Screening and Probiotic Properties of Lactic Acid Bacteria Inhibiting α-Amylase and α-Glucosidase Activities in Camel Dairy Products
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摘要: 目的：本研究以新疆阿勒泰地区的驼乳制品为研究对象，筛选对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有抑制活性的优良乳酸菌。方法：采用稀释涂布法分离纯化菌株，DNS和pNPG法筛选对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有抑制活性的菌株，通过耐酸性、耐胆盐、模拟胃肠道环境耐受性、抑菌性、抗氧化活性实验评价菌株的益生特性。结果：从驼乳制品中共计获得34株菌株，其中6株对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有抑制活性，经过形态学和16S rRNA分子鉴定，确定有4株为植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum，2株为副干酪乳杆菌Lactiplantibacillus paracasei。6株乳酸菌对α-淀粉酶的抑制活性都达到50%以上，其中X34对α-淀粉酶的抑制率最高达到88.59%。本实验中筛选的乳酸菌对α-葡萄糖苷酶的抑制率在11%~16%之间，X31抑制率最高为15.43%。6株乳酸菌在不同pH（1.0、2.0、3.0）和不同浓度胆盐（1、2、3 g/L）的培养基中均可存活。6株乳酸菌在模拟胃液和肠液中的存活率分别达到83%和90%以上。对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率超过90%以上，其中X29对羟自由基的清除率最高为92.43%，对超氧阴离子自由基清除率最强的是X33清除率达到94.04%。6株乳酸菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，其中X31对大肠杆菌的最大抑菌圈直径为19.63 mm，X23对沙门氏菌抑菌圈最大达到19.85 mm，菌株X33对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径最大为19.17 mm。结论：从驼乳制品中筛选到6株具有潜在降糖活性的乳酸菌，对强酸、胆盐和胃肠液有一定的耐受性，抗氧化能力较强，具有抑制致病菌的效果，为后期研发功能性降糖饮品提供益生菌株。Abstract: Objective: In this study, camel dairy products from the Altay region of Xinjiang were used to screen for excellent lactic acid bacteria with inhibitory activity against α-amylase and α-glucosidase. Methods: The strains were isolated and purified by dilution coating method, screened by DNS and pNPG methods for their inhibitory activity against α-amylase and α-glucosidase, and evaluated for their probiotic properties by acid tolerance, bile salt tolerance, tolerance to simulated gastrointestinal environment and bacterial inhibition assays. Results: A total of 34 strains were obtained from camel dairy products, six of which showed inhibitory activity against α-amylase and α-glucosidase. After morphological analysis and 16S rRNA molecular identification, four strains were identified as Lactobacillus plantarum and two as Lactobacillus paracasei. The inhibitory activity of six strains of Lactobacillus plantarum reached more than 50% against α-amylase, with one strain of Lactobacillus paracasei X34 showing the highest inhibition rate of 88.59% against α-amylase; the inhibitory activity against α-glucosidase ranged from 11% to 16%, with one strain of Lactobacillus plantarum X31 showing the highest inhibition rate of 15.43%. Six strains of Lactobacillus survived at different pH (1.0, 2.0, 3.0) and in different concentrations of bile salts (1, 2 and 3 g/L) in the medium. The survival rate of 6 strains of lactic acid bacteria in simulated gastric juice and intestinal juice was 83% and 90%, respectively. The scavenging rate of hydroxyl radicals and superoxide anion radicals exceeded 90%, among which X29 had the highest scavenging rate of 92.43% for hydroxyl radicals and the strongest scavenging rate of 94.04%. Six strains of lactic acid bacteria inhibited Escherichia coli, Salmonella and Staphylococcus aureus, with X31 having a maximum inhibition circle diameter of 19.63 mm against Escherichia coli, X23 having a maximum inhibition circle of 19.85 mm against Salmonella and X33 having a maximum inhibition circle diameter of 19.17 mm against Staphylococcus aureus. Conclusion: Six strains of lactic acid bacteria with potential hypoglycaemic activity, tolerance to strong acids, bile salts and gastrointestinal fluids, high antioxidant effect and inhibition of pathogenic bacteria were screened from camel dairy products to provide probiotic strains for later development of functional hypoglycaemic drinks.
