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）是胆汁酸合成途径中的关键合成酶，正常生理状态下，FXR负反馈调节胆汁酸合成酶CYP7A1的表达，使胆汁酸的合成减少，从而维持胆汁酸的稳态[39]。多位学者研究发现[40-41]，FXR缺失的小鼠血清胆汁酸、TG、TC水平和肝脏TG均有不同程度的升高，形成肝内脂质堆积、炎症和动脉粥样硬化斑块，提示FXR在维持正常胆汁酸代谢、脂类代谢和控制炎症反应方面发挥着作用。Wu等[14]采用野生型和FXR敲除（FXR-/-）小鼠构建酒精性肝损伤模型，结果显示野生型小鼠肝内存在胆汁游积现象，胆汁酸合成关键酶CYP7A1 mRNA表达增加；而FXR-/-小鼠表现出更加敏感的酒精肝毒性，肝细胞脂肪变性加重，胆汁酸含量及炎性因子表达明显增高，提示酒精摄入能够影响肝脏胆汁酸代谢造成胆汁淤积，而FXR活性的降低会影响肝脏内胆汁酸代谢以及酒精性肝损伤进程。在FXR-/-小鼠中，胆汁酸抑制CYP7A1 mRNA的水平大大减弱，证明了FXR在胆汁酸合成中的关键作用[42]。这些实验结果表明，FXR的激活可以负反馈抑制CYP7A1的转录，进而抑制了胆汁酸的合成。本研究结果显示，酒精的摄入明显降低了大鼠肝组织中FXR的蛋白表达，CYP7A1表达增加，大鼠胆汁酸合成障碍，胆汁酸代谢紊乱，表现出TBA显著升高，这与Guo等[43]研究结果一致。而经熊果酸干预后，可见大鼠肝FXR蛋白表达显著上调，CYP7A1表达下调，TBA含量相对于模型组也有所下调，胆汁酸趋于稳态。
此外，在酒精性肝损伤发生过程中，SREBPs家族也对疾病进程起着关键作用。大量酒精摄入扰乱了SREBPs介导的脂质的合成，是导致肝脏脂质代谢紊乱的重要因素[44]。SREBPs家族中，SREBP-1c是脂质合成的主要调节者。酒精通过上调SREBP-1c及其下游致脂基因，增加肝细胞中脂肪酸的合成，扩增的SREBP-1c进一步增强脂质合成，加重肝脏脂肪变性[45]。正常生理状态下，在肝脏中，FXR通过下调SREBP-1c的表达参与脂质代谢。Lívero等[46]在研究中发现，FXR激动剂6ECDCA可激活肝FXR减轻慢性酒精诱导的肝脏脂肪变性，这归因于肝FXR对SREBP-1c的负调控，从而阻断了SREBP-1c介导的脂肪生成。本实验Western blotting结果显示，大鼠经酒精诱导后，肝脏FXR显著降低、SREBP-1c表达大幅提高，肝脏脂质代谢出现异常，表现为肝脏TG和TC显著升高。而熊果酸能够显著上调肝FXR的蛋白表达、下调SREBP-1c的表达，从而阻止了肝脏中脂肪过量生成，TG、TC含量下降，同时肝脏病理学检查也显示无明显的脂滴出现，脂肪变性得到改善。
因此，沙棘熊果酸可通过激活肝FXR从而调控其下游关键蛋白的表达，改善大鼠胆汁酸稳态和肝脏脂质代谢，最终起到保肝护肝的效果。
4. 结论
综上所述，沙棘熊果酸能够有效改善大鼠酒精性肝损伤，这可能与其上调肝FXR的蛋白表达、抑制CYP7A1和SREBP-1c的蛋白表达，从而维持胆汁酸稳态，调控肝脏脂质代谢有关。故本研究为进一步探索沙棘熊果酸对酒精诱导肝损伤保护作用提供了参考，也为沙棘的开发利用提供了实验依据和途径。但其具体调控机制尚不清楚，仍有待于进一步的研究。
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图 1 沙棘熊果酸对各组大鼠肝组织病理结构的影响（HE，400×）
注：A：正常对照组；B：酒精模型组；C：熊果酸对照组；D：熊果酸+酒精组。
Figure 1. Effects of ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on the pathological structure of liver tissue of rats in each groups (HE, 400×)
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图 2 沙棘熊果酸对各组大鼠肝组织FXR、CYP7A1和SREBP-1c蛋白表达量的影响（
ˉx ±s，n=6）注：*表示与正常对照组，P<0.05；#表示与酒精模型组比较，P<0.05；&表示与熊果酸对照组比较，P<0.05；A：正常对照组；B：酒精模型组；C：熊果酸对照组；D：熊果酸+酒精组。
Figure 2. The effect of the ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on the expression of FXR, CYP7A1 and SREBP-1c protein in liver tissue of rats in each group (
ˉx ±s，n=6)表 1 沙棘熊果酸对各组大鼠ALT和AST活性的影响（
ˉx ±s，n=9）Table 1 Effects of the ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on ALT and AST of rats in each group (
ˉx ±s，n=9)
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表 2 沙棘熊果酸对各组大鼠血清细胞因子含量的影响（
ˉx ±s，n=9）Table 2 Effects of the ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on serum cytokines of rats in each group (
ˉx ±s, n=9)组别 TNF-α （pg/mL） IL-1β（pg/mL） IL-10（pg/mL） 正常对照组 12.92±0.89 18.82±0.64 52.89±6.33 酒精模型组 14.07±1.24* 26.02±1.33* 46.05±2.13* 熊果酸对照组 12.36±0.22# 19.00±0.81# 48.52±5.58 熊果酸+酒精组 12.60±0.21# 19.79±0.88# 54.87±4.23#
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表 3 沙棘熊果酸对各组大鼠血清TBA、肝组织TG、TC含量的影响（
ˉx ±s，n=9）Table 3 Effects of the ursolic acid extracted from Hippophae rhamnoides L. on TBA in serum, TG and TC in liver of rats in each group (
ˉx ±s，n=9)组别 TBA（μmol/L） TG（μmol/g） TC（μmol/g） 正常对照组 10.15±0.73 5.34±1.09 5.50±0.15 酒精模型组 14.16±0.48* 11.20±2.28* 6.67±0.75* 熊果酸对照组 11.65±2.33# 5.10±0.54# 6.05±0.54 熊果酸+酒精组 11.82±0.67*# 6.72±1.95# 6.49±0.18*
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