Metabolic Transformation and Fermentation Condition of L-homoserine Synthesis by Corynebacterium glutamicum
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摘要: 目的：本研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为底盘细胞，构建1株L-高丝氨酸合成菌株并分析溶氧环境对其产物合成的影响。方法：首先通过外源添加0~40 g/L的L-高丝氨酸分析谷氨酸棒状杆菌的产物耐受性；随后，通过基因thrB敲除阻断L-高丝氨酸的降解途径，获得谷氨酸棒状杆菌重组菌H1；在此基础上利用挡板摇瓶进行细胞培养以增强发酵过程中氧气供给能力。结果：与大肠杆菌相比，谷氨酸棒状杆菌对L-高丝氨酸具有更强耐受性。研究中通过敲除基因thrB构建了L-苏氨酸缺陷型谷氨酸棒状杆菌重组菌H1，发现基础培养基中加入0.5 g/L的L-苏氨酸后，该重组菌生长恢复正常水平。挡板摇瓶条件下重组菌H1的L-高丝氨酸产量增加至836.7 mg/L，较普通摇瓶产量44.6 mg/L提高了17.76倍。结论：通过阻断L-苏氨酸的合成，成功构建L-高丝氨酸合成菌株谷氨酸棒状杆菌H1，并且发现利用挡板摇瓶增强发酵过程中供氧能力是促进谷氨酸棒状杆菌高效合成L-高丝氨酸的有效手段，为后续提高L-高丝氨酸发酵产量提供了参考。
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关键词:
- L-高丝氨酸 /
- 谷氨酸棒状杆菌重组菌 /
- 强耐受性 /
- 溶氧
Abstract: Objective: In this study, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 was used as the chassis cell for synthesizing L-homoserine and analyzing the effect of dissolved oxygen on product synthesis. Methods: First, the product tolerance of C. glutamicum was analyzed by exogenously adding 0~40 g/L L-homoserine. Second, the degradation pathway of L-homoserine was blocked by gene thrB knockout, namely C. glutamicum recombinant strain H1. On this basis, the shake flask with baffles was used for cell culture to enhance oxygen supply capacity in the fermentation process. Results: Compared with Escherichia coli, C. glutamicum had a stronger tolerance to L-homoserine. In the study, C. glutamicum recombinant strain H1 was constructed by deleting the gene thrB. It was found that the growth of recombinant strain H1 returned to normal after adding 0.5 g/L L-threonine in the basal medium. The L-homoserine production of recombinant strain H1 increased to 836.7 mg/L using shake flask with baffles, which was 17.76 times higher than that using ordinary shake flask, which was 44.6 mg/L. Conclusion: C. glutamicum recombinant strain H1 was successfully constructed for producing L-homoserine via blocking the synthesis of L-threonine. It was found that the using of shake flask with baffles to enhance the oxygen supply capacity during fermentation was an effective means to promote the production of L-homoserine by C. glutamicum. This study provides a reference for improving L-homoserine production subsequently. -
