Effect of Heat Treatment on the Interaction Mechanism and Digestibility of Soybean Protein Isolate-Curcumin
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摘要: 为了探究热处理对大豆分离蛋白-姜黄素复合物结构和互作机理的影响，研究了不同热处理温度（75、80、85、90、95 ℃）下大豆分离蛋白对姜黄素的包埋率以及其复合物粒径、电位、二级结构、三级结构，及其在体外消化率的变化。结果表明，85 ℃条件下热处理有利于大豆蛋白与姜黄素结合，形成稳定的复合物，包埋率达89.13%。此时液滴粒径大小为163.33 nm，电位值为−24.30 mV，总巯基和表面疏水性达到最大值分别为3.82 μmol/g和3814±20，此时蛋白结构最为舒展，体系最稳定，有利于提高体外模拟消化释放率。该实验结果证明热处理可提高大豆蛋白与姜黄素的结合，有利于后续对大豆蛋白、姜黄素复合物的创新和开发。Abstract: The effects of different heat treatment temperatures (75, 80, 85, 90, 95 ℃) on the embedding rate, particle size, zeta, secondary structure, tertiary structure and its digestibility in vitro of soybean protein isolate-curcumin complexes were studied in order to explore the structure and interaction mechanism of complexes. The results showed that heat treatment at 85 ℃ was the best to combine soybean protein isolate with curcumin. Meanwhile, the embedding rate reached 89.13%, the particle size was 163.33 nm, and the potential value was −24.30 mV. The total sulfhydryl group and surface hydrophobicity of complex reached the maximum, 3.82 μmol/g and 3814±20, which indicated that the protein structure was stretch to stable and interact with curcumin to improve the digestibility in vitro. It was also concluded that the binding effect of soybean protein isolate and curcumin was enhanced by heat treatment. The result would be beneficial to the innovation and development of soybean protein isolate and curcumin complex.
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Keywords:
- soybean protein isolate /
- curcumin /
- heat treatment /
- interaction /
- digestive property
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大豆蛋白是一种重要的植物性食品级蛋白质，可从豆粕中分离纯化，具有来源广泛、营养丰富、价格低廉的特点。大豆分离蛋白是大豆蛋白的主要成分，主要含有7S和11S蛋白，其蛋白含量在80%以上，具有优良的表面特性和自组装特性，并具有与小分子和聚合物结合的能力。可作为纳米运载体系运载或包埋的生物活性小分子物质，达到保护、缓慢释放和定向运输的目的[1-3]。