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Keywords:
- camel milk /
- sour camel milk /
- lactic acid bacteria /
- α-amylase /
- α-glucosidase /
- inhibitory activity /
- probiotic properties
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糖尿病是一种以高血糖为主要特征的代谢性疾病[1]，餐后食物中碳水化合物被α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖和果糖等被机体消化吸收引起血糖水平的升高[2]，因此，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，可减缓餐后血糖升高，对预防和控制糖尿病起关键性作用。目前，常用的降糖药物如阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇[3]等都属于α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物，长期服用会对人体产生一定的副作用，因此开发各类副作用小、能兼顾治疗并发症的药物，特别是天然物质在治疗糖尿病方面受到日益重视[4]。
驼乳营养价值丰富，有一定的保健功效，对糖尿病、肺结核、肝炎和胃肠道等疾病的治疗有改善作用，有研究表明这与驼乳中蕴含的益生菌资源有关[5]。乳酸菌就是其中之一，它作为一种益生菌对预防和调节糖尿病具有一定的作用，一方面通过产生胞外多糖、γ-氨基丁酸等活性物质[6]可缓解糖尿病症状，达到降低血糖的目的，另一方面可通过调节肠道菌群、增强免疫力、提高抗氧化能力等，对肥胖、糖尿病等慢性代谢疾病起到一定的改善作用[7]。目前，对驼奶及其奶制品中的乳酸菌资源的开发还有待提升，但是已经证明驼乳以及乳制品中有一定的乳酸菌资源。Elvira等[8]从驼乳和发酵驼乳中分离得到17株乳酸菌，罗伊氏乳杆菌Lactobacillaceae占比53%，乳酸乳球菌属Lactococcus占23%。李远等[9]从新疆采集的4份酸驼乳中分离得到22株乳酸菌，其中乳杆菌属Lactobacillus有16株占72.72%，其次是乳酸乳球菌属Lactococcus有3株占13.63%。驼奶及发酵驼奶中的乳酸菌对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制性的研究也较少。分离自马肠道中的唾液乳杆菌MW1对α-葡萄糖苷酶抑制率高达46.36%，且对酸性、胆盐、胃肠液环境的耐受性较好[10]。有研究发现，人体肠道中的1株乳杆菌菌株具有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性能力，并且可以降低体内血糖反应[11]。因此，对驼乳及驼乳制品中的益生菌资源的挖掘，借助驼乳及其中的乳酸菌对血糖的调节作用，并开发α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶降解功能的微生物类食药产品，对有效替代高价格、高成本的预防和治疗糖尿病保健品具有重要意义。
本研究从新疆阿勒泰地区驼乳制品中筛选对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有抑制活性的乳酸菌，并评价它们对酸性、胆盐、肠胃液的耐受性、病原菌的抑制作用以及抗氧化活性，为后续进一步开发新疆本地具有降糖活性的驼乳制品提供一定的资源支持和理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
鲜驼奶和自制的酸驼奶样品 采集位于阿勒泰吉木乃县万驼园地区牧民自家，用离心管将样品用干冰低温保存，快速运回实验室置于−20 ℃冰箱中暂时保存；大肠杆菌0517、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌 均来自实验室保藏；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、NA培养基、琼脂粉 北京奥博星生物技术有限公司，葡萄糖 天津盛奥化学试剂有限公司；乙酸钠、硫酸镁、吐温80、磷酸氢二钾、氢氧化钠 天津市致远化学试剂有限公司；柠檬酸氢二铵 天津市北联精细化学品开发有限公司；硫酸锰 天津市福晨化学试剂厂；可溶性淀粉、甘油 天津市鑫铂特化工有限公司，胃蛋白酶（1:30000）、胰蛋白酶（1:250）、牛胆盐、PBS缓冲溶液、α-淀粉酶（50 ku）、α-葡萄糖苷酶（100 U）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、DNS试剂 上海源叶生物科技有限公司；阿卡波糖 上海麦克林生化科技有限公司；人工胃液 称取0.3 g胃蛋白酶、溶于100 mL 50 g/L的NaCl溶液中，用1 mol/L HCl调整pH为3.0后，经0.22 μm的微孔过滤膜过滤除菌备用；人工肠液 称取0.1 g胰蛋白酶、溶于100 mL50 g/L的NaCl溶液中，用1 mol/L NaOH调整pH为8.0后，经0.22 μm的微孔过滤膜过滤除菌备用。
Presoo17型微量高速离心机、YXQ-LS-75SⅡ型压力蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2FD型超净工作台 上海博迅医疗生物仪器公司；ZWY型恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司；UV-6550型紫外分光光度计 日本自动化设备公司；DK-8D型电热恒温水槽 上海齐欣科学仪器有限公司；SepectraMaxM5e型酶标仪 METTLER TOLEDO；pH计 梅特勒托利多科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 驼乳样品中乳酸菌的分离纯化
在超净工作台中取10 mL的样品加入90 mL的无菌水中，形成稀释液，吸取1 mL稀释液加入到9 mL无菌试管水中，依次稀释成10−3、10−4、10−5。每个稀释度的样品吸取200 µL涂布于MRS固体培养基上，每个梯度做3个平行，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，根据形态、颜色、大小挑选单菌落继续划线纯培养。直至平板上全部为单菌落，对挑选的菌株进行编号，并记录颜色、大小、形态，将筛选得到的单菌落进行甘油保藏。
1.2.2 乳酸菌产酸特性
将甘油保存的乳酸菌活化2~3代，按照3%的接种量接种于MRS液体培养基中，在37 ℃、120 r/min的摇床中恒温培养18 h，将发酵液在6000 r/min、4 ℃的条件下离心10 min，在含有1.5% CaCO3的MRS固体培养基平板上选择合适的间距打孔，取100 µL的发酵上清液加入孔中，37 ℃恒温培养24~48 h，测量溶钙圈直径。
1.2.3 α-淀粉酶抑制活性的测定
样品处理：将冻存于甘油管的乳酸菌活化2~3代后，以3%的接种量接种到MRS液体培养基中，37 ℃培养18 h，发酵液在6000 r/min、4 ℃的条件下离心10 min，保留上清液备用。
参考文献[12]的方法加以修改，将125 µL样品上清液与1 mg/mL α-淀粉酶溶液等体积混合，于37 ℃孵育10 min，然后将混合液加入至37 ℃的250 µL的1.5%的可溶性淀粉溶液中，于37 ℃反应15 min，再加入500 µL DNS溶液，在沸水浴中反应5 min后迅速冷却至室温，稀释20倍后静置30 min，并于540 nm处测定吸光值。用PBS溶液（0.1 mol/L，pH=6.8）作为α-淀粉酶溶液和待测样品的空白对照，每组设定3个平行。