L-高丝氨酸又称2-氨基-4羟基丁酸，属于天冬氨酸家族，L-高丝氨酸虽然不是合成蛋白质的氨基酸，但却具有丰富的生物活性，L-高丝氨酸是合成L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸的前体，同时L-高丝氨酸在医药、农业、食品、化工等领域都具有十分重要的应用价值[1-3]。目前国内外L-高丝氨酸的生产方法主要是化学法和微生物发酵法。化学法过程复杂繁琐，原料用量大，生产成本高，合成效率低。与之相比，微生物发酵法具有生产成本低，反应条件温和，对环境友好等优势，是未来L-高丝氨酸工业化生产的发展趋势，具有较大的研究价值[4-6]。研究报道，菌株自身不能积累L-高丝氨酸，合成的L-高丝氨酸主要被分解为苏氨酸，阻断苏氨酸合成途径是代谢改造以L-高丝氨酸或其下游的蛋氨酸等为目的产物的基本策略之一[7]。
目前，微生物发酵生产L-高丝氨酸的研究方向主要集中在大肠杆菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）。由于遗传背景清晰，E. coli相关的L-高丝氨酸合成研究较为详细。Li等[8]和Liu等[9]报道通过代谢工程改造E. coli，构建了L-高丝氨酸高产菌HM5，发酵45 h合成39.9和37.6 g/L的L-高丝氨酸。为解决发酵过程中添加L-苏氨酸等物质导致成本提高的问题，张宇等[10]以E. coli为底盘细胞，构建1株非营养缺陷型L-高丝氨酸高产菌株，发酵48 h合成52.1 g/L的L-高丝氨酸，为目前报道的最高产量。
作为食品发酵的优势菌株，C. glutamicum可以利用相对廉价的底物合成多种高价值化合物[11]，已成功实现L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸等的高效生产[12-13]。Plachý等[14]和Li等[15]构建了L-苏氨酸营养缺陷型C. glutamicum，阻断L-高丝氨酸竞争及降解途径，L-高丝氨酸的摇瓶产量达到8.8 g/L，表明其为底盘细胞高效生产L-高丝氨酸也具有很大潜力和提升空间。刘剑[16]分析了溶氧影响C. glutamicum生长、谷氨酸合成能力的机制，发现氧限制条件下乳酸以及副产物氨基酸丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸的代谢流通量增加，谷氨酸合成量降低。与此同时，溶氧量是氨基酸发酵过程中的一个十分重要的参数，可直接影响菌体生长和产物积累[17-18]。目前为止，发酵过程中氧气供给能力对C. glutamicum合成L-高丝氨酸的影响尚未有报道。
本研究针对上述问题，以C. glutamicum ATCC 13032为底盘细胞构建L-苏氨酸缺陷型的L-高丝氨酸合成工程菌，进一步探讨了溶氧环境对C. glutamicum积累L-高丝氨酸的影响。首先分析C. glutamicum对L-高丝氨酸的耐受性；然后通过敲除L-高丝氨酸激酶编码基因thrB阻断L-高丝氨酸分解途径，实现L-高丝氨酸积累；在此基础上分析溶氧环境对L-高丝氨酸合成的影响，进一步提升其产量。该研究为进一步实现C. glutamicum高效合成L-高丝氨酸提供理论依据和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
本研究中使用的菌株和质粒见表1。其中E. coli DH5α用于质粒构建，C. glutamicum ATCC 13032作为出发菌株用于构建L-高丝氨酸生产菌株。C. glutamicum基因组编辑系统所用质粒pK18mobsacB。
表 1 实验菌株与质粒Table 1. Experimental strains and plasmids菌株/质粒 特征 来源 E. coli DH5α 用于质粒的扩增与保存 本实验室保存 E. coli W3110 用于L-高丝氨酸生长抑制测定 本实验室保存 C. glutamicum ATCC 13032 野生型，生物素缺陷型 本实验室保存 C. glutamicum H1 13032 衍生菌，∆thrB 本研究 pK18mobsacB 自杀质粒，Kmr 本实验室保存 pK18-thrB 包含thrB同源臂的pK18mobsacB 本研究 L-高丝氨酸标品（纯度99%） 上海麦克林生化科技有限公司；限制性内切酶、质粒提取试剂盒、产物回收试剂盒、基因组提取试剂盒及分子实验相关试剂 上海生工生物有限公司；2×TaqDNA聚合酶、2×pfuDNA聚合酶 杭州宝赛生物公司；其他试剂均为市售分析纯。