姜黄素是存在于一些植物根茎当中的一种天然酚类化合物，在抗炎、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等方面有良好的医学价值[4-5]。高脂溶性，水溶性极差，但能够有效的溶解在甲醇、乙醇等极性溶剂中[6]。此外姜黄素在酸性缓冲溶液中能够以更加稳定的形式存在，而在中性和碱性条件下则非常容易受到光、热、空气等外界因素的干扰使其分解变色，这很大程度上限制了姜黄素在食品领域的发展与应用，因此提高姜黄素的稳定性是保障其功效发挥的首要条件。大部分姜黄素进入人体内难吸收、易经肝肠循环代谢，这不利于其功效的发挥[7]。
大量研究表明，可通过乳液、纳米颗粒、脂质体、凝胶以及胶束等多种载体对姜黄素进行包埋运输，从而提高姜黄素的稳定性、溶解性和生物利用度。大豆蛋白来源广泛、价格低廉，是目前作为食品大分子包埋基材的主要原料。由于大豆蛋白含有丰富的疏水性氨基酸和带电性氨基酸，可促进大豆蛋白与生物活性小分子进行结合[8-9]。Tapal等[10]首次提出大豆蛋白能与姜黄素通过疏水相互作用形成复合物，提高了姜黄素的溶解性。除了疏水相互作用外，二硫键、氢键等都可成为大豆分离蛋白与姜黄素结合的作用力[6, 8]。Zhang等[11]通过超声联合酶解处理制备大豆分离蛋白与姜黄素的自组装纳米颗粒，显著提高了姜黄素的生物活性。物理处理会改变蛋白质的结构，使得结构展开，疏水性增加。但展开后的结构会因为与其他小分子的互作而形成聚集体。例如当温度大于80 ℃后，大豆蛋白形成网络化结构[12]。一般实验室通过热诱导促进姜黄素与β-乳球蛋白形成纳米颗粒，显著提高其溶解性[13-14]。而当温度超过95 ℃处理60 min后，蛋白质变性，对复合物的稳定性产生了消极作用[15]。由于姜黄素极易被分解，采用蛋白质复合可显著降低姜黄素的降解率，提高生物利用度。Tapal等[10]研究证明通过与大豆蛋白复合，姜黄素的吸收率得到提高。陈飞平[16]的实验结果表明复合后的姜黄素降解率降低80%左右。截止目前，二者的互作机理尚不清晰，同时缺少在其他物理场作用下二者的稳定性研究。
本文将对大豆分离蛋白-姜黄素（SPI-Cur）复合物中二者的互作机理进行解析，探究二者复合物在不同热处理条件下的稳定性及消化特性，为后续姜黄素在食品领域的发展提供理论基础，同时拓宽大豆蛋白在活性物质运载方面的应用。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
脱脂豆粕 黑龙江省农科院；姜黄素（95 %） 国药集团化学试剂有限公司；大豆油 市售；正己烷、乙醇、浓盐酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠 （SDS）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、β-巯基、乙醇、猪胆盐 天津市科密欧化学试剂有限公司；胃蛋白酶（25000 U/mL）、胰蛋白酶（20000 U/mL）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、过硫酸钾 Solarbio科技有限公司。
PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器有限公司；79-1型磁力搅拌器 江苏国华仪器厂产品；ALPHA 1650 型紫外可见分光光度计 上海谱元仪器有限公司；LAMBDA 365型紫外光谱仪 美国珀金埃尔默股份有限公司；721E型电子天平 上海恒平科学仪器有限公司；ALPHA 1-2 LD plus型冷冻干燥机 德国 CHRIST公司；KH19A型台式高速高性能离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；Scientz-IID型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技公司；Malvern Zeta Plus电位及粒度分析仪 Malvern公司；BCD-216TSM型均质机 浙江苏泊尔股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 大豆分离蛋白的制备
大豆分离蛋白（Soybean protein isolated，SPI）的制备参考黄利华等[17]的方法并稍作修改，脱脂豆粕按照质量比例与水混合，将混合后的溶液用2 mol/L NaOH将pH调节到8.0。置于磁力搅拌器上搅拌2 h后，在10000 r/min的转速条件下用离心机离心30 min，离心后的溶液取得上清液，上清液用2 mol/L的HCL将pH调节到4.5。静置一段时间，使溶液状态稳定，随后在6000 r/min的转速条件下离心30 min，沉淀用去离子水水洗两次，最后用2 mol/L的NaCl将溶液pH调节至7.0，将沉淀蛋白分散至水中，之后进行4000 r/min离心30 min，除去管中的少量不溶物，将溶液进行冷冻干燥处理，粉碎研磨后得到粉末状的SPI。