式中：A为样品组，含有样品溶液和α-淀粉酶溶液；B为样品空白组，含有样品溶液不含α-淀粉酶溶液；C为对照组，不含样品溶液含α-淀粉酶溶液；D为空白组，不含样品溶液不含α-淀粉酶溶液。
1.2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
样品处理同1.2.3，测定方法参考文献[13]并加以修改，取1.5 mL的离心管加入50 µL的样液，再加入100 µL浓度为0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，将混合物于37 ℃孵化10 min，再加入50 µL浓度为5 mmol/L的对硝基苯酚-α-D-吡喃葡葡糖苷溶液，继续在37 ℃恒温水浴锅中反应20 min，再加入50 µL浓度为0.2 mol/L Na2CO3终止反应，将反应液于405 nm处测量吸光度值。
式中：A为样品组含有样品溶液以及α-葡萄糖苷酶溶液；B为样品空白组含有样品溶液不含α-葡萄糖苷酶溶液；C为对照组不含有样品溶液含α-葡萄糖苷酶溶液；D为空白组不含有样品溶液以及α-葡萄糖苷酶溶液。
1.2.5 16S rRNA基因测序及系统发育学分析
将筛选得到的34株菌由上海生工生物工程技术服务有限公司进行16S rRNA基因鉴定，将测定序列提交至GenBank数据库，获取登录号，得出所鉴定菌株种属关系。对有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的乳酸菌序列，使用MEGA软件进行系统发育树的构建[14]。
1.3 乳酸菌益生特性测定
1.3.1 生长曲线和产酸性的测定
将筛选得到的对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有抑制活性的菌株，按照3%的接种量接种到MRS液体培养基中37 ℃、120 r/min进行摇床培养，每隔2 h对发酵液取样测定在600 nm下的吸光度值，以未接菌的MRS液体培养基作为空白调零。同时测定发酵液的pH。
1.3.2 耐酸、耐胆盐实验
活化3代后的菌株，按照3%的接种量接种于pH为1.0、2.0、3.0的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养分别在0、6、12 h测OD600 nm处的吸光度值，以未接种的MRS液体培养基作为空白调零。
活化后的菌株按照3%的接种量接种于胆盐添加浓度为1、2、3 g/L的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养分别在0、3、6 h取样，测定其OD600 nm处的吸光度值，以未添加胆盐的MRS液体培养基作为空白调零。
1.3.3 肠胃液耐受实验
将活化后的菌液，用灭菌PBS缓冲溶液清洗3次（6000 r/min、4 ℃、10 min）菌泥中加PBS缓冲溶液吹打混匀后制成供试菌液，并调节菌悬液浓度为1×108 CFU/mL。处理后的菌悬液接种于含9 mL过滤除菌处理的pH3.0的人工胃液中，置于37 ℃恒温培养箱中培养。分别在0、3 h取样进行合适的梯度稀释涂布，平板计数法测定其活菌数，计算存活率。
式中：N1为人工胃液处理3 h后的活菌数；N0为人工胃液处理0 h后的活菌数。
将在模拟胃液中孵育3 h后的菌液，接种于经过滤除菌的人工肠液中，继续置于37 ℃恒温培养箱中培养。分别在0、4 h取样进行合适的梯度稀释涂布，平板计数测定其活菌数，计算存活率。
式中：N1为人工肠液处理4 h后的活菌数；N0为人工肠液处理0 h后的活菌数。
1.3.4 抗氧化实验
1.3.4.1 羟自由基清除能力的测定
参考羟自由基试剂盒的方法，在对照管中分别加入试剂一150 μL、试剂二150 μL、H2O 750 μL、试剂三300 μL，37 ℃反应20 min测定吸光度值；空白管中分别加入试剂一150 μL、H2O 900 μL、试剂三300 μL，37 ℃反应20 min测定吸光度值；测定管中分别加入试剂一150 μL、试剂二150 μL、H2O 450 μL、试剂三300 μL、样品300 μL，37 ℃反应20 min测定吸光度值。
式中：A对照—不加样品的比色皿吸光度值；A空白—不加样品和试剂二的比色皿吸光度值；A测定—加样品和所有试剂的比色皿吸光度值。
1.3.4.2 超氧阴离子自由基清除能力的测定
参考超氧阴离子自由基试剂盒的方法，在对照管中分别加入试剂一40 μL、试剂二160 μL、H2O 100 μL、充分混匀，25 ℃反应1 min，试剂三200 μL、充分混匀，37 ℃反应30 min，试剂四200 μL、试剂五200 μL、充分混匀，37 ℃显色20 min，测定吸光度值；在测定管中分别加入试剂一40 μL、试剂二160 μL、充分混匀，25 ℃反应1 min，样品100 μL、试剂三200 μL、充分混匀，37 ℃反应30 min，试剂四200 μL、试剂五200 μL、充分混匀，37 ℃显色20 min，测定吸光度值。
式中：A对照—不加样品的比色皿吸光度值；A测定—加样品的比色皿吸光度值。
1.3.5 抑菌实验
采用打孔法评价乳酸菌的抑菌活性。无菌培养皿中倒入20 mL的NA培养基，水平放置在超净工作台中静置至凝固，将100 µL的指示菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌）菌悬液均匀涂布在NA培养基上，利用打孔器在NA培养基上打孔，加入乳酸菌上清液100 µL，加入等量的灭菌MRS液体培养基作为对照，于37 ℃培养24~48 h，观察并测量抑菌圈。每个菌株做3次平行，取其平均值。
1.4 数据处理
实验重复3次，数据以平均值±标准差表示，实验数据用SPSS 24软件分析，Duncan多重比较法进行差异性显著比较，P<0.05表示有显著差异性，使用Origin 2021软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 菌株的形态鉴定及产酸特性
通过稀释涂布法，将分离得到的菌落平板置于恒温培养箱中培养24~48 h后，根据其菌落形态、表面特征分离得到34株菌株，经革兰氏染色初步判断其中27株为乳酸菌。其菌落形态和产酸溶钙圈直径如表1所示。由表可以看出34株菌在含有碳酸钙的固体MRS培养基上均产生溶钙圈，菌株X23的溶钙圈直径最大达到22.33 mm，其中有5株菌株的溶钙圈直径达到20 mm以上，有23株菌株的溶钙圈直径达到15 mm以上，6株菌株的溶钙圈直径在11~15 mm之间。证明分离得到的菌株均能产生酸性物质使碳酸钙溶解。
表 1 34株菌株的菌落形态和溶钙圈直径Table 1. Colony morphology and diameter of calcium soluble circles of the 34 strains编号 菌落形态 革兰氏