SW-CJ-2FD 超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；Scout SE 电子天平 奥豪斯仪器（常州）有限公司；FE28 pH计 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；UPT-I-20 L 超纯水系统 成都优越科技有限公司；TOMYSX-700立式压力蒸汽灭菌器 日本TOMY公司；ZQZY-88CV 全温度振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；5454R高速离心机 艾本德国际贸易有限公司；Eppendorf Eporator 电转化仪 艾本德国际贸易有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SensoQuest Labcycler系列PCR仪 德国圣欧公司；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美国赛默飞公司；Waters HPLC-1525液相色谱仪 沃特世科技（上海）有限公司；AR8210 笔式溶氧仪 希玛仪器仪表有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基的配制及菌株的培养条件
LB培养基（E. coli培养基）：蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；氯化钠10 g/L，固体培养基添加20 g/L的琼脂粉，121 ℃高温灭菌15 min。
LBB培养基（C. glutamicum培养基）：脑心浸出液10 g/L；蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；氯化钠10 g/L，固体培养基添加20 g/L的琼脂粉，115 ℃高温灭菌20 min。
C. glutamicum蔗糖致死培养基：在LBB培养基中添加100 g/L的蔗糖。用于C. glutamicum基因编辑的反向筛选，115 ℃高温灭菌20 min。
LBHIS培养基（用于C. glutamicum电转恢复培养基）：脑心浸出液10 g/L；蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；氯化钠10 g/L；山梨醇91 g/L，115 ℃高温灭菌20 min。
种子培养基：葡萄糖25 g/L；尿素1.25 g/L；玉米浆20 g/L；磷酸二氢钾1 g/L；硫酸镁0.5 g/L，使用氨水调节pH至7.0，115 ℃高温灭菌 20 min。
发酵培养基Ⅰ：葡萄糖50 g/L；玉米浆30 g/L；硫酸铵15 g/L；七水硫酸镁0.87 g/L；甜菜碱1.2 g/L；85%磷酸0.01 g/L；氯化钾0.53 g/L；维生素B1 1 mg/L；七水硫酸亚铁0.12 g/L；一水硫酸锰0.12 g/L；右旋泛素钙6.3 mg/L；烟酰胺42 mg/L；维生素B16 3 mg/L；生物素0.88 mg/L；硫酸锌0.6 mg/L；硫酸铜0.6 mg/L，调节pH至7.0，115 ℃高温灭菌20 min。
发酵培养基Ⅱ：葡萄糖50 g/L；玉米浆20 g/L；硫酸铵20 g/L；磷酸二氢钾1 g/L；七水硫酸镁0.5 g/L；一水硫酸锰0.01 g/L；七水硫酸亚铁0.01 g/L；维生素B1 1 mg/L；维生素B6 6 mg/L；生物素0.025 mg/L；维生素B12 0.2 g/L，使用氨水调节pH至7.0，115 ℃高温灭菌20 min。
CGXⅡ基础培养基（L-高丝氨酸、生长谱测定培养基）：葡萄糖10 g/L；尿素5 g/L；硫酸铵20 g/L；磷酸二氢钾1 g/L；磷酸氢二钾1 g/L；氯化钙13.25 mg/L；七水硫酸镁4 g/L；一水硫酸锰10 mg/L；七水硫酸亚铁10 mg/L；氯化镍0.02 mg/L；硫酸铜0.313 mg/L；硫酸锌1 mg/L；原儿茶酸30 mg/L；维生素B1 1 mg/L；维生素B6 6 mg/L；生物素0.025 mg/L；维生素B12 0.2 g/L，调节pH至7.0，115 ℃高温灭菌20 min。
E. coli的培养条件：37 °C、200 r/min，抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL。C. glutamicum的培养条件为：30 °C、200 r/min，所需抗生素时抗生素浓度：卡那霉素 25 μg/mL。
1.2.2 不同宿主菌对L-高丝氨酸的耐受性分析
在CGXⅡ基础培养基中添加0~40 g/L L-高丝氨酸，培养E. coli W3110与C. glutamicum ATCC 13032，根据菌株生长情况，在适当时间间隔取样，测量菌株的生物量。
1.2.3 基因thrB的敲除
1.2.3.1 感受态细胞的制备、转化以及阳性转化子验证