1.2.2 大豆分离蛋白-姜黄素复合物的制备
用分析天平称取0.25 g的SPI粉末，溶解于去离子水中制备质量浓度为50 mg/mL的SPI溶液，溶液置于磁力搅拌器上搅拌2 h后静置于冰箱冷藏层中水化过夜。
用分析天平称取一定量的姜黄素粉（Curcumin，Cur），加入无水乙醇，制备浓度为5 mg/mL的溶液。在磁力搅拌条件下，将姜黄素溶液与大豆分离蛋白溶液按照质量比例1:30混合在一起，在磁搅拌器上继续搅拌8 h，让SPI与Cur充分复合。之后将复合物分别在75、80、85、90和95 ℃下进行水浴热处理10 min。溶液恢复至室温后，将未经水浴热处理的复合溶液和水浴热处理后的样品倒入离心管中。离心20 min以去除未结合的姜黄素。离心后取上清液进行电位、粒径分析，其余样品冷冻干燥制备SPI-Cur复合粉末。
1.2.3 姜黄素包埋率（EE）和包埋量（EA）的测定
大豆分离蛋白-姜黄素复合物对姜黄素的包埋率由以下公式来计算：
EE(%)=(1−未结合的姜黄素总加入的姜黄素)×100 (1) 式中：未结合的姜黄素是指大豆分离蛋白与姜黄素结合离心后所得的沉淀。沉淀用无水乙醇充分溶解，9000 r/min离心15 min去除蛋白聚集物。用紫外-可见分光光度计测定上清液在426 nm处的光吸收值。然后用标准曲线[18]计算姜黄素含量（μg）。大豆分离蛋白-姜黄素复合物对姜黄素的包埋量计算如下：
EA(µg/mgSPI)=总加入的姜黄素−未结合的姜黄素总蛋白质质量 (2) 1.2.4 表面疏水性的测定
通过1-苯胺基萘8-磺酸盐（ANS）探针法测定复合物的表面疏水性（H0） [19]。将复合物溶液分别用蒸馏水稀释10倍，然后加入10 mL离心管中。向其中加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液，立即混合。避光5 min后，测量反应溶液的荧光强度。激发波长390 nm，发射波长470 nm，狭缝宽度5 nm。样品的荧光强度减去试剂的空白值即为样品的相对荧光强度。以相对荧光强度为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制曲线并进行线性拟合，初始阶段斜率为样品的表面疏水性（H0）。
1.2.5 水动力学直径（Dz）、聚合物分散性指数（PDI）与Zeta电位分析
采用动态光散射法测定不同热处理温度下SPI-Cur复合物的Dz、PDI和Zeta电位。样品置于激光粒度分析仪中，使用激光器。测试前，在25 ℃平衡，蛋白折光率设定为1.145。每个参数测试三次取平均值。
1.2.6 傅立叶-变换红外光谱（FT-IR）分析
分别取不同热处理温度下的SPI-Cur复合物冻干粉末研磨，制成透明薄片来进行红外光谱扫描。扫描波数为500~4000 cm−1，扫描次数为32次。对扫描后的结果进行分析处理。
1.2.7 巯基含量的测定
复合物中-SH和S-S组的含量参考Ellman等 [20]的方法测定。在0.5 mL的样品溶液中加入2.5 mL的含有8 mol/L 尿素的Tris-甘氨酸缓冲液和0.02 mL含有1% DNTB（5,5'-二硫双-2-硝基苯甲酸）的Tris-甘氨酸缓冲液，将其置于40 ℃水浴中保温25 min。利用双光束分光光度计在412 nm处测量其吸光值。Tris-甘氨酸缓冲液作为空白对照。根据以下公式计算-SH和-SS组的含量：
SH/SS(µmol/g)=73.53×A412nm×DC (3) 二硫键(µmol/g)=SS−SH2 (4) 式中：A412 nm为412 nm处的吸光度；C为样品浓度，mg固体/mL；D为稀释因子，SH的稀释倍数为5.02，SS的总稀释倍数为10；73.53=106/（1.36×104） ，1.36×104为摩尔吸光系数。
1.2.8 体外模拟消化率的测定
胃消化阶段：取4 g NaCl溶于950 mL 0.1 mol/L PBS缓冲液中，用浓盐酸调pH1.5并定容至1 L得到模拟胃消化液。取质量浓度为1 mg/mL的SPI-Cur复合物溶液10 mL于锥形瓶中，加入模拟胃消化液（内含6.9 mmol/L KCl，25 mmol/L NaHCO3, 0.5 mmol/L （NH4）2CO3，47.2 mmol/L NaCl，0.9 mmol/L KH2PO4，0.1 mmol/L MgCl2（H2O）6）和胃蛋白酶，使最终胃环境液中胃蛋白酶为2000 U/mL，放入37 ℃摇床中速振荡，模拟胃消化30 min。