染色溶钙圈直径（mm） X1 菌落较大，白色透明，表面干燥凸起有褶皱，边缘不规则 阴性 16.03±0.05 X2 菌落较小，乳白色不透明，表面干燥，边缘光滑 阳性 18.50±0.41 X3 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 18.33±0.47 X4 菌落较大，灰白色不透明，表面粘稠，光滑圆形 阴性 18.07±0.09 X5 菌落较小，灰白色不透明，菌落呈圆形，边缘光滑 阳性 17.23±0.03 X6 菌落较小，灰白色不透明，表面湿润，光滑圆形 阳性 19.33±0.62 X7 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 14.33±0.24 X8 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 14.10±0.29 X9 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 18.83±0.62 X10 菌落较大，淡黄色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阴性 15.42 ±0.04 X11 菌落较小，乳白色不透明，表面干燥，边缘光滑 阳性 17.00±0.41 X12 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阳性 20.83±0.62 X13 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 16.50±0.41 X14 菌落较小，乳白色半透明，表面光滑有凸起，边缘整齐 阴性 18.20±0.02 X15 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 17.50±0.41 X16 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 18.07±0.09 X17 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 18.23±0.05 X18 菌落较小，淡黄色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阴性 16.28±0.02 X19 菌落较大，淡黄色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阴性 11.50±0.01 X20 菌落较大，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阴性 12.43±0.18 X21 菌落较小，灰白色不透明有凸起表面湿润，边缘光滑圆形 阳性 13.67±0.12 X22 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 18.30±0.02 X23 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘规则有凸起 阳性 22.33±0.85 X24 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 16.17±0.24 X25 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 18.20±0.04 X26 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 16.70±0.03 X27 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 13.50±0.41 X28 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 16.87±0.19 X29 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 16.80±0.30 X30 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 16.00±0.41 X31 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阳性 20.27±0.52 X32 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 15.93±0.09 X33 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 20.00±0.08 X34 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阳性 20.83±0.62 2.2 菌株的16S rRNA基因鉴定
为了确定分离得到34株菌株的种属，将菌株的16S rRNA基因鉴定结果进行分析，与GenBank中已知的相似序列进行比对，结果如表2所示。34株菌株的同源性都在97%以上，大于分类研究阈值97%，其中Bacillus subtilis 1株，Enterococcus faecalis 2株，Lactococcus lactis 5株，Klebsiella sp 2株，Leuconostoc lactis 2株，Enterococcus durans 1株，Leuconostoc mesenteroides 7株，Leuconostoc pseudomesenteroides 3株，Acetobacter fabarum 2株，Lactobacillus plantarum 4株，Uncultured Acetobacter sp 1株，Acetobacter pasteurianus 1株，Enterococcus italicus 1株，Lactobacillus paracasei 2株。其中杆菌有13株占总细菌数的38.24%，Lactobacillus plantarum为优势种（66.67%）。球菌有21株占总细菌数的61.76%，分属于Enterococcus、Lactococcus和Leuconostoc 3个属，Leuconostoc mesenteroides为优势种（33.33%）。
表 2 菌株的 16S rRNA 鉴定结果Table 2. Results of 16S rRNA identification编号 菌株名称 登录号 同源性 X1 Bacillus subtilis OM914980 99.90% X2 Enterococcus faecalis OM914979 99.55% X3 Lactococcus lactis OM914977 99.64% X4 Klebsiella sp. OM914976 99.81% X5 Leuconostoc lactis OM914975 99.56% X6 Enterococcus durans OM914974 99.47% X7 Leuconostoc mesenteroides OM914973 97.54% X8 Leuconostoc pseudomesenteroides OM914972 99.36% X9 Leuconostoc mesenteroides OM914971 97.08% X10 Acetobacter fabarum OM914970 98.24% X11 Enterococcus faecalis OM914968 99.82% X12 Lactobacillus plantarum OM063101 99.02% X13 Lactococcus lactis OM914966 99.47% X14 Klebsiella oxytoca OM914965 98.55% X15 Lactococcus lactis OM914963 99.64% X16 Lactococcus lactis OM914964 99.91% X17 Leuconostoc pseudomesenteroides OM914960 