CaCl2介导E. coli DH5α感受态细胞的制备与转化[19]，0.1 mol/L的CaCl2溶液处理菌体制备感受态细胞，通过热激转化法进行质粒的转化。C. glutamicum ATCC 133032的感受态制备与电击转化的方法参考先前文献报道[20]，通过10%的甘油溶液多次处理细胞，制备电转化的感受态细胞，1.8 kV、5 ms电击感受态细胞进行质粒转化。将阳性转化子进行菌落PCR验证。PCR扩增体系：2×pfu/taqDNA聚合酶 25 μL、上下游引物各2 μL、DNA模板约200 ng，利用双蒸水补充至50 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，合适退火温度下退火15 s，72 ℃延伸适当时间（1 min延伸约1000 bp），30个循环；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。
1.2.3.2 基因thrB敲除载体的构建
使用软件SnapGene 1.1.3设计实验引物，引物由上海生工科技有限公司合成（表2）。
表 2 实验引物Table 2. Primers for the experiments引物名称 引物序列 thrB-L-F-BamH I CATGGATCCCCCGACTCTATTACCTGTGT thrB-L-R CTTGTTGGGCGTCAGTAAAATTAGTCCCTTTCGAGGCG thrB-R-F TTTTACTGACGCCCAACAAGGAAGGCCCCCTTC thrB-R-R-Hind III CCCAAGCTTCTTCCAAACACGCGTCCCCGACAAC thrB-YZ-F GCTATTTCTGCTCGCGTGCA thrB-YZ-R GATTCGAAGGGGGCCTTCCTTGTTG 将C. glutamicum ATCC 133032接种于50 mL的LBB液体培养基中30 ℃、200 r/min，培养24 h；使用基因组提取试剂盒提取C. glutamicum ATCC 133032的基因组；以C. glutamicum ATCC 133032的基因组为模板，使用2×pfuDNA聚合酶，通过引物thrB-L-F-BamH I/thrB-L-R、thrB-R-F/thrB-R-R-Hind III扩增thrB的上下游同源臂；纯化thrB的上下游同源臂片段，使用2×pfuDNA聚合酶，通过引物thrB-L-F-BamH I/thrB-R-R-Hind III进行重叠PCR得到重叠片段；将重叠片段和敲除载体pK18mobsacB使用限制性内切酶BamH I、Hind III进行酶切；将酶切纯化后的同源臂与载体使用T4 DNA连接酶过夜连接，将连接产物通过热激转化转入E. coli DH5α感受态细胞；使用2×taqDNA聚合酶，通过thrB-L-F-BamH I/thrB-R-R-Hind III进行菌落PCR验证；能扩增出同源臂片段的菌株接种于50 mL的LB液体培养基中37 ℃、200 r/min、培养12 h，提取质粒，进行酶切验证，验证正确的即为目的基因敲除载体pK18-thrB。
1.2.3.3 基因thrB敲除过程
菌株基因组的编辑采用pK18mobsacB无痕编辑系统[21]。将敲除载体经电击转化转入C. glutamicum感受态细胞，涂布于含有50 mg/L的卡那霉素的LBB固体培养基，30 ℃恒温培养36 h；将平板上长出的单菌落接种于含有50 mg/L的卡那霉素的LBB液体培养基中，培养24 h，按照试剂盒的提取步骤提取菌株基因组，以基因组为模板扩增片段thrB-L-F-BamH I，成功扩增出前同源臂的菌落即为单交换菌株；将单交换菌株接种于无抗LBB液体培养基，30 ℃、200 r/min、培养24 h后将菌液稀释（10−3、10−4）涂布于含有100 g/L蔗糖的LBB固体培养基，30 ℃培养大约48 h；挑取在平板上生长的单菌落，使用thrB-YZ-F/thrB-YZ-R进行菌落PCR验证，验证结果正确的菌株即为双交换菌株。按照试剂盒的提取步骤提取双交换菌株基因组，以基因组为模板使用引物thrB-YZ-F/thrB-YZ-R进行PCR验证并委托上海生工科技有限公司测序。
1.2.4 基因thrB敲除对C. glutamicum ATCC 13032生长的影响
将C. glutamicum ATCC 13032与C. glutamicum H1在无抗的LBB固体培养基上划线，置于30 ℃培养48 h；从平板上提取单菌落，接种于50 mL的LBB液体培养基中30 ℃、200 r/min、培养12 h；将C. glutamicum ATCC 13032与C. glutamicum H1的菌液按照0.1%的接种量接种于CGXⅡ基础培养基中，另外再将C. glutamicum H1的菌液按照0.1%的接种量接种于添加0.5 g/L的苏氨酸的CGXⅡ基础培养基中，30 ℃、200 r/min培养，测量菌株的生物量（OD600）。
1.2.5 基因thrB敲除对L-高丝氨酸合成的影响