肠消化阶段：胃消化结束后，将pH调至7.4，并向胃消化产物中加入胰蛋白酶20 mg、猪胆盐250 mg、CaCl2 0.067 g、NaCl 0.53 g混匀以模拟肠消化环境，摇床中37 ℃，100 r/min条件下水浴振荡2 h。
分别在消化不同时间时取消化液在8000 r/min条件下离心，测定上清液中姜黄素含量，同时测定没有离心的消化液中姜黄素的含量。取100 μL消化液和1 mL乙酸乙酯于离心管中并漩涡振荡5 min，将萃取后的消化液样品在8000 r/min条件下离心10 min，取上清液测定其在426 nm处的吸光度，计算其姜黄素含量（方法见1.2.3）。
1.2.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳
取0.5 mL不同消化时间的消化液加入0.5 mL样品缓冲液（0.2 mL 10% SDS和50 μL 0.01 mol/L的β-巯基乙醇）混匀，沸水浴5 min后上样，上样量为20 μL。采用浓缩胶体积分数5%、分离胶体积分数12%，电压恒定为120 V。取出凝胶后放入考马斯亮蓝染液中染色30 min，再用甲醇、冰醋酸溶液脱色至背景清晰。
1.3 数据处理
采用Excel 2013和SPSS 22.0对数据进行处理和显著性分析（LSD，P<0.05），通过Origin 2017绘图，实验结果除有特殊说明外，均为三次平均值±标准偏差。
2. 结果与分析
2.1 姜黄素包埋率（EE）和包埋量（EA）分析
姜黄素包埋率（EE）指的是姜黄素与大豆分离蛋白的结合率，包埋量（EA）指的是大豆分离蛋白对姜黄素的承载含量。通过表1可知：SPI对Cur的包埋率随热处理温度的升高呈现先增加后减小的趋势，当热处理温度达到85 ℃后包埋率达到最大值89.13%±0.22%。此外，SPI对Cur的包埋量也随热处理温度的升高先升高后降低，且处理温度在85 ℃时也达到最大值3.56 μg/mg SPI。这是由于热处理导致蛋白质变性，结构松散，更多的内部基团暴露出来与姜黄素结合[6, 21]。当加热温度超过85 ℃后，蛋白质变性程度增加，形成聚集体，导致蛋白分子对Cur的包埋承载能力有所降低。该实验结果表明热处理温度对SPI与Cur二者的结合有很大影响，适当的加热可提高SPI对Cur的包埋承载能力。
表 1 不同热处理温度下SPI对Cur的包埋率（EE）和包埋量（EA）Table 1. The EE and EA of SPI to Cur at different heat treatment temperatures指标 未处理 75 ℃ 80 ℃ 85 ℃ 90 ℃ 95 ℃ 包埋率EE（%） 78.60±0.30 82.80±0.12 84.30±0.16 89.13±0.22 88.05±0.18 86.60±0.10 包埋量EA（μg/mg SPI） 2.94±0.10 3.31±0.20 3.37±0.20 3.56±0.10 3.52±0.10 3.32±0.20 2.2 SPI-Cur复合物表面疏水性分析
从图1可以看出，随着加热温度的升高，复合物的表面疏水性先升高后降低，在85 ℃时达到3814±20。这是由于随着温度的不断升高，蛋白质内部的三、四级结构被打开，内部的疏水性基团被暴露出来。对于像姜黄素这种疏水性生物活性小分子，主要是与蛋白质的疏水区域形成疏水相互作用而复合。而加热处理导致蛋白质变性，结构舒展，使其内部的疏水性基团暴露，促进了与Cur的复合。这与Tang等[21]的研究结果一致。当温度较高时，疏水相互作用减弱，蛋白质分子形成了热聚集体，导致整体的表面疏水性有所降低。
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图 1 不同热处理温度下SPI-Cur复合物的表面疏水性Figure 1. Surface hydrophobicity of SPI-Cur complex at different heat treatment temperatures2.3 SPI-Cur复合物粒径、电位分析
从表2中可知，SPI-Cur复合物的粒径随热处理温度的升高呈现不断增大的趋势，由未热处理的73.00 nm，随着温度的不断升高，增大到223.23 nm。其原因可能是热处理使蛋白质的结构变性展开，暴露出原本埋藏在内部的疏水基团，从而导致蛋白质分子更为分散，增加颗粒的平均直径，粒径增大[22]。通过PDI指数可以看出，SPI-Cur复合物溶液PDI值均小于0.5，体系较为均一；另外经过90 ℃热处理的复合物其PDI值明显升高，说明低温加热下复合物溶液分散性比后者复合物溶液样品的分散性要好，表明热处理温度的升高会对复合物溶液的分散性产生影响，经过90、95 ℃热处理的复合物PDI较高，可能是温度过高导致原本隐藏在分子内部的巯基和疏水性氨基酸暴露，促使蛋白质分子之间形成二硫键相互交联以及疏水性聚集，从而使体系PDI增大。与此同时，通过ζ-电势的数值可以看出在85 ℃时粒子间静电斥力最大，体系最稳定，当加热温度过高时，二者的稳定性被破坏，SPI对Cur的承载能力降低。因此，适当的加热处理可提高大豆蛋白对姜黄素的分散性和稳定性。