99.64% X18 Acetobacter fabarum OM914956 99.44% X19 Uncultured Acetobacter sp. FJ348419.1 99.02% X20 Acetobacter pasteurianus CP039846.1 100.00% X21 Leuconostoc lactis MF425334.1 100.00% X22 Lactococcus lactis MT597705.1 100.00% X23 Lactiplantibacillus plantarum OM056676 100.00% X24 Leuconostoc mesenteroides OM915398 100.00% X25 Leuconostoc pseudomesenteroides OM914919 99.93% X26 Leuconostoc mesenteroides OM914920 99.79% X27 Enterococcus italicus OM915397 100.00% X28 Leuconostoc mesenteroides OM915396 99.93% X29 Lactobacillus paracasei OM056677 99.93% X30 Leuconostoc mesenteroides OM915395 100.00% X31 Lactiplantibacillus plantarum OM056678 100.00% X32 Leuconostoc mesenteroides OM915399 100.00% X33 Lactiplantibacillus plantarum OM056679 99.79% X34 Lactobacillus paracasei OM056680 100.00% 2.3 具有降糖活性乳酸菌的筛选
从上述的27株乳酸菌中，通过DNS和pNPG法筛选得到6株对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有抑制活性的乳酸菌。由表3可知，6株乳酸菌对α-淀粉酶抑制率在50%到90%之间，与阳性对照阿卡波糖抑制率有显著差异（P<0.05），其中菌株X23、X33、X34对α-淀粉酶的抑制率达到了80%以上，抑制率分别为80.97%、83.01%和88.59%，X34对α-淀粉酶的抑制活性显著高于其余5株乳酸菌（P<0.05）。X31对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高为15.43%，与其余5株乳酸菌之间有显著性差异（P<0.05），其次是X12抑制率为13.39%，X23和X29对α-葡萄糖苷酶的抑制率无显著性差异（P>0.05），抑制率分别为12.91%和12.62%。筛选的6株乳酸菌对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用。
表 3 乳酸菌对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率Table 3. Inhibition of α-amylase and α-glucosidase by lactic acid bacteria2.4 系统发育树的构建
将6株乳酸菌的测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，并将结果上传至GenBank，发现6株乳酸菌与GeneBank数据库中参考菌株的同源性达到99%以上。利用MEGA软件构建系统发育树。结果如图1所示，可以确定菌株X12、X23、X31和X33为植物乳杆菌，X29和X34为副干酪乳杆菌。
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图 1 6株乳酸菌系统发育树的构建Figure 1. Construction of a phylogenetic tree of six strains of Lactobacillus2.5 乳酸菌的益生特性
2.5.1 乳酸菌的生长曲线和产酸曲线
生长曲线的测定可以反映菌株的生长状况，对乳酸菌其他性能的研究有参考价值。生长结果如图2所示，由生长曲线图可以看出，6株乳酸菌在接种的0~2 h内生长缓慢，2 h后迅速进入生长对数期，生长旺盛，14 h后生长速率逐渐减慢，生长的第20 h乳酸菌的吸光度值达到最高点，20~24 h菌株生长逐渐进入衰亡期。在6株乳酸菌中，X23生长速度最快，说明该菌株适应期与对数期相比其他菌株较短，6株乳酸菌在生长第20 h细菌数保持相对稳定，活菌数达到最高水平，20 h后由于培养基营养物质被消耗，菌体死亡速度大于新生速度，出现负增长，吸光度值开始下降。
从产酸曲线图3中可以看出，6株乳酸菌在接入MRS培养基后的0 h和24 h发酵液pH变化较大，其中X23发酵液的pH从起始的5.54降低到3.70，其次是X29、X12、X31、X33和X34。在接种后的2 h内发酵液的pH变化不是很大，2~14 h之间，6株乳酸菌的发酵液pH迅速降低，有5株乳酸菌X12、X23、X29、X31、X33在14 h发酵液的pH都达到了4.0以下，菌株X34在发酵18 h时，pH到达4.0以下。在18~22 h内菌体浓度最大的时候发酵液的pH降到最低，随后6株乳酸菌在发酵的22~24 h内，发酵液的pH逐渐趋于稳定，这与菌株的生长规律密切相关。
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图 3 6株乳酸菌的产酸曲线Figure 3. Acid production curves of six strains of lactic acid bacteria2.5.2 乳酸菌的耐酸性、耐胆盐能力
由图4可知6株乳酸菌在不同酸度的培养基中生长状况不同，随着pH降低，6株乳酸菌的生长受到抑制，但均有存活的趋势，没有被完全抑制。由图可以看出6株乳酸菌对酸性环境的耐受性强弱为X29>X34>X33>X31>X23>X12，其中X29在pH=1.0的酸性培养基中胁迫12 h后，OD值从0 h的0.048增加到12 h的0.083，表现出较高的耐酸性，X12对酸性环境敏感耐受性较低。总体上6株乳酸菌对强酸的生长环境有一定耐受性。
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图 4 6株乳酸菌在不同pH的培养基中吸光度值注：不同小写字母代表同一时间不同菌株之间吸光度值存在显著差异（P<0.05）；图5同。Figure 4. Absorbance values of six strains of Lactobacillus in media of different pH values由图5可知不同浓度的胆盐对菌株的生长影响较大，随着胆盐浓度的增加，6株乳酸菌的生长均受到限制，同一浓度下不同菌株的生长状况也不相同。其中X12在3种不同浓度的胆盐培养基中吸光度值与其余5株乳酸菌存在显著差异（P<0.05），在胆盐浓度为3 g/L的培养基中，X12的吸光度值从第0 h的0.017增加到第6 h的0.315，均显著高于（P<0.05）其余5株乳酸菌的吸光度值，表现出较高的胆盐耐受性。
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图 5 6株乳酸菌在不同胆盐浓度的培养基中吸光度值Figure 5. Absorbance values of six strains of Lactobacillus in media with different bile salt concentrations2.5.3 乳酸菌的肠胃液耐受性