将C. glutamicum ATCC 13032、C. glutamicum H1在无抗的LBB平板上划线，置于30 ℃培养箱培养48 h；从平板上提取单菌落，接种于50 mL的种子培养基中30 ℃、200 r/min、培养24 h；将菌液按照1%的接种量分别接种于发酵培养基Ⅰ与发酵培养基Ⅱ中，30 ℃、200 r/min、发酵72 h，测定生物量OD600以及胞内和胞外L-高丝氨酸含量。
1.2.6 不同摇瓶方式对细胞生长以及L-高丝氨酸合成的影响
将重组菌C. glutamicum H1在无抗的LBB平板上划线，置于30 ℃培养箱培养48 h；从平板挑取单菌落，接种于50 mL的LBB培养基中30 ℃、200 r/min、培养24 h；将菌液按照1%的接种量分别接种于普通摇瓶（规格250 mL，装液量50 mL）和挡板摇瓶（规格500 mL，3×挡板3 cm，装液量100 mL），测定发酵液中葡萄糖、溶氧量、生物量OD600以及L-高丝氨酸产量。
1.3 指标测定
1.3.1 葡萄糖检测
葡萄糖检测条件：葡萄糖采用DNS法测定[22]，配置DNS溶液，用葡萄糖标品配制标准液并绘制标准曲线，将测定值带入标准曲线公式（y=1.316x−0.23，y：OD540，x：葡萄糖浓度g/L），计算葡萄糖含量。
1.3.2 生物量检测
生物量OD600检测条件：分光光度计法测定600 nm下稀释后样品的吸光值（确保读数范围0.3~0.8），将该吸光值乘以稀释倍数作为单位时间的菌体量。
溶氧量检测条件：每隔2 h分别取3瓶挡板摇瓶和普通摇瓶的发酵液，使用笔式溶氧仪测定其溶氧量。
1.3.3 产物检测
产物检测条件：胞内L-高丝氨酸检测过程中利用缓冲液（Tris 20 mmol/L；NaCl 500 mmol/L；10%甘油；pH5.53）将菌体清洗3次并重悬，使用细胞破碎仪将细胞破碎，获得破碎液。将发酵液12000 r/min高速离心10 min，收集上清液。采用OPA柱前在线衍生高效液相色谱法[7]定性定量分析破碎液与上清液中的L-高丝氨酸。用L-高丝氨酸标品配制标准液并绘制标准曲线。色谱条件：色谱柱为 Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），检测器为紫外检测器，检测波长338 nm，柱温箱温度50 °C，流动相为流动相A与流动相B梯度洗脱，进样量2 µL。发酵液高速离心10 min后取上清液与0.4 mol/L的三氯乙酸等体积稀释，4 °C静置4 h以上，4 °C下高速离心10 min后取上清液，稀释适当倍数，使用0.22 µm膜过滤处理。
流动相A液：5 g醋酸钠溶于1 L双蒸水中，冰醋酸调pH至7.2，加入5 mL四氢呋喃，200 μL三乙胺。B液: 5 g醋酸钠溶于200 mL双蒸水中，冰醋酸调pH至7.2，与400 mL甲醇、400 mL乙腈混合。流动相经0.22 μm有机滤膜过滤后超声脱气10 min。
衍生化体系：硼酸缓冲液0.6 mL、OPA溶液0.12 mL、处理好的发酵液0.12 mL、双蒸水2.76 mL。
梯度洗脱程序见表3。
表 3 L-高丝氨酸梯度洗脱程序Table 3. Gradient elution procedure of L-homoserine时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（mL/min） 0 90.0 10.0 1.00 5.00 90.0 10.0 1.00 11.00 33.0 67.0 1.00 14.50 0.0 100.0 1.20 15.00 0.0 100.0 1.20 17.00 90.0 10.0 1.00 25.00 90.0 10.0 1.00 1.4 数据处理
本次实验中每组实验数据均由3次重复实验得到，实验获得的数据用平均值±标准差（SD）表示。采用Origin 2019进行图表绘制。
2. 结果与分析
2.1 不同宿主菌对L-高丝氨酸的耐受性分析
据文献报道，高浓度L-高丝氨酸对多种微生物具有毒害作用并抑制细胞的生长，包括Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans和Escherichia coli [8,23-24]。在 E. coli培养过程中添加3 g/L的L-高丝氨酸，细胞生长延迟期超过20 h，细胞生物量OD600下降50%（图1A）。与此同时，本实验验证了不同L-高丝氨酸浓度对C. glutamicum生长的影响。不添加L-高丝氨酸时，C. glutamicum ATCC13032在10 h时进入对数生长期；添加3~40 g/L的L-高丝氨酸时，细胞生长在对数期受到抑制，但培养结束时细胞生物量OD600并无明显著差别（图1B）。由于L-高丝氨酸在C. glutamicum培养过程中不会完全消耗，菌株中某些基因，例如参与L-高丝氨酸胞外转运的BrnF/BrnE，被L-高丝氨酸激活，从而增强菌株在L-高丝氨酸中的耐受性，或者该菌株中存在完整的L-高丝氨酸应激机制[10]。以上结果表明，C. glutamicum具有更强的L-高丝氨酸耐受性，能够在高浓度L-高丝氨酸环境下生长，更有利于L-高丝氨酸的代谢合成。