表 2 不同热处理温度下SPI-Cur复合物的粒径和电位Table 2. Particle size and Zeta potential of SPI-Cur complex at different heat treatment temperatures组别 Dz（nm） PDI ζ-电势（mV） 未处理 73.00±1.75 0.326±0.031 −20.70±2.06 75 ℃ 110.32±3.81 0.308±0.073 −23.10±3.44 80 ℃ 130.67±5.24 0.223±0.040 −23.80±2.23 85 ℃ 163.33±1.66 0.203±0.031 −24.30±1.91 90 ℃ 166.10±3.61 0.478±0.098 −17.50±4.29 95 ℃ 223.23±6.02 0.497±0.039 −18.10±1.71 2.4 SPI-Cur复合物FT-IR分析
如图2所示，未加热及热处理的SPI-Cur复合物在3268 cm−1至3277 cm−1范围内均有一个宽峰，表明Cur与SPI二者存在着部分的氢键作用力结合。此外，热处理后SPI-Cur复合物相较未处理的复合物酰胺Ⅰ带发生了蓝移（1645 cm−1位移至1634 cm−1），酰胺Ⅱ带吸收峰也发生了蓝移（1552 cm−1位移至1515 cm−1）。这是由于加热使蛋白质结构舒展，折叠结构展开导致峰位向低波数偏移。此外，经过热处理后，SPI-Cur复合物之间的疏水作用表现的更加强烈，这与所测得的复合物表面疏水性数据相吻合。比较不同温度热处理后的SPI-Cur复合物，85 ℃温度以上水浴处理的复合物在酰胺Ⅰ带的吸收峰发生明显变化，这说明在85℃以上水浴热处理条件下，有更多的SPI与Cur通过疏水相互作用结合在一起。通过FT-IR可知，氢键、疏水相互作用均是影响SPI与Cur结合的因素，这与Chen等[6]的研究结果一致。
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图 2 不同热处理温度下SPI-Cur复合物的红外光谱谱图Figure 2. FT-IR spectroscopy of SPI-Cur complex at different heat treatment temperaturesFT-IR光谱同时可分析蛋白质结构变化，其中的酰胺Ⅰ带吸收峰变化反应了蛋白质二级结构的变化（1700～1600 cm-1）。已有研究表明，蛋白质二级结构与各子峰间的对应关系为：波数1646～1664 cm−1处对应的结构为α-螺旋结构；波数1615～1637 cm−1和1682～1700 cm−1处对应的结构为β-折叠结构；波数1664～1681 cm−1处对应的结构为β-转角结构；波数1637～1645 cm−1处对应的结构为无规则卷曲结构[23-24]。采用Gauss面积法拟合，将复合物的酰胺Ⅰ带红外谱图进行二阶导数，可得到不同处理的复合物酰胺Ⅰ带的拟合谱图，通过计算得出蛋白质各二级结构的含量。Liu 等[25]研究表明Cur在不同条件下对蛋白质结构变化的影响程度不同。通过表3可知，随着SPI与Cur的结合，蛋白质结构中的α-螺旋和β-折叠结构增加，无规则卷曲和β-转角结构降低，蛋白质的结构趋向于有序结构；当加热温度高于90℃后，蛋白质变性程度变大，复合物的结构变得不稳定，无序结构增加。
表 3 不同热处理温度下复合物蛋白质二级结构组成Table 3. Secondary structure content of protein of complex at different heat treatment temperatures样品 α-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） SPI 17.43±0.23b 48.98±0.23a 15.50±0.23c 18.10±0.23b 未处理SPI-Cur 19.70±0.23d 51.56±0.23c 13.33±0.23a 16.42±0.23a SPI-Cur 75 ℃ 18.85±0.23cd 51.07±0.23c 13.86±0.23a 16.22±0.23a SPI-Cur 80 ℃ 