对6株乳酸菌的耐肠胃液耐受性结果如图6所示，在模拟胃液中孵育3 h的乳酸菌，存活率均达到83%以上，其中X29、X31、X33和X34在胃液中的存活率达到90%以上。将在胃液中孵育3 h的乳酸菌接种到人工肠液中孵育4 h，测定乳酸菌对肠液的耐受性，从图中可以看出，乳酸菌在肠液中孵育4 h后的存活率均在90%以上，其中X23、X31和X34的存活率达到99%以上，对胃液的耐受性6株乳酸菌之间都存在显著性差异（P<0.05），X23、X31和X34在肠液中的存活率差异不显著（P>0.05），与剩余3株乳酸菌之间有显著性差异（P<0.05），被测定的6株乳酸菌对肠胃液均表现出较高的耐受性。
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图 6 6株乳酸菌在肠胃液中的存活率注：不同小写字母代表不同菌株之间存在显著差异（P<0.05）。Figure 6. Survival of six strains of lactic acid bacteria in gastrointestinal fluid2.5.4 乳酸菌的抗氧化性能
6株乳酸菌对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率如表4所示，乳酸菌发酵上清液对羟自由基的清除能力较强的菌株依次为X29>X34>X31>X12>X23>X33，其清除率分别达到92.43%、91.35%、90.99%、90.90%、90.44%和90.33%，其中X29对羟自由基的清除率显著高于其余5株乳酸菌（P<0.05）。乳酸菌发酵上清液对超氧阴离子自由基清除率不同，其中清除率最强的是X33清除率达到94.04%，其次是X23、X12、X31和X29清除率分别为93.67%、93.40%、93.38%、92.55%，X34对超氧阴离子自由基的清除能力最低为91.76%，菌株X33对超氧阴离子自由基的清除率显著高于其余5株（P<0.05）。
表 4 乳酸菌对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率Table 4. Scavenging rates of hydroxyl radicals and superoxide anion radicals by lactic acid bacteria菌株编号 羟自由基清除率（%） 超氧阴离子自由基清除率（%） X12 90.90±0.0005c 93.40±0.001b X23 90.44±0.0003d 93.67±0.001b X29 92.43±0.0005a 92.55±0.001c X31 90.99±0.0003c 93.38±0.001b X33 90.33±0.0005e 94.04±0.001a X34 91.35±0.0005b 91.76±0.001d 2.5.5 乳酸菌的抑菌性能
6株乳酸菌对食品中常见的3种食源性致病菌（大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）的抑菌性测定结果如表5所示。从表中可以看出，X12、X31和X33对3种病原菌均有明显的抑制效果，但是X23、X29和X34对金黄色葡萄球菌无抑制作用。6株乳酸菌对3株病原菌的抑菌圈直径之间存在显著差异（P<0.05），菌株X31对大肠杆菌的抑菌圈直径达到最大19.63 mm；菌株X23对沙门氏菌的抑制最大抑菌圈直径达到19.85 mm；菌株X33对金黄色葡萄球菌的最大抑菌直径可达到19.17 mm。不同种属的乳酸菌产生不同的抑菌代谢产物，导致其对致病菌的抑制活性不同。
表 5 6株乳酸菌对致病菌的抑菌性Table 5. Inhibition of pathogenic bacteria by six strains of lactic acid bacteria菌株编号 大肠杆菌（mm） 沙门氏菌（mm） 金黄色葡萄球菌（mm） X12 17.93±0.01e 16.77±0.08e 18.17±0.02c X23 19.20±0.08b 19.85±0.01a − X29 18.17±0.02d 16.23±0.02f − X31 19.63±0.01a 18.27±0.02c 18.67±0.02b X33 19.03±0.01c 18.50±0.04b 19.17±0.02a X34 16.73±0.02f 17.77±0.02d − 3. 结论与讨论
通过传统的稀释涂布分离法并结合16S rRNA基因序列分析，从新疆阿勒泰地区驼乳制品中筛选处34株菌株，经鉴定有27株为乳酸菌，乳明串珠菌属Leuconostoc为该地区驼乳制品的优势属，占细菌总数的35.29%。目前关于驼乳和酸驼乳中乳酸菌的报道研究越来越多，张苗苗等[15]对新疆哈密地区原驼乳中乳酸菌进行分离鉴定，优势菌属为明串珠菌属Leuconostoc占35%。Zhao等[16]从阿拉善某牧场的15份新鲜驼乳中分离鉴定分离出32个门、377个属和652个种，其中有72株乳酸菌，包括Lactobacillus paracasei，Enterococcus italicus，Enterococcus durans，Lactococcus lactis ssp. Lactis，Weissellaconfusa和Enterococcus faecium。这与研究结果不同，原因可能是采样的地区，所处地理环境和饲养环境不同影响了菌株的多样性。
α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制α-葡萄糖苷酶活性[17]来控制体内碳水化合物的延缓吸收，达到降低餐后血糖的目的，同时α-葡萄糖苷酶抑制率是体外筛选乳酸菌是否具有降糖活性的重要指标[18]。乳酸菌[19]在生长繁殖过程中分泌有机酸、胞外多糖、特殊酶系等生物活性物质，通过抑制病原菌的生长，调节肠道菌群平衡，增强机体免疫功能，从而有效缓解糖尿病病症。白璐等[20]发现干酪乳杆菌通过调节短链脂肪酸含量刺激血糖代谢，改善糖尿病小鼠的糖代谢紊乱。Li等[21]采用pNPG法筛选出对α-葡萄糖苷酶抑制率达到32.19%的植物乳杆菌，通过饲喂发现能有效改善小鼠胰岛素抵抗，提高抗氧化能力。曾珠等[22]从发酵制品中筛选的副干酪乳杆菌和植物乳杆菌对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为31%和27%，高于本实验中乳酸菌对α-葡萄糖苷酶抑制率，这可能与菌株的来源不同有关。
为确保筛选的具有抑制酶活性的乳酸菌能有效发挥降糖作用，对乳酸菌的益生特性进行评价。人体胃液在空腹条件下pH为0.9~1.8左右[23]，食用食物后pH一般保持在3.0左右。并且人体消化道中含有一定浓度的胆盐和胆汁酸，益生菌既能够耐受酸性环境，又能耐受一定浓度的胆盐环境[24]，肠胃液耐受性是筛选益生菌的另一个重要指标[25]，任何益生菌想要到达肠道发挥益生功能，必须经过胃肠道，并且有一定的定值能力。陈欢等[26]从新疆哈萨克族传统奶酪中筛选分离得到8株乳酸菌，其中D-14、D-12在模拟胃液中的存活率均大于70%。在本实验中，6株乳酸菌在pH1.0的强酸性环境下胁迫12 h，仍然有一定存活率。随着胆盐浓度的增加，乳酸菌的存活率受到一定限制，但没有被完全抑制生长，表现出较高的耐酸性和胆盐耐受性。在模拟胃液中的存活率达到85%以上，模拟肠液中孵育4 h后的存活率在90%以上，表现出较高的肠胃液耐受性。