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图 1 不同宿主菌对L-高丝氨酸的耐受性分析注：A：大肠杆菌；B：谷氨酸棒状杆菌。Figure 1. Tolerance analysis of different host bacteria to L-homoserine2.2 基因thrB敲除的验证及其对C. glutamicum ATCC 13032生长的影响
根据文献报道的C. glutamicum基因敲除方法，本研究以C. glutamicum ATCC 13032基因组为模板，通过引物thrB-L-F-BamH I/thrB-L-R，thrB-R-F/thrB-R-R-Hind III扩增500 bp的L与R同源臂，并将两同源臂连接至敲除载体pK18mobsacB，构建了敲除质粒pK18-thrB，构建过程如图2A所示。对敲除质粒进行单酶切和双酶切验证，双酶切后目的条带为基因上下游同源臂，条带大小1000 bp，表明基因thrB敲除质粒构建成功（图2B）。随后，将该质粒电转入C. glutamicum进行基因thrB敲除。通过引物thrB-YZ-F/thrB-YZ-R进行PCR验证，发现目标片段长度由原始菌的1478 bp减小为敲除菌的548 bp，表明L-高丝氨酸激酶编码基因thrB已经成功敲除，获得重组菌C. glutamicum H1（图2C）。
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图 2 基因thrB敲除及其对C. glutamicum ATCC 13032生长的影响注：A：基因thrB敲除质粒构建流程图；B：基因thrB敲除质粒琼脂糖凝胶电泳图，M：marker；1：上游同源臂（L）；2：下游同源臂（D）；3：L-D重叠 PCR产物；4：敲除质粒单酶切验证；5：敲除质粒双酶切验证；C：基因thrB敲除PCR验证，M：marker；1：野生菌C. glutamicum ATCC 13032；2：基因thrB敲除菌C. glutamicum H1；D：基因thrB敲除对C. glutamicum ATCC 13032生长的影响。Figure 2. The deletion of gene thrB and its effect on the growth of C. glutamicum ATCC 13032对基因thrB敲除前后的菌株生长谱进行分析。为降低LBB培养基对生长谱鉴定的影响，接种量由百分之一减少至千分之一，导致30 h前菌株生长缓慢。由于基因thrB的敲除阻断了L-苏氨酸合成途径，重组菌C. glutamicum H1不能合成苏氨酸；而L-苏氨酸为菌体生长的必需氨基酸，因此该重组菌在基础培养基上无法正常生长。在基础培养基中加入0.5 g/L的L-苏氨酸后，重组菌C. glutamicum H1生长恢复正常水平（图2D）。
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图 3 L-高丝氨酸激酶编码基因thrB敲除对L-高丝氨酸合成的影响注：A：野生菌C. glutamicum ATCC 13032与基因thrB敲除菌C. glutamicum H1 72 h发酵液高效液相色谱分析；B：野生菌C. glutamicum ATCC 13032与基因thrB敲除菌C. glutamicum H1的细胞生长以及L-高丝氨酸产量分析。Figure 3. The effect of gene thrB deletion on the synthesis of L-homoserine2.3 L-高丝氨酸激酶编码基因thrB敲除对L-高丝氨酸合成的影响
研究报道，苏氨酸是L-高丝氨酸的主要分解途径，阻断苏氨酸合成途径是代谢改造以L-高丝氨酸或其下游的蛋氨酸等为目的产物的基本策略之一[24]。本研究中考察了L-苏氨酸代谢途径基因thrB敲除对C. glutamicum生长和L-高丝氨酸合成的影响。首先，本研究通过高效液相色谱法分析了不同培养基下L-高丝氨酸的合成情况，结果表明重组菌C. glutamicum H1利用培养基Ⅱ发酵72 h合成L-高丝氨酸产量高于培养基Ⅰ（表4）。随后，对C. glutamicum ATCC 13032与重组菌C. glutamicum H1发酵过程进行分析，如图3所示。重组菌C. glutamicum H1可以成功实现积累L-高丝氨酸，而原始菌发酵液中未检测到目标产物，证实了C. glutamicum中基因thrB的敲除对L-高丝氨酸积累具有促进作用（图3A）。由于发酵培养基Ⅱ中存在苏氨酸，基因thrB的敲除对菌体生长未产生明显影响，重组菌C. glutamicum H1的L-高丝氨酸产量为44.6 mg/L（图3B）。为进一步提升重组菌C. glutamicum H1的L-高丝氨酸合成能力，本实验考察了发酵环境对其产物合成的影响。