19.03±0.23d 50.86±0.23b 13.39±0.23a 16.72±0.23ab SPI-Cur 85 ℃ 18.27±0.23c 49.14±0.23a 13.88±0.23a 16.70±0.23ab SPI-Cur 90 ℃ 17.61±0.23b 50.05±0.23b 13.97±0.23ab 18.37±0.23c SPI-Cur 95 ℃ 16.19±0.23a 48.39±0.23a 14.46±0.23b 20.99±0.23d 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 2.5 SPI-Cur复合物巯基含量分析
从图3（a）中可以看出，复合物中的总巯基含量随热处理温度的升高呈现逐渐上升的趋势，且在热处理温度为85 ℃时，复合物中总巯基的含量达到了最大值3.82 μmol/g，相较于未经热处理的复合物，总巯基含量增加18.2%。总巯基增加的原因可能是更多的游离巯基从蛋白内部暴露到表面。然而随着温度的不断升高，游离巯基含量减少导致总巯基含量减少。
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图 3 不同热处理温度对复合物巯基含量的影响Figure 3. Effect of different heat treatment temperatures on the sulfhydryl content of the complex从图3（b）中可看出，热处理温度对复合物二硫键的影响呈现先降低后升高的趋势，随着热处理温度的升高，复合物二硫键含量从0.895 μmol/g降低到0.728 μmol/g，当处理温度达到85 ℃时，二硫键含量开始呈现上升趋势，而当热处理温度达到95 ℃时，二硫键含量达到最大值1.125 μmol/g。可能由于适当的热处理导致蛋白质变性，二硫键被破坏，含量降低；当温度过高时，游离巯基含量降低，又重新氧化成二硫键，蛋白分子发生聚集。另外有研究表明，二硫键常在疏水性氨基酸附近聚集形成[26]，因此二硫键的趋势与疏水性趋势保持一致。
2.6 SPI-Cur复合物体外模拟消化过程研究
2.6.1 复合物中姜黄素的消化率
不同热处理后SPI-Cur复合物在消化过程中姜黄素的释放率如表4所示。通过对比可知，热处理可显著提高姜黄素在肠道中的释放率，复合物能够尽可能完整的从胃中通过，在小肠处被消化吸收。若SPI-Cur复合物在胃中被消化，释放出的姜黄素在胃的酸性环境中会结晶，后以晶体的形式进入肠道，而晶体形式的姜黄素难以被小肠上皮细胞吸收，通过制备蛋白质复合物的方式可以保护姜黄素顺利经过胃后，在小肠处释放，供人体吸收利用。虽然复合物中蛋白质都有保护姜黄素的作用，但随着热处理温度的不同，二者结合程度不同所导致的保护效果随之改变。也有可能在消化过程中蛋白酶与Cur之间形成了复合物[16]。
表 4 SPI-Cur复合物模拟体外消化中姜黄素的释放率（%）Table 4. Release rates of digested curcumin of the SPI-Cur complex in vitro (%)阶段 时间（min） 未处理 75 ℃ 80 ℃ 85 ℃ 90 ℃ 95 ℃ 胃消化 0 − − − − − − 30 24.45±0.12 23.70±0.30 18.30±0.16 17.13±0.12 17.05±0.18 17.60±0.10 肠消化 60 25.98±0.20 25.84±0.12 27.30±0.20 23.74±0.25 20.25±0.10 22.70±0.20 90 28.12±0.34 28.35±0.42 32.30±0.34 30.65±0.22 26.37±0.20 25.64±0.15 120 29.04±0.23 29.86±0.21 34.14±0.18 37.12±0.24 31.85±0.35 30.64±0.34 150 30.22±0.11 31.94±0.10 36.57±0.20 39.56±0.10 34.52±0.15 35.32±0.20 2.6.2 SPI-Cur复合物消化过程中粒径变化
SPI-Cur复合物在模拟体外消化过程中粒径的变化情况如图4所示。在模拟胃消化30 min后观察到广泛的颗粒聚集，粒径增大。这是由于酸性条件下静电相互作用的变化所致。复合物中的蛋白质可以被胃蛋白酶水解，粒径变小，从而减少了静电排斥和空间位阻。在肠消化阶段复合物被降解，粒径逐渐减小。不同热处理温度下SPI-Cur复合物在消化过程中的粒径变化基本一致，85 ℃以下温度处理的样品在消化前期速率较快，加热温度高于85 ℃后样品在消化速率较慢。处理温度增加会使得降解速度减缓，这主要是由于蛋白质与Cur紧密结合，改变水相的迁移率并阻碍了胰酶与大分子粒径的接触，粒径稍大的复合物需要很长时间才能被水解。