体内存在过多的活性氧会引起机体抗氧化能力下降，氧化应激水平增加，导致机体细胞损伤，这是引发糖尿病的主要病理机制之一，机体内持续的氧化应激反应造成胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤，引起血糖持续升高[27]。而乳酸菌在面临氧胁迫时会产生一系列抗氧化酶包括NADH氧化酶、NADH过氧化物酶、过氧化物氢化还原酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶发生氧化还原反应，清除体内的活性氧分子，维持机体氧化还原平衡[28]。本实验中筛选的乳酸菌对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率均在90%以上，表现出较强的抗氧化活性。
乳酸菌在代谢过程中能产生细菌素、有机酸、过氧化氢等多种具有抑菌活性的物质，是一种天然防腐剂，在食品保鲜等方面有待被加工为更安全、副作用小的新型保鲜剂[29]。Ren等[30]从发酵食品筛选的植物乳杆菌对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌长度均达到13 mm左右，均具有较好的抑菌效果。杜贺超等[31]筛选得到一株抑菌效果最佳植物乳杆菌，发酵液上清经过蛋白酶处理后丧失抑菌活性，证实植物乳杆菌分泌的抑菌物质为细菌素。在本实验中，菌株X12、X31和X33对三种病原菌均有明显的抑制效果，其中X31对大肠杆菌的抑菌圈直径达到最大19.63 mm，X23对沙门氏菌的抑制最大抑菌圈直径达到19.85 mm，X33对金黄色葡萄球菌的最大抑菌直径达到19.17 mm。
综上所述，本实验从驼乳制品中筛选的6株具有潜在降糖活性的乳酸菌，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，并且表现出良好的益生特性，在产酸能力、耐酸耐胆盐能力、肠胃液中的存活率较高，抗氧化能力较强，对食品中常见的致病菌有一定的抑制作用，可作为后期研发功能乳制品的益生菌株。
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图 1 6株乳酸菌系统发育树的构建
Figure 1. Construction of a phylogenetic tree of six strains of Lactobacillus
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图 3 6株乳酸菌的产酸曲线
Figure 3. Acid production curves of six strains of lactic acid bacteria
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图 4 6株乳酸菌在不同pH的培养基中吸光度值
注：不同小写字母代表同一时间不同菌株之间吸光度值存在显著差异（P<0.05）；图5同。
Figure 4. Absorbance values of six strains of Lactobacillus in media of different pH values
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图 5 6株乳酸菌在不同胆盐浓度的培养基中吸光度值
Figure 5. Absorbance values of six strains of Lactobacillus in media with different bile salt concentrations
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图 6 6株乳酸菌在肠胃液中的存活率
注：不同小写字母代表不同菌株之间存在显著差异（P<0.05）。
Figure 6. Survival of six strains of lactic acid bacteria in gastrointestinal fluid
表 1 34株菌株的菌落形态和溶钙圈直径
Table 1 Colony morphology and diameter of calcium soluble circles of the 34 strains
编号 菌落形态 革兰氏
染色溶钙圈直径（mm） X1 菌落较大，白色透明，表面干燥凸起有褶皱，边缘不规则 阴性 16.03±0.05 X2 菌落较小，乳白色不透明，表面干燥，边缘光滑 阳性 18.50±0.41 X3 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 18.33±0.47 X4 菌落较大，灰白色不透明，表面粘稠，光滑圆形 阴性 18.07±0.09 X5 菌落较小，灰白色不透明，菌落呈圆形，边缘光滑 阳性 17.23±0.03 X6 菌落较小，灰白色不透明，表面湿润，光滑圆形 阳性 19.33±0.62 X7 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 14.33±0.24 X8 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 14.10±0.29 X9 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 18.83±0.62 X10 菌落较大，淡黄色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阴性 15.42 ±0.04 X11 菌落较小，乳白色不透明，表面干燥，边缘光滑 阳性 17.00±0.41 X12 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阳性 20.83±0.62 X13 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 16.50±0.41 X14 菌落较小，乳白色半透明，表面光滑有凸起，边缘整齐 阴性 18.20±0.02 X15 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 17.50±0.41 X16 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 18.07±0.09 X17 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 18.23±0.05 X18 菌落较小，淡黄色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阴性 16.28±0.02 X19 菌落较大，淡黄色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阴性 11.50±0.01 X20 菌落较大，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阴性 12.43±0.18 X21 菌落较小，灰白色不透明有凸起表面湿润，边缘光滑圆形 阳性 13.67±0.12 X22 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 18.30±0.02 X23 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘规则有凸起 阳性 22.33±0.85 X24 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 16.17±0.24 X25 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 