表 4 不同培养基下L-高丝氨酸的产量（mg/L）Table 4. The production of L-homoserine in different media (mg/L)培养基 C. glutamicum ATCC 13032 C. glutamicum H1 发酵培养基Ⅰ 0 22.4±0.35 发酵培养基Ⅱ 0 44.6±0.72 2.4 不同摇瓶方式对L-高丝氨酸合成的影响
细胞溶氧环境对C. glutamicum发酵过程中碳代谢以及菌体生长具有十分重要的影响，例如低溶氧条件导致杂酸代谢流增加，菌体浓度仅为高溶氧条件下的44.7%[25-27]。文献报道，挡板摇瓶溶氧系数可达1.20～1.80 L/h，比普通摇瓶提高2倍[28]。本研究利用不同种类摇瓶实现两种溶氧方式并分析其对菌体生长以及L-高丝氨酸合成的影响。由于改善细胞溶氧环境可以增强TCA循环代谢流[29]，挡板摇瓶的菌体浓度是普通摇瓶的2.51倍（图4）。挡板摇瓶条件下发酵72 h后，C. glutamicum H1的胞内和胞外L-高丝氨酸产量分别是普通摇瓶的2.62和18.76倍，达到1.78 mg/g-DCW和836.7 mg/L（表5），主要原因存在于NADPH再生能力得到增强，为L-高丝氨酸合成提供了更多辅因子[30]。在后续菌株改造过程中，将尝试将血红蛋白（VHb）编码基因vgb插入C. glutamicum基因组，提升细胞摄氧能力，进而增强其L-高丝氨酸合成能力[31]。由于基因thrB与天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶编码基因thrA的表达具有正相关的关系[32]，后期研究中也将在重组菌C. glutamicum H1中过表达基因thrA以提升L-高丝氨酸的合成。
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图 4 不同培养环境下菌株的生长情况及溶氧变化Figure 4. Growth and dissolved oxygen of strains in different culture environments表 5 不同摇瓶方式对L-高丝氨酸合成的影响Table 5. The effect of different shaking flasks on the synthesis of L-homoserine摇瓶种类 菌株 胞外L-高丝氨酸（mg/L） 胞内L-高丝氨酸
（mg/g-DCW）OD600 残糖（g/L） 普通摇瓶 C. glutamicum H1 44.6±0.72 0.68±0.015 16.03±0.52 16.61±0.63 挡板摇瓶 C. glutamicum H1 836.7±20.54 1.78±0.143 40.2±2.12 4.24±0.25 3. 结论
对C. glutamicum及 E. coli进行L-高丝氨酸耐受性实验，发现C. glutamicum对L-高丝氨酸的耐受能力具有优势，能够在高浓度L-高丝氨酸环境下生长，更易实现高密度发酵生产L-高丝氨酸。通过敲除thrB基因阻断了重组C. glutamicum的L-高丝氨酸向L-苏氨酸转化途径，成功构建了菌株C. glutamicum H1实现L-高丝氨酸的积累。通过挡板摇瓶发酵， C. glutamicum H1的L-高丝氨酸产量由44.6 mg/L提高到836.7 mg/L，产量提升了17.76倍，证实利用挡板摇瓶增强发酵过程中供氧能力是促进谷氨酸棒状杆菌高效合成L-高丝氨酸的有效手段。在C. glutamicum发酵过程中，可以通过改变溶氧环境提高其L-高丝氨酸的合成能力，为其高密度发酵产L-高丝氨酸奠定基础。
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图 1 不同宿主菌对L-高丝氨酸的耐受性分析
注：A：大肠杆菌；B：谷氨酸棒状杆菌。
Figure 1. Tolerance analysis of different host bacteria to L-homoserine
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图 2 基因thrB敲除及其对C. glutamicum ATCC 13032生长的影响
注：A：基因thrB敲除质粒构建流程图；B：基因thrB敲除质粒琼脂糖凝胶电泳图，M：marker；1：上游同源臂（L）；2：下游同源臂（D）；3：L-D重叠 PCR产物；4：敲除质粒单酶切验证；5：敲除质粒双酶切验证；C：基因thrB敲除PCR验证，M：marker；1：野生菌C. glutamicum ATCC 13032；2：基因thrB敲除菌C. glutamicum H1；D：基因thrB敲除对C. glutamicum ATCC 13032生长的影响。