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图 4 SPI-Cur复合物消化过程中粒径的变化Figure 4. Changes in particle size during digestion of the SPI-Cur complex2.6.3 SPI-Cur复合物消化过程凝胶电泳分析
蛋白酶水解会影响蛋白质复合物中二者的消化率。因此，进一步通过凝胶电泳分析了姜黄素复合对大豆蛋白可消化性的影响（见图5）。随着消化时间延长，蛋白肽链逐渐水解，而且大豆蛋白的水解主要发生在胃液（含胃蛋白酶）消化阶段。不同热处理温度下SPI-Cur复合物在消化过程中的亚基变化基本一致。在图中可见，在SPI-Cur消化的前30 min里，低温处理后的复合物中一些分子量为35~63 kDa的蛋白条带基本消失，说明分子量为35~63 kDa的蛋白已经被完全消化降解，而分子量小于35 kDa的蛋白随着消化的进行，蛋白质条带的颜色逐渐变浅。当复合物处理温度高于85 ℃中的分子量为35~63 kDa蛋白条带消化速率较低，颜色逐渐变浅直至完全消失，说明该部分的蛋白是被陆续的消化分解的。因此，适当的热处理可提高二者的互作，蛋白质亚基被分布降解，使小分子亚基充分被胃蛋白酶水解，提高了SPI的消化率。
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图 5 SPI-Cur复合物消化物的SDS-PAGE电泳图Figure 5. SDS-PAGE during digestion of the SPI-Cur complex3. 结论
本实验探究不同热处理温度对大豆蛋白-姜黄素复合物互作机理的影响，通过复合物的表面疏水性、巯基、二硫键含量、红外光谱及姜黄素的包埋率等结果表明：随着热处理温度的不断升高，复合物的表面疏水性、总巯基及复合物对姜黄素的包埋率总体上均有升高的趋势，并且在85 ℃时，复合物的总巯基含量与表面疏水性均达到最大值，电位绝对值最大，此时体系最稳定。由于温度的升高，复合物内部有越来越多的疏水基团及巯基暴露出来，通过其红外分析可以看出蛋白质结构更为舒展，有利于姜黄素分子与大豆蛋白结合在一起，可推断出二者是通过疏水相互作用、氢键和二硫键多种相互结合方式形成复合物。并且蛋白质与姜黄素的相互作用还可以提高复合物在模拟胃肠道消化过程中的消化率，适当的加热处理会促进复合物的消化。
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图 1 不同热处理温度下SPI-Cur复合物的表面疏水性
Figure 1. Surface hydrophobicity of SPI-Cur complex at different heat treatment temperatures
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图 2 不同热处理温度下SPI-Cur复合物的红外光谱谱图
Figure 2. FT-IR spectroscopy of SPI-Cur complex at different heat treatment temperatures
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图 3 不同热处理温度对复合物巯基含量的影响
Figure 3. Effect of different heat treatment temperatures on the sulfhydryl content of the complex
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图 4 SPI-Cur复合物消化过程中粒径的变化
Figure 4. Changes in particle size during digestion of the SPI-Cur complex
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图 5 SPI-Cur复合物消化物的SDS-PAGE电泳图
Figure 5. SDS-PAGE during digestion of the SPI-Cur complex
表 1 不同热处理温度下SPI对Cur的包埋率（EE）和包埋量（EA）