18.20±0.04 X26 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 16.70±0.03 X27 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 13.50±0.41 X28 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 16.87±0.19 X29 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑的圆形 阳性 16.80±0.30 X30 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 16.00±0.41 X31 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阳性 20.27±0.52 X32 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 15.93±0.09 X33 菌落较小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑 阳性 20.00±0.08 X34 菌落极小，乳白色不透明，表面湿润，边缘光滑有凸起 阳性 20.83±0.62 
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表 2 菌株的 16S rRNA 鉴定结果
Table 2 Results of 16S rRNA identification
编号 菌株名称 登录号 同源性 X1 Bacillus subtilis OM914980 99.90% X2 Enterococcus faecalis OM914979 99.55% X3 Lactococcus lactis OM914977 99.64% X4 Klebsiella sp. OM914976 99.81% X5 Leuconostoc lactis OM914975 99.56% X6 Enterococcus durans OM914974 99.47% X7 Leuconostoc mesenteroides OM914973 97.54% X8 Leuconostoc pseudomesenteroides OM914972 99.36% X9 Leuconostoc mesenteroides OM914971 97.08% X10 Acetobacter fabarum OM914970 98.24% X11 Enterococcus faecalis OM914968 99.82% X12 Lactobacillus plantarum OM063101 99.02% X13 Lactococcus lactis OM914966 99.47% X14 Klebsiella oxytoca OM914965 98.55% X15 Lactococcus lactis OM914963 99.64% X16 Lactococcus lactis OM914964 99.91% X17 Leuconostoc pseudomesenteroides OM914960 99.64% X18 Acetobacter fabarum OM914956 99.44% X19 Uncultured Acetobacter sp. FJ348419.1 99.02% X20 Acetobacter pasteurianus CP039846.1 100.00% X21 Leuconostoc lactis MF425334.1 100.00% X22 Lactococcus lactis MT597705.1 100.00% X23 Lactiplantibacillus plantarum OM056676 100.00% X24 Leuconostoc mesenteroides OM915398 100.00% X25 Leuconostoc pseudomesenteroides OM914919 99.93% X26 Leuconostoc mesenteroides OM914920 99.79% X27 Enterococcus italicus OM915397 100.00% X28 Leuconostoc mesenteroides OM915396 99.93% X29 Lactobacillus paracasei OM056677 99.93% X30 Leuconostoc mesenteroides OM915395 100.00% X31 Lactiplantibacillus plantarum OM056678 100.00% X32 Leuconostoc mesenteroides OM915399 100.00% X33 Lactiplantibacillus plantarum OM056679 99.79% X34 Lactobacillus paracasei OM056680 100.00%
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表 3 乳酸菌对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率
Table 3 Inhibition of α-amylase and α-glucosidase by lactic acid bacteria
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表 4 乳酸菌对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率
Table 4 Scavenging rates of hydroxyl radicals and superoxide anion radicals by lactic acid bacteria
菌株编号 羟自由基清除率（%） 超氧阴离子自由基清除率（%） X12 90.90±0.0005c 93.40±0.001b X23 90.44±0.0003d 93.67±0.001b X29 92.43±0.0005a 92.55±0.001c X31 90.99±0.0003c 93.38±0.001b X33 90.33±0.0005e 94.04±0.001a X34 91.35±0.0005b 91.76±0.001d
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表 5 6株乳酸菌对致病菌的抑菌性
Table 5 Inhibition of pathogenic bacteria by six strains of lactic acid bacteria
菌株编号 大肠杆菌（mm） 沙门氏菌（mm） 金黄色葡萄球菌（mm） X12 17.93±0.01e 16.77±0.08e 18.17±0.02c X23 19.20±0.08b 19.85±0.01a − X29 18.17±0.02d 16.23±0.02f − X31 19.63±0.01a 18.27±0.02c 18.67±0.02b X33 19.03±0.01c 18.50±0.04b 19.17±0.02a X34 16.73±0.02f 17.77±0.02d −
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