Figure 2. The deletion of gene thrB and its effect on the growth of C. glutamicum ATCC 13032
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图 3 L-高丝氨酸激酶编码基因thrB敲除对L-高丝氨酸合成的影响
注：A：野生菌C. glutamicum ATCC 13032与基因thrB敲除菌C. glutamicum H1 72 h发酵液高效液相色谱分析；B：野生菌C. glutamicum ATCC 13032与基因thrB敲除菌C. glutamicum H1的细胞生长以及L-高丝氨酸产量分析。
Figure 3. The effect of gene thrB deletion on the synthesis of L-homoserine
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图 4 不同培养环境下菌株的生长情况及溶氧变化
Figure 4. Growth and dissolved oxygen of strains in different culture environments
表 1 实验菌株与质粒
Table 1 Experimental strains and plasmids
菌株/质粒 特征 来源 E. coli DH5α 用于质粒的扩增与保存 本实验室保存 E. coli W3110 用于L-高丝氨酸生长抑制测定 本实验室保存 C. glutamicum ATCC 13032 野生型，生物素缺陷型 本实验室保存 C. glutamicum H1 13032 衍生菌，∆thrB 本研究 pK18mobsacB 自杀质粒，Kmr 本实验室保存 pK18-thrB 包含thrB同源臂的pK18mobsacB 本研究 
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表 2 实验引物
Table 2 Primers for the experiments
引物名称 引物序列 thrB-L-F-BamH I CATGGATCCCCCGACTCTATTACCTGTGT thrB-L-R CTTGTTGGGCGTCAGTAAAATTAGTCCCTTTCGAGGCG thrB-R-F TTTTACTGACGCCCAACAAGGAAGGCCCCCTTC thrB-R-R-Hind III CCCAAGCTTCTTCCAAACACGCGTCCCCGACAAC thrB-YZ-F GCTATTTCTGCTCGCGTGCA thrB-YZ-R GATTCGAAGGGGGCCTTCCTTGTTG
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表 3 L-高丝氨酸梯度洗脱程序
Table 3 Gradient elution procedure of L-homoserine
时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（mL/min） 0 90.0 10.0 1.00 5.00 90.0 10.0 1.00 11.00 33.0 67.0 1.00 14.50 0.0 100.0 1.20 15.00 0.0 100.0 1.20 17.00 90.0 10.0 1.00 25.00 90.0 10.0 1.00
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表 4 不同培养基下L-高丝氨酸的产量（mg/L）
Table 4 The production of L-homoserine in different media (mg/L)
培养基 C. glutamicum ATCC 13032 C. glutamicum H1 发酵培养基Ⅰ 0 22.4±0.35 发酵培养基Ⅱ 0 44.6±0.72
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表 5 不同摇瓶方式对L-高丝氨酸合成的影响
Table 5 The effect of different shaking flasks on the synthesis of L-homoserine
摇瓶种类 菌株 胞外L-高丝氨酸（mg/L） 胞内L-高丝氨酸
（mg/g-DCW）OD600 残糖（g/L） 普通摇瓶 C. glutamicum H1 44.6±0.72 0.68±0.015 16.03±0.52 16.61±0.63 挡板摇瓶 C. glutamicum H1 836.7±20.54 1.78±0.143 40.2±2.12 4.24±0.25
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