Table 1 The EE and EA of SPI to Cur at different heat treatment temperatures
指标 未处理 75 ℃ 80 ℃ 85 ℃ 90 ℃ 95 ℃ 包埋率EE（%） 78.60±0.30 82.80±0.12 84.30±0.16 89.13±0.22 88.05±0.18 86.60±0.10 包埋量EA（μg/mg SPI） 2.94±0.10 3.31±0.20 3.37±0.20 3.56±0.10 3.52±0.10 3.32±0.20 
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表 2 不同热处理温度下SPI-Cur复合物的粒径和电位
Table 2 Particle size and Zeta potential of SPI-Cur complex at different heat treatment temperatures
组别 Dz（nm） PDI ζ-电势（mV） 未处理 73.00±1.75 0.326±0.031 −20.70±2.06 75 ℃ 110.32±3.81 0.308±0.073 −23.10±3.44 80 ℃ 130.67±5.24 0.223±0.040 −23.80±2.23 85 ℃ 163.33±1.66 0.203±0.031 −24.30±1.91 90 ℃ 166.10±3.61 0.478±0.098 −17.50±4.29 95 ℃ 223.23±6.02 0.497±0.039 −18.10±1.71
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表 3 不同热处理温度下复合物蛋白质二级结构组成
Table 3 Secondary structure content of protein of complex at different heat treatment temperatures
样品 α-螺旋（%） β-折叠（%） β-转角（%） 无规则卷曲（%） SPI 17.43±0.23b 48.98±0.23a 15.50±0.23c 18.10±0.23b 未处理SPI-Cur 19.70±0.23d 51.56±0.23c 13.33±0.23a 16.42±0.23a SPI-Cur 75 ℃ 18.85±0.23cd 51.07±0.23c 13.86±0.23a 16.22±0.23a SPI-Cur 80 ℃ 19.03±0.23d 50.86±0.23b 13.39±0.23a 16.72±0.23ab SPI-Cur 85 ℃ 18.27±0.23c 49.14±0.23a 13.88±0.23a 16.70±0.23ab SPI-Cur 90 ℃ 17.61±0.23b 50.05±0.23b 13.97±0.23ab 18.37±0.23c SPI-Cur 95 ℃ 16.19±0.23a 48.39±0.23a 14.46±0.23b 20.99±0.23d 注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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表 4 SPI-Cur复合物模拟体外消化中姜黄素的释放率（%）
Table 4 Release rates of digested curcumin of the SPI-Cur complex in vitro (%)
阶段 时间（min） 未处理 75 ℃ 80 ℃ 85 ℃ 90 ℃ 95 ℃ 胃消化 0 − − − − − − 30 24.45±0.12 23.70±0.30 18.30±0.16 17.13±0.12 17.05±0.18 17.60±0.10 肠消化 60 25.98±0.20 25.84±0.12 27.30±0.20 23.74±0.25 20.25±0.10 22.70±0.20 90 28.12±0.34 28.35±0.42 32.30±0.34 30.65±0.22 26.37±0.20 25.64±0.15 120 29.04±0.23 29.86±0.21 34.14±0.18 37.12±0.24 31.85±0.35 30.64±0.34 150 30.22±0.11 31.94±0.10 36.57±0.20 39.56±0.10 34.52±0.15 35.32±